KR20130047855A - 항천식 활성을 갖는 저분자량 키토산 올리고당 및 이를 함유하는 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명에서는 저분자 키토산 올리고당이 Ovalbumin(OVA)에 의해 천식이 유발된 마우스의 폐조직과 기관지 폐포 세척액에서 증가된 IL-4, IL-5, IL-13 그리고 TNF-α의 생성량을 감소시킨다는 점을 확인하였다. 따라서 저분자 키토산 올리고당이 항천식 효과를 발휘하면서 이들 질병 예방과 치료에 도움을 줄 수 있을 것이라는 것을 알 수 있었다. 본 발명은 이런 결과를 근거하여 항천식 질환을 예방 및 치료할 수 있는 항천식 활성을 갖는 저분자 키토산 올리고당을 함유하는 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

Description

항천식 활성을 갖는 저분자량 키토산 올리고당 및 이를 함유하는 약학 조성물{Low Molecular Weight Chitosan Oligosaccharide Having Potent Anti-Asthma Activity and Pharmacological Composition Containing the Same}
본 발명은 천연 물질 유래의 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 저분자량 키토산 올리고당을 유효 성분으로 함유하는 항천식 약학 조성물 및 천식 개선을 위한 건강기능식품에 관한 것이다.
급속한 산업발전에 따라 최근 생활환경이 오염되고 식생활이 변화되면서 다양한 알레르기성 질환들이 증가하고 있으며, 이러한 알레르기성 질환 중에서도 특히 천식의 발병률이 크게 증가하고 있는 실정이다. 천식의 치료, 예방 및 개선을 위해 많은 약품들이 개발되고 있지만, 알레르기성 질환의 원인이나 메커니즘에 완벽하게 밝혀지지 않은 상태이기 때문에 현재까지 천식을 완전하게 치료하거나 예방할 수 있는 방법이나 치료제는 전무할 뿐만 아니라 현재 시판되고 있는 천식 치료제들은 많은 부작용을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.
현재 대부분의 천식 치료제를 포함하여, 기존의 화학 합성법에 따라 제조된 많은 의약품들의 부작용 및 독성이 계속 보고되고 있다. 이에 따라, 최근에는 식물이나 동물의 체내에서 합성되는 자연적 생성물(nature product)은 인체에서의 원활한 대사가 가능할 뿐만 아니라 인체에 전혀 해가 없다는 장점을 가지고 있다는 점에 근거하여, 이러한 자연적 생성물을 이용하여 다양한 질병을 예방, 개선 그리고 치료에 활용하고자 하는 노력이 의학과 약학 그리고 기능성식품 분야에서 활발하게 연구되고 있다.
이와 같은 자연적 생성물, 즉 천연물 중에서 널리 활용되고 있는 대표적인 자연 산물이 키틴(chitin) 및 키토산(chitosan)과 같은 키토산 유도체이다. 키틴(chitin)은 주로 갑각류인 게, 새우 등의 갑각류의 껍질이나 곤충류인 메뚜기, 바퀴벌레의 외골격, 연체동물인 오징어, 조개류, 그리고 미생물인 버섯이나 균류의 세포벽 등에 널리 분포하는 천연 고분자 물질로서, 생명체의 지지와 방호 역할을 담당하는 다당류이다. 기본적으로 키틴은 셀룰로오스(cellulose)와 유사한 구조를 가지는 매우 긴 사슬구조의 천연 고분자 물질인데, 셀룰로오스의 구성 단당인 글루코오스의 2번 탄소 위치에 존재하는 수산화기(-OH)를 대신하여 아세틸아미노기(-NHCOCH3)가 치환되어 있는 유도체인 2-아세틸아미노-2-디옥시-D-글루코오스, 다시 말하면 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine)이 β-1,4 연결되어 있는 폴리-β-1,4-N-아세틸-D-글루코사민(poly-β-1,4-N-acetyl-D-glucosamine)인 당질(carbohydrate)을 의미한다. 키틴은 용매에 녹지 않는 불용성이기 때문에 그 이용에 한계가 있음에도, 대표적인 천연 자원의 하나인 셀룰로오스와 유사한 구조를 갖기 때문에 기능성 고분자 소재, 생분해성 소재 등으로의 활용이 기대되고 있다.
한편, 키토산(chitosan)은 키틴의 단위체인 N-아세틸글루코사민의 2번 탄소의 아세틸기를 제거하는 공정을 통해서 얻어지는 다당류이다. 일반적으로 키틴을 진한 수산화나트륨 용액과 같은 고온의 알칼리 용액에 반응시키는 탈아세틸화(deacetylation) 처리를 수행하는 방법으로 키토산을 얻을 수 있는데, 키틴에 대한 탈아세틸화 처리시의 반응온도, 반응시간, 수산화나트륨 농도에 따라 각각 다른 탈아세틸화도를 갖는 키토산을 얻을 수 있다. 키틴이 키토산으로 변환되는 공정에서 많은 유리 양이온이 생성되므로 다양한 키토산은 다양한 생리활성을 가질 수 있다. 예를 들어 키토산은 보습 효과를 가지고 있어서 화장품 분야라든가 폐수용 응집제, 염료 폐수 정화제 등이나 농약이나 식물 병충해 방지제로서는 물론이고, 항균, 방취 기능을 갖는 섬유 소재나 콜레스테롤 저하, 항혈전, 혈압 조정제, 약물 전달체 등 의약품이나 식품의 소재로서도 활용되고 있다.
하지만 키토산(chitosan)은 그 자체가 대단위 고분자 물질로서 흡수력에 한계가 있기 때문에 그 응용이 제한되고 있다. 따라서 키토산을 화학적 방법 또는 효소적 방법을 이용하여 고분자 다당류 형태인 긴 사슬을 끓어주는 공정에 의해 키토산 올리고당을 제조한다. 키토산과 키토산 올리고당은 글루코사민(glucosamine) 중합체로서 그 중합 정도에 따라 분자량이 달라지는데, 키토산은 자체의 독성이 비교적 낮고 생분해성이기 때문에 의학 분야에서의 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 한편, 키토산 올리고당은 대부분의 다당류와 매우 유사한 화학구조를 가지고 있어서 의약, 약학, 식품 등 다양한 분야에서 신소재로 이용되고 있다. 예를 들어, 키토산과 키토산 올리고당은 분자량과 탈아세틸화 정도에 따라 동맥경화, 심장병을 예방하는 콜레스테롤 저하작용, 면역강화, 간장 기능의 강화작용, 상처 치유, 세포재생 효과, 세균 억제효과, 항암효과 효과 등의 다양한 기능들을 나타내는 것으로 알려져 있다(Furda, I. (1990). In New Developments in Dietary Fiber, pp. 67-82. New York: Plenum Press; Ikeda, I., Sugano, M., Yoshida, K., Sasaki, E., Iwamoto, Y. & Hatano, K. (1993). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 41, pp. 431-435; Razdan, A. & Pettersson, D. (1994). British Journal of Nutrition, 72, pp. 277-288; Ryu, BH. (1992). J. Korean Soc. Food Nutr. 21(2), 154-162).
키토산 올리고당의 활용과 관련한 특허를 살펴보면, 대한민국등록특허 10-0518265호에서는 키틴을 분해하거나 키토산올리고당을 아세틸화하여 얻어진 중합도가 2-15이고 분자량이 200~3000의 키틴올리고당 또는 키토산올리고당이 지방세포분화, 지방대사 등에 관여하는 유전자인 PPAR-α 또는 PPAR-γ 유전자의 발현을 억제시킨다고 보고하고 있다. 또한, 대한민국등록특허 제10-0602948호에서는 키토산올리고당이 산화된 저밀도 지단백질(oxLDL)에서의 산화 LDL의 수용체인 LOX-1을 코딩하는 유전자의 발현을 억제시키기 때문에 동맥경화를 예방하고 혈관을 보호할 수 있는 소재로 활용될 수 있다고 설명하고 있다. 아울러, 대한민국등록특허 제10-0989834호에서는 분자량 700~9000의 키토올리고당이 AMPK(AMP-activated protein kinase) 및 지방대사 관련 효소를 활성화시켜 간세포에서의 에너지 대사를 촉진시킨다는 사실에 근거하여 키토올리고당을 함유하는 피로 개선용 건강식품 조성물을 제안하고 있다.
이처럼 키토산 유도체에 대해서 다양한 생리적 활성 기능이 알려져 있으나, 키토산 올리고당의 다른 생리 활성 기능에 대한 연구가 필요한 실정이며, 특히 현재까지는 키토산 올리고당의 항천식 효과에 대해서는 보고된 것이 없다.
본 발명은 저분자량 키토산 올리고당의 항천식 효과에 대한 것으로, 본 발명의 목적은 저분자량 키토산 올리고당의 의약 및 산업분야 활용을 위해 아직 알려져 있지 않은 저분자량 키토산 올리고당의 새로운 생리활성 규명을 통하여 의약품 및 건강기능식품 등으로의 응용에 관한 것이다.
즉, 본 발명의 목적은 저분자량 키토산 올리고당의 새로운 생리활성 규명을 통하여 이를 유효 성분으로 함유하는 천식의 치료 및/또는 예방을 위한 약학 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 저분자량 키토산 올리고당을 유효 성분으로 함유하는 천식의 개선을 위한 식품조성물로서의 건강기능식품을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 후술하는 발명의 상세한 설명 및 첨부하는 도면 및 청구의 범위를 통해서 더욱 분명해질 것이다.
본 발명은 저분자량 키토산 올리고당의 새로운 생리활성 효과로서 항천식 효과를 밝혀내고 이를 약품이나 건강기능식품 등으로의 응용에 관한 것이다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 본 발명은 저분자량 키토산 올리고당을 유효 성분으로 함유하는 천식의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.
이때, 상기 저분자량 키토산 올리고당은 3 ~ 5개의 글루코사민으로 구성되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 저분자량 키토산 올리고당은 오브알부민(OVA)에 의해 유도된 기관지 폐포 세척액과 폐조직내의 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13) 및 종양괴사인자-알파(TNF-α)의 발현을 억제하는 방법으로 항천식 효과를 갖는다. 약품으로 활용되는 경우, 상기 저분자량 키토산 올리고당은 5 ~ 20 ㎎/㎏ body weight의 농도로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 관점에 따르면, 저분자량 키토산 올리고당을 유효 성분으로 함유하는 천식의 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에서 사용된 저분자량 키토산 올리고당은 천식동물모델에서 천식과 밀접한 관련이 있는 IL-4, IL-5, IL-13 그리고 TNF-α mRNA 및/또는 단백질 발현이 BALF와 폐조직에서 천식이 유발됨에 따라 현저히 증가하였고, 이와 같은 증가는 저분자량 키토산 올리고당을 구강 투여함으로써 IL-4, IL-5, IL-13 그리고 TNF-α mRNA 및/또는 단백질 발현을 억제하는 것을 확인함으로써 저분자량 키토산 올리고당이 항천식 소재라는 것을 증명하여 기능성 식품 소재로 이용 가능할 것이고, 또한 다양한 분야에 기능성 소재로 활용할 수 있을 것이다.
더하여 본 실험에 사용된 농도의 저분자량 키토산 올리고당은 ALT와 AST의 활성에 영향을 미치지 않으므로 독성이 없는 것으로 판단된다.
본 발명에 따른 저분자량 키토산 올리고당은 자연 산물 중에 키토산으로부터 유래되었고, 키틴으로부터 얻어진 N-아세틸글루코사민은 기능성과 안전성이 인정 된 탄수화물 소재 건강기능식품 기능성 원료이다. 따라서 본 발병에 사용된 저분자량 키토산 올리고당이 안전성이 확보될 수 있는 가능성이 높아 건강기능성이 증명되었을 때 건강기능성 원료로 사용할 수 있을 가능성이 높다. 세계적으로 키토산 올리고당은 다양한 건강기능이 밝혀져 의약, 식품 등 다양한 산업분야에 활용을 시도하고 있다. 따라서 저분자량 키토산 올리고당에 대한 항천식 효과에 대한 발명은 약 및 건강기능식품 소재로 키토산 올리고당 활용을 더욱 확대시킬 것이다.
본 발명에서는 키토산 올리고당의 항천식 효과 및 기본단위인 글루코사민이 바람직하게는 3-5개 결합[glucosamine(GlcN)n, n = 3-5]된 형태로 분자량은 바람직하게는 1.0 kDa 이하이며, 100% 탈아세틸화(deacetylation) 된 것이라는 것을 제시함으로써 산업적으로 대량 생산을 위한 과학적 정보도 제시하였다. 현재 의약품으로 사용되고 있는 항천식 치료제는 다양한 부작용을 가지고 있고 천연 소재인 저분자량 키토산 올리고당은 이들 부작용을 최소화할 수 있는 항천식 기능성 소재로 사용될 수 있으므로 항천식 예방 및 치료를 위한 기능성 소재로 활용 가능함으로 그 소재의 응용분야와 시장성은 광범위하다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따라 기도염증 질환과 관련이 있는 천식 마우스 모델을 이용하여, 저분자량 키토산 올리고당(low molecular weight chitosan oligosaccharides, LM-COS)이 천식에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험 과정을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에서 천식과 밀접한 관련이 있는 사이토카인인 IL-4, IL-13 및 TNF-α의 발현에 저분자량 키토산 올리고당(LM-COS)이 미치는 영향을 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 3은 폐-조직 내에서 천식과 밀접한 관련이 있는 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-13 및 TNF-α의 발현에 저분자량 키토산 올리고당(LM-COS)이 미치는 영향을 측정한 결과를 나타낸 것으로, 도 3a는 ELISA 분석에 따른 측정 결과를 도시한 사진이고, 도 3b는 이 결과를 그래프로 도시한 것이다. 도 3b에서 IL-4(B), IL-13(C), Il-5(D), TNF-α(E) 및 IL-4/IL-13(G)의 발현 정도와 함께 혈액 내의 ALT 및 AST 변화 정도(H)를 동시에 표시하였다.
전술한 것과 같이, 키토산 및 키토산 올리고당에 대하여 다양한 생리활성 효과가 알려져 있으나, 저분자량 키토산 올리고당이 항천식 효과가 있는지 그리고 어떤 기전에 의해 항천식 효과를 발휘하는지에 대해서는 보고된 바가 없다. 이에, 본 발명자들은 저분자량 키토산 올리고당의 새로운 생리활성 기능으로서 항천식 효과를 밝혀내고, 항천식 효과를 나타내는 건강기능식품, 의약품 등에 활용할 수 있는 천연 생리활성 소재로 저분자량 키토산 올리고당이 적당한 소재라는 것을 발명하였다. 이를 위해서 본 발명의 실시예에서는 오브알부민(ovalbumin, OVA)을 이용한 마우스의 천식 모델에서 저분자량 키토산 올리고당(low molecular weight chitosan oligosaccharides, LM-COS)의 항천식 효과를 알아보기 위하여 천식과 관련된 중요한 기관인 폐조직과 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에서 천식을 야기하는 것으로 알려져 있는 주요 사이토카인(cytokine)인 인터류킨-4(interleukin 4, IL-4), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-α, TNF-α)의 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. 이하에서는 본 발명에 대해서 보다 구체적으로 설명한다.
우선, 본 발명의 유효 성분인 저분자량 키토산 올리고당(low molecular weight chitosan oligosaccharides, LM-COS)은 고분자 키토산으로부터 얻어질 수 있다. 고분자량의 키토산으로부터 저분자량 키토산 올리고당을 얻기 위한 방법으로는 종래 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 키토산에 염산과 같은 산을 처리하는 산-분해법이나 알칼리로 처리하는 화학적 처리 방법이 사용될 수 있으나, 화학적 처리 방법으로는 적절한 크기의 저분자량의 키토산 올리고당의 함량이 매우 낮다. 따라서 바람직하게는 화학적 처리 방법을 대신하여 효소적 처리 방법에 의해 키토산으로부터 저분자량의 키토산 올리고당으로 가수분해될 수 있다. 이러한 효소적 처리 방법으로는 Aspergillus sp. Bacillus sp. 등이 분비하는 β-1,4-glucoside 결합을 분해하는 효소인 chitosanase와 같은 키토산 분해 특이적 효소(키토산 분해 효소)를 이용하거나, 셀룰로오스 분해효소인 셀룰라아제(cellulase)나 라이소자임(lysozyme)과 같은 비-특이적 효소를 이용하는 방법을 사용할 수 있다. 효소적 방법을 통해서 본 발명에 따른 저분자량의 키토산 올리고당을 높은 수율로 획득할 수 있는데, 특히 기본단위인 글루코사민이 2-10, 바람직하게는 3-5(즉, 중합도가 2-10, 바람직하게는 3-5)인 저분자량의 키토산 올리고당을 얻을 수 있다. 관련해서, 본 명세서에서 '저분자량의 키토산 올리고당' 또는 '저분자량 키토산 올리고당'은 분자량이 2.0 kDa 이하, 예를 들어 350 ~ 2000 Da, 바람직하게는 1.0 kDa 이하, 특히 바람직하게는 500 ~ 1000 Da이며, 기본단위인 글루코사민이 2-10, 바람직하게는 3-5개 결합된 [glucosamine(GlcN)n, n= 2-10, 바람직하게는 3-5] 형태의 키토산 올리고당을 의미하는 것으로 이해된다. 특히 바람직하게는 탈아세틸화도(degree of deacetylation, %DD)가 100%인 저분자량의 키토산 올리고당이다.
본 발명의 실시예에 사용된 저분자량의 키토산 올리고당은 분자량, 글루코사민 중합도, 탈아세틸화도가 이미 연구, 보고된 시료를 사용하였다(Park et al., 2011). 본 발명의 바람직한 실시예에서 사용된 저분자량 키토산 올리고당은 글루코사민이 3-5개 중합[(GlcN)n, n = 3-5]된 것으로, 분자량은 1.0 kDa 이하이다(Park et al., 2011).
한편, 천식(asthma)은 매우 흔한 만성 면역성 질환으로서, 기도 폐쇄(airflow obstruction), 기관지 경련(bronchospasm), 잦은 기침 등과 같은 다양하고 재발하는 증상이 특징이다. 잘 알려져 있는 것과 같이, 천식은 호흡기의 알레르기 반응에 의하여 기관지의 세부 기관이 세기관지가 수축하거나 기관지 점막의 종창이나 점액 분비로 인하여 호흡 곤란을 일으키는 질환이다.
천식은 유전적 원인은 물론이고 환경적 요인에 의해서도 유발되는데, 급성 천식의 경우에는 salbutamol과 같은 베타-2-아드레날린성 수용체 작용제(β-2-adrenoceptor agonist)를 흡입하는 방법으로 치료되기도 하며, 장기간의 치료를 위해서는 환경적 요인인 알레르기원(allergen)을 회피하거나 또는 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 흡입하는 방법이 제안되기도 한다. 하지만, 천식은 여전히 예방 및 치료가 쉽지 않은 질병이며, 산업화가 진전됨에 따라 그 빈도가 증가하고 있는 질병이다.
그 중에서도 기관지 천식은 제 2형 조력 T 세포(Th2 cell)에 의해 매개되며, 외부로부터 침입한 항원 때문에 나타나는 과민반응에 의한 질환이다(Wills-Karp, M. 1999. Annu. Rev. Immunol. 17: 255-281; Del, GF. et al. 1993. European J. Immunol. 23(7):1449-53). 즉, 기관지 천식은 알레르기 반응의 하나로 임상적으로 발작적인 호흡 곤란을 나타내며, 기도 염증, 기도 내 호산구 증가, 점액 과분비를 동반한 점액세포의 과증식 등의 여러 증상을 동반한다. 이때, 기관지 천식은 알레르기 반응에 관여하는 면역 글로불린인 Immunoglobulin E(IgE)와 관련이 있는 type Ⅰ 과민 반응인데, 외부로부터 유입된 천식 유발 물질인 항원이 폐에서 일종의 면역 반응을 일으킴으로써 유도된다.
특히 Th2 세포가 생산하는 Type 2형의 사이토카인(cytokine)인 IL-4, IL-5 및 IL-13은 지관지 천식의 중요한 매개 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Coyle AJ. et al. 1995. Am J Respir Cell Mol Biol. 13(1): 54-9; Nakajima H. et al. 1992. Am. Rev. Respir. Dis. 146(2): 374-7; Wills-Karp, M. et al. 1998. Sci. 282(5397): 2258-61; Cohn et al., 2004; Medoff et al., 2008). 특히 염증질환인 천식에 걸리게 되면 염증을 유발하는 사이토카인 TNF-α의 활성이 폐조직과 BALF에서 역시 증가하는 것으로 알려져 있다.
보다 구체적으로 살펴보면, 기관지 천식을 일으키는 항원은 1차적으로 대식세포에 의해 제거되고, 이 과정에서 활성화된 폐포의 대식세포가 B 세포를 자극하여 IgE를 생산하면, IgE는 비만세포를 활성화시키는 방법으로 초기 천식 반응을 담당한다. 이와 함께, 천식을 유발하는 항원에 노출된 B 세포는 CD4 T 세포를 자극하여 Th2 세포로 분화되고, 이 분화된 Th2 세포가 폐조직 및 기관지 폐포 세척액(BALF) 내에서 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13) 및 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-알파, TNF-α)와 같은 사이토카인의 분비를 촉진하고, 이들 촉진된 사이토카인에 의하여 기관지 과민성과 기도 폐쇄가 유발되어 천식 반응이 일어난다.
이에 본 발명에서는 전술한 저분자량 키토산 올리고당의 항천식 효과를 규명하기 위해서, OVA을 투여하여 천식이 유발된 마우스에 저분자량 키토산 올리고당을 투여하여 천식 반응과 관련하여 분비가 촉진된 사이토카인의 발현 정도를 억제하는지를 확인하였다. 잘 알려져 있는 것과 같이, 식품으로부터 분리·정제된 물질은 비교적 독성이 적어 의약품에 비해 장기간 섭취하여도 안전하다는 점 때문에 치료제 및 치료보조제로서의 가능성이 많이 연구되고 있는데, 본 발명에서는 OVA의 급여에 의해 유발된 천식 반응과 밀접한 관련이 있는 IL-4, IL-5, IL-13 및 TNF-α의 발현을 단백질 수준에서는 물론이고, mRNA 수준에서 억제하는 물질로서 저분자량 키토산 올리고당의 활성을 확인하였다.
구체적으로, 도 1에 개략적으로 도시되어 있는 절차에 따라, 모델 마우스에 오브알부민(OVA)으로 처리하여 천식을 유발시킨 뒤, 본 발명에 따른 저분자량 키토산 올리고당의 투여에 따른 천식 억제 정도를 살펴보았다. 우선, OVA 대신에 phosphate buffer saline(PBS, pH 7.4)으로 처리한 정상군(Normal), OVA으로 처리한 천식유발군(OVA, Asthma, 대조군(control)), OVA으로 처리한 뒤에 일정 농도(16.5 ㎎/kg body weigh/day)의 저분자량 키토산 올리고당 투여군(OVA+LM-COS)으로 나누었다. 그리고 마우스를 희생시킨 뒤, 폐포세척액과 폐조직내에서 천식과 관련이 있는 사이토카인의 발현 정도를 측정하였다.
우선, 천식유발군과 대조군을 비교한 결과, 천식유발군의 BALF에서 IL-4, IL-13 그리고 TNF-α 단백질 함량이 정상군과 비교하여 현저히 증가하였다(도 2). 또한, 천식유발군의 폐조직내 IL-4, IL-5, IL-13, TNF-α mRNA과 IL-4와 IL-13 단백질 함량을 대조군과 비교한 결과 역시 현저하게 증가하였다(도 3a 및 도 3b 참조). 반면, 천식 유발에 의해 BALF에서 증가한 IL-4, IL-13 및 TNF-α 단백질과, 폐조직내에서 증가된 IL-4, IL-5, IL-13 및 TNF-α의 mRNA 및 단백질은 저분자량 키토산 올리고당 투여군(16.5mg LM-COS/kg body weight/day)에서 현저히 감소한 것을 보여 주므로 LM-COS 처리한 실험군이 항천식 효과가 있다는 것을 알 수 있었다(도 2, 도 3a 및 도 3b 참조). 따라서 본 발명에 따른 저분자량 키토산 올리고당은 항천식 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.
결국, 본 발명에서는 천식을 유발하는 원인 물질로 잘 알려져 있는 오브알부민(Ovalbumin, OVA)을 마우스에 투여하여 천식을 유발시킨 뒤, 본 발명에 따른 저분자량 키토산 올리고당을 일정한 농도로 천식 유발 마우스에 투여한 결과, 이들 마우스의 폐포 세척액 및 폐조직에서 이들 천식 관련 사이토카인의 발현이 억제된다는 점을 근거하여 저분자량 키토산 올리고당의 항천식 효과를 규명하였다. 따라서 본 발명은 항천식 활성을 가지는 저분자량 키토산 올리고당을 유효 성분으로 함유하는 약학 조성물과 이러한 조성물에 일반적으로 사용되는 담체, 또는 추가적으로 부형제와 같은 첨가제가 함유되어 있는, 천식을 치료 또는 예방하기 위한 의약품 및 천식을 예방 또는 천식에 의한 체질을 개선하기 위한 건강기능식품에 관한 것이다.
우선, 본 발명은 저분자량 키토산 올리고당을 유효성분으로 함유하는 천식의 치료 및/또는 예방을 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 저분자량 키토산 올리고당의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 천식의 치료 및/또는 예방을 위한 약학 조성물에는 저분자량 키토산 올리고당을 유효성분으로 단독으로 포함할 수 있고, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분 즉, 약제학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 저분자량 키토산 올리고당을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 저분자량 키토산 올리고당은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제와 같은 희석제 또는 부형제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용할 수 있다.
예를 들어, 저분자량 키토산 올리고당을 포함하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 약학 조성물의 유효성분인 저분자량 키토산 올리고당에는 상기 성분들이 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명에 따른 저분자량 키토산 올리고당에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 및 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥 주사 또는 근육내 주사를 통할 수 있다. 비경구 투여를 위한 형태로는 치약, 구강세정제, 국소 투여제(크림, 연고, 드레싱 용액, 분무제, 기타 도포제 등) 등을 들 수 있다. 상기 국소 투여제의 제형의 일예로는, 유효성분인 저분자량 키토산 올리고당 또는 천식의 치료 및/또는 예방을 위한 약학 조성물을 천연 섬유 또는 합성 섬유로 만든 거즈 등의 담체에 함침시킨 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 천식의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제형은 사용 방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 경고제, 과립제, 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 산제, 시럽제, 액제, 에어로솔제, 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 전제, 침제, 점안제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 크림제, 환제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다. 더 나아가 본 발명의 구강질환 예방 또는 치료용 조성물은 당해 기술분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화 될 수 있다.
아울러, 천식의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물 중에는 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.
천식의 치료 및/또는 예방용의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 저분자량 키토산 올리고당은 0.001 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 99 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 50 중량% 포함될 수 있다. 하지만, 본 발명의 항천식 약학 조성물의 사용 방법 및 사용 목적에 따라 유효 성분인 저분자량 키토산 올리고당의 함량을 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 치료 및/또는 예방용의 약학 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용될 수 있다. 적용 대상인 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배설 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 바람직하게는 척추동물, 더욱 바람직하게는 포유류일 수 있다. 구체적으로는 상기 포유류는 인간, 돼지, 소 또는 염소 등일 수 있다. 특히, 본 발명의 저분자량 키토산 올리고당은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 저분자량 키토산 올리고당을 포함하는 천식의 치료 및/또는 예방용의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서의 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 저분자량 키토산 올리고당은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg, 더욱 바람직하게는 5 내지 20 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하게는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 약학적 조성물의 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/㎏이고, 바람직하기로는 0.0001 g ~ 5 g/kg이며, 하루 1~6회 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 저분자량 키토산 올리고당을 유효성분으로 함유하는 천식 개선용 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 식품 조성물의 예로는 식품, 식품첨가제, 음료 또는 음료첨가제를 들 수 있다. 본 명세서에서 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이며, 바람직하게는 껌 또는 캔디일 수 있다.
본 발명은 천식 질환의 치료, 예방 및/또는 개선 효과를 나타내는 저분자량 키토산 올리고당 및 식품학적으로 허용가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 저분자량 키토산 올리고당을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 캔디, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있으며 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 저분자량 키토산 올리고당 및 이의 약학적 및/또는 식품공학적으로 허용가능한 염을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영·유아식 등), 식육 가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실·채소류 음료, 두유류, 발효 음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 명세서에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 바람직하게는 본 발명의 기능성 식품은 구강질환의 예방 또는 개선에 관한 체조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발현할 수 있는 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 명세서에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다. 본 명세서에서 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.
본 발명의 저분자량 키토산 올리고당을 식품 첨가물로 사용할 경우, 저분자량 키토산 올리고당을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 저분자량 키토산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 또한, 천식의 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 천식 개선 효과를 목적으로 하는 식품 또는 음료 중에 본 발명에 따른 저분자량 키토산 올리고당의 양은 전체 식품 중량의 0.0001 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.001 내지 50 g, 바람직하게는 0.01 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다. 본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 저분자량 키토산 올리고당을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물과 같은 식품 보조 첨가제 성분을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
전술한 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당과 같은 단당류(모노사카라이드); 말토오스, 수크로오스 등과 같은 이당류(디사카라이드); 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 다당류(폴리사카라이드) 등과 같은 통상적인 당은 물론이고, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제 또는 감미제로서 타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진)과 같은 천연 향미제/감미제; 사카린, 아스파탐과 같은 합성 향미제/감미제 등을 사용할 수 있다. 이와 같이 식품에 함유될 수 있는 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내 지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는다.
그 외에 본 발명의 건강기능식품의 식품 조성물에는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명에 따른 식품공학적 조성물 중에는 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 저분자량 키토산 올리고당 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부, 바람직하게는 0.01 ~ 1.0 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 결코 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예 1: 사용한 저분자량 키토산 올리고당 제조
본 실험에 사용한 저분자량 키토산 올리고당을 제조하기 위하여, 고분자 키토산을 1% acetic acid(w/v)를 NaHCO3를 사용하여 pH 5.0으로 맞춘 뒤, 원심분리(14,000rpm, 30min)하여 녹지 않은 물질은 제거하였다. 키토산 분해효소(Kyowa Chemical Ltd., Tokyo, Japan)를 0.5U(nmol reducing sugars/㎍/min) 이용하여 30 ℃에서 2시간 동안 가수분해한 후 100 ℃에서 10분 동안 반응을 정지하기 위해 끓였다. 원심분리하여 상층액에 있는 키토산 올리고당을 얻은 후 10 kDa의 분자량 이하의 분자량을 가진 물질이 통과할 수 있는 ultra-filtration membrane filter를 이용하여 단백질, 녹지 않은 물질을 제거하고 물이 녹는 수용성 키토산-올리고당을 얻었다. 얻은 수용성 키토산-올리고당은 동결건조하였다. Bio Gel-P 4(Bio-RAD, USA) 겔로 충진된 gel-filtration column chromatograph(Φ1.0 ㎝ x L 30 ㎝)는 ammonia/formic acid(pH 7.5)를 함유하고 있는 완충액으로 안정화 시킨 후 같은 완충액에 500 ㎎/㎖ 농도의 저분자량 키토산 올리고당을 녹인 후 gel-filtration column에 주입하여 분당 5 ㎕ 속도(flow-rate: 5 ㎕/min)로 용출하였고, Nelson-Somogyi 방법(Smogyi, 1952)으로 탄수화물이 검출되지 않을 때까지 용출하였다.
획득된 두 주요한 탄수화물을 함유하고 있는 분획물은 matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)(Voyager-DE TM STR Biospectrometry Workstation, Applied Biosystems Inc., NCIRF, Korea) 분석을 시행하였다. 키토산 분해 효소를 이용해 가수분해하여 얻은 키토산 올리고당의 분자량과 탈아세틸화 정도는 MALDI-TOF MS 분석에 의해 알 수 있었다. 즉 탈아세틸화 정도, 분자량은 GlcN과 N-acetylglucosamine(GlcNAc)의 분자량을 기초하여 계산하였다. 본 발명에서 사용된 저분자량 키토산 올리고당은 기본단위인 글루코사민이 3-5개 결합[glucosamine(GlcN)n, n=3-5]된 형태로 분자량은 1.0 kDa 이하이며, 100% 탈아세틸화(deacetylation) 된 것을 확인하였고, 이를 후술하는 실시예에서 사용하였다.
실시예 2: 천식 유발 동물 모델, 폐조직 및 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 채취
천식 동물모델은 마우스를 이용한 것으로 Balb/c(6 주령)를 이용하였다. 천식 유발 동물 모델 및 이들 모델을 이용하여 저분자량 키토산 올리고당 천식 개선효과 실험을 위한 개략적인 모식도를 도 1에 나타내었다. 즉, 천식 모델의 경우 phosphate buffer saline(PBS, pH 7.4)에 녹인 OVA(500 ㎍/㎖)(Sigma, St. Louis, MO, USA)과 면역 증강제인 alum(500 ㎍/㎖)을 3:1의 비율로 섞어 267 ㎕/mouse/day 녹여 0, 6, 12일로 3회 복강 투여하였으며, 이후 Compressor Nebulizer(0.4 ㎖/min, Omron, Tokyo, Japan)를 이용하여 PBS에 녹인 2% OVA(w/v)를 10분간 분무 후 5분 방치하여 매일 마우스의 호흡기에 15일간 분무하였다. 천식 비유발 모델(정상군)의 경우 PBS를 복강 주사 및 분무하였다. 효능 실험군에서는 저분자량 키토산 올리고당(16.5 ㎎ LM-COS/kg body weigh/day)을 경구용 존대를 이용하고 정확한 양을 경구 섭취시켰다. 이와 같이 처리한 후 16-19시간 절식시킨 후 졸레틸 50(Virbac S.A, France)과 럼푼(Bayer, Germany)를 3:2로 섞어 마우스 복강에 주사하여 마취시킨 후 심장 채혈하여 혈액을 취한 후 1.5 ㎖ 원심튜브에 넣고 실온에서 혈액을 응고 시킨 후 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 혈청을 얻었으며, 실험하기 전까지 -70 ℃에 보관하였다. 채혈 후 BALF를 분리는 마우스를 마취한 후 경부와 흉부의 피부를 절개하고 기관지를 개봉한 뒤, PBS를 기관지로 통해서 1회에 0.5 ㎖을 3회 넣어 폐포를 세척하고, 수거한 후 회수된 세척액을 최종 부피를 1.5 ㎖로 맞춘 뒤, 4 ℃, 1,000 rpm으로 10분간 원심분리하고, 이 상등액은 cytokine 측정을 위해 -70 ℃에 보관하였다. 폐조직은 적당한 크기(1-2g)로 잘라 액체질소에 급속 동결한 후 -70 ℃에 보관하였다.
실시예 3: 저분자량 키토산 올리고당 구강 투여에 의한 천식관련 유전자 발현량 변화 측정
3-1. RT-PCR
1 단계: 세포내의 RNA 추출
폐조직에 TRIzol Reagent(Invitrogen, Carlsbad CA, USA)를 1 ㎖씩 가하여 완전히 마쇄 시킨 후 0.2 ㎖의 클로로포름을 넣고 15초간 잘 흔들어 준 후 실온에서 2-3분간 더 반응시켰다. 4 ℃에서 15분간 원심분리(12,000xg)하면 가장 위층인 RNA, 중간층인 DNA, 그리고 가장 아래층인 단백질 층으로 분리되었다. DNA가 오염되지 않게 조심스럽게 위층을 잘 분리하여 다른 튜브로 옮긴 후 isopropyl alcohol 0.5 ㎖을 넣고 10분간 반응시켜 RNA를 침전시켰다. 그 후 4 ℃에서 10분간 원심분리(12,000xg) 후 상층액을 버리고 침전물을 75% DEPC-ethanol 1㎖을 넣고 몇 번 흔들어 준 후 다시 4℃에서 5분간 원심분리(12,000xg) 하였다. 역시 상층액을 버리고 실온에서 침전물을 5-10분간 말린 다음 RNase-free 증류수나 0.1% DEPC 증류수로 침전물을 녹였다. 0.1% DEPC 증류수 995.0 ㎕에 RNA 5 ㎕을 넣어 200배 희석 후 260 ㎚와 280 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. RNA의 농도는 260 ㎚에서의 흡광도값 x 40 ㎍/㎖ x (희석배수)로 계산하고, 260 ㎚와 280 ㎚의 비가 1.6이상 일 때 순수한 RNA라고 보고 다음 단계를 진행하였다.
2 단계: Oligonucleotide primers의 합성
본 발명에서 사용한 IL-4, IL-5, IL-13, TNF-α, β-actin 유전자 발현 연구를 위해 PCR에 사용된 primers의 염기서열을 표 1에 나타냈다.
사용한 primers의 염기서열
Sequence1)
Sense Antisence
IL-4 5'-TGTTTCTGGCTGTTACTG-3' 5'-TTGCTGTTGCTGAAGAAG-3'
IL-5 5'-AAGCAATGAGACGATGAG-3' 5'-CATCACACCAAGGAACTC-3'
IL-13 5'-TTGCTTGCCTTGGTGGTC-3' 5'-GGCTGGAGACCGTAGTGG-3'
TNF-α 5'-GGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTGC-3' 5'-ACATTCGAGGCTCCAGTGAATTCGG-3'
β-actin 5'-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3' 5'-AGGTCTTTACGGATGTCAACG-3
1)Primer: 5 →3으로 나타냄.
3 단계: cDNA 합성
본 발명에 First-stand cDNA를 생산하기 위하여 Power cDNA synthesis kits (Invitrogen)를 이용하였다. 즉, RNase-free 튜브에 추출한 RNA(2 ㎍)와 RNase-free water로 최종 부피가 9.5 ㎕가 되도록 맞추고 oligo(dT)15 primer(500 ㎍/㎖) 1 ㎕를 더한 다음, 75 ℃에서 5분 동안 끓인 후 용액을 튜브 아래로 모운 다음 즉시 얼음에서 냉각시켰다. 1 ㎕ RNase inhibitor(10U/㎕), 5 x RT buffer 4.0 ㎕, dNTP Mix(10 mM: each 2.5 mM) 2 ㎕ 및 AMV RT enzyme(Invitrogen) 0.5 ㎕를 첨가한 후 피펫으로 골고루 섞었다. 그 후 42 ℃에서 60분, 70 ℃에서 15분간 반응시켰다.
4 단계: PCR
각 유전자 발현을 알아보기 위하여 PCR를 실시하였다. 2 x PCR Master mix Solution (i-StarTaqTM)(iNtRON BIOTECHNOLOGY, Korea) 10 ㎕, 표 1에 표시된 Forward Primer(10 pmol/㎕)와 Reverse Primer(10 pmol/㎕)를 각각 1 ㎕, 증류수 7 ㎕ 그리고 앞에서 합성한 first-strand cDNA(DNA template) 1 ㎕을 PCR tube에 넣은 후 잘 섞었다. 각 혼합물을 94℃에서 2분간 pre-denature시킨 후, 94 ℃에서 20초간, annealing 온도(60 ℃: β-actin, 54 ℃: IL-4, 50 ℃: IL-5, 60 ℃: IL-13, TNF-α)에서 30초간, 72 ℃에서 40초간(각 유전자 마다 cycles가 다름) cycles를 실시하였고, 최종적으로 72 ℃에서 4분간 extension 반응을 하였다. PCR 산물은 0.002% ethidium bromide가 첨가된 2% agarose gel에 80V에서 30시간 전기영동 한 후, 자외선광으로 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 SigmaGel(Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA) 소프트웨어에 의해 분석 정량하였고, 내부 표준물로써 β-actin을 사용하였다.
실시예 4 : Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) analysis
ELISA kit(IL-4 와 IL-13, eBioscience, San Diego, CA; TNF-α, BD Biosciences San Jose, CA)를 사용하여, 생쥐에서 분리된 기관지폐포세척액(BALF)의 cytokine의 양을 측정하였다. 항-cytokine 항체가 코팅된 96 well plate에 BALF를 가하여 반응시킨 후 세척하였다. 그 후 biotin이 표지된 항cytokine 항체(IL-4, IL-13, TNF-α)를 가하여 반응시킨 후 세척하고 여기에 straptavidin-HRP를 가하여 ELISA-reader를 이용하여 측정하였다(450 ㎚-570 ㎚).
실시예 5: 저분자량 키토 올리고당의 항천식 관련 유전자 발현량 측정
BALF내의 IL-4, IL-13 그리고 TNF-α 단백질 발현을 측정한 결과(도 2), OVA에 의해 유발된 천식모델군에서 IL-4, IL-13 및 TNF-α 단백질이 OVA 대신 PBS를 처리한 정상군과 비교하여 현저한 증가를 나타내었고, 천식을 유발시키면서 동시에 저분자량 키토산 올리고당(16.5mg LM-COS/kg body weigh/day)을 구강 투여한 처리군의 BALF내 IL-4, IL-13 그리고 TNF-α 단백질 발현이 천식유발군과 비교하여 현저하게 감소하였다.
한편, 폐조직내 IL-4, IL-5, IL-13 및 TNF-α mRNA (도 3a, 도 3b의 B 내지 E)와, IL-4와 IL-13 단백질(도 3b의 G) 발현을 측정한 결과, OVA에 의해 유발된 천식유발군의 폐조직내 IL-4, IL-5, IL-13와 TNF-α mRN 및 IL-4와 IL-13 단백질 발현이 현저하게 증가하였다. 반면, LM-COS 투여군은 천식유발군과 비교하여 IL-4, IL-5, IL-13와 TNF-α mRNA 및 IL-4와 IL-13 단백질의 발현이 현저히 감소되었다. 아울러, 혈액 내의 간기능 지수인 ALT(alkaline aminotransferase)와 AST(aspartate aminotransferase)는 변화가 없었다(도 3b의 H 참조).
상기의 결과로부터 본 발명은 OVA에 의해 천식이 유발됨으로써 BALF내와 폐조직에서 생성량이 증가된 천식 관련 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-13 그리고 TNF-α를 저분자량 키토산 올리고당 섭취에 의해 천식관련 사이토카인 발현량의 감소를 보여주므로 저분자량 키토산 올리고당이 천연 항천식 소재로 이용가능하며 따라서 항천식 활성을 갖는 저분자량 키토산 올리고당을 함유하는 약리적 조성물 발명이 가능할 것이라는 것을 추론할 수 있었다.

Claims (6)

  1. 저분자량 키토산 올리고당을 유효 성분으로 함유하는 천식의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 저분자량 키토산 올리고당은 3 ~ 5개의 글루코사민으로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 천식의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 저분자량 키토산 올리고당은 오브알부민(OVA)에 의해 유도된 기관지 폐포 세척액과 폐조직내의 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13) 및 종양괴사인자-알파(TNF-α)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 천식의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 저분자량 키토산 올리고당은 5 ~ 20 ㎎/㎏ body weight의 농도로 투여되는 것을 특징으로 하는 천식의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
  5. 저분자 키토산 올리고당을 유효 성분으로 함유하는 천식의 개선을 위한 건강기능식품.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 저분자량 키토산 올리고당은 3 ~ 5개의 글루코사민으로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 천식의 개선을 위한 건강기능식품.
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Cited By (3)

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