CN104396880B - 一种湿热哮喘动物模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种湿热哮喘动物模型的建立方法,用高脂饲料喂养大鼠,并灌服大肠杆菌,造成大鼠湿热证型;在喂养高脂饲料期间用卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液对大鼠致敏;致敏后进行卵蛋白生理盐水溶液激发,得到湿热哮喘动物模型。本发明将传统哮喘动物模型与中医湿热证型动物模型有机结合,形成中医湿热证型哮喘动物模型,切合中医临床哮喘研究应用,方便中医平喘药物筛选的研究。
Description
技术领域
本发明涉及动物药理实验技术领域,特别涉及一种湿热哮喘动物模型的建立及检测方法。
背景技术
过敏性哮喘的病因和发病机制是外部抗原进入机体后引起的I型变态反应。而根据外来抗原进入机体导致I型变态反应这个基本原理而制备的动物模型已经成为研究平喘药品与生物制品的安全性评价及有效药品的筛选等实验方面的重要工具。哮喘的发生多为宿疾内伏于肺,遇外感、饮食、情志、劳倦等诱因而引发,以致痰阻气道、肺失肃降致病。然而由于气候的变化和饮食结构改变,肥甘厚腻辛辣煎炸饮食者众,而使肠胃积湿积热,发病后不论外感内伤多从湿化热,湿与热合,缠绵难愈。肺与大肠相表里,肺气肃降有助于大肠传导功能的发挥,大肠传导功能正常,则有助于肺气的肃降。肠胃湿热可影响肺之肃降功能而致胸满咳喘。基于此可以看出,目前哮喘临床特征和病理特点受诸多因素的影响,单纯以外来抗原复制的哮喘中医模型与中医哮喘临床辨证难以完全匹配。因此单纯外来抗原诱导复制的动物模型无法体现中医辨证思想的优势,也不适合中医哮喘临床证型的研究。
儿童哮喘患者在哮喘人群中占有较大的比例,并且随着社会的发展,儿童哮喘人数有增加的趋势。随着人们生活水平不断提高,现今的青少儿摄入过多的脂肪和蛋白,且活动量比以往减少,出现肥胖率增长的倾向。儿童因生理病理有别于成人,肺脾不足,且为纯阳之体,不论外感湿热之邪,或饮食不节,过食膏粱厚味,脾失健运,湿热内生,大肠传导失司,部分患儿易表现为病情迁延,咳喘痰多,伴腹胀、恶心、呕吐,大便粘腻,舌红苔黄厚腻,这种饮食情况和生活方式使青少儿的体质中医辨证属于湿热证候。该因素在患儿罹患哮喘疾病过程中有相关性。而传统的哮喘模型仅考虑外部抗原的因素,无法将湿热因素纳入到模型当中,因此无法准确将中医辨证论治思想贯彻执行于动物实验研究过程中,更无法体现中药辨证组方应用实际意义。因此,研究将儿童湿热性体质因素纳入到哮喘动物模型的建立之中,对开展中医药在儿童哮喘药物的药效学研究更有实际意义,并推进中医治疗哮喘药物的技术进步。
而将成功的中医证候动物模型与哮喘动物模型相结合是一种行之有效的方式,适应中医临床需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种湿热哮喘动物模型的建立方法,采用该方法能够得到具有湿热症状的哮喘动物模型,更加接近于当今儿童体质,更利于儿童哮喘湿热证型的研究。
本发明建立大鼠的湿热哮喘动物模型,为进行中医哮喘湿热证型研究提供动物模型,并可进一步拓展应用于哮喘的防治技术的使用。
本发明是这样实现的:
一种湿热哮喘动物模型的建立方法,其特征是:用高脂饲料喂养大鼠,并灌喂大肠杆菌,造成大鼠湿热证型;在喂养高脂饲料期间用卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液对大鼠致敏;致敏后进行卵蛋白生理盐水溶液激发,得到湿热哮喘动物模型。
上述湿热哮喘动物模型的建立方法,具体包括以下步骤:
(1)在正常喂养的同时,于每日上午和夜间对大鼠分别灌胃高脂饲料,用量为2ml/只,连续喂养14天;
(2)在第12天进行大肠杆菌灌服,用量为2ml/只,灌服大肠杆菌后12h再次灌服大肠杆菌,用量为1ml/只;
(3)从第13天开始将大鼠放入温度31-35℃、相对湿度92-98%的环境中造模3天,每天8小时;
(4)分别在第7天和第14天用10%卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液对大鼠进行致敏,致敏方式为:将1ml混悬液对大鼠腹腔进行注射或者将2ml混悬液对大鼠进行灌胃;
(5)从第16天开始将大鼠放入雾化箱中,使大鼠吸入2%卵蛋白生理盐水溶液激发哮喘,每日一次,每次30min,连续7d;激发过程中大鼠出现哮喘发作症状,湿热哮喘造模成功。
上述建立方法中,所述高脂饲料由猪油、白糖、奶粉、蛋黄按照1:1:1: 1的质量比配制而成。
上述建立方法中,步骤(2)中,灌服的大肠杆菌的浓度为109个/ ml。
上述建立方法中,10%卵清蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液由以下成分组成:卵蛋白100mg,氢氧化铝100mg,生理盐水1m1。
上述建立方法中,2% 卵蛋白生理盐水溶液由以下成分组成:卵蛋白2g,生理盐水100ml。
上述建立方法中,所用大鼠为SPF级大鼠,体重140-160g,月龄1-1.5月。
上述建立方法中,所述大肠杆菌为侵袭性大肠杆菌。
上述建立方法中,哮喘症状包括烦躁、不停抓挠头面部,呼吸加快和紫绀中的至少一种。
本发明针对现有哮喘模型针对性低的问题,针对现今儿童体质普遍存在湿热症状的特征,将中医湿热证型动物模型引入哮喘模型中,通过对造模参数的大量筛选,研制出了本发明适合于现今生活状态下的青少儿的动物哮喘模型,该模型能更好的反应出现今儿童哮喘的特点,对儿童哮喘药物的研究更加有益。本发明并非简单的将湿热证模型和哮喘模型进行简单的叠加,还针对这两种方法的结合对建模参数都进行了优化和调整,使这两种方法能很好的搭配在一起,不会出现相互抵触和矛盾的问题。例如将湿热环境与致敏步骤进行重叠保证大鼠对于过敏原的敏感性,也使试验时间缩短减少其他不稳定因素干预的机会。将细菌接种、湿热环境和卵蛋白激发紧密衔接来模拟患儿外感加湿热诱发哮喘的过程。此外,本发明方法造模成功率高,模型重复性好,造模过程中大鼠死亡率低,能够大批量获得动物模型。
本发明将传统哮喘动物模型与中医湿热证型动物模型有机结合,形成中医湿热证型哮喘动物模型,切合中医临床哮喘研究应用,方便中医平喘药物筛选的研究。
附图说明
图1为正常对照组的HE染色图。
图2为湿热哮喘模型组的HE染色图。
具体实施方式
为了更好的解释本发明,下面对具体的建模过程进行详细的描述。
实施例1
1、所需材料
1.1 实验动物
SPF级大鼠20只(山东中医药大学实验动物中心,许可证号:SCXK(冀)2008-1-003,合格证编号:1011003)体重150士10g,月龄1-1.5月左右。
1.2实验药品
卵清蛋白干粉:OVA(Ovalbumin), 1g/瓶, 5g/瓶,北京鼎盛昌盛生物技术有限责任公司公司分装,临用前配置成10%和2%溶液。
侵袭性大肠杆菌干燥菌种:购于山东省卫生防疫站菌种室,菌号8099。
氢氧化铝粉剂:分析纯AR, 500g/瓶,天津恒兴化学试剂制造有限公司,生产口期:2013年3月01日。
水合氯醛:分析纯AR, 250g/瓶,天津市科密欧化学试剂有限公司,批号201001100,临用前用生理盐水配制成10%的溶液置4 0℃冰箱备用。
1.3 高脂饲料
高脂饲料的配制方法:猪油,白糖,奶粉,蛋黄根据1:1:1:1的质量比配制。
1.4 仪器设备
超声雾化器:S666F型超声雾化器,北京芬道实验器材有限公司生产。
电子天平:赛多利斯科学仪器(北京)有限公司,型号,BSA124S。
数字肛温计:上海华辰医用仪表有限公司。
离心机:湖南仪器仪表总厂离心机厂,型号,GL20A。
光学显微镜:奥林巴斯CHC双目生物显微镜。
温箱:电热恒温水浴箱DHG-9031,上海。
1.5实验试剂
大鼠IL-2 ELISA试剂盒:上海研辉生物科技有限公司;
大鼠IL-4 ELISA试剂盒:上海研辉生物科技有限公司;
大鼠IL-5 ELISA试剂盒:上海研辉生物科技有限公司;
大鼠IL-6 ELISA试剂盒:上海研辉生物科技有限公司;
大鼠IFN-γELISA试剂盒:上海研辉生物科技有限公司;
HE染液:广州威佳生物科技有限公司。
2、方法
2.1动物分组
大鼠称重,随机(随机数字表法)分为正常对照组、湿热哮喘模型组,每组10只。
2.2湿热证哮喘模型的建立
造模时,湿热造模和哮喘造模有机的结合、重叠进行。
2.2.1湿热证型造模
实验开始,在正常喂养的同时,模型组于每日上午(10时)和夜间(20时)分别灌胃高脂饲料,用量2ml/只,连续喂养14天;正常对照组相同时间给与生理盐水灌胃,2ml/只。
在实验第12天模型组进行大肠杆菌灌服(浓度109个/ml),用量为2ml/只,灌服12h后再加强灌服大肠杆菌(浓度109个/ml),用量为1ml/只。
从实验第13天开始将模型组大鼠放入温度(33±2)℃,相对湿度(95±3)%中造模3d,每天8h。
2.2.2哮喘模型造模
在实验第7天和第14天用10%卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液(100mg卵蛋白+100mg氢氧化铝+1m1生理盐水)对模型组大鼠进行致敏;致敏方式为:用1ml10%卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液对大鼠腹腔注射致敏,或者用2ml10%卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液对大鼠灌服致敏。
哮喘模型激发:从实验第16天开始将模型组大鼠放入密闭有机玻璃雾化箱中,使大鼠吸入2%卵蛋白生理盐水溶液(卵蛋白2g,生理盐水100ml)激发哮喘,每日1次,每次30min,连续7d。正常对照组组则给予生理盐水雾化吸入。激发过程中模型组大鼠出现烦躁、不停抓挠头面部,呼吸加快、紫绀等哮喘发作等症状为哮喘造模成功。
3、湿热证哮喘模型各性能指标检测
3.1标本采集
最后一次激发后24内以10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉,腹主动脉取血5ml;4℃5000 r/min离心, 15 min后提取血清,置-80℃低温冰箱待测。打开胸腔采集左肺上叶,浸泡于10%福尔马林液体中待测。
3.2观查指标
3.2.1一般指标观察:自造模之日起,观察并记录两组大鼠体温、体重、食量、饮水量、症状和舌苔的变化。
3.2.2标本检测
ELISA法测定大鼠血清IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ水平,步骤参照试剂盒说明书。进行大鼠肺组织常规HE染色:10%甲醛固定常规脱水,透明,浸蜡包埋,制作蜡块,分别进行HE染色。
3.3统计方法
采用spss17.0软件进行分析,计量资料采用方差分析,计数资料采用秩和检验。
P<0.05表示差异具有统计学意义。
3.4结果
3.4.1一般指标
3.4.1.1体重,如表1所示:
从上表可以看出,常温环境饲养下,模型组大鼠体重增长较快,实验第7天、第13天模型组大鼠体重显著高于空白组(P<0.05)。第13-15天进入湿热环境造模后,模型组大鼠体重增长缓慢,模型组大鼠体重增长值低于空白组大鼠体重增长值,但模型组大鼠体重仍高于空白组。实验第19天,测量两组大鼠体重无显著差异(P>0.05)。至第23天,模型组大鼠体重显著低于空白组大鼠体重(P<0.05)。
3.4.1.2体温,如表2所示:
从上表可以看出,常温环境饲养下,所有大鼠体温均稳定在37.6℃左右,体温差异无统计学意义(P>0.05)。灌服大肠杆菌后,第13天模型组大鼠体温出现显著升高,偏离正常温度,平均38.6±0.17℃左右,显著高于空白组(P<0.01)。湿热环境期间,模型组大鼠体温均高于空白组(P<0.05),湿热环境结束后,模型组大鼠体温渐趋回复,到第19天,模型组大鼠体温开始下降,至试验结束,模型组大鼠体温持正常体温。
3.4.1.3饮食量,如表3所示:
从上表可以看出,常温环境饲养下,所有大鼠均采食活跃,模型组大鼠饮食与空白组饮食无统计学意义。第12天大肠杆菌灌胃和进入湿热环境后,与空白组大鼠相比,模型组大鼠饮食量显著减少(P<0.01)。移出湿热环境,模型组大鼠饮食逐渐增多,至实验结束,模型组大鼠饮食量仍显著低于空白组(P<0.05)。
3.4.1.4饮水量,如表4所示:
从上表可以看出,常温环境饲养下,两组大鼠饮水量差异无统计学意义,湿热造模开始后,与空白对照组相比,模型组大鼠饮水量显著减少(P<0.01)。湿热环境造模结束后,模型组大鼠饮水量有所升高,但仍低于空白组,差异有统计学意义(P<0.05)。持续至实验结束,模型组大鼠饮水量持续低于空白对照组。
3.4.2症状观察
常温环境饲养下,所有大鼠均状态良好,行动灵活,采食活跃,正常对照组大鼠毛色光泽,食欲好,活动正常;模型组大鼠体重增长较快,大便粘滞较软。第7天首次卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液致敏后,模型组大鼠开始出现倦卧、食少等表现。第12天灌服大肠杆菌后,出现不同程度的发热、大便粘滞或溏泄。第13天进入湿热环境后,模型组大鼠体温出现显著升高,显著高于对照组(P<0.01)。进入湿热环境造模约10分钟后,模型组大鼠开始出现躁动,活动增加,攀爬笼壁,呼吸急促,颈部、背部、胸部毛发开始湿润等症状;约1h后进入安静状态,活动减少,散在静卧,偶有仰卧,腹部皮肤潮红,全身毛发湿润,至移出湿热环境,大鼠持续安静状态,未见活动、饮水量增加;回到室温后,约1 h恢复常态。进入湿热环境后,模型组大鼠出现大便溏泄或粘腻加重的症状,饮食量、饮水量较对照组大鼠均减少,渐见肛周污秽、红肿,倦怠,反应迟钝。第14天再次致敏后,模型组大鼠出现烦躁、呼吸加快、腹式呼吸,两只大鼠因过敏性休克死亡,约40min后,模型组大鼠呼吸渐趋平稳。哮喘激发开始,2min左右模型组大鼠即开始出现烦躁、不停抓挠头面部,打喷嚏;9min左右出现呼吸加快、加深、静伏不动、弓背,严重者伸颈、缩胸、收缩呈喘息状,呼吸加快、紫绀等哮喘发作症状。随造模时间推移,模型组大鼠逐渐毛发蓬松,颜色枯稿。
3.4.3舌苔变化
实验开始后,模型组大鼠逐渐出现腻苔,至第10天,约6只老鼠出现薄腻苔。灌服大肠杆菌之后,第14天,腻苔出现率达100%,至15天结束,模型组大鼠腻苔出现高峰,舌苔厚腻略黄。至试验结束,模型组大鼠舌苔持续腻苔。
3.4.4运用ELISA 检测大鼠血清IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ情况,见表5。
从表中可以看出,模型组中代表TH-2细胞的炎症因子IL-4、IL-5、IL-6浓度增高,代表TH-1细胞的炎症因子IL-2、IFN-γ浓度降低。
3.4.5肺组织HE染色结果
HE染色显示:正常组支气管壁光滑、完整,肺组织及气道、血管周围未见炎性细胞浸润;模型组均出现严重的气道粘膜破坏,炎症细胞侵润,气道和肺泡上皮细胞严重坏死脱落,肺组织及气道、血管周围大量炎性细胞和血细胞浸润。
正常对照组和湿热哮喘模型组HE染色情况见图1和图2。
4、结论
由上可知:本发明造模方法是可行的,能很好的反应出哮喘情况,该方法得到的动物模型切合中医临床湿热哮喘研究应用,方便中医湿热原因平喘药物筛选的研究。
实施例2
采用上述实施例1的方法连续进行10批动物模型建立,每批建模大鼠20只。建模过程中,共有8只大鼠死亡,死亡时间集中在放入人工气候箱期间。造模结束后,对存活小鼠按照实施例1的方法对动物模型进行各性能指标检测,结果显示100%的存活大鼠表现出很好的湿热哮喘症状特征,表示模型建立成功。
由此可以看出,本发明方法成功率高,重现性好,大鼠死亡率低,具有推广价值。
Claims (7)
1.一种湿热哮喘动物模型的建立方法,其特征是:用高脂饲料喂养大鼠,并灌服大肠杆菌,造成大鼠湿热证型;在喂养高脂饲料期间用卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液对大鼠致敏;致敏后进行卵蛋白生理盐水溶液激发,得到湿热哮喘动物模型;
具体包括以下步骤:
(1)在正常喂养的同时,于每日上午和夜间对大鼠分别灌胃高脂饲料,用量为2ml/只,连续喂养14天;
(2)在第12天进行大肠杆菌灌服,用量为2ml/只,灌服大肠杆菌后12h再次灌服大肠杆菌,用量为1ml/只;
(3)从第13天开始将大鼠放入温度31-35℃、相对湿度92-98%的环境中造模3天,每天8小时;
(4)分别在第7天和第14天用10%卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液对大鼠进行致敏,致敏方式为:将1ml混悬液对大鼠进行腹腔注射或者将2ml混悬液对大鼠进行灌胃;
(5)从第16天开始将大鼠放入雾化箱中,使大鼠吸入2%卵蛋白生理盐水溶液激发哮喘,每日一次,每次30min,连续7d;激发过程中大鼠出现哮喘发作症状,湿热哮喘造模成功;
10%卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液由以下成分组成:卵蛋白100mg,氢氧化铝100mg,生理盐水1m1。
2.根据权利要求1所述的湿热哮喘动物模型的建立方法,其特征是:所述高脂饲料由猪油、白糖、奶粉、蛋黄按照1:1:1: 1的质量比配制而成。
3.根据权利要求1所述的湿热哮喘动物模型的建立方法,其特征是:步骤(2)中,灌服的大肠杆菌的浓度为109个/ ml。
4.根据权利要求1所述的湿热哮喘动物模型的建立方法,其特征是:2% 卵蛋白生理盐水溶液由以下成分组成:卵蛋白2g,生理盐水100ml。
5.根据权利要求1所述的湿热哮喘动物模型的建立方法,其特征是:所用大鼠为SPF级大鼠,体重140-160g,月龄1-1.5月。
6.根据权利要求1所述的湿热哮喘动物模型的建立方法,其特征是:所述大肠杆菌为侵袭性大肠杆菌。
7.根据权利要求1所述的湿热哮喘动物模型的建立方法,其特征是:哮喘症状包括烦躁、不停抓挠头面部、呼吸加快和紫绀中的至少一种。
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