CN103110959A - 一种甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒在制备治疗过敏性哮喘药物中应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种DGKα(甘油二酯激酶α)基因-壳聚糖纳米粒作为唯一有效成分在制备治疗过敏性哮喘药物中的应用以及一种DGKα基因-壳聚糖纳米粒的制备方法。本发明针对裸DGKα质粒易被体内的核酸酶、酸和碱等破坏的缺点，利用壳聚糖制备了DGKα基因-壳聚糖纳米粒，能有效保护DGKα质粒，增强DGKα质粒在体内的活性，促进DGKα基因在体内更好地发挥作用。DGKα具有诱导T细胞无能的作用，能诱导免疫耐受。本发明制备的DGKα基因-壳聚糖纳米粒能抑制卵蛋白诱发的哮喘小鼠的气道炎症，降低血清卵蛋白特异性IgE水平，有望应用于哮喘等变态反应性疾病的治疗。

Description

一种甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒在制备治疗过敏性哮喘药物中应用

技术领域

本发明属于生物医药制剂领域，特别涉及一种甘油二酯激酶α(DGKα)基因-壳聚糖纳米粒在制备治疗过敏性哮喘药物中应用。

背景技术

哮喘是一种慢性气道变态反应性炎症性疾病，CD4+T细胞的过度活化在哮喘的发病中具有重要作用。CD4+T细胞活化后向Th2细胞分化增多，Th2细胞的过度活化导致了Th2反应为主的免疫反应，Th2型细胞因子IL(白细胞介素)-4、IL-5和IL-13等分泌增多，最终导致嗜酸性粒细胞等炎症细胞在气道聚集，引起气道变态反应性炎症。研究表明，正常人反复接触过敏原后，过敏原的刺激不会导致抗原特异性T细胞过度活化而始动发病过程。而哮喘患者，气道抗原呈递细胞摄取和提呈过敏原给T细胞后，促使T细胞过度活化和增殖，始动哮喘的发生。因此免疫耐受机制的缺陷和障碍是哮喘的主要发病机制。诱导机体对抗原特异性免疫耐受目前已成为防治哮喘的新途径。

近年来许多研究发现，DGK(甘油二酯激酶)在调节免疫细胞的免疫功能中起重要作用。甘油二酯和磷脂酸是重要第二信使，可直接或者分解为各种信号后参与多种免疫细胞的信号传导。DGK能使甘油二酯磷酸化生成磷脂酸，调节甘油二酯和磷酸脂的平衡，在调节免疫功能中起重要作用。DGKα(甘油二酯激酶α)是DGK的一个亚型，为I型DGK，T细胞高度表达DGKα。

T细胞无能是外周免疫耐受主要机制之一。T细胞无能是指T细胞的功能性无反应或者失活。无能T细胞不能分泌IL-2，不能增殖。Zha等[Zha Y，MarksR，Ho AW，et al.T cell anergy is reversed by active Ras and is regulated bydiacylglycerol kinase-a.Nat Immunol.2006；7(11)：1166-1173.]研究组发现无能T细胞过度表达DGKα，表达量为正常静息T细胞5～10倍。Sanjuan等[Sanjuan MA，Jones DR，Izquierdo M，et al.Role of diacylglycerol kinase alpha in theattenuation of receptor signaling.J Cell Biol.2001：153，207-220.Sanjuan MA，Pradet-Balade B，Jones DR，et al.T cell activation in vivo targets diacylglycerolkinase to the membrane：a novel mechanism for Ras attenuation.J Immunol，2003，170：2877-2883.]研究发现转染DGKα基因的T细胞过度表达DGKα，抑制甘油二酯依赖的T细胞受体(TCR)信号，从而减弱Ras激活信号和抑制ERK磷酸化，抑制了IL-2启动子的活性，减弱T细胞活化信号CD69表达，导致T细胞无能。Olenchock等[Olenchock BA，Guo R，Carpenter JH，et al.Disruption ofdiacylglycerol metabolism impairs the induction of T cell anergy.Nat Immunol.2006；7(11)：1174-1181.]研究发现DGKα缺陷的T细胞在诱导T细胞无能的条件下仍能增殖并分泌IL-2，RAS活性、ERK磷酸化等细胞增殖信号表达增强。因此，DGKα能将甘油二酯磷酸化为磷脂酸，抑制甘油二酯介导的TCR信号活化，抑制T细胞过度活化，诱导T细胞无能，在T细胞免疫耐受中起重要作用。DNA疫苗是治疗哮喘的常用方法，DGKα基因的DNA疫苗是否可通过诱导免疫耐受治疗哮喘尚不清楚。

壳聚糖是一种从甲壳类动物提取制备的生物可降解性多糖，是自然界唯一的带正电荷的碱性氨基阳离子多糖，无毒，无致突性，毒副作用小。壳聚糖溶于弱酸水溶液后具有高粘性且带正电，可与带负电荷的DNA相互作用形成壳聚糖-DNA纳米粒，DNA被封入壳聚糖内，不被体内的酸、碱和核酸酶所破坏，提高DNA生物利用性[Mao HQ，Roy K，Troung-Le VL，et al.Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers：synthesis，characterization andtransfection efficiency.J Control Release.2001；70(3)：399-421.]。同时，壳聚糖-DNA纳米粒表面带正电，而机体细胞表面带负电，壳聚糖纳米粒可粘附在细胞表面，从而促使DNA在细胞摄取作用下进入细胞，可以实现安全有效的靶向性基因治疗[Lavertu M，Méthot S，Tran-Khanh N，et al.High efficiency genetransfer using chitosan/DNA nanoparticles with specific combinations ofmolecular weight and degree of deacetylation.Biomaterials.2006；27(27)：4815-4824.]。而且，壳聚糖具有缓释作用，在体内可以缓慢释放所包封的DNA或者药物，壳聚糖本身可以完全降解并代谢，其分解产物和降解产物均对人体健康无害。因此，壳聚糖是一种优良的基因载体，可增强DNA疫苗等基因药物的治疗作用。目前尚未见有关DGKα基因-壳聚糖纳米粒的制剂的相关报道，以及壳聚糖包裹DGKα基因应用于哮喘治疗的报道。

发明内容

本发明提供了一种甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒在制备治疗过敏性哮喘药物中应用以及甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒的制备方法。

本发明提供的技术方案为：

一种甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒在制备治疗过敏性哮喘药物中应用，所述甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒作为唯一有效成分在制备治疗过敏性哮喘药物中的应用。

甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒在制备减轻哮喘气道炎症药物中的应用。

甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒在制备降低哮喘血清中过敏原特异性IgE和支气管肺泡灌洗液中白细胞介素-4和白细胞介素-5药物中的应用。

一种甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒的制备方法，包括：

步骤1、制备甘油二酯激酶α质粒：全基因合成小鼠白细胞介素-2信号肽序列和小鼠甘油二酯激酶α基因的融合基因，克隆到pEGFP-N3载体而制备得甘油二酯激酶α质粒；

步骤2、将壳聚糖溶解于1％醋酸水溶液，配制成浓度为0.5～2.5mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用NaOH将其pH值调节在5.5～5.7之间，无菌膜过滤，其中所述壳聚糖的分子量在2～60万道尔顿之间，其脱乙酰度在90％～95％之间，所述无菌膜的孔径为0.22μm；

步骤3、将所述甘油二酯激酶α质粒溶解在浓度为10～25mM的经孔径为0.22μm的无菌膜过滤的无水硫酸钠溶液中，制备得浓度在100～360μg/ml之间的甘油二酯激酶α质粒溶液。其中，步骤2中所述壳聚糖醋酸溶液中的氨基摩尔数与所述甘油二酯激酶α溶液中的磷酸酯基摩尔数之比≥5；

步骤4、所述的甘油二酯激酶α质粒溶液和所述壳聚糖醋酸溶液在温度在55℃～57℃之间的水浴中加热10～15min；

步骤5、在漩涡震荡的条件下，按体积比1∶1的比例，将经水浴加热后的所述甘油二酯激酶α溶液缓慢匀速加入到经水浴加热后的所述壳聚糖醋酸溶液中，旋涡振荡30～60s，室温静置，既得甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒溶液。

优选的是，所述的甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒的制备方法中，所述步骤5中的甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒溶液的保存温度为4℃。

优选的是，所述的甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒的制备方法中，本方法制备得的甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒溶液中的甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒的粒径在150nm～500nm之间，其中粒径在150nm～300nm之间的甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒占60％以上。

过敏性哮喘是临床常见病和多发病，近年来发病率呈上升趋势，它是一种慢性气道变态反应性炎症性疾病，CD4⁺T细胞的过度活化在哮喘的发病中具有重要作用。CD4⁺T细胞活化后向Th2细胞分化增多，Th2细胞的过度活化导致了Th2反应为主的免疫反应，Th2型细胞因子IL(白细胞介素)-4、IL-5和IL-13等分泌增多，最终导致嗜酸性粒细胞等炎症细胞在气道聚集，引起气道变态反应性炎症。研究表明，正常人反复接触过敏原后，过敏原的刺激不会导致抗原特异性T细胞过度活化而始动发病过程。而哮喘患者，气道抗原呈递细胞摄取和提呈过敏原给T细胞后，促使T细胞过度活化和增殖，始动哮喘的发生。因此，免疫耐受机制的缺陷和障碍是哮喘的主要发病机制。

诱导机体对抗原的免疫耐受是目前防治哮喘的新途径。DGKα(甘油二酯激酶α)具有诱导T细胞无能的作用，能诱导免疫耐受。若将DGKα质粒疫苗注入体内，体内的免疫细胞摄取DGKα质粒并长期表达DGKα蛋白，可能通过诱导机体对变应原的免疫耐受，从而达到治疗哮喘的作用。但裸DGKα质粒进入体内后易被组织内的核酸酶、酸和碱等降解，且机体对吸收差，导致其免疫活性显著降低。构建能有效保护DNA疫苗并能被组织更好吸收的DNA疫苗运载体系是非常重要的。

本发明建立一种过敏性哮喘小鼠的模型，此模型验证了DGKα基因-壳聚糖纳米粒可降低哮喘小鼠的气道炎症，为DGKα基因-壳聚糖纳米粒可应用于哮喘等变态反应性疾病的治疗提供了有力的实验模型。

本发明还提供了一种DGKα基因-壳聚糖纳米粒的制备方法。该制备方法中采用了壳聚糖作为载体，包裹DGKα，保护了DGKα在生物体内不被酸、碱和核酸酶所破坏，制备出高活性和高稳定性的DGKα基因-壳聚糖纳米粒，提高了DGKα的生物利用性，实现安全有效的靶向性基因治疗。其中，目前，采用复凝聚法，根据壳聚糖的阳离子特性与DNA的阴离子特性，将两者直接结合形成纳米粒子。但是多以低浓度壳聚糖(0.05-0.5mg/ml)与低浓度DNA溶液(40-100μg/ml)相互作用。本发明将壳聚糖和DNA溶液浓度均显著提高，比较而言，本发明显著提高DGKα基因-壳聚糖纳米粒的得率，且尺寸仍在纳米级范围。

附图说明

图1为DGKα基因-壳聚糖纳米粒的粒径检测结果。

图2为DGKα基因-壳聚糖纳米粒的Zeta电位检测结果。

图3为DGKα基因-壳聚糖纳米粒的透射电镜图。

图4为DGKα基因-壳聚糖纳米粒的DNase I的酶解反应结果。

图5为过敏性哮喘小鼠的构建流程图和治疗干预流程图。

图6为治疗过敏性哮喘小鼠模型中各组支气管肺泡灌洗液细胞总数计数。

图7为治疗过敏性哮喘小鼠模型中各组支气管肺泡灌洗液细胞分类计数。

图8为治疗过敏性哮喘小鼠模型中各组支气管肺泡灌洗液IL-4水平。

图9为治疗过敏性哮喘小鼠模型中各组支气管肺泡灌洗液IL-5水平。

图10为治疗过敏性哮喘小鼠模型中各组血清卵蛋白特异性IgE水平。

图11为治疗过敏性哮喘小鼠的动物模型中正常组肺组织切片显微图(苏木素-伊红×400)。

图12为治疗过敏性哮喘小鼠模型中哮喘组肺组织切片显微图(苏木素-伊红×400)

图13为治疗过敏性哮喘小鼠模型中DGKα基因-壳聚糖纳米粒干预组肺组织切片显微图(苏木素-伊红×400)。

图14为治疗过敏性哮喘小鼠模型中DGKα基因干预组肺组织切片显微图(苏木素-伊红×400)。

图15为治疗过敏性哮喘小鼠模型中空白pEGFP-N3质粒对照组肺组织切片显微图(苏木素-伊红×400)。

图16为治疗过敏性哮喘小鼠模型中壳聚糖纳米粒对照组肺组织切片显微图(苏木素-伊红×400)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例

1、DGKα(甘油二酯激酶α)基因-壳聚糖纳米粒的制备：

步骤1、全基因合成小鼠IL-2信号肽序列和小鼠DGKα基因的融合基因，克隆到pEGFP-N3载体，即获得DGKα质粒。经测序证实小鼠IL-2信号肽和小鼠DGKα基因序列均与GenBank的IL-2(NM_008366.3)和DGKα基因(NM_016811.2)完全相符；

步骤2、将壳聚糖溶解于醋酸浓度为1％的溶液中，制备得浓度为1.5mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，将其pH值用氢氧化钠调节到5.5，再用孔径为0.22μm的无菌膜过滤杀菌，其中壳聚糖的分子量为10万道尔顿，脱乙酰度为95％；

步骤3、将所述DGKα质粒溶解在10mM的0.22μm的无菌膜过滤的无水硫酸钠溶液中，制备得浓度为360μg/ml的DGKα溶液，其中步骤2中所述壳聚糖醋酸溶液中的氨基摩尔数与所述DGKα溶液中的磷酸酯基摩尔数之比为8.3；

步骤4、将DGKα溶液和壳聚糖醋酸溶液在温度为55℃的水浴中加热15min；

步骤5、将1ml的360μg/ml DGKα溶液继续保持在55℃的水浴中，将1ml的1.5mg/ml壳聚糖醋酸溶液取出置于旋涡振荡器上，边振荡边用吸头向壳聚糖醋酸溶液中缓慢匀速加入DGKα质粒溶液，两者比例为1∶1，DGKα质粒溶液全部加入后继续振荡60s。室温静置10min，既获得2ml淡蓝色乳光的DGKα基因-壳聚糖纳米粒的溶液，将DGKα基因-壳聚糖纳米粒的溶液在4℃的条件下保存。

2、DGKα基因-壳聚糖纳米粒的检测结果及讨论：

2.1、纳米粒度仪检测DGKα基因-壳聚糖纳米粒的粒径和Zeta电位，透射电镜观察DGKα基因-壳聚糖纳米粒的形态。

如图1所示，经纳米粒度仪检测，DGKα基因-壳聚糖纳米粒的粒径为283.4nm，多分散度为0.227；图2所示，DGKα基因-壳聚糖纳米粒的Zeta电位为+22.1mV；图3所示透射电镜图可见DGKα基因-壳聚糖纳米粒的粒径大小较均一、分布均匀，无明显凝聚现象，而且包裹DGKα的壳聚糖纳米粒的中心染色更深，表明DGKα质粒被包裹在壳聚糖内部，而未包裹DGKα的壳聚糖纳米粒粒径显著更小，颜色均匀，无深染区。

2.2、DNase I型保护实验：向含1μg裸DGKα质粒的溶液和含1μgDGKα质粒的DGKα基因-壳聚糖纳米粒的溶液加入I型DNase1U，37℃反应15min，冰浴放置30min，中止消化反应，用含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，凝胶成像分析仪成像。

如图4所示，DGKα质粒与壳聚糖形成DGKα基因-壳聚糖纳米粒后，DGKα基因-壳聚糖纳米粒被阻滞在加样孔中，未被I型DNase降解，壳聚糖可保护DGKα质粒免受核酸酶破坏。而A孔中裸DGKα质粒被I型DNase降解为小片段。

其中，在图4中，A：裸DGKα质粒+I型DNase；B：裸DGKα质粒；C：DGKα基因-壳聚糖纳米粒+I型DNase；D：DGKα基因-壳聚糖纳米粒。

3、治疗过敏性哮喘小鼠模型

3.1、实验分组：SPF(无特定病原体)级BALB/c雄性小鼠，5-6周龄，随机分为正常组(Normal)、哮喘组(Asthma)、DGKα基因-壳聚糖纳米粒干预组(CS-DGKα)、DGKα基因干预组(DGKα)、空白pEGFP-N3质粒对照组(Control plasmid)、壳聚糖纳米粒对照组(CS)，共6组，每组10只。过敏性哮喘小鼠的构建流程和治疗干预流程如图5所示。

3.2、过敏性哮喘小鼠模型的构建：除正常组外，其余5组按以下方法构建模型。将OVA(卵蛋白，Sigma公司)溶于生理盐水中，配制浓度为400μg/ml的溶液。将400μg/ml OVA溶液与氢氧化铝凝胶以1∶3比例混合，混匀后静置1小时后可用于腹腔注射小鼠致敏。在第0，7，14天腹腔注射与氢氧化铝凝胶(Sigma公司)混合的OVA，剂量为200μl/鼠，即20μg OVA/鼠。第28、29、30、31天采用空气压缩雾化器雾化吸入10mg/ml OVA溶液(OVA溶于生理盐水)激发小鼠，每天35分钟。采用同样的处理方法，以不含OVA的生理盐水与氢氧化铝凝胶溶液1∶3混合后以同样体积腹腔注射致敏小鼠，以生理盐水雾化吸入激发小鼠，作为正常组。

3.3、给药方法

给药时间：于致敏前第-13，-4天给药。

DGKα基因干预组：将裸DGKα质粒溶于生理盐水，配制成2000μg/ml，每只小鼠肌肉注射50μl(含100μgDGKα质粒)。

DGKα基因-壳聚糖纳米粒干预组：将制备的DGKα基因-壳聚糖纳米粒的溶液，腹腔注射200μl/只小鼠，含36μg DGKα质粒。

空白pEGFP-N3质粒对照组：将空白pEGFP-N3质粒溶于生理盐水，配制成2000μg/ml，每只小鼠肌肉注射50μl(含100μg空白pEGFP-N3质粒)。

壳聚糖纳米粒对照组：将1.5mg/ml壳聚糖醋酸溶液与不含质粒的10mM的经孔径为0.22μm的无菌膜过滤的无水硫酸钠溶液在55℃的水浴中加热15min，不含质粒10mM的经孔径为0.22μm的无菌膜过滤的无水硫酸钠溶液继续保持在55℃的水浴中，将1ml的1.5mg/ml壳聚糖醋酸溶液取出置于旋涡振荡器上，边振荡边用吸头向1ml的1.5mg/ml壳聚糖醋酸溶液加入到1ml的不含质粒10mM的经孔径为0.22μm的无菌膜过滤的无水硫酸钠溶液中，腹腔注射200μl/只小鼠。

3.4、指标测定及其结果

3.4.1、BALF(支气管肺泡灌洗液)中细胞总数以及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数量

末次激发后48小时，腹腔注射麻醉小鼠，处死小鼠，摘眼球取血。切开气管，插管，PBS(磷酸盐缓冲液)0.8ml/次，灌洗3次，灌洗液回收率＞80％。回收BALF，1500r/min离心10min，留取上清，-80℃保存。细胞沉淀用1ml PBS重悬，取少许滴于血细胞计数板，行细胞总数计数，算出每毫升的细胞数。剩余细胞溶液，1500r/min离心10min，弃上清，用50μl PBS重悬细胞沉淀后涂片，晾干后行HE(苏木素-伊红)染色。油镜下进行细胞分类计数，计数600个细胞，计算嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞各占的百分比，计算各类细胞数量。

如图6和7所示，哮喘组的BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞数量均显著高于正常组。腹腔注射DGKα基因-壳聚糖纳米粒和肌肉注射裸DGKα质粒均能降低哮喘小鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量，腹腔注射DGKα基因-壳聚糖纳米粒作用显著优于肌肉注射裸DGKα质粒。壳聚糖纳米粒对照组和空白pEGFP-N3质粒对照组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞数量与哮喘组无显著差异。以上结果表明DGKα质粒能降低气道炎症，而DGKα基因-壳聚糖纳米粒能够显著增强DGKα基因的治疗效果。

其中，在图6和7中，Normal：正常组；Asthma：哮喘组；CS-DGKα：DGKα基因-壳聚糖纳米粒干预组；DGKα：DGKα基因干预组；Control plasmid：空白pEGFP-N3质粒对照组；CS：壳聚糖纳米粒对照组。EOS：嗜酸性粒细胞；LYM：淋巴细胞；NEU：中性粒细胞；MAC：巨噬细胞。与Asthma组相比^*p＜0.05；与CS-DGKα组相比^#p＜0.05。

3.4.2、BALF炎性指标

取BALF上清液，采用ELISA(酶联免疫吸附试验)法检测BALF中IL-4和IL-5水平，ELISA试剂盒购自eBioscience公司，按说明书操作。

Th2细胞因子水平增高是哮喘的重要特征之一。如图8和9所示，哮喘组BALF中IL-4和IL-5水平较正常组明显增高。腹腔注射DGKα基因-壳聚糖纳米粒能显著降低BALF中IL-4和IL-5水平，而肌肉注射裸DGKα质粒不能降低IL-4和IL-5水平。壳聚糖纳米粒对照组和空白pEGFP-N3质粒对照组BALF中IL-4、IL-5水平与哮喘组无显著差异。

其中，在图8和9中，Normal：正常组；Asthma：哮喘组；CS-DGKα：DGKα基因-壳聚糖纳米粒干预组；DGKα：DGKα基因干预组；Control plasmid：空白pEGFP-N3质粒对照组；CS：壳聚糖纳米粒对照组。与Asthma组相比^*p＜0.05。

3.4.3、血清OVA特异性IgE水平检测

小鼠处死后，摘眼球取血，室温静置1小时后，10000g，离心10min，留取血清，-80℃保存。采用ELISA法检测血清OVA特异性IgE水平，ELISA试剂盒购自Chondrex公司，按说明书操作。

图10所示，正常组不能检测到血清OVA特异性IgE，而哮喘组血清OVA特异性IgE明显增高。给予DGKα基因-壳聚糖纳米粒和裸DGKα质粒干预均能显著降低血清OVA特异性IgE水平，且DGKα基因-壳聚糖纳米粒干预组作用显著优于裸DGKα质粒干预组。而壳聚糖纳米粒对照组和空白pEGFP-N3质粒对照组血清OVA特异性IgE水平与哮喘组无显著差异。

其中，在图10中，Normal：正常组；Asthma：哮喘组；CS-DGKα：DGKα基因-壳聚糖纳米粒干预组；DGKα：DGKα基因干预组；Control plasmid：空白pEGFP-N3质粒对照组；CS：壳聚糖纳米粒对照组。与Asthma组相比*p＜0.05；与CS-DGKα组相比^#p＜0.05。

3.4.4、肺组织病理检查

取小鼠肺组织放入4％甲醛固定液中固定过夜。常规取材后，进行梯度酒精脱水，组织透明处理，浸蜡，石蜡包埋切片，HE染色，光镜观察肺组织炎性细胞浸润，水肿和气道上皮损伤情况。

如图11～16所示，正常组气道和肺组织均未见明显炎症改变。哮喘组出现气道嗜酸性粒细胞等炎性细胞浸润，气道上皮破坏、气道水肿。DGKα基因-壳聚糖纳米粒干预组几乎未见嗜酸性粒细胞浸润，较哮喘组明显减轻。DGKα基因干预组气道炎症较轻，与哮喘组相比气道炎症减轻较明显。而壳聚糖纳米粒对照组和空白pEGFP-N3质粒对照组气道炎症与哮喘组相似。

综上所述，我们成功制备了DGKα基因-壳聚糖纳米粒，粒径大小为283.4nm，多分散度为0.227，Zeta电位为+22.1mV，壳聚糖能保护DGKα质粒不被核酸酶所降解。

而且，根据DGKα具有诱导T细胞无能的作用，我们通过治疗过敏性哮喘小鼠的动物模型可以很好的验证，DGKα基因-壳聚糖纳米粒能减少哮喘小鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量，明显降低BALF中IL-4、IL-5和血清OVA特异性IgE水平，显著改善气道炎症。DGKα基因-壳聚糖纳米粒在体内降低哮喘小鼠气道炎症作用显著优于裸DGKα质粒，而且壳聚糖价格低廉，来源丰富，DGKα基因-壳聚糖纳米粒的制备方法简单，重现性好等优点，DGKα基因-壳聚糖纳米粒可适用于过敏性哮喘的治疗。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.一种甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒在制备治疗过敏性哮喘药物中应用，其特征在于，所述甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒作为唯一有效成分在制备治疗过敏性哮喘药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒在制备减轻哮喘气道炎症药物中的应用。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒在制备降低哮喘血清中过敏原特异性IgE和支气管肺泡灌洗液中白细胞介素-4和白细胞介素-5药物中的应用。

4.一种甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1、制备甘油二酯激酶α质粒：全基因合成小鼠白细胞介素-2信号肽序列和小鼠甘油二酯激酶α基因的融合基因，克隆到pEGFP-N3载体而制备得甘油二酯激酶α质粒；

步骤2、将壳聚糖溶解于1％醋酸水溶液，配制成浓度为0.5～2.5mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用NaOH将其pH值调节在5.5～5.7之间，无菌膜过滤，其中所述壳聚糖的分子量在2～60万道尔顿之间，其脱乙酰度在90％～95％之间，所述无菌膜的孔径为0.22μm；

步骤3、将所述甘油二酯激酶α质粒溶解在浓度为10～25mM的经孔径为0.22μm的无菌膜过滤的无水硫酸钠溶液中，制备得浓度在100～360μg/ml之间的甘油二酯激酶α质粒溶液。其中，步骤2中所述壳聚糖醋酸溶液中的氨基摩尔数与所述甘油二酯激酶α溶液中的磷酸酯基摩尔数之比≥5；

步骤4、所述的甘油二酯激酶α质粒溶液和所述壳聚糖醋酸溶液在温度在55℃～57℃之间的水浴中加热10～15min；

步骤5、在漩涡震荡的条件下，按体积比1∶1的比例，将经水浴加热后的所述甘油二酯激酶α溶液缓慢匀速加入到经水浴加热后的所述壳聚糖醋酸溶液中，旋涡振荡30～60s，室温静置，既得甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒溶液。

5.如权利要求4所述的甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤5中的甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒溶液的保存温度为4℃。

6.如权利要求4所述的甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，本方法制备得的甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒溶液中的甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒的粒径在150nm～500nm之间，其中粒径在150nm～300nm之间的甘油二酯激酶α基因-壳聚糖纳米粒占60％以上。

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