CN109557254A - 一种建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法，属于生物应用技术领域。该方法包括卷烟烟气抽吸、烟气稀释、参考孔和检测孔设置、小鼠暴露、采样、检测孔数据标准化、时间变异系数计算、空间变异系数计算、判定等步骤。本发明的方法操作简单，对卷烟烟气在暴露周期内TVOC浓度以时间和空间两个方面作为切入点，建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法及相关参数，并验证此方法下烟气口鼻暴露体系中TVOC浓度的均一性和稳定性，为后续生物学效应的科学性和准确性提供保证。

Description

一种建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法
技术领域
本发明属于生物应用技术领域，具体涉及一种建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法。
背景技术
卷烟烟气是一种含有颗粒物、挥发性有机物和气体的混合物。在利用动物模型研究其生物学效应的暴露方法中，口鼻暴露系统和全身暴露系统是烟气生物学效应研究的两种主要方式，其中口鼻暴露方式与全身暴露相比，避免了动物毛发对暴露气溶胶的吸附和过滤，同时还可以迅速使暴露仓内的气溶胶分布均匀并节省样品等优点，是卷烟烟气啮齿类动物急性、亚急性和亚慢性吸入暴露的主要方式。
现有烟气啮齿类动物吸入暴露的大多数研究中注重生物学效应指标结果，忽略了对小鼠口鼻暴露方法自身的研究。口鼻暴露方法中，不同时间和位置的动物是否能够吸入暴露特征相同或稳定的烟气决定相应生物学效应的均一性、可重复性和准确性。
目前针对小鼠口鼻暴露方法的研究少之又少，且完全忽视了挥发性有机物等暴露特征为指标的数据，而上述数据对于烟气的生物学效应研究来说至关重要，因为在动物暴露过程中挥发性有机物量的多少直接决定着烟气在动物肺中的沉积剂量和部位，也决定着机体对烟气中成份产生相关生物学效应和代谢途径。
因此如何克服现有技术的不足，研究出一种可确保烟气暴露动物生物学效应结果的准确性和可重复性的卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法是目前生物应用技术领域亟需解决的问题，目前未有相关研究。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明以TVOC浓度为指标进行监测，在暴露周期内浓度以时间和空间两个方面作为切入点，旨在提供一种建立能确保烟气暴露动物生物学效应结果的准确性和可重复性的卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法，包括如下步骤：
步骤（1），卷烟烟气抽吸：
每支烟抽吸持续时间2-5s，抽吸频率30-60s，抽吸容量35.0-50ml/2s，抽吸口数4-6口，得到卷烟烟气；
步骤（2），烟气稀释：
将步骤（1）得到的卷烟烟气与洁净空气按体积比为1:10-1:100的配比稀释混匀，后进入口鼻式暴露系统；
所述的洁净空气是空气经高效空气过滤器过滤所得；
步骤（3），参考孔和检测孔设置：
在口鼻式暴露系统上，选择一个采样孔作为参考孔，同时，随机选择多个采样孔作为检测孔；
步骤（4），小鼠暴露：
将小鼠束缚在固定筒中适应15-30min后，将装有小鼠的固定筒安装在口鼻式暴露系统上除了采样孔的其余孔对应的位置上，内缸正压烟气气流进入动物鼻部，呼出气流从侧面被吸入外缸，平衡至少10min后进行采样；
步骤（5），采样：
通过步骤（3）选择好的参考孔和检测孔进行采样，之后测量所采样品的TVOC浓度；连续多天进行采样测量，每天采样测量多次；
步骤（6），检测孔数据标准化：
将步骤（5）检测孔所测量得到的TVOC浓度除以参考孔TVOC浓度，得到检测孔标准化TVOC浓度数据；
步骤（7），时间变异系数计算：
计算每次采样测量得到的TVOC浓度的时间变异系数CV ij ；计算公式如下：
CV ij =（所有检测孔第i天第j次采样测量得到的标准化TVOC浓度数据的标准差/所有检测孔第i天第j次采样测量得到的标准化TVOC浓度数据的均值）×100%，
CV ij 为第i天第j次采样的TVOC浓度的时间变异系数；
步骤（8），空间变异系数计算：计算出口鼻式暴露系统TVOC浓度的空间变异系数CV ij空间；计算公式如下：
(CV ij空间)2 =(CV总变异)2-(CV ij )2
其中，CV总变异=所有检测孔所有采样次数得到的标准化TVOC浓度数据的标准差/所有检测孔所有采样次数得到的标准化TVOC浓度的均值×100%；
CV ij空间为第i天第j次采样的TVOC浓度的空间变异系数；
步骤（9），判定：当所有的CV ij 小于10%，且所有的CV ij空间均小于10%，则说明步骤（1）、步骤（2）和步骤（4）的构成的小鼠暴露方法适合作为研究烟气暴露啮齿类动物生物学效应的暴露方法，作为标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法；反之，则不适合作为研究烟气暴露啮齿类动物生物学效应的暴露方法，需要增加洁净空气的流量和/或调节卷烟烟气发生量，直至所有的CV ij 和CV ij空间均小于10%。
进一步，优选的是，步骤（1）中，抽吸采用十通道转盘式吸烟机。
进一步，优选的是，步骤（2）中，所述的洁净空气是空气经高效空气过滤器连续过滤3次所得。
进一步，优选的是，步骤（3）中，在口鼻式暴露系统上，每个模块需随机选择2个采样孔作为检测孔。
进一步，优选的是，步骤（4）中，口鼻式暴露系统上安装有多只小鼠，数量＜所有采样孔数量-检测孔数量-1。
进一步，优选的是，步骤（5）中，采用TVA-1000B有毒挥发气体分析仪测量样品中TVOC浓度。
进一步，优选的是，步骤（5）中，每天测量3次。
进一步，优选的是，步骤（5）中，连续5天进行采样测量。
口鼻式暴露系统在试验时通常内缸正压，外缸微弱负压，压力一般为-200到-50帕。本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明的方法操作简单，对卷烟烟气在暴露周期内TVOC浓度以时间和空间两个方面作为切入点，建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法及相关参数，验证口鼻式暴露系统中烟气口鼻暴露体系的TVOC浓度的均一性和稳定性，为后续生物学效应的科学性和准确性提供保证。
附图说明
图1是本发明实施例口鼻式暴露系统的选择采样孔的示意图；
图2是口鼻暴露系统剖面图。
其中，1、口鼻暴露仓；2、过滤器；3、采样孔；4、动物固定器；5、有毒挥发气体分析仪；6、开关；7、采样气泵；8、采样管；9、连接处；10、混合仓。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本方法所采用的口鼻式暴露系统为小动物口鼻暴露系统，型号HRH-MNE3026，北京慧荣和科技有限公司，剖面图如图2所示，但不限于此；整个监测过程可以采用本发明申请人的ZL201811341117.0所示的监测装置，但不限于此。
TVA-1000B有毒挥发气体分析仪，FID检测器，1-10000ppm，美国Thermo科技仪器有限公司。
实施例1
一种建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法，包括如下步骤：
步骤（1），卷烟烟气抽吸：
每支烟抽吸持续时间2s，抽吸频率30s，抽吸容量35.0ml/2s，抽吸口数4口，得到卷烟烟气；
步骤（2），烟气稀释：
将步骤（1）得到的卷烟烟气与洁净空气按体积比为1:10的配比稀释混匀，后进入口鼻式暴露系统；
所述的洁净空气是空气经高效空气过滤器过滤所得；
步骤（3），参考孔和检测孔设置：
在口鼻式暴露系统上，选择一个采样孔作为参考孔，同时，随机选择多个采样孔作为检测孔；
步骤（4），小鼠暴露：
将小鼠束缚在固定筒中适应15-30min后，将装有小鼠的固定筒安装在口鼻式暴露系统上除了采样孔的其余孔对应的位置上，内缸正压烟气气流进入动物鼻部，呼出气流从侧面被吸入外缸，平衡至少10min后进行采样；
步骤（5），采样：
通过步骤（3）选择好的参考孔和检测孔进行采样，之后测量所采样品的TVOC浓度；连续多天进行采样测量，每天采样测量多次；
步骤（6），检测孔数据标准化：
将步骤（5）检测孔所测量得到的TVOC浓度除以参考孔TVOC浓度，得到检测孔标准化TVOC浓度数据；
步骤（7），时间变异系数计算：
计算每次采样测量得到的TVOC浓度的时间变异系数CV ij ；计算公式如下：
CV ij =（所有检测孔第i天第j次采样测量得到的标准化TVOC浓度数据的标准差/所有检测孔第i天第j次采样测量得到的标准化TVOC浓度数据的均值）×100%，
CV ij 为第i天第j次采样的TVOC浓度的时间变异系数；
步骤（8），空间变异系数计算：计算出口鼻式暴露系统TVOC浓度的空间变异系数CV ij空间；计算公式如下：
(CV ij空间)2 =(CV总变异)2-(CV ij )2
其中，CV总变异=所有检测孔所有采样次数得到的标准化TVOC浓度数据的标准差/所有检测孔所有采样次数得到的标准化TVOC浓度的均值×100%；
CV ij空间为第i天第j次采样的TVOC浓度的空间变异系数；
步骤（9），判定：当所有的CV ij 小于10%，且所有的CV ij空间均小于10%，则说明步骤（1）、步骤（2）和步骤（4）的构成的小鼠暴露方法适合作为研究烟气暴露啮齿类动物生物学效应的暴露方法，作为标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法；反之，则不适合作为研究烟气暴露啮齿类动物生物学效应的暴露方法，需要增加洁净空气的流量和/或调节卷烟烟气发生量，直至所有的CV ij 和CV ij空间均小于10%。
实施例2
一种建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法，包括如下步骤：
步骤（1），卷烟烟气抽吸：
采用十通道转盘式吸烟机进行抽吸，每支烟抽吸持续时间5s，抽吸频率60s，抽吸容量50ml/2s，抽吸口数6口，得到卷烟烟气；
步骤（2），烟气稀释：
将步骤（1）得到的卷烟烟气与洁净空气按体积比为1:100的配比稀释混匀，后进入口鼻式暴露系统；
所述的洁净空气是空气经高效空气过滤器过滤所得；
步骤（3），参考孔和检测孔设置：
在口鼻式暴露系统上，选择一个采样孔作为参考孔，同时，随机选择多个采样孔作为检测孔；
步骤（4），小鼠暴露：
将小鼠束缚在固定筒中适应15-30min后，将装有小鼠的固定筒安装在口鼻式暴露系统上除了采样孔的其余孔对应的位置上，内缸正压烟气气流进入动物鼻部，呼出气流从侧面被吸入外缸，平衡至少10min后进行采样；
步骤（5），采样：
通过步骤（3）选择好的参考孔和检测孔进行采样，之后测量所采样品的TVOC浓度；连续多天进行采样测量，每天采样测量多次；
步骤（6），检测孔数据标准化：
将步骤（5）检测孔所测量得到的TVOC浓度除以参考孔TVOC浓度，得到检测孔标准化TVOC浓度数据；
步骤（7），时间变异系数计算：
计算每次采样测量得到的TVOC浓度的时间变异系数CV ij ；计算公式如下：
CV ij =（所有检测孔第i天第j次采样测量得到的标准化TVOC浓度数据的标准差/所有检测孔第i天第j次采样测量得到的标准化TVOC浓度数据的均值）×100%，
CV ij 为第i天第j次采样的TVOC浓度的时间变异系数；
步骤（8），空间变异系数计算：计算出口鼻式暴露系统TVOC浓度的空间变异系数CV ij空间；计算公式如下：
(CV ij空间)2 =(CV总变异)2-(CV ij )2
其中，CV总变异=所有检测孔所有采样次数得到的标准化TVOC浓度数据的标准差/所有检测孔所有采样次数得到的标准化TVOC浓度的均值×100%；
CV ij空间为第i天第j次采样的TVOC浓度的空间变异系数；
步骤（9），判定：当所有的CV ij 小于10%，且所有的CV ij空间均小于10%，则说明步骤（1）、步骤（2）和步骤（4）的构成的小鼠暴露方法适合作为研究烟气暴露啮齿类动物生物学效应的暴露方法，作为标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法；反之，则不适合作为研究烟气暴露啮齿类动物生物学效应的暴露方法，需要增加洁净空气的流量和/或调节卷烟烟气发生量，直至所有的CV ij 和CV ij空间均小于10%。
步骤（2）中，所述的洁净空气是空气经高效空气过滤器连续过滤3次所得。
步骤（3）中，在口鼻式暴露系统上，每个模块需随机选择2个采样孔作为检测孔。
步骤（4）中，口鼻式暴露系统上安装有多只小鼠，数量＜所有采样孔数量-检测孔数量-1。
步骤（5）中，采用TVA-1000B有毒挥发气体分析仪测量样品中TVOC浓度。；连续5天进行采样测量，每天测量3次。
实施例3
一种建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法，包括如下步骤：
步骤（1），卷烟烟气抽吸：
采用十通道转盘式吸烟机进行抽吸，每支烟抽吸持续时间4s，抽吸频率40s，抽吸容量40ml/2s，抽吸口数5口，得到卷烟烟气；
步骤（2），烟气稀释：
将步骤（1）得到的卷烟烟气与洁净空气按体积比为1:50的配比稀释混匀，后进入口鼻式暴露系统；
所述的洁净空气是空气经高效空气过滤器过滤所得；
步骤（3），参考孔和检测孔设置：
在口鼻式暴露系统上，选择一个采样孔作为参考孔，同时，随机选择多个采样孔作为检测孔；
步骤（4），小鼠暴露：
将小鼠束缚在固定筒中适应15-30min后，将装有小鼠的固定筒安装在口鼻式暴露系统上除了采样孔的其余孔对应的位置上，内缸正压烟气气流进入动物鼻部，呼出气流从侧面被吸入外缸，平衡10min后进行采样；
步骤（5），采样：
通过步骤（3）选择好的参考孔和检测孔进行采样，之后测量所采样品的TVOC浓度；连续多天进行采样测量，每天采样测量多次；
步骤（6），检测孔数据标准化：
将步骤（5）检测孔所测量得到的TVOC浓度除以参考孔TVOC浓度，得到检测孔标准化TVOC浓度数据；
步骤（7），时间变异系数计算：
计算每次采样测量得到的TVOC浓度的时间变异系数CV ij ；计算公式如下：
CV ij =（所有检测孔第i天第j次采样测量得到的标准化TVOC浓度数据的标准差/所有检测孔第i天第j次采样测量得到的标准化TVOC浓度数据的均值）×100%，
CV ij 为第i天第j次采样的TVOC浓度的时间变异系数；
步骤（8），空间变异系数计算：计算出口鼻式暴露系统TVOC浓度的空间变异系数CV ij空间；计算公式如下：
(CV ij空间)2 =(CV总变异)2-(CV ij )2
其中，CV总变异=所有检测孔所有采样次数得到的标准化TVOC浓度数据的标准差/所有检测孔所有采样次数得到的标准化TVOC浓度的均值×100%；
CV ij空间为第i天第j次采样的TVOC浓度的空间变异系数；
步骤（9），判定：当所有的CV ij 小于10%，且所有的CV ij空间均小于10%，则说明步骤（1）、步骤（2）和步骤（4）的构成的小鼠暴露方法适合作为研究烟气暴露啮齿类动物生物学效应的暴露方法，作为标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法；反之，则不适合作为研究烟气暴露啮齿类动物生物学效应的暴露方法，需要增加洁净空气的流量和/或调节卷烟烟气发生量，直至所有的CV ij 和CV ij空间均小于10%。
步骤（2）中，所述的洁净空气是空气经高效空气过滤器连续过滤3次所得。
步骤（3）中，在口鼻式暴露系统上，每个模块需随机选择2个采样孔作为检测孔。
步骤（4）中，口鼻式暴露系统上安装有多只小鼠，数量＜所有采样孔数量-检测孔数量-1。
步骤（5）中，采用TVA-1000B有毒挥发气体分析仪测量样品中TVOC浓度；连续5天进行采样测量，每天测量3次。
应用实例
如图1所示，一共有三个模块，每个模块随机选择了两个采样口，即A、B、C、D、E、F，作为检测孔。烟气稀释时，稀释的体积比为1：15、1：50、1：100三个配比。除此之外，其余步骤及参数与实施例3相同。其中，采用BALB/c小鼠，SPF级，北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0011，共计60只，雌雄各半，6周龄，体重18-22g，同性别动物体重范围为平均体重的±20%内。
采用市售的某牌号卷烟进行抽吸。第2天第2次采样测量得到的数据的计算结果如表1。
表1
从表1中，我们可以看出，1:15稀释的TVOC浓度的时间变异系数大于10%，说明该暴露方法不适合作为研究烟气暴露啮齿类动物生物学效应的暴露方法；而1:50和1:100稀释的所有的时间变异系数和空间变异系数均小于10%，此外，其余次采样的所有的时间变异系数和空间变异系数均小于10%，说明该暴露方法适合作为研究烟气暴露啮齿类动物生物学效应的暴露方法，能作为标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法。
现有方法大多数是以卷烟数量作为暴露剂量，进行生物学检测。本发明是将卷烟燃烧后在口鼻暴露系统TVOC浓度的均一性和稳定性作为考察指标，与现有方法相比动物吸入卷烟颗粒物的浓度准确、稳定，可减少动物由于吸入剂量的不同造成的个体差异，确保生物效应研究结果有良好的重现性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），卷烟烟气抽吸：
每支烟抽吸持续时间2-5s，抽吸频率30-60s，抽吸容量35.0-50ml/2s，抽吸口数4-6口，得到卷烟烟气；
步骤（2），烟气稀释：
将步骤（1）得到的卷烟烟气与洁净空气按体积比为1:10-1:100的配比稀释混匀，后进入口鼻式暴露系统；
所述的洁净空气是空气经高效空气过滤器过滤所得；
步骤（3），参考孔和检测孔设置：
在口鼻式暴露系统上，选择一个采样孔作为参考孔，同时，随机选择多个采样孔作为检测孔；
步骤（4），小鼠暴露：
将小鼠束缚在固定筒中适应15-30min后，将装有小鼠的固定筒安装在口鼻式暴露系统上除了采样孔的其余孔对应的位置上，内缸正压烟气气流进入动物鼻部，呼出气流从侧面被吸入外缸，平衡至少10min后进行采样；
步骤（5），采样：
通过步骤（3）选择好的参考孔和检测孔进行采样，之后测量所采样品的TVOC浓度；连续多天进行采样测量，每天采样测量多次；
步骤（6），检测孔数据标准化：
将步骤（5）检测孔所测量得到的TVOC浓度除以参考孔TVOC浓度，得到检测孔标准化TVOC浓度数据；
步骤（7），时间变异系数计算：
计算每次采样测量得到的TVOC浓度的时间变异系数CV ij ；计算公式如下：
CV ij =（所有检测孔第i天第j次采样测量得到的标准化TVOC浓度数据的标准差/所有检测孔第i天第j次采样测量得到的标准化TVOC浓度数据的均值）×100%，
CV ij 为第i天第j次采样的TVOC浓度的时间变异系数；
步骤（8），空间变异系数计算：计算出口鼻式暴露系统TVOC浓度的空间变异系数CV ij空间；计算公式如下：
(CV ij空间)2 =(CV总变异)2-(CV ij )2
其中，CV总变异=所有检测孔所有采样次数得到的标准化TVOC浓度数据的标准差/所有检测孔所有采样次数得到的标准化TVOC浓度的均值×100%；
CV ij空间为第i天第j次采样的TVOC浓度的空间变异系数；
步骤（9），判定：当所有的CV ij 小于10%，且所有的CV ij空间均小于10%，则说明步骤（1）、步骤（2）和步骤（4）的构成的小鼠暴露方法适合作为研究烟气暴露啮齿类动物生物学效应的暴露方法，作为标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法；反之，则不适合作为研究烟气暴露啮齿类动物生物学效应的暴露方法，需要增加洁净空气的流量和/或调节卷烟烟气发生量，直至所有的CV ij 和CV ij空间均小于10%。
2.根据权利要求1所述的建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法，其特征在于，步骤（1）中，抽吸采用十通道转盘式吸烟机。
3.根据权利要求1所述的建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的洁净空气是空气经高效空气过滤器连续过滤3次所得。
4.根据权利要求1所述的建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法，其特征在于，步骤（3）中，在口鼻式暴露系统上，每个模块需随机选择2个采样孔作为检测孔。
5.根据权利要求1所述的建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法，其特征在于，步骤（4）中，口鼻式暴露系统上安装有多只小鼠，数量＜所有采样孔数量-检测孔数量-1。
6.根据权利要求1所述的建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法，其特征在于，步骤（5）中，采用TVA-1000B有毒挥发气体分析仪测量样品中TVOC浓度。
7.根据权利要求1所述的建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法，其特征在于，步骤（5）中，每天测量3次。
8.根据权利要求1所述的建立标准化卷烟烟气小鼠口鼻暴露方法的方法，其特征在于，步骤（5）中，连续5天进行采样测量。
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