CN109966509B - 一种用于治疗支气管哮喘的复合壳聚糖纳米微粒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域,具体涉及一种用于治疗支气管哮喘的复合壳聚糖纳米微粒及其应用;该微粒采用CS(壳聚糖)包裹DGKα基因(甘油二酯激酶α基因)表达载体和OVA(卵蛋白)形成的微粒,其能够显著降低血清中OVA特异性IgE抗体水平以及支气管炎症反应,其还能够显著降低哮喘气道反应性,降低气道敏感性,因此,在制备治疗和/或预防支气管哮喘药物和/或保健品方面具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及一种用于治疗支气管哮喘的复合壳聚糖纳米微粒及其应用。
背景技术
支气管哮喘是多种炎症细胞参与,以气道嗜酸性粒细胞浸润为特征的慢性气道变态反应性炎症性疾病。人体吸入过敏原后,由气道抗原呈递细胞摄取和提呈过敏原给T细胞后,促使T细胞过度活化和增殖,始动哮喘的发生。其中CD4+T细胞的过度活化被认为在哮喘发病中起重要作用。CD4+T细胞活化后向Th2细胞分化增多,Th2细胞的过度活化导致了Th2反应为主的免疫反应,最终导致嗜酸性粒细胞等炎症细胞在气道聚集,引起气道变态反应性炎症。
T细胞无能是指T细胞对过敏原的功能性无反应性或者失活,即表现为T细胞不能增殖。诱导抗原特异性T细胞无能是诱导外周免疫耐受的主要方法,有望用于哮喘的治疗。近年研究发现,甘油二酯激酶(DGK)具有免疫调节功能。正常情况下,T细胞受体被激活可引起甘油二酯(DAG)水平迅速增高,而且共刺激信号导致DAG水平进一步增高,启动DAG信号相关通路,引起T细胞活化。若TCR被激活后DAG水平的迅速增高被抑制则会导致T细胞无能,导致免疫耐受。DGKα是DGK的一个亚型,为I型DGK,T细胞可表达DGKα。DGKα能分解DAG,从而中止或减弱DAG信号,在调节DAG信号中具有重要作用。转染DGKα基因的T细胞过度表达DGKα,抑制甘油二酯依赖的T细胞受体信号,从而抑制T细胞活化,导致T细胞不能增殖和T细胞无能。
专利CN103110959A公开了一种甘油二酯酶α基因-壳聚糖纳米粒在制备治疗过敏性哮喘药物中应用,具体公开了一种DGKα-壳聚糖纳米粒,该纳米粒能够抑制常见过敏原卵蛋白(OVA)诱发的气道炎症,降低血清过敏原OVA特异性IgE水平。但其并不能降低气道反应性,降低气道敏感性。而气道高反应性是哮喘的基本临床特征,降低气道反应性能有效减轻哮喘症状,获得临床哮喘控制,气道反应性是评估哮喘疗效的关键指标。
发明内容
为解决上述问题本发明提供一种用于治疗支气管哮喘的复合壳聚糖纳米微粒,该微粒同时包裹DGKα基因和过敏原蛋白质OVA两种不同种类的组分 ,两种物质相互作用,该微粒除了能够显著降低血清中过敏原OVA特异性IgE抗体水平以及气道炎症反应,其还能够显著降低哮喘气道反应性,降低气道敏感性。
一种用于治疗支气管哮喘的复合壳聚糖纳米微粒,该微粒是采用CS(壳聚糖)包裹DGKα基因(甘油二酯激酶α基因)表达载体和过敏原OVA形成的微粒。
优选的,所述复合壳聚糖纳米微粒中DGKα基因表达载体和OVA的质量比为2-12.24:1。
优选的,DGKα基因表达载体和CS的质量比为0.05-0.36:1。更为优选的,所述DGKα基因表达载体、OVA和CS三者的质量比为12:1:50。
上述复合壳聚糖中的各组分相互间质量比经过大量实验摸索所得出,DGKα基因表达载体是主要治疗组分,当壳聚糖与DGKα基因表达载体为0.05-0.36:1既能够保证粒径大小为200-500nm范围,进而达到有效的治疗浓度,同时使得使壳聚糖包裹DGKα基因表达载体接近其最大载药量,以提高疗效; OVA质量过大可能会影响疗效,甚至诱发哮喘气道炎症加重,可能导致治疗失败, 且OVA本身质量低,不影响壳聚糖的载药量;经过发明人反复摸索得出DGKα基因表达载体和OVA的质量比为2-12.24时,降低气道反应性较优,当OVA在此范围内含量偏低更优。
优选的,所述复合壳聚糖纳米微粒的直径为200~500nm。
优选的,所述壳聚糖的分子量为10万道尔顿,所述壳聚糖的脱乙酰度(D.D)为95%
壳聚糖作为一种多聚糖,其相对分子质量范围大,常用壳聚糖的分子量波动于数千至数百万道尔顿,分子量越大,水溶性越低,凝聚DNA的能力更强。而脱乙酰度越高,壳聚糖分子链上的游离氨基就越多,在酸中的溶解性就越好,且包封带负电荷药物的效率越高,因此所选壳聚糖脱乙酰度为95%。大量研究发现,当壳聚糖的分子量波动于10万至60万道尔顿时,壳聚糖包裹DNA转染细胞可取得高转染效率。而且我们从前期研究中摸索出分子量10万道尔顿,脱乙酰度95%转染效率相对更高,治疗哮喘疗效更佳。
优选的,所述复合壳聚糖纳米微粒的制备方法包括如下步骤:
(1)采用质量百分数为1-2%的醋酸溶液配制浓度为1.0~2.0mg/mL的壳聚糖醋酸溶液,NaOH调节pH至5.5~5.7(25℃),除菌,得无菌的CS溶液;
(2)采用浓度为10mM的无菌硫酸钠溶液配制浓度为100~360μg/mL的DGKα基因表达载体溶液;
(3)配制浓度为5mg/mL的无菌的OVA水溶液;
(4)漩涡振荡条件下,按CS溶液和OVA水溶液的体积比为100~170:1向CS溶液中加入OVA水溶液,继续震荡得CS-OVA溶液;
(5)CS-OVA溶液和DGKα基因表达载体溶液分别水浴加热至55℃,漩涡振荡条件下,按CS-OVA溶液和DGKα基因表达载体溶液的体积比为1:1向CS-OVA溶液中加入DGKα基因表达载体溶液,继续震荡,室温(15-25℃)静置得CS-DGKα-OVA微粒。
优选的,所述壳聚糖醋酸溶液的浓度为1.5mg/mL,所述DGKα基因表达载体溶液的浓度为360μg/mL。
优选的,所述步骤(4)中,所述CS溶液和OVA水溶液体积比为500:3。
优选的,所述复合壳聚糖纳米微粒中壳聚糖骨架中带正电荷的NH2/DGKα基因表达载体中带负电荷的磷酸根的摩尔比例即N/P比大于5。
优选的,所述DGKα基因表达载体是通过将全基因小鼠IL-2信号肽序列和小鼠DGKα基因的融合基因克隆到真核表达载体的DGKα质粒,所述真核表达载体选自pEGFP-N3、pcDNA3.1和pUC19 DNA等常见真核表达载体。
上述用于治疗支气管哮喘的复合壳聚糖纳米微粒在制备治疗和/或预防支气管哮喘药物和/或保健品中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果在于:
1.本发明的提供的用于治疗支气管哮喘的复合壳聚糖纳米微粒除了能够显著降低血清中OVA特异性IgE抗体水平以及气道炎症反应,其还能够显著降低哮喘气道反应性,降低气道敏感性。
2.本发明提供的复合壳聚糖纳米微粒的粒径大小均一,分布均匀无明显凝聚现象,完全包裹了OVA和DGKa,治疗哮喘效果更佳。
3.本发明的复合壳聚糖纳米微粒的制备方法简单,设备要求低,反应时间短,条件简单,操作方法易于掌握,材料易获得,成本低廉。
附图说明
图1是CS-DGKα-OVA壳聚糖微粒的粒径检测结果;
图2是CS-DGKα-OVA壳聚糖微粒的Zeta电位检测结果;
图3是CS-DGKα-OVA壳聚糖微粒的透射电镜图;
图4是CS-DGKα-OVA壳聚糖微粒的扫描电镜图;
图 5是哮喘小鼠建模和治疗流程图;
图6是各组气道性反应(PC100),其中,Normal:正常组;Asthma:哮喘组;CS-DGKα-OVA:腹腔注射CS-DGKα-OVA干预组;CS-DGKα:腹腔注射CS-DGKα干预组;CS-OVA:腹腔注射CS-OVA干预组;CS:腹腔注射CS对照组;与Asthma组相比*p<0.05;与CS-DGKα-OVA干预组相比#p<0.05;
图7是各组支气管肺泡灌洗液细胞总数计数;
图8是各组支气管肺泡灌洗液细胞分类比例,其中,Normal:正常组;Asthma:哮喘组;CS-DGKα-OVA:腹腔注射CS-DGKα-OVA干预组;CS-DGKα:腹腔注射CS-DGKα干预组;CS-OVA:腹腔注射CS-OVA干预组;CS:腹腔注射CS对照组;EOS:嗜酸性粒细胞;LYM:淋巴细胞;NEU:中性粒细胞;MAC:巨噬细胞 ;与Asthma组相比*p<0.05;与CS-DGKα-OVA干预组相比#p<0.05;
图 9 是各组肺组织病理检查图;
图 10是 各组血清OVA特异性IgE抗体水平;
图11是各组支气管肺泡灌洗液IL-5水平;
图12是各组支气管肺泡灌洗液IL-13水平,其中,Normal:正常组;Asthma:哮喘组;CS-DGKα-OVA:腹腔注射CS-DGKα-OVA干预组;CS-DGKα:腹腔注射CS-DGKα干预组;CS-OVA:腹腔注射CS-OVA干预组;CS:腹腔注射CS对照组;与Asthma组相比*p<0.05;与CS-DGKα-OVA干预组相比#p<0.05。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明中的复合壳聚糖纳米微粒 N/P 比是指壳聚糖骨架中带正电荷的NH2/DGKα基因表达载体中带负电荷的磷酸根的摩尔比例。
本实施例中的壳聚糖是购买自青岛海汇公司,优纯级,纯度>=98%,分子量为10万道尔顿,D.D为95%;OVA购买自Sigma公司,优纯级,纯度>=98%。
实施例1
制备DGKα基因和OVA抗原复合壳聚糖纳米微粒(CS-DGKα-OVA)
1、构建表达DGKα基因的载体:全基因合成小鼠IL-2信号肽序列和小鼠DGKα基因的融合基因,克隆到pEGFP-N3载体,即获得DGKα质粒。经测序证实IL-2信号肽和小鼠DGKα基因序列均与GenBank的IL-2(NM_008366.3)和DGKα基因(NM_016811.2)完全相符。因为含信号肽序列,DGKα基因基因转染细胞后,细胞可表达DGKα蛋白,并将其分泌至细胞外。
2、CS-DGKα-OVA的制备:
2.1将壳聚糖(分子量:10万,D.D:95%)溶解于1%醋酸水溶液配制为浓度1.5mg/mL的壳聚糖醋酸溶液,用NaOH调节pH值为5.5-5.7,无菌0.22μm膜过滤。
2.2 将DGKα质粒溶于无菌0.22μm膜除菌的10mM 无水硫酸钠,制备成360μg/mLDGKα溶液。
2.3将OVA溶于超纯水制成5mg/mL,无菌0.22μm膜除菌。
2.4在旋涡振荡条件下,将壳聚糖与OVA溶液按1mL:6μl比例,向壳聚糖溶液中缓慢加入OVA溶液,并继续旋涡振荡10分钟,制备壳聚糖-OVA溶液。
2.5将壳聚糖-OVA溶液和DGKα溶液55℃水浴10-15min,在旋涡振荡条件下,按1:1比例向壳聚糖-OVA溶液中缓慢加入DGKα溶液,旋涡振荡30s。室温静置约10min后,得到CS-DGKα-OVA溶液。
纳米粒度仪检测CS-DGKα-OVA的纳米粒径和Zeta电位,透射电镜和扫描电镜观察DGKα壳聚糖纳米微粒的形态。结果如下:如图1和图2所示,经纳米粒度仪检测,CS-DGKα-OVA粒径大小为269.5nm,多分散度为0.230,Zeta电位为+19.4mV。图3和图4所示透射电镜图和扫描电镜图可见CS-DGKα-OVA壳聚糖纳米微粒的粒径大小较均一、分布均匀,无明显凝聚现象,而且包裹CS-DGKα-OVA的壳聚糖微粒的中心染色更深,表明DGKα质粒和OVA蛋白包裹在壳聚糖内部,而未包裹药物的壳聚糖微粒粒径显著更小,微粒颜色均匀,无深染区。
3、CS-DGKα-OVA应用于哮喘小鼠的治疗
参见图5, 哮喘小鼠建模和治疗流程图,具体步骤如下:
3.1 实验分组:SPF级BALB/c雌性小鼠,5-6周龄,随机分为正常组(Normal)、哮喘组(Asthma)、CS-DGKα-OVA干预组(CS-DGKα-OVA组),CS-DGKα干预组(CS-DGKα组),CS-OVA干预组(CS-OVA组),CS对照组(CS组)共6组,每组10只。
3.2 哮喘小鼠模型的构建:将OVA溶于生理盐水中,配制浓度为400μg/mL的溶液。将400μg/mL OVA溶液与氢氧化铝凝胶以1:3比例混合,混匀后静置1小时后可用于腹腔注射小鼠致敏。在第0、7、14天腹腔注射与氢氧化铝凝胶混合的OVA,剂量为200μl/鼠,即20μgOVA/鼠。第28、29、30、31天采用空气压缩雾化器雾化吸入10mg/mL OVA溶液(OVA溶于生理盐水)激发小鼠,每天35分钟。采用同样的处理方法,以不含OVA的同样体积的氢氧化铝凝胶溶液腹腔注射致敏小鼠,以生理盐水雾化吸入激发小鼠,作为正常组。
3.3给药时间、给药方法及药物制备
给药时间:致敏前给药组于第-13,-4天给药。
CS-DGKα-OVA组:按上述方法制备DGKα基因和OVA抗原复合壳聚糖纳米疫苗(CS-DGKα-OVA),腹腔注射200μl/只小鼠,含36μg DGKα质粒+3μg OVA。
CS-DGKα组:将壳聚糖溶解于1%醋酸水溶液配制为浓度1.5mg/mL的壳聚糖醋酸溶液,用NaOH调节pH值为5.5-5.7,无菌0.22μm膜过滤,将DGKα质粒溶于无菌0.22μm膜除菌的10mM 无水硫酸钠,制备成360μg/mL DGKα溶液。将壳聚糖溶液和DGKα溶液55度水浴10-15min,在旋涡振荡条件下,按1:1比例向壳聚糖溶液中缓慢加入DGKα溶液,旋涡振荡30s。室温静置约10min后,4℃保存备用。腹腔注射200μl/只小鼠,含36μg DGKα质粒。
CS-OVA组:将壳聚糖溶解于1%醋酸水溶液(质量百分数)配制为浓度1.5mg/mL的壳聚糖醋酸溶液,用NaOH调节pH值为5.5-5.7,无菌0.22μm膜过滤。将OVA溶于超纯水制成5mg/mL,无菌0.22μm膜除菌。在旋涡振荡条件下,将壳聚糖与OVA溶液按1mL:6μl比例,向壳聚糖溶液中缓慢加入OVA溶液,并继续旋涡振荡10分钟,制备壳聚糖-OVA溶液。室温静置约10min后,4℃保存备用。腹腔注射200μL/只小鼠,含3μg OVA。
CS组:制备方法及用法如下:1.5mg/mL壳聚糖醋酸溶液用NaOH调节pH值为5.5-5.7,无菌0.22μm膜过滤,无菌0.22µm膜过滤的10mM无水硫酸钠溶液在55℃的水浴中加热15min,在旋涡振荡条件下,按1:1比例向1.5mg/mL壳聚糖醋酸溶液加入10mM无水硫酸钠溶液。室温静置约10min后,4℃保存备用。腹腔注射200μl/只小鼠。
3.4指标测定
3.4.1 气道反应性
评价气道反应性包括以下两个方面:气道反应性升高为基值2倍时的Mch激发浓度即PC100,PC100值越小,气道敏感性越高。结果如图6所示。CS-DGKα-OVA组能显著降低哮喘小鼠的气道反应性,且气道反应性亦显著低于CS-OVA组和CS对照组,而CS-DGKα组、CS-OVA组和CS对照组均不能降低哮喘小鼠的气道反应性。
3.4.2 支气管肺泡灌洗液中细胞总数以及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞所占比例
末次激发后48小时,腹腔注射麻醉小鼠,处死小鼠,切开气管,插管,PBS 0.8mL/次,灌洗3次,灌洗液回收率>80%。回收支气管肺泡灌洗液,1500 r/min离心10min,留取上清,-80度保存。细胞沉淀用1mL PBS重悬,取少许滴于血细胞计数板,行细胞总数计数,算出每毫升的细胞数。剩余细胞溶液,1500 r/min离心10min,弃上清,用50μl PBS重悬细胞沉淀后涂片,晾干后行HE染色。油镜下进行细胞分类计数,计数600个细胞,计算嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞各占的百分比。结果如图7和图8所示。哮喘组的支气管肺泡灌洗液中细胞总数和嗜酸性粒细胞比例均显著高于正常组。腹腔注射CS-DGKα-OVA和CS-DGKα均能降低哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数、嗜酸性粒细胞比例,而且而且CS-DGKα-OVA的作用显著优于CS-DGKα。注射CS-OVA和CS则无此作用。
3.4.3 肺组织病理检查:
取小鼠肺组织放入4%甲醛固定液中固定过夜。常规取材后,进行梯度酒精脱水,组织透明处理,浸蜡,石蜡包埋切片,HE染色,光镜观察肺组织炎性细胞浸润,水肿和气道上皮损伤情况。结果如图9所示,正常组气道和肺组织均未见明显炎症改变。哮喘组均出现气道嗜酸性粒细胞浸润,气道上皮破坏、气道水肿。腹腔注射CS-DGKα-OVA和CS-DGKα气道炎症较哮喘组显著减轻,以腹腔注射CS-DGKα-OVA组气道炎症减轻更显著,几乎未见嗜酸性粒细胞浸润。而CS-OVA组和CS组气道炎症和哮喘组相似。
3.4.4ELISA法检测血清OVA特异性IgE抗体水平,支气管肺泡灌洗液上清液IL-5、IL-13水平。
如图9所示,正常组不能检测到血清OVA特异性IgE抗体。给予CS-DGKα-OVA干预和CS-DGKα干预能显著降低哮喘小鼠血清OVA特异性IgE抗体水平,CS-DGKα-OVA作用显著优于CS-DGKα,而CS-OVA组和CS组不能降低哮喘小鼠血清OVA特异性IgE抗体水平。Th2细胞因子水平增高是哮喘的重要特征之一。如图11,12所示,腹腔注射CS-DGKα-OVA和CS-DGKα均能显著降低支气管肺泡灌洗液中IL-5和IL-13水平,CS-DGKα-OVA作用显著优于CS-DGKα,而CS-OVA组和CS组不能降低支气管肺泡灌洗液中IL-5和IL-13水平。
由以上可知,采用实施例1的方法制备的CS-DGKα-OVA壳聚糖纳米微粒,CS-DGKα-OVA粒径大小为269.5nm,多分散度为0.230,平均Zeta电位为+19.4mV,CS-DGKα-OVA壳聚糖纳米微粒能保护DGKα质粒不能核酸酶所降解,将此CS-DGKα-OVA应用于治疗哮喘,结果提示腹腔注射CS-DGKα-OVA壳聚糖纳米微能降低哮喘小鼠的气道嗜酸性炎症和气道反应性,降低血清OVA特异性IgE抗体水平,显著降低BALF中IL-5和IL-13水平,提示其能抑制哮喘小鼠的Th2反应,而且以上作用显著优于单独包裹DGKα的CS-DGKα。而且CS-DGKα不能降低哮喘小鼠的气道反应性,而仅包裹OVA的CS-OVA对哮喘无任何治疗作用。因此,本发明所提供的同时包裹DNA核酸疫苗和过敏原蛋白的复合壳聚糖纳米微粒制备方法可行,通过应用于哮喘模型小鼠能有效抑制哮喘小鼠的气道炎症和气道反应性,证实了在体内能有效发挥作用。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (8)
1.一种用于治疗支气管哮喘的复合壳聚糖纳米微粒,其特征在于,所述复合壳聚糖纳米微粒是采用壳聚糖(CS)包裹甘油二酯激酶α基因(DGKα基因)表达载体和卵清蛋白(OVA)形成的纳米微粒;DGKα基因表达载体和OVA的质量比为2-12.24:1;DGKα基因表达载体和CS的质量比为0.05-0.36:1。
2.如权利要求1所述的复合壳聚糖纳米微粒,其特征在于,所述复合壳聚糖纳米微粒的直径为200~500nm。
3.如权利要求1所述的复合壳聚糖纳米微粒,其特征在于,所述复合壳聚糖纳米微粒中,壳聚糖骨架中带正电荷的NH2/DGKα基因表达载体中带负电荷的磷酸根的摩尔比例比大于5。
4.如权利要求2所述的复合壳聚糖纳米微粒,其特征在于,所述DGKα基因表达载体是通过将全基因小鼠IL-2信号肽序列和小鼠DGKα基因的融合基因克隆到真核表达载体的DGKα质粒。
5.如权利要求1-4任一项所述的复合壳聚糖纳米微粒,其特征在于,所述复合壳聚糖纳米微粒的制备方法包括如下步骤:
(1)采用质量百分数为1-2%的醋酸溶液配制浓度为1.0~2.0mg/mL的壳聚糖醋酸溶液,NaOH调节pH至5.5~5.7,除菌,得无菌的CS溶液;
(2)采用10mM的无菌无水硫酸钠溶液配制浓度为100~360μg/mL DGKα基因表达载体溶液;
(3)配制浓度为5mg/mL的OVA水溶液;
(4)漩涡振荡条件下,按CS溶液和OVA水溶液的体积比为100~170:1向壳聚糖溶液中加入OVA水溶液,继续震荡得CS-OVA溶液;
(5)CS-OVA溶液和DGKα基因表达载体溶液分别水浴加热至55℃,漩涡振荡条件下,按CS-OVA溶液和DGKα基因表达载体溶液的体积比为1:1向CS-OVA溶液中加入DGKα基因表达载体溶液,继续震荡,室温静置得CS-DGKα-OVA微粒。
6.如权利要求5所述的复合壳聚糖纳米微粒,其特征在于,所述壳聚糖醋酸溶液的浓度为1.5mg/mL,所述DGKα基因表达载体溶液的浓度为360μg/mL。
7.如权利要求5所述的复合壳聚糖纳米微粒,其特征在于,所述步骤(4)中,所述CS溶液和OVA水溶液体积比为500:3。
8.权利要求1-6任一项所述的复合壳聚糖微粒在制备治疗和/或预防支气管哮喘药物和/或保健品中的应用。
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