CN104535747A - 一种基于大鼠口鼻吸烟评价卷烟对肺部炎症有诱导作用的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于大鼠口鼻吸烟评价卷烟对肺部炎症有诱导作用的检测方法，步骤如下：1）吸烟机分别按国际标准设置吸烟程序，连接烟气质量检测仪，实时监测香烟烟气质量浓度；2）清洁级大鼠置于口鼻暴露塔上；3）每批大鼠每天吸烟20支；待一批大鼠吸烟完成后，换另一批大鼠吸入另外批次香烟或不同抽吸设置；空白组以不吸烟空气进行暴露；4）大鼠最后一次吸烟后处死大鼠，对肺部进行处理，观察肺部炎症细胞浸润。采用多指标综合评价卷烟对大鼠肺部炎症的诱导作用。本发明具有以下优点：1.大鼠仅口鼻吸烟，避免卷烟有害物质经粘膜或大鼠舔毛等方式进入，更加准确，运用灵活。
Description
技术领域
本发明涉及卷烟危害的生物评价领域，具体为一种基于大鼠口鼻吸烟评价卷烟对肺部炎症有诱导作用的检测方法。
背景技术
人们已经普遍接受了这样一种观点，即通过降低卷烟烟气中有害成分的释放量可以有效地降低卷烟对人体的危害。但是国内外尚没有形成统一的评价标准。目前，国内外普遍以卷烟中含有主要有害物质的致癌,致畸变数据为基础，结合数学模型公式进行危害评价，尚无关于卷烟和肺部炎症相关的数据基础。大多在研究卷烟危害往往以固定卷烟烟气浓度进行暴露，或采用全身暴露，我们首次采用大鼠经口鼻暴露方式，且卷烟烟气经吸烟机产生后直接由载气载入暴露装置，模拟人吸烟时吸烟和吐烟的实际情况，使获得数据更加接近现实。慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)简称慢阻肺，主要表现为进行性的呼吸困难及肺功能下降，反复发作后，将发展成慢性肺源性心脏病，导致严重的心、肺功能障碍，甚至多个器官的功能衰竭。目前，COPD发病机制尚未完全研究清楚，普遍认为吸烟会诱导COPD的形成，且吸烟者COPD患病率较不吸烟者高。即使没有出现气流受限，健康吸烟者肺部仍然有轻度炎症。主要原因是卷烟中含有成千上万种物质，卷烟烟气中有1015种自由基，卷烟焦油中含有1018活性物质和氮化合物(ROS)，这些有害物质能在肺部长期滞留，从而导致炎症反应。因此，我们结合模拟人吸烟的大鼠口鼻暴露装置对卷烟对肺部早期炎症的诱导进行评价。
发明内容
本发明的目的是在现有技术状况下提供一种基于大鼠口鼻吸烟评价卷烟对肺部炎症作用检测方法。本方法提供的检测方法，具有模拟人吸烟，仅口鼻暴露，多指标综合评价等优点。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种基于大鼠口鼻吸烟评价卷烟对肺部炎症有诱导作用的检测方法，包括以下步骤：
1）吸烟机分别按国际标准或加拿大深度抽吸模式设置吸烟程序，口鼻暴露装置设置载气流量为8L/min，连接烟气质量检测仪，实时监测香烟烟气质量浓度；
2）清洁级大鼠15只/组置于固定器中，置于口鼻暴露塔上，仅口鼻吸烟；
3）每批大鼠每天吸烟20支；待一批大鼠吸烟完成后，换另一批大鼠吸入另外批次香烟或不同抽吸设置；空白组以不吸烟空气进行暴露；连续吸烟28天；
4）大鼠最后一次吸烟18小时后处死大鼠，右肺结扎，采用PBS 5ml ′ 3次对左肺进行肺泡灌洗，以回收率大于80%为合格；肺泡灌洗液进行细胞计数后，3000r ′ 5min离心，取上清液采用eBioscience Elisa试剂盒测定IL-1β和TNF-α的含量，细胞沉淀涂片，瑞士-吉姆萨染色进行分类计数；右肺于10%甲醛溶液中固定一周后，脱水，石蜡包埋，切片，进行HE染色，观察肺部炎症细胞浸润。采用多指标综合评价卷烟对大鼠肺部炎症的诱导作用。
本发明卷烟样品经吸烟机按照国际标准抽吸模式或者加拿大深度抽吸模式吸烟，将卷烟烟气以空气为载气通入大鼠口鼻暴露塔中，大鼠固定于口鼻暴露塔，仅口鼻暴露于卷烟烟气中，同时暴露塔抽气保持微小负压，模拟人吸烟过程中的吸烟吐气过程。大鼠每天吸烟20支，连续28天，空白组以不含卷烟烟气的空气暴露。28天后处死大鼠，左肺进行肺泡灌洗，对总炎症细胞数及炎症细胞分类进行计数；同时取灌洗液上清进行炎症因子IL-1β和TNFα检测；右肺固定一周进行病理检测。结果表明：口鼻暴露烟气质量浓度检测大鼠吸烟的烟气证实烟气质量浓度呈现的峰谷变化，一定程度上模拟人自然吸烟过程；在对三种市售不同焦油浓度卷烟按国际标准抽吸模式或者加拿大深度抽吸模式下诱导卷烟大鼠肺部炎症的评价中发现，高焦油含量卷烟组大鼠出现明显炎症细胞浸润，巨噬细胞，中性粒细胞，淋巴细胞均有一定上升，炎症因子IL-1β和TNFα分泌对比空白组显著上升，而低浓度焦油卷烟组炎症细胞浸润较少，说明大鼠肺部炎症浸润程度与卷烟焦油含量呈现正比例关系；同时发现同等焦油含量卷烟，加拿大深度抽吸模式对大鼠肺部炎症高于国际标准抽吸模式。上述结果表明该方法操作简单，能很好的评价不同卷烟对大鼠肺部炎症的诱导作用，填补国内经口鼻吸烟评价卷烟对肺部炎症的诱导作用的研究。
本发明由于采用上述的技术方案，建立了一种基于大鼠口鼻吸烟评价卷烟对肺部炎症有诱导作用的检测方法，具有以下优点：
1.大鼠仅口鼻吸烟，避免卷烟有害物质经粘膜或大鼠舔毛等方式进入，更加准确；
2.由吸烟机吸烟产生卷烟烟气，能检测卷烟不同抽吸模式下对大鼠肺部炎症诱导作用，运用灵活；
3.卷烟烟气经载气进行暴露，能更好的模拟人吸烟过程中的吸烟和吐烟的实际过程；
4.采用的肺泡灌洗炎症细胞计数及分类计数，病理和炎症因子分泌多指标综合观察，更加系统和准确的评价卷烟对大鼠肺部炎症的诱导作用。
附图说明
图1为不同焦油卷烟按加拿大深度抽吸或国际标准抽吸模式经载气进入大鼠口鼻暴露塔后于口鼻暴露口检测的烟气质量浓度变化图。
图2为不同焦油含量卷烟对大鼠肺部炎症细胞浸润的影响图。
具体实施方式
本发明通过以下具体实例作进一步描述，但不限制本发明。
考察市售3种不同焦油含量卷烟对大鼠肺部炎症诱导作用。卷烟样品为市售的烤烟型卷烟，焦油含量分别为11mg，5mg及1mg。实验前样品准备在温度22±1oC，相对湿度为60±2%的条件下平衡48h。SD雄性大鼠，220±20g，购于上海斯莱克。吸烟时大鼠均饲养于空气洁净度十万级的动物房，室温21±1oC，湿度58±4%，昼夜周期为12h/12h。采用慧荣和大鼠口鼻暴露系统，维持载气流量8L/min，抽气流量9.5L/min，氧分压20±0.5%，温度24±2oC，相对湿度60-80%；同时测定大鼠口鼻暴露口卷烟烟气质量浓度。单孔道吸烟机，分别采用加拿大深度抽吸模式（抽吸体积55ml，抽吸间隔30s，抽吸时间2s）及国际标准抽吸模式（抽吸体积35ml，抽吸间隔60s，抽吸时间2s）进行吸烟。大鼠连续吸烟28天后，吸麻醉处死大鼠，左肺采用PBS进行肺泡灌洗，去回收率大于80%肺泡灌洗液进行细胞计数，并离心取上清测定IL-1β及TNF-α，细胞沉淀涂片后，瑞士-吉姆萨染色进行分类计数。右肺经10%甲醛固定一周后，取材，脱水，透明，石蜡包埋，切片进行HE染色，观察肺部炎症细胞浸润。
结果显示：
1 、不同焦油含量卷烟对大鼠BALF中炎症细胞浸润的影响
大鼠经28天吸烟后，加拿大深度抽吸模式下1mg和5mg卷烟组BALF灌洗液中总细胞数相对不吸烟空白组无显著想变化，而加拿大深度抽吸模式及国际标准抽吸模式下11mg卷烟组总细胞数有显著上升。分类计数结果显示：加拿大深度抽吸模式下1mg卷烟组大鼠BALF中巨噬细胞，淋巴细胞和中性粒细胞均无明显的上升；5mg卷烟组对淋巴细胞和中性粒细胞的肺部浸润有显著诱导作用，而对巨噬细胞无显著作用。加拿大深度抽吸及国际标准抽吸模式下11mg卷烟均能显著诱导巨噬细胞，中性粒细胞及淋巴细胞的肺部浸润。进一步分析，发现加拿大深度抽吸模式下11mg卷烟对BALF中炎症细胞浸润及分类计数与加拿大深度抽吸模式下的1mg有显著上升，而和加拿大深度抽吸模式下5mg卷烟组及国际标准抽吸模式下11mg卷烟组无显著差异(表1)。
表1 不同吸烟组大鼠肺泡灌洗液中炎症细胞数量
2、不同焦油含量卷烟对炎症因子分泌影响
不同吸烟组大鼠BALF采用Elisa进行IL-1β及TNF-a含量检测。结果显示加拿大深度抽吸模式下1mg相对空白组对IL-1β和TNF-a分泌无显著影响；加拿大深度抽吸模式下5，11mg及国际标准抽吸模式下11mg对IL-1β和TNF-a分泌有显著诱导作用，且加拿大深度抽吸11mg组与其他组均存在显著差异(表2)。
[0013] 表2 不同吸烟组大鼠肺泡灌洗液中炎症因子分泌
3、不同焦油含量卷烟对大鼠肺部炎症细胞浸润的影响
如图2所示，加拿大深度抽吸模式下1mg卷烟组对大鼠肺部炎症细胞浸润无明显影响，加拿大深度抽吸模式下5mg及国际标准抽吸模式下11mg卷烟组大鼠肺部发现有少量炎症细胞浸润，只有加拿大深度抽吸模式11mg卷烟组大鼠肺部切片中发现有大量炎症细胞浸润，具有诱导炎症细胞作用。
Claims (1)
1.一种基于大鼠口鼻吸烟评价卷烟对肺部炎症有诱导作用的检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
1）开启吸烟机和卷烟口鼻暴露装置于待机状态，吸烟机分别按国际标准或加拿大深度抽吸模式设置吸烟程序，口鼻暴露装置设置载气流量为8L/min，连接烟气质量检测仪；
2）清洁级大鼠15只/组置于固定器中，置于口鼻暴露塔上，仅口鼻吸烟；
3）插入卷烟，开始吸烟，每批大鼠每天吸烟20支，待一批大鼠吸烟完成后，换另一批大鼠吸入另外批次香烟或不同抽吸设置；空白组以不吸烟空气进行暴露；连续吸烟28天；
4）大鼠最后一次吸烟18小时后处死大鼠，右肺结扎，采用PBS 5ml ′ 3次对左肺进行肺泡灌洗，以回收率大于80%为合格；肺泡灌洗液进行细胞计数后，3000r ′ 5min离心，取上清液采用联科生物Elisa试剂盒测定IL-1β和TNF-α的含量，细胞沉淀涂片，瑞士-吉姆萨染色进行分类计数；右肺于10%甲醛溶液中固定一周后，脱水，石蜡包埋，切片，进行HE染色，观察肺部炎症细胞浸润。
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