CN101796937A

CN101796937A - 建立无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型的方法

Info

Publication number: CN101796937A
Application number: CN 201010109450
Authority: CN
Inventors: 赖克方; 陈莉延; 钟南山; 谢佳星
Original assignee: Guangzhou Institute Of Respiratory Disease; STATE KEY LABORATORY OF RESPIRATORY DISEASE; FIRST AFFILIATED HOSPITAL OF GUANGZHOU MEDICAL SCHOOL
Current assignee: Guangzhou Institute Of Respiratory Disease; STATE KEY LABORATORY OF RESPIRATORY DISEASE; FIRST AFFILIATED HOSPITAL OF GUANGZHOU MEDICAL SCHOOL
Priority date: 2010-02-05
Filing date: 2010-02-05
Publication date: 2010-08-11

Abstract

本发明公开了一种建立无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型的方法。该方法包括步骤：(1)小鼠的准备：SPF级雌性Balb/c小鼠，5～6周龄；(2)小鼠造模：在实验第0、7和14天分别用10μg鸡卵清蛋白+1.3mg氢氧化铝的生理盐水混悬液200μl给予小鼠腹腔内注射，进行致敏；在实验第21、22和23天对小鼠进行浅麻醉，予质量百分比浓度0.02％的鸡卵清蛋白溶液50ul进行滴鼻激发；(3)小鼠的处理：在末次激发24～48h后对小鼠进行创肺功能检测和支气管肺泡灌洗液细胞分类计数分析，收集小鼠的肺以观察肺组织学变化，即获得类似人类的无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症的小鼠模型。

Description

建立无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型的方法

技术领域

本发明属于应用基础医学研究领域，特别涉及一种建立无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型的方法。

背景技术

哮喘是世界范围内严重威胁人类健康的疾病，在我国大约有2亿人受到哮喘的困扰，如不能得到控制，将严重影响日常生活，甚至引起生命危险。气道高反应性和气道炎症是哮喘的两个主要病理生理学特征。气道高反应性是气道对各种刺激物产生严重的阻塞反应。刺激物多种多样，包括直接刺激物和间接刺激物，环境和基因均和气道高反应性机制有关。气道反应性检测已广泛应用于哮喘流行病学和临床研究的诊断和检测，目前已成为肺功能评估和哮喘治疗的重要参数。

1989年Gibson发现临床上有一类特殊的患者，表现为慢性刺激性干咳或咳少量粘液痰，诱导痰嗜酸粒细胞增高，糖皮质激素治疗效果良好，但患者肺通气正常，无气道高反应性，峰流速变异率正常，无法诊断为支气管哮喘，因此将这一类疾病定义为嗜酸粒细胞性支气管炎(EB)。2006年美国胸科医师协会咳嗽指南和2009年我国最新慢性咳嗽指南中均将EB作为独立疾病提出，其与哮喘的关系和自然转归受到了人们的关注。EB与哮喘痰液中嗜酸粒细胞都可以增高，其活化标志物嗜酸细胞阳离子蛋白浓度也明显增高，气道黏膜均有白介素-5、集落刺激-肿瘤坏死因子和2型辅助T细胞的基因表达，血管重建在EB和哮喘患者中均存在。为什么EB和哮喘具有相似的气道炎症和结构改变，但前者却不出现气道高反应性？EB的出现为研究气道高反应性发生机制提供了有利的工具。

关于EB的研究主要集中于临床患者，目前的研究主要涉及临床病学，临床表现，诊治和预后，有关机制的研究尚不深入。鉴于直接进行人体实验的局限性，有关病因的确定，发病机制的探索、治疗方法的评价、疾病的转归和新药的研发在很大程度上需要通过动物实验进行。因此建立无气道高反应性嗜酸粒细胞气道炎症动物模型对进一步研究EB的发病机制和哮喘气道高反应性的发生机理具有重要意义。

经检索目前国际上尚未建立确切的EB动物模型。仅有日本学者Ishiura提出了EB豚鼠模型的建立方法。但该模型使用多粘菌素滴鼻造模，不符合人类EB的流行病学情况。并且药物改变了豚鼠体内状态，可能影响最终的判断。另外该模型并非应用于与哮喘比较，因此不适用于气道高反应性机制的研究。而且豚鼠的生化免疫试剂非常少，今后的进一步研究受到了约束。因此该模型的应用受到极大限制，该学者发表文章后未见其他研究应用该模型。

目前小鼠模型中用于反映气道反应性的较为常用指标是无创肺功能检测的Penh(enhanced pressure，增高的压力)，但有研究认为该指标也有缺陷，容易受到很多因素如小鼠的运动、小鼠的潮气量、功能残气量以及气体的温度、湿度等的影响，结果不直观，很多情况下不能真正反映气道反应性。有创肺功能检查可以直接检测下气道功能，排除上气道阻力等因素对肺功能的影响，是目前国际公认的检测小动物肺功能的金标准。

发明内容

为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种建立无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种建立无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型的方法，包括以下操作步骤：

(1)小鼠的准备：雌性Balb/c小鼠，小鼠的年龄为6～10周龄，动物级别为SPF级；

(2)小鼠的模型制作：在实验第0、7和14天分别用10μg鸡卵清蛋白+1.3mg氢氧化铝的生理盐水混悬液200μl给予小鼠腹腔内注射，进行致敏；分别在实验第21、22和23天对小鼠进行浅麻醉后，给予质量百分比浓度为0.02％的鸡卵清蛋白溶液50ul进行滴鼻激发；

(3)小鼠的处理：在实验第23天进行滴鼻激发24～48小时后对小鼠进行创肺功能检测和支气管肺泡灌洗液细胞分类计数分析，并且收集小鼠的肺以观察肺组织学变化，即获得类似人类的无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症的小鼠模型。

步骤(1)所述小鼠的年龄优选6～7周龄。

本发明建立的小鼠模型与哮喘小鼠模型相比，滴鼻激发期间竖毛、呼吸急促和腹肌抽搐的表现减轻且较快恢复；支气管肺泡灌洗液白细胞分类计数显示和对照组比较嗜酸粒细胞(EOS)明显增高，与哮喘组相仿，提示小鼠气道嗜酸粒细胞性炎症形成；本发明建立的小鼠模型的基础气道阻力无明显变化，与对照组之间气道阻力无显著差异；提示本模型无气道高反应性产生。对本发明建立的小鼠模型进行肺组织形态学观察，与对照组相比，可见支气管、细支气管上皮下和小血管周围有炎性细胞浸润，以嗜酸粒细胞和淋巴细胞为主，上皮细胞轻度变性脱落，肺泡腔内渗出增加，可见组织细胞或巨噬细胞，间质充血水肿，但程度较哮喘小鼠模型减轻。

本发明的原理是：EB作为一种变态反应性疾病有与哮喘相似的病因和临床表现。有学者认为EB的气道嗜酸粒细胞浸润程度较轻，释放出相关的炎症介质较少，对气道上皮作用较弱。也可能是二者的基础反应不同、遗传易感性不同。Brightling认为，EB患者中与咳嗽密切相关的炎症介质(组胺和前列腺素D2)明显增加，与哮喘有关的炎症介质(半胱氨酸白三烯、嗜酸粒细胞阳离子蛋白等)没有区别。发明人在之前的研究中显示EB患者气道粘膜基底膜厚度显著低于哮喘患者，炎症细胞浸润程度低于咳嗽变异性哮喘患者。这些都提示EB和哮喘本质也许是一样的。因此发明人选择哮喘模型建立中常用的OVA进行致敏，通过低剂量激发试图得到无气道高反应性嗜酸粒细胞气道炎症的小鼠模型。本发明还采用气管插管和机械通气的有创方法，使用经典的小鼠气道阻力作为指标测定小鼠气道反应性变化，结合气道炎性细胞浸润情况，对哮喘气道反应性增高程度作出准确评价。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：本研究模型模仿成熟的小鼠哮喘模型制作方法，仅在激发阶段使用低剂量鸡卵清白蛋白滴鼻与哮喘不同之外，其它过程完全一致，从而减少了造模阶段的差异；使用鸡卵清白蛋白做为变应原，更能模拟人类哮喘的病因学变化，且与哮喘小鼠模型比较时有更好的操作背景；模型制作过程中小鼠气道反应性使用Buxco有创肺功能仪进行检测，是目前国际上检测小动物肺功能的金标准，检测方法和结果得到国际公认。模型制作之后得到的结果能够模拟人类EB疾病的主要病理生理学特点，即无气道高反应性，有气道嗜酸粒细胞性炎症，提示模型建立成功。该小鼠模型与小鼠哮喘模型的病理生理学特点仅存在气道反应性不同，在气道炎症方面具有相似的特点，排除了气道炎症在研究气道高反应性方面的干扰，为气道高反应性研究提供了较以往更好的动物模型。小鼠是目前应用最广的实验动物，因其广泛的分生、免疫组化试剂和基因操作手段，模型建立之后的后续研究将有广泛的适用范围。该模型是在国际上首次建立的无气道高反应性嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型，为EB的发病机制和气道高反应性的研究奠定了良好的基础，提供了广阔的前景。

附图说明

图1为小鼠支气管肺泡灌洗液分析图。

图2为小鼠气道反应性变化图。

图3为小鼠肺组织形态图，其中A为对照组小鼠肺组织病理图，B为模型组小鼠肺组织病理图，C为哮喘组小鼠肺组织病理图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)动物及分组：SPF级雌性Balb/c小鼠30只，6～7周龄，体重18～20g，广东省实验动物中心提供(购买日期：2009年7月16日；实验动物质量合格证明：No.0052732)，饲养于广州呼吸疾病研究所SPF级动物室，自由进食去卵白蛋白SPF级饲料和饮水，昼夜明暗交替12/12小时；随机分为生理盐水(NS)对照组、模型组和哮喘组，每组8只。

(2)试剂：鸡卵清蛋白(OVA，V级)，氢氧化铝溶液，乙酰甲胆碱(MCh)，均购自美国Sigma公司，用生理盐水配制MCh激发液，浓度为3.12mg/ml、6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml和50mg/ml。

(3)主要仪器：小鼠肺功能仪有创检测系统(RC System)，美国Buxco公司；普通光学显微镜，德国ZEISS公司。

(4)模型制备：哮喘组小鼠在实验第0、7、14天用10μg OVA+1.3mg氢氧化铝的生理盐水混悬液200μl，予小鼠腹腔内注射进行致敏；分别在实验第21、22和23天对小鼠浅麻醉后，予质量百分比浓度为0.4％的OVA溶液50ul滴鼻激发；在实验第23天进行滴鼻激发24小时后进行小鼠有创肺功能检测；对照组予0.2ml生理盐水(NS)进行致敏及50μl生理盐水进行滴鼻激发；模型组小鼠激发时改用质量百分比浓度为0.02％的OVA溶液50ul滴鼻激发，其余步骤同哮喘组。

(5)肺功能检测：Buxco小鼠肺功能仪有创肺阻抗法测定小鼠的气道反应性：对小鼠腹腔注射质量百分比浓度为1％的戊巴比妥钠60mg/kg进行麻醉，在第2和3环状软骨做横行切口，置入20G插管，将小鼠置于Buxco体描箱中，连接小动物呼吸机行机械通气；呼吸频率120次/分，潮气量10ml/kg；首先记录小鼠基础气道阻力(lung resistence，R_L)1min，随后盐水雾化激发了解OVA溶剂对气道的影响，盐水激发所得的肺阻力与基础肺阻力的比值增高超过10％的小鼠考虑其对盐水存在气道高反应性则弃去。之后测定以10ul倍增浓度的乙酰甲胆碱雾化激发后R_L的变化；每次雾化1min，记录3min。Mch激发浓度由低到高，依次为3.12mg/ml、6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml和50mg/ml，以Mch激发后R_L为评价指标。

(6)支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)分析：肺功能检测结束后，将气管插管内注入0.8ml磷酸盐缓冲液(PBS液)，注入3次，共2.4ml，反复抽吸3次后立即回收，回收率为80％。离心后细胞沉淀用1mlPBS液混匀，取10ul入血细胞计数板进行细胞总数测定，取100ul悬浮液涂片，苏木素&伊红(HE)染色，在光学显微镜下计数200个白细胞并进行分类。

(7)肺组织病理变化：BALF分析结束后，气管插管内注入质量百分比浓度为的4％多聚甲醛0.8ml行内固定，取全肺置于质量百分比浓度为4％多聚甲醛溶液中固定24小时以上；然后用常规石蜡包埋，HE染色，光学显微镜下观察肺组织病理变化，观察肺组织大体变化和炎症细胞浸润情况。

(8)统计学处理：应用SPSS12.0统计学软件，数据以

表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用最小显著差异法(LSD法)。

(9)结果：

喘息表现：哮喘组小鼠在滴鼻激发期间出现明显竖毛、呼吸急促和腹肌抽搐等表现。模型组和对照组小鼠的上述症状明显减轻且较快恢复正常。

BALF白细胞总数及分类：不同剂量OVA致敏后，BALF中的细胞总数明显增加，模型组和哮喘组同对照组比较有显著差异。分类计数中以EOS增加明显，中性粒细胞(Neu)和淋巴细胞(Lym)也有不同程度增高，巨噬细胞(Mac)显著下降(如图1所示)。

气道反应性变化：和对照组比较，哮喘组小鼠的基础气道阻力增高，模型组小鼠的基础气道阻力无明显变化；哮喘组的基础气道阻力和对照组及模型组比较均有增高，模型组和对照组之间的R_L无显著差异。经生理盐水激发后，各组的气道阻力增加值不超过10％。倍增浓度的Mch激发后，模型组和对照组比较无显著差异。在6.25mg/ml之后哮喘组与对照组及模型组比较气道反应性均明显增高，有显著差异(如图2所示)。

肺组织形态学观察：对照组小鼠肺组织结构清晰，肺泡壁、肺内支气管壁及血管周围无炎性细胞浸润，间质无充血水肿。哮喘组小鼠支气管、细支气管上皮下和小血管周围可见明显炎性细胞浸润，以EOS为主，上皮细胞轻度变性脱落，肺泡腔内渗出增加，可见组织细胞或巨噬细胞，间质充血水肿。模型组小鼠上述表现存在但较哮喘组减轻(如图3所示)。

本实验结果显示哮喘组小鼠基础肺阻力显著高于对照组和模型组，模型组和对照组的基础肺阻力无显著差异。生理盐水激发后气道阻力与基础肺阻力比较，三组均未超过10％，提示生理盐水作为MCh的溶剂对气道阻力基本无影响。倍增浓度的MCh激发后，在浓度大于6.25mg/ml的哮喘组与对照组比较气道反应性均明显增高，显示哮喘组小鼠出现气道反应性增高，模型成功建立。

模型组小鼠在各MCh浓度点气道反应性与对照组比较无显著差异，在MCh浓度大于6.25mg/ml时与哮喘组有显著差异，提示模型组小鼠无气道高反应性产生。

BALF显示模型组和哮喘组中细胞分类有明显变化，其中以EOS增高为主。肺组织病理显示模型组和哮喘组中均有炎症细胞浸润，以EOS和淋巴细胞为主，后者表现更加明显。

综上所述，应用腹腔注射OVA致敏结合小剂量OVA滴鼻激发的方法制备的小鼠模型，具有嗜酸粒细胞性气道炎症的病理生理特征，无气道反应性增高的气道表现，是一种较为理想的无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症动物模型，为进一步研究EB和哮喘之间的联系与区别奠定了实验基础。

目前我国学者在建立小鼠哮喘模型时多未检测小鼠气道反应性，仅通过气道炎症来判断小鼠哮喘模型的成立。本实验从另一方面说明仅通过BALF中EOS增高和肺组织病理炎症浸润改变并不能真正确定哮喘模型的成功，必须进行肺功能检测得到与对照组有意义的肺功能差异才是确定模型成功的依据。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种建立无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型的方法，其特征在于包括以下操作步骤：

2.根据权利要求1所述的一种建立无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型的方法，其特征在于：步骤(1)所述小鼠的年龄为6～7周龄。