CN101382544B

CN101382544B - 卷烟烟气导致dna氧化损伤产生8-羟基脱氧鸟苷的测定评价方法及其应用

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Publication number: CN101382544B
Application number: CN2008101218501A
Authority: CN
Inventors: 储国海; 周国俊; 黄芳芳; 陈红君; 卢建忠
Original assignee: China Tobacco Zhejiang Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Zhejiang Industrial Co Ltd
Priority date: 2008-10-30
Filing date: 2008-10-30
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2028-10-30
Also published as: CN101382544A

Abstract

本发明涉及卷烟烟气毒理学研究领域，尤其涉及卷烟烟气导致DNA氧化损伤产生8-羟基脱氧鸟苷的测定评价方法和应用。卷烟烟气导致DNA氧化损伤产生8-OH-dG的测定评价方法，该方法包括以下的步骤：共价键固定DNA在磁珠微球表面；加入卷烟烟气或烟气吸收液，体外染毒固定化的DNA；磁珠分离去除烟气或烟气吸收液组分，保留氧化损伤的DNA；加入8-OH-dG抗体，与氧化损伤产生的8-OH-dG发生免疫反应；加入酶标第二抗体，与上述得到的产物反应；加入发光底物，高灵敏度化学发光法检测烟气损伤产生的8-OH-dG。本发明可以检测卷烟烟气对DNA的损伤，可以用来检测筛选中草药对卷烟烟气对DNA损伤的保护作用，研制和开发高效安全的中草药制剂降低卷烟的危害，为研制低危害卷烟提供理论支持。

Description

卷烟烟气导致DNA氧化损伤产生8-羟基脱氧鸟苷的测定评价方法及其应用

技术领域

本发明涉及卷烟烟气毒理学研究领域，尤其涉及卷烟烟气导致DNA氧化损伤产生8-羟基脱氧鸟苷的测定评价方法和应用。

背景技术

吸烟可产生大量的自由基、活性氧(ROS)，多环芳烃类物质，经CYP1A1活化成亲电子化合物，可攻击DNA，形成共价的DNA加合物，引起DNA碱基错配，DNA单链或双链断裂，导致DNA损伤，最终导致癌变(Poulsen，HE.，OxidativeDNA modifications，Exp.Toxicol.Pathol.，2005，57，161-169.)。DNA损伤与癌症、阿尔茨海默氏症和正常衰老过程等人类一切变化均有关联，DNA氧化损伤产物是指由ROS损伤DNA而产生的DNA加合物。在现已发现的二十几种DNA氧化损伤产物中，鸟嘌呤由于拥有的分子轨道具有较高的能级，因此最容易被氧化损伤，生成化学性质比较稳定的修饰核苷8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)。在复制过程中，DNA链上8-OH-dG可以与C以外的其它碱基配对形成点突变，被认为是氧化应激因素致癌、致突变的主要机理之一。(徐永俊，徐顺清，DNA氧化损伤生物标志物8-OH-dG的检测及其在医学中的应用，癌变畸变突变，2002，14，50-53)、(王云南，吕嘉春，曾波航等，8-羟基-脱氧鸟苷在肺癌发生和人支气管上皮细胞癌变过程中的作用中的作用，中国综合临床，2004，20，100-103。)。

由于8-OH-dG在体内能稳定存在，一旦形成不再被机体进一步代谢；而且8-OH-dG不能由细胞内外的dG通过非DNA氧化途径形成，组织细胞核DNA及线粒体DNA中8-OH-dG，可反应体内DNA氧化损伤。因此，8-OH-dG可以作为反映内源及外源因素对DNA氧化损伤的灵敏和稳定的生物标记物，能够用来估计癌症等多种疾病发生的危险性。各种致氧自由基形成物如Fenton型羟基自由基系统、X射线、γ射线、香烟焦油、香烟烟雾中的多环芳烃和烟草咀嚼残渣、石棉、氧化不饱和脂肪酸、柴油废气颗粒、化学致癌物如氧化物酶体系、黄曲酶毒素B1(AFB1)、N-亚硝基二乙胺等许多物质可经由不同的机理导致8-OH-dG的形成。在体内/外实验中，通过检测上述物质处理后的细胞或动物组织的8-OH-dG水平，可以评价这些物质的致癌性。对人体组织的研究也提示，分析人体白细胞、器官组织和尿液等标本的8-OH-dG水平可以评价个体肿瘤发生的危险性和研究与氧自由基有关的疾病。最新的研究热点有：袭著革等人(袭著革，李官贤，孙咏梅等，烹调油烟雾诱导核酸氧化损伤及其标志物8-羟基脱氧鸟苷的形成机制，环境与健康杂志，2003，20，259-262)研究了烹调油烟体外染毒小牛胸腺DNA，发现油烟冷凝物和挥发性有机物均能诱导DNA氧化损伤产生8-OH-dG；孙咏梅等人发现大气混杂污染物体外染毒小牛胸腺DNA，能诱导DNA氧化损伤产生8-OH-dG；Mikhailova M等人和Hirano T等人发现镉离子的存在能显著增加8-OH-dG的含量。Rusling JF研究小组发表了一系列研究工作，利用电化学法监控8-OH-dG的水平体外评价多种化学物质的毒性；孟紫强等人发现吸烟能诱发淋巴细胞DNA的氧化损伤，显著增加细胞DNA中8-OH-dG的含量，其中高敏感人群中吸烟者比不吸烟者8-OH-dG的含量可升高5倍以上，大大增加了基因突变甚至癌变的几率。Traber等人发现补充某些营养素能显著抑制吸烟引起的DNA损伤。

体外研究也表明：香烟烟雾中产生的大量超氧自由基和羟自由基能与小牛胸腺DNA反应，产生大量的加合物8-OH-dG，8-OH-dG的水平可以作为香烟烟雾暴露水平及其对DNA损伤的生物学标志物，可用于环境污染物与人类健康危险性评价研究。Phillips等于1988年在《Nature》杂志上提出吸烟可导致肺组织DNA加合物水平升高。香烟烟雾在体外就可产生大量的超氧自由基(O₂ ^-)和羟自由基(^-OH)，在分子水平上直接进攻DNA而产生大量的8—OH-dG或形成其它的DNA损伤形式，如DNA单链断裂(SSB)，DNA双链断裂(DSB)、交联等。8-OH-dG生成量在一定程度上反应了DNA受损伤的程度。Pilger等研究表明，和不吸烟的人群相比，吸烟人群尿中的8-OH-dG浓度明显著升高。孙咏梅等以DNA加合物8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)作为DNA氧化损伤的生物学标志物，研究了香烟烟雾成分对DNA生物氧化损伤。

中草药是我国的传统药物，在我国经过上千年的实践应用，具有高效、安全等特性，特别是很多中草药提取物在抗氧化、清除自由基保护机体免受伤害等方面具有重要作用。它对许多疾病有良好的疗效，它对许多疑难杂症的治疗效果远远好于西药，因此它日益受到全世界的关注，成为新的研究热点。通过研究中草药对卷烟烟气导致的DNA氧化损伤的保护作用，开发和利用高效安全的中草药制剂，降低烟气对机体DNA的氧化损伤，无疑具有十分重要的社会效益和经济意义。

发明内容

本发明的一个目的是建立卷烟烟气导致DNA氧化损伤产生8-OH-dG的测定评价方法。本发明的另外一个目的是采用上述的方法用来检测筛选中草药对卷烟烟气对DNA损伤的保护作用，研制和开发高效安全的中草药制剂降低卷烟的危害，为研制低危害卷烟提供理论支持。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

卷烟烟气导致DNA氧化损伤产生8-OH-dG的测定评价方法，该方法包括以下的步骤：

①共价键固定DNA在磁珠微球表面；

②加入卷烟烟气或烟气吸收液，体外染毒固定化的DNA；

③磁珠分离去除烟气或烟气吸收液组分，保留氧化损伤的DNA；

④加入8-OH-dG抗体，与氧化损伤产生的8-OH-dG发生免疫反应；

⑤加入酶标第二抗体，与上述得到的产物反应；

⑥加入发光底物，高灵敏度化学发光法检测烟气损伤产生的8-OH-dG。

作为优选，上述的8-OH-dG抗体为羊抗8-OH-dG，酶标第二抗体为HRP标记兔抗羊IgG。羊抗8-OH-dG先与磁珠表面DNA氧化损伤产生的标志物8-OH-dG特异性结合，然后磁珠表面结合的羊抗8-OH-dG与HRP标记的兔抗羊IgG特异性结合进行第二步免疫反应，通过HRP催化的鲁米诺与过氧化氢反应产生的发光信号强度表征结合在磁珠表面HRP的量，间接检测与HRP间接相连的DNA氧化损伤产生的标志物8-OH-dG。

作为优选，上述的步骤①为取羧基修饰的磁珠用咪唑缓冲液洗涤，磁座分离，吸去上清液；将洗涤后的羧基修饰的磁珠分散在溶有EDC的咪唑溶液中，于恒温振荡器中；反应后，将反应混合物平分于离心管中；然后在离心管中加入DNA，在恒温振荡器中反应；取出用洗涤液和水各洗一次后，每管加入封闭液I，恒温振荡器中反应；取出洗涤。

作为优选，上述的步骤②为在样品中加入烟气氧化6～12h；氧化后的样品用PBS洗涤后，用封闭液II封闭，磁座分离，吸出上清液。

作为优选，上述的步骤④加入羊抗8-OH-dG的PBS溶液，恒温振荡器中反应；步骤⑤洗涤液洗涤，再加入HRP标记兔抗羊IgG的PBS溶液，同样于恒温振荡器中反应，洗涤液洗涤。作为再优选，上述的步骤③羊抗8-OH-dG的稀释倍数为75000～150000倍；HRP标记兔抗羊IgG的稀释倍数为10000～40000倍。

作为优选，上述的步骤②烟气吸收液的制备方法为烟气通过滤片后气相部分用吸收液吸收；粒相物收集到滤片，然后将收集粒相物的滤片放入吸收液中，超声，离心，取上清液后待用。作为再优选，上述的吸收液采用(1)水；(2)PBS(pH7.2-7.4，0.1M，0.9％的NaCl)；(3)PBS-TW(PBS中含0.05％吐温20)；(4)PBS(K⁺)(pH7.4，50mM，含K⁺及0.9％的NaCl)；(5)PBS(K⁺)-TW(含0.05％吐温20)。最优选的吸收液采用磷酸盐缓冲液-吐温溶液(PBS-TW)。

本发明的另外一个目的是提供上述的测定评价方法用于有效降低DNA氧化损伤产生8-OH-dG的中草药的筛选。

上述的筛选方法是在步骤②加入卷烟烟气或烟气吸收溶液之前加入中草药溶液。

本发明由于采用了上述的技术方案，可以检测卷烟烟气对DNA的损伤，并研究了损伤产生8-OH-dG的信号与卷烟烟气量的关系。该方法可以用来检测筛选中草药对卷烟烟气对DNA损伤的保护作用，研制和开发高效安全的中草药制剂降低卷烟的危害，为研制低危害卷烟提供理论支持。

附图说明

图1为本发明的原理图。

图2为不同烟气及烟焦油吸收液对检测信号影响图表。

图3为烟气吸收液浓度对DNA损伤的影响图表。

图4为葛根素与大黄素对烟气引起DNA氧化损伤的影响图表。

具体实施方式

实施例1卷烟烟气导致DNA氧化损伤产生8-OH-dG的测定

一、试剂与仪器：

所有试剂均为分析纯，实验用水为去离子超纯水。pH6.0的咪唑缓冲液；0.1M的PBS，pH＝7.2-7.4；洗涤液为含有0.1％的吐温20的PBS；封闭液I为40mM甘氨酸，1％BSA的咪唑缓冲液；封闭液II为10％BSA的PBS。

N-(3-二甲基氨丙基)-N’-乙基-碳二亚胺盐酸盐(EDC)购于Sigma公司；HRP标记兔抗羊IgG购于北京博奥森生物技术有限公司；羊抗8-OH-dG购于abcam公司；HRP化学发光试剂盒购于Milipore公司；羧基修饰的磁性微球(1.5μm，BangsLaboratories，Inc.)；DNA(5’-GCC AAC AGC CAG TGG GAA ACA AAA AAAAAA-NH₂-3’)，由上海英骏生物技术公司合成。烟气：由Borgwaldt Technik公司的RM1/Plus吸烟机制得。

BPCL微弱发光测量仪(中国科学院生物物理研究所)；HZ-9211K恒温振荡器(太仓市科教器材厂)。

二、检测的方法：

1、烟气制备

将卷烟置于温度(22±1)℃、相对湿度(60±2)％的环境中平衡48h，挑选在平均重量±0.02g和平均吸阻±49Pa范围内的烟支为测试样品。在温度(22±2)℃、相对湿度(60±5)％的环境中及按ISO3308标准抽吸条件用吸烟机抽吸卷烟，每60s抽吸一次，每次抽吸持续2s，抽吸体积为35mL，。每个滤片收集5支卷烟的烟气粒相物。烟气按所需量通入到PBS-TW(PBS中含0.05％吐温20)烟气吸收液中，同样将收集粒相物的滤片放入上述收集液中，超声，离心，取上清液后稀释待用。

2、反应体系及方法

将羧基修饰的磁珠用咪唑缓冲液洗涤，磁座分离，吸去上清液，如此重复三次。将其分散在溶有EDC的咪唑溶液中，于37℃的恒温振荡器中。反应20min后，将反应混合物平分于12个离心管中，每管中加入1pmol的DNA，在37℃恒温振荡器中反应60min。取出用洗涤液和水各洗一次后，每管加入100μL封闭液I，于恒温振荡器中反应60min。取出用洗涤液和水各洗涤一次；在样品中加入相应的100μl烟气吸收溶液，氧化9-10h。氧化后的样品用PBS洗涤三次后，用封闭液II封闭60min，磁座分离，吸出上清液，加入抗8-OH-dG的PBS溶液(含2％BSA)，37℃恒温振荡器中反应60min。洗涤液洗涤，再加入HRP标记兔抗羊IgG的PBS溶液(含2％BSA)，同样于37℃恒温振荡器中反应60min，洗涤液洗涤三次。用HRP化学发光试剂盒于化学发光仪检测，发光信号由相连的工作站显示并记录。实施例2烟气吸收液的选择

选择烟气吸收液涉及到气液相溶的问题，虽有文献报道用DMSO收集烟气，但DMSO浓度过大会对DNA有毒性，故本实验选择条件温和的水相溶剂。为增加烟气中脂溶性成分在水相中的溶解性，在PBS中加入吐温，同时吐温的加入使得烟气通过吸收液时形成小的气泡，增加了烟气和吸收液的作用时间，使得吸收更加充分。考察了(1)水；(2)PBS(pH7.2-7.4，0.1M，0.9％的NaCl)；(3)PBS-TW(PBS中含0.05％吐温20)；(4)PBS(K⁺)(pH7.4，50mM，含K⁺及0.9％的NaCl)；(5)PBS(K⁺)-TW(含0.05％吐温20)等五种烟气吸收液对检测信号强度的影响，如图2所示，PBS溶液对焦油的溶解性能不好，导致对DNA的损伤不充分，而加了吐温的吸收液对DNA的损伤明显增加，各种吸收液中以PBS-TW的吸收液检测信号最高，说明PBS-TW对烟气及烟焦油有相对较强的溶解能力，吸收效果最好。故本发明中最优选的烟气吸收液选择PBS-TW。

实施例3不同烟气吸收液浓度对DNA损伤的影响

PBS-TW烟气吸收液在反应体系中的含量对DNA损伤产生8-OH-dG的影响。如图3所示，吸收液浓度越大，烟气量越多，携带活性物质含量越高，对DNA损伤越严重，理论上产生的8-OH-dG量也会增多，但图中显示烟气量超过2ml/mLPBS-TW以后信号降低，说明过量的氧化剂使得DNA受损严重以致链断裂，导致产生的8-OH-dG损失增多。研究同时发现，烟焦油对DNA的氧化损伤也呈现类似趋势。

实施例4 将实施例1所建立的方法应用于中草药对吸烟导致DNA氧化损伤的保护作用研究

分别考察了几种中草药对烟气引起DNA氧化损伤的影响。以葛根素与大黄素为例(如图4)，对照组为实施例1测得的数据，中草药组为在加入烟气吸收溶液之前加入中草药溶液。由图4可以看出，加入葛根素与大黄素反应组，产生的8-OH-dG均比对照组的少，说明这两种中草药对卷烟烟气导致的DNA氧化损伤有一定的保护作用。

Claims

1.卷烟烟气导致DNA氧化损伤产生8-OH-dG的测定评价方法在筛选有效降低DNA氧化损伤产生8-OH-dG的中药中的应用，其特征在于该方法包括以下的步骤：

①共价键固定DNA在磁珠微球表面

取羧基修饰的磁珠用咪唑缓冲液洗涤，磁座分离，吸去上清液；将洗涤后的羧基修饰的磁珠分散在溶有N-(3-二甲基氨丙基)-N’-乙基-碳二亚胺盐酸盐的咪唑溶液中，于恒温振荡器中；反应后，将反应混合物平分于离心管中；然后在离心管中加入DNA，在恒温振荡器中反应；取出用洗涤液和水各洗一次后，每管加入封闭液I，所述的封闭液I为40mM甘氨酸，1％BSA的咪唑缓冲液；恒温振荡器中反应；取出洗涤；所述的DNA的序列如下：5’-GCC AAC AGC CAG TGG GAA ACA AAA AAA AAA-NH₂-3’；

②加入烟气吸收液，体外染毒固定化的DNA

样品中加入中草药溶液，然后加入烟气吸收液氧化6～12h；氧化后的样品用PBS洗涤后，用封闭液II封闭，所述的封闭液II为10％BSA的PBS；磁座分离，吸出上清液；

所述的烟气吸收液制备如下：

将卷烟置于温度22±1℃、相对湿度60±2％的环境中平衡48h，挑选在平均重量±0.02g和平均吸阻±49Pa范围内的烟支为测试样品；

在温度22±2℃、相对湿度60±5％的环境中及按ISO3308标准抽吸条件用吸烟机抽吸卷烟，每60s抽吸一次，每次抽吸持续2s，抽吸体积为35mL，每个滤片收集5支卷烟的烟气粒相物；

烟气按所需量通入到PBS-TW烟气吸收液中，所述PBS-TW烟气吸收液为PBS中含0.05％吐温20，同样将收集粒相物的滤片放入上述烟气吸收液中，超声，离心，取上清液后稀释待用；

④加入羊抗8-OH-dG，与氧化损伤产生的8-OH-dG发生免疫反应

加入羊抗8-OH-dG的PBS溶液，羊抗8-OH-dG的稀释倍数为75000～150000倍；恒温振荡器中反应；

⑤洗涤液洗涤，再加入HRP标记兔抗羊IgG的PBS溶液，HRP标记兔抗羊IgG的稀释倍数为10000～40000倍；同样于恒温振荡器中反应，洗涤液洗涤；