WO2021060792A1 - 키토산을 포함하는 면역억제용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

키토산을 포함하는 면역억제용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2021060792A1
WO2021060792A1 PCT/KR2020/012741 KR2020012741W WO2021060792A1 WO 2021060792 A1 WO2021060792 A1 WO 2021060792A1 KR 2020012741 W KR2020012741 W KR 2020012741W WO 2021060792 A1 WO2021060792 A1 WO 2021060792A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
chitosan
composition
regulatory
kda
Prior art date
Application number
PCT/KR2020/012741
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
황동수
임신혁
변서현
이수영
이유정
Original Assignee
포항공과대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 포항공과대학교 산학협력단 filed Critical 포항공과대학교 산학협력단
Publication of WO2021060792A1 publication Critical patent/WO2021060792A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans
    • A61K31/722—Chitin, chitosan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2066—IL-10
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A61K8/736—Chitin; Chitosan; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q90/00—Cosmetics or similar toiletry preparations for specific uses not provided for in other groups of this subclass
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/324—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/50—Polysaccharides, gums
    • A23V2250/51—Polysaccharide
    • A23V2250/511—Chitin, chitosan

Definitions

  • the present invention relates to a composition for immunosuppression comprising chitosan, and more specifically, a chitosan deacetylated at least 89% and having a molecular weight of 5 kda or less, which induces differentiation from inactive auxiliary T cells to regulatory T cells. It relates to a composition for immunosuppression comprising and a pharmaceutical composition for preventing or treating immune diseases or inflammatory diseases comprising the composition as an active ingredient.
  • Chitosan can be obtained by deacetylating chitin, a biopolymer that makes up the shell of crustaceans, the exoskeleton of insects, and the cell walls of fungi. More specifically, chitin is deacetylated in a basic environment treated with sodium hydroxide, and the chain is cleaved using an acid treatment such as hydrochloric acid or nitrous acid or enzymes such as chitinase, chitosanase, pepsin, and lysozyme, resulting in low-molecular chitosan.
  • an acid treatment such as hydrochloric acid or nitrous acid
  • enzymes such as chitinase, chitosanase, pepsin, and lysozyme
  • Chitosan is widely applied as a biomaterial because it has various properties such as excellent biocompatibility and biodegradability, wound healing, hemostasis, and antibacterial action.
  • it is used as a variety of biomaterials such as implants, adhesives, hemostatic agents, or drug delivery systems, and in particular, a number of health functional foods using the immunomodulatory activity and anticancer activity exhibited by chitosan are manufactured and sold.
  • the present inventors studied to apply chitosan to the treatment of immune diseases such as allergies and inflammatory diseases caused by excessive immune reactions, and as a result, the opposite immune activity of chitosan was determined by the production and purification process of chitosan, a raw material derived from chitosan.
  • the determined degree of deacetylation, originating from the molecular weight difference between protein and chitosan, and the molecular weight range and degree of acetylation of chitosan that induce an immunosuppressive reaction of chitosan were first identified.Based on this, the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a composition for immunosuppression comprising chitosan having a molecular weight of 5 kda or less and deacetylated at least 89%.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating immune diseases or inflammatory diseases, comprising the composition as an active ingredient.
  • another object of the present invention is to provide a health functional food composition for preventing or improving immune diseases or inflammatory diseases, comprising the composition as an active ingredient.
  • another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for preventing or improving immune diseases or inflammatory diseases, comprising the composition as an active ingredient.
  • the present invention comprises a chitosan having a molecular weight of more than 89% deacetylated and 5 kda or less. It provides a composition for immunosuppression.
  • the composition may induce differentiation of inactive auxiliary T cells (naive T cells) into regulatory T cells (regulatory T cells, T reg ).
  • the regulatory T cells may be CD4 + Foxp3 + regulatory T cells.
  • the regulatory T cells may secrete interleukin-10 (IL-10).
  • IL-10 interleukin-10
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating irritable immune disease or inflammatory disease, comprising the composition as an active ingredient.
  • the irritable immune disease is irritable bowel syndrome, ulcerative enteritis, Crohn's disease atopic dermatitis, allergic rhinitis, contact dermatitis, asthma, psoriasis, scleroderma, neurodegenerative disease, vitiligo, And it may be any one or more selected from the group consisting of autoimmune diseases.
  • the autoimmune disease is rheumatoid arthritis, lupus, type 1 diabetes, myasthenia gravis, gout, ankylosing spondylitis, systemic scleroderma (scleroderma), Guilian-Barre syndrome, skin It may be any one or more selected from the group consisting of dermatomyositis, polymyositis, multiple sclerosis, autoimmune encephalomyelitis, pemphigus, Crohn's disease, Sjogren's syndrome and Behcet's disease.
  • the inflammatory disease is edema, periodontitis, rhinitis, otitis media, sore throat, tonsillitis, pneumonia, gastric ulcer, gastritis, colitis, hemorrhoids, gout, ankylosing spondylitis, arthritis, osteoarthritis, peri-shoulderitis, tendinitis, tendonitis , Myositis, hepatitis, cystitis and nephritis may be any one or more selected from the group consisting of.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving irritable immune disease or inflammatory disease, comprising the composition as an active ingredient.
  • the present invention provides a cosmetic composition for preventing or improving irritable immune disease or inflammatory disease, comprising the composition as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating an irritable immune disease or an inflammatory disease, comprising administering the pharmaceutical composition to an individual.
  • the present invention provides a use of the pharmaceutical composition for preventing or treating irritable immune diseases or inflammatory diseases.
  • the present inventors studied to apply chitosan to the treatment of hypersensitivity immune diseases such as allergies, autoimmune diseases, and inflammatory diseases caused by excessive immune reactions.
  • hypersensitivity immune diseases such as allergies, autoimmune diseases, and inflammatory diseases caused by excessive immune reactions.
  • the molecular weight range and the degree of acetylation of chitosan that induces immunosuppression As it was found out, by inducing differentiation of inactive helper T cells into CD4 + Foxp3 + regulatory T cells, the regulatory T cells secrete IL-10, thereby inhibiting the immune response, which is useful for the treatment of irritable immune diseases or inflammatory diseases. It is expected to be used.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram schematically representing a mechanism by which chitosan affects the differentiation of T cells and suppresses immunity.
  • 2A is a result showing the physical properties of chitosan, showing the result of confirming the molecular weight and molecular weight distribution content of chitosan according to the present invention through MALDI-TOF MS experiment.
  • 2B is a result showing the physical properties of chitosan, showing the result of confirming the acetyl group content of chitosan according to the present invention through NMR.
  • 3A is a result showing the function of inducing regulatory T cell differentiation of chitosan.
  • Dendritic cells cultured by treatment with specific concentrations of 1 kda, 5 kda and 15 kda chitosan in vitro were regulated with inactive CD4 + auxiliary T cells. It shows the result of confirming the expression level of Foxp3 + when cultured under conditions capable of cell differentiation.
  • 3B is a result showing the function of inducing regulatory T cell differentiation of chitosan, as a result of confirming the amount of Foxp3 + expression according to the concentration of 1 kda, 5 kda and 15 kda chitosan (red bar is 1 Kda chitosan, blue bar is 5 Kda chitosan , Gray bars represent the results of treatment with 15 Kda chitosan).
  • 4A is a result showing the function of inducing regulatory T cell differentiation of chitosan.
  • Dendritic cells cultured in vitro with specific concentrations of 1 kda, 5 kda and 15 kda chitosan were treated with inactive CD4 + auxiliary T cells and auxiliary T It shows the results of confirming the expression level of Foxp3 + when cultured under essential conditions for cell survival.
  • 4B is a result showing the function of inducing regulatory T cell differentiation of chitosan, and shows the result of confirming the survival rate of regulatory T cells under the above conditions.
  • FIG. 4C is a result showing the function of inducing regulatory T cell differentiation of chitosan, showing the results of confirming the expression of T-bet, a marker of T helper 1 cells, and GATA3, a marker of T helper 2 cells (FIG. 4c ).
  • Figure 5a is a result showing cytokines secreted from the colonic mucosa (Lamina intestinal) and mesenteric lymph nodes of the DSS-induced colitis animal model treated with chitosan, and weight loss after treatment with 1 kda chitosan in the DSS-induced colitis animal model It shows the result of checking whether or not.
  • 5B is a result showing cytokines secreted from the colonic mucosa (Lamina intestinal) and mesenteric lymph nodes of the DSS-induced colitis animal model treated with chitosan, and the length of the colon after treatment with 1 kda chitosan in the DSS-induced colitis animal model It shows the result of confirming the decrease.
  • Figure 5c is a result showing the cytokines secreted from the mucous membrane of the large intestine (Lamina intestinal) and the mesenteric lymph nodes of the DSS-induced colitis animal model treated with chitosan. will be.
  • 5D is a result of showing cytokines secreted from the colonic mucosa (Lamina intestinal) and mesenteric lymph nodes of the DSS-induced colitis animal model treated with chitosan, and shows the results of confirming cytokines secreted from the mesenteric lymph nodes.
  • the present inventors have studied to apply chitosan to the treatment of hypersensitivity diseases such as autoimmune diseases, allergies, and inflammatory diseases caused by excessive immune reactions.
  • hypersensitivity diseases such as autoimmune diseases, allergies, and inflammatory diseases caused by excessive immune reactions.
  • the molecular weight range and the degree of acetylation of chitosan that induces immunosuppressive reactions As it was found out, the present invention was completed based on this.
  • the present invention provides a composition for immunosuppression comprising chitosan, which is deacetylated at least 89% and has a molecular weight of 5 kda or less.
  • chitosan which is deacetylated at least 89% and has a molecular weight of 5 kda or less.
  • the degree of deacetylation of chitosan is 89% or more and 97.4% or less
  • the molecular weight range of chitosan is 1 Kda or more and 5 Kda or less, but is not limited thereto.
  • the composition can induce differentiation of inactive helper T cells (naive T cells) into regulatory T cells (regulatory T cells, T reg ), and the regulatory T cells are CD4 + Foxp3 + regulatory T cells It may be, and the regulatory T cell may be one that secretes IL-10.
  • the “naive T cell” is called a helper T cell or a helper T cell having a CD4 molecule as a marker. It refers to T cells that have not been met.
  • MHC antigen complex presented to the antigen presenting cell
  • the antigen is recognized through the T-Cell Receptor signaling pathway and activated as an effector T cell to initiate an acquired immune response.
  • L-selectin CD62L
  • CD25, CD44, CD69 which are characteristics of effective T cells, hardly exist.
  • the activation process is as follows.
  • T cells activation of T cells occurs when inactive T cells encounter the MHC: antigen complex.
  • the T cell receptor of inactive T cells binds to the MHC:antigen complex
  • the CD45 protein of the T cell dephosphorylates the Fyn protein inside the cell.
  • Fyn activated by dephosphorylation phosphorylates the ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) of the T cell antigen receptor's accessory protein chains CD3 gamma ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), epsilon ( ⁇ ), and zeta ( ⁇ ) chains.
  • ITAM Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif
  • ZAP-70 protein binds to the zeta chain of ITAM-phosphorylated CD3 protein, and Lck protein attached to CD4, a co-receptor of T cells, phosphorylates ZAP-70 protein.
  • ZAP-70 protein phosphorylated and activated by Lck protein triggers a signaling reaction that activates transcription factors such as NF ⁇ AP-1 and NFAT by phosphorylating LAT protein and SLP-76 protein.
  • Transcription factors such as NF ⁇ AP-1 and NFAT promote the expression of Interleuking-2 (IL-2), allowing T cells to divide and differentiate.
  • IL-2 Interleuking-2
  • the "regulatory T cell (T reg )” is a group of T cells that regulate the immune system, and maintains immunological tolerance to autoantigens and some foreign antigens (Immune-tolerance). And suppresses excessive immune response. Regulatory T cells generally inhibit or down-regulate the induction and proliferation of effector T cells. According to the differentiation of regulatory T cells in mouse model experiments, it is reported that autoimmune diseases and cancer can be treated and organ transplantation can be facilitated. All T cells are made from the hepatocytes of the bone marrow and continue lineage in the thymus.
  • All T cells are CD4 - CD8 - TCR - cells starting at the double-negative stage (DN), and individual cells modulate their own T cell receptor genes to create a unique T cell receptor structure.
  • DN double-negative stage
  • the autoantigen reactivity of T cell receptors is tested by binding to MHC molecules of cortical cells in the thymus epithelium.
  • DP T cells Upon receiving a signal by an autoantigen, DP T cells enter the single-positive (SP) stage, which expresses CD4 or CD8, respectively.
  • SP single-positive
  • Selection of regulatory T cells occurs in antigen presenting cells expressing MHC class II in the thymus in the SP stage. Regulatory T cells show a strong affinity towards self-peptide.
  • the selection process of regulatory T cells is determined by the affinity in the interaction between the autologous peptide-MHCII molecule and the T cell receptor, and the process of selection to become a regulatory T cell is called the'Negative Selection' process.
  • T cells receiving a strong signal undergo apoptotic death, and cells receiving a weak signal remain alive and are selected as effective cells. If a T cell receives a medium-intensity signal, it becomes a regulatory T cell. Because of the probabilistic nature of the T cell activation process, it is reported that all T cell populations given a TCR will eventually become a mixture of effector T cells (T eff ) and regulatory T cells (T reg ).
  • induced regulatory T cells (CD4 + CD25 + Foxp3 + ) are inhibitory cells associated with immune tolerance. Induced regulatory T cells (iT reg ) develop outside the thymus from common inactive CD4 + helper T cells. Although induced regulatory T cells (iT reg ) and thymus derived regulatory T cells (nT reg ) share functionally similar aspects, induced regulatory T cells have recently expanded TCR diversity within a'essential and useless, regulatory response'. It is reported to be a regulatory subpopulation that partially supplements natural regulatory T cells through'.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating irritable immune disease or inflammatory disease comprising the composition as an active ingredient.
  • irritable immune disease are irritable bowel syndrome, ulcerative enteritis, Crohn's disease atopic dermatitis, allergic rhinitis, contact dermatitis, asthma, psoriasis, scleroderma (scleroderma), neurodegenerative disease, vitiligo. And any one or more selected from the group consisting of autoimmune diseases, but is not limited thereto.
  • the “autoimmune disease”, which is a disease targeted by the present invention, is a disease that is caused by autoimmunity and causes an excessive immune response to normal tissues, molecules, cells, etc. of the body. In other words, the immune response mistakenly sees healthy cells as harmful and attacks them.
  • autoimmune diseases are also manifested by lymphocytes that have receptors that react with their own molecules in the body among various lymphocytes. If the above self-reactive lymphocytes are not removed or inactivated, the immune system will eventually attack its own cells or tissues.
  • lymphocytes with receptors specific for magnetic molecules die or become non-responsive cells by apoptosis.
  • self-tolerance only lymphocytes that react with non-magnetic molecules remain, and this process is called self-tolerance. If the auto-tolerance mechanism is not normal, it causes autoimmune diseases.
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, lupus, type 1 diabetes, myasthenia gravis, gout, ankylosing spondylitis, systemic scleroderma (scleroderma), Guilian-Barre syndrome, dermatomyositis, polymyositis. (polymyositis), multiple sclerosis, autoimmune encephalomyelitis, pemphigus, Crohn's disease, Sjogren's syndrome and Behcet's disease, and the autoimmune disease according to the present invention may be any one or more selected from the group consisting of the above, but is limited thereto. It does not become.
  • “Inflammatory disease” as a disease target in the present invention is edema, allergy, periodontitis, rhinitis, otitis media, sore throat, tonsillitis, pneumonia, gastric ulcer, gastritis, colitis, hemorrhoids, gout, ankylosing spondylitis, arthritis, osteoarthritis, peri-shoulderitis, tendinitis , Tendonitis, myositis, hepatitis, cystitis, and nephritis may be any one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of an immune disease or an inflammatory disease by administration of the composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which symptoms for an immune disease or an inflammatory disease are improved or advantageously changed by administration of the composition according to the present invention.
  • the inventors of the present invention induce differentiation into regulatory T cells (T reg ) from chitosan-inactivated auxiliary T cells (naive T cells) having a molecular weight of more than 89% deacetylated and less than 5 kda through examples.
  • T reg regulatory T cells
  • auxiliary T cells chitosan-inactivated auxiliary T cells having a molecular weight of more than 89% deacetylated and less than 5 kda through examples.
  • the function of preventing or treating immune diseases or inflammatory diseases was investigated.
  • 1 kda chitosan according to the present invention has 2.6% acetyl group (deacetylation degree is 97.4%), 5 kda chitosan has 11% acetyl group (deacetylation degree is 89%), 15 It was confirmed that kda chitosan has an acetyl group of 15% (deacetylation degree is 85%) (see Example 2).
  • dendritic cells isolated from the spleen of mice were treated with 1 kda, 5 kda, and 15 kda chitosan, respectively, and cultured, and inactivated auxiliary T cells were converted into regulatory T cells under conditions capable of differentiation of regulatory T cells.
  • dendritic cells isolated from the spleen of mice are treated with 1 kda, 5 kda, and 15 kda chitosan, respectively, and cultured, and inactivated helper T cells are regulated in the essential conditions for supplemental T cell survival.
  • 1 kda chitosan it was confirmed that the 1 kda chitosan induced the most differentiation of Foxp3 + regulatory T cells, and when treated with 1 kda chitosan, the different markers of T-bet and GATA3 It was confirmed that all of the expression levels were reduced (see Example 3-2).
  • Foxp3 + regulatory T cells were significantly increased in the experimental group under the conditions of feeding 200 ul of 1 kda chitosan at a concentration of 25 mg/ml and drinking water treated with 1% DSS.
  • IL-10 an anti-inflammatory cytokine
  • chitosan which is deacetylated by 89% or more and has a molecular weight of 5 kda or less, prevents or treats immune diseases or inflammatory diseases by inducing differentiation of inactive auxiliary T cells into regulatory T cells. As confirmed, this suggests that the chitosan can be usefully used for the prevention or treatment of immune diseases or inflammatory diseases.
  • the prophylactic or therapeutic pharmaceutical composition according to the present invention comprises chitosan having a molecular weight of at least 89% deacetylated and less than 5 kda. It includes a composition for immunosuppression as an active ingredient, and may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in formulation, and includes, but is limited to, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, and the like. It is not, and other conventional additives such as antioxidants and buffers may be further included as needed.
  • injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, etc., pills, capsules, granules, or tablets.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations it can be preferably formulated according to each component using a method disclosed in Remington's literature.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in its formulation, but can be formulated as an injection, an inhalant, an external preparation for skin, or the like.
  • the pharmaceutical composition for prophylaxis or treatment according to the present invention includes chitosan having a molecular weight of 5 kda or less and deacetylated at least 89%, and the chitosan may be included in a concentration of 1000 to 2500 ug/ml, preferably Preferably, it may be included in a concentration of 1250 to 2500 ug/ml, 1500 to 2500 ug/ml, 1750 to 2500 ug/ml, and 2000 to 2500 ug/ml, more preferably at a concentration of 2250 to 2500 ug/ml It can be, but is not limited thereto.
  • composition for prevention or treatment of the present invention may be administered orally or parenterally according to a desired method (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically), but preferably may be administered orally,
  • a desired method for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically
  • the dosage depends on the condition and weight of the patient, the severity of the disease, the form of the drug, the route and time of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the preventive or therapeutic composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient to treat or diagnose a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment or diagnosis, and the effective dose level is the type of disease, severity, and drug of the patient. Activity, sensitivity to drugs, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or administered in combination with another therapeutic agent, may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent, and may be administered single or multiple. It is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect in a minimum amount without side effects in consideration of all the above factors, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the effective amount of the composition for prevention or treatment of the present invention may vary depending on the age, sex, condition, weight, absorption of the active ingredient in the body, the inactivation rate and excretion rate of the patient, the type of disease, and the drug to be used in combination.
  • 0.001 to 150 mg, preferably 0.01 to 100 mg per 1 kg of body weight may be administered daily or every other day, or divided into 1 to 3 times a day.
  • the dosage amount does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the present invention is deacetylated at least 89% and comprising chitosan having a molecular weight of 5 kda or less, comprising a composition for immunosuppression as an active ingredient, for preventing or treating immune diseases or inflammatory diseases It provides a method for preventing or treating an immune disease or an inflammatory disease, comprising administering a pharmaceutical composition to an individual.
  • the pharmaceutical composition for prophylaxis or treatment includes chitosan having a molecular weight of 5 kda or less and deacetylated at least 89%, and the chitosan may be included in a concentration of 1000 to 2500 ug/ml, preferably 1250 to 2500 ug/ml, 1500 to 2500 ug/ml, 1750 to 2500 ug/ml, and 2000 to 2500 ug/ml, and more preferably 2250 to 2500 ug/ml, but are not limited thereto. Does not.
  • the present invention provides a use of the pharmaceutical composition for preventing or treating an immune disease or an inflammatory disease.
  • the present invention is deacetylated at least 89% and comprising chitosan having a molecular weight of 5 kda or less. It provides a health functional food composition for preventing or improving irritable immune disease or inflammatory disease, comprising a composition for immunosuppression as an active ingredient.
  • the composition of the present invention may be added to a health functional food for the purpose of preventing or improving an irritable immune disease or an inflammatory disease, and a compound having an effect of improving an irritable immune disease or an inflammatory disease of the present invention is used as a food additive.
  • the compound When used, the compound may be added as it is or may be used with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the compound of the present invention is added in an amount of 15% by weight or less, preferably 10% by weight or less based on the raw material.
  • the amount may be less than the above range, and there is no problem in terms of safety, so the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • foods to which the above substances can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, There are alcoholic beverages and vitamin complexes, and all health functional foods in the usual sense are included.
  • the health beverage composition of the present invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as an additional component, like a conventional beverage.
  • the natural carbohydrates described above are monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • sweetener natural sweeteners such as taumatin and stevia extract, and synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 0.20 g, preferably about 0.04 to 0.10 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, Carbonating agents used in carbonated beverages may be contained.
  • the composition of the present invention may contain pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage. These components may be used independently or in combination. Although the proportion of these additives is not very important, it is generally selected in the range of 0.01 to 0.20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the present invention provides a cosmetic composition for preventing or improving immune diseases or inflammatory diseases, comprising a composition for immunosuppression, comprising chitosan having a molecular weight of less than or equal to 89% and having a molecular weight of 5 kda or less.
  • the composition can be used as a cosmetic composition, and softening lotion, astringent lotion, nourishing lotion, nourishing cream, massage cream, essence, eye cream, eye essence, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, powder , Body lotion, body cream, body oil, body essence, makeup base, foundation, hair dye, shampoo, conditioner or body cleaner, etc., but is not limited thereto.
  • additional substances can be added according to the formulation of the cosmetic.
  • the formulation is a paste, cream or gel
  • the formulation is a powder or spray
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, or polyamide powder may be used as a carrier component.
  • propellants such as chlorofluorohydrocarbon, propane/butane or dimethyl ether may be included.
  • a solvent, a solubilizing agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, preferably water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 ,3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol, or fatty acid ester of sorbitan, but is not limited thereto.
  • a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, an ethoxylated isostearyl alcohol, a suspending agent such as polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystalline cellulose , Aluminum meta-hydroxide, bentonite, agar, or tracant
  • a surfactant-containing cleansing as a carrier component, an aliphatic alcohol sulfate, an aliphatic alcohol ether sulfate, a sulfosuccinic acid monoester, isethionate , Imidazolinium derivatives, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide ether sulfate, alkylamidobetaine, aliphatic alcohol, fatty acid glyceride, fatty acid diethanolamide, vegetable oil, lanolin derivative or ethoxy
  • 1, 5kda chitooligosaccharide was used in the experiment using a purified method specified in the literature, and 15kda chitosan (Polysciences, Inc., USA) was purchased.
  • 15kda chitosan Polysciences, Inc., USA
  • To measure the molecular weight and molecular weight distribution of chitosan 1 kda chitosan was dissolved in 50% methanol, 2,5-dihydroxybenzoic acid was dissolved in 30% ethanol as a matrix, and the sample solution and the matrix solution were mixed in a 1:1 volume ratio, and MALDI-TOF Mass Spectrometer (Autoflex LRF speed, Bruker, USA) was used.
  • the degree of acetylation is 1 kda, 5 kda, 15 kda chitosan dissolved in 2% v/v deuterium chloride/deuterium oxide at a concentration of 1 mg/ml, and then 1DH Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectrometer (Bruker assemble III ascend 500, Bruker, USA), and the acetylation degree (deacetylation degree) was calculated using the following Equation 1 using the peak area of H Ac and the value of H 2-6 peak area.
  • NMR Nuclear Magnetic Resonance
  • mice C57BL/6 mice were maintained in the laboratory animal room of the Biotechnology Research Center of Pohang University of Science and Technology, and all experimental procedures were carried out with the approval of the Animal Experimental Ethics Committee of Pohang University of Science and Technology. In all experimental procedures, mice within 5 to 7 weeks of age with the same sex and week age were used. Mice were euthanized using cervical dislocation or carbon dioxide.
  • the method of separating splenic dendritic cells is as follows. After the mouse was euthanized, the spleen was collected and the spleen was incised into small pieces using scissors. Using 0.5 mg/ml collagenase D (Roche) and DNase I (Sigma-Aldrich, USA) to disintegrate the tissue, remove red blood cells, and then use a CD11c magnetic bead (Milltenyi) to perform a Magnet-associated cell sorting (MACS) process. CD11c + dendritic cells were isolated.
  • CD4 + CD25 + CD44 - T cells were isolated using Easysep Streptavidin Rapidsphere Kit (Stem Cell).
  • the method of separating T cells from the Lamina intestinal in the colon is as follows. First, the large intestine was excised from the euthanized mouse, and then the intestine was incised vertically to remove the mucous membrane and mucus. After cutting the intestine into small pieces, it was incubated for 20 minutes at 37° C. in a buffer solution containing 10 mM EDTA, 20 mM HEPES, 1 mM sodium pyruvate, 3% Fetal Bovine Serum, and PBS. Through this, all intestinal epithelial cells were separated and removed.
  • the isolated cells were dissolved in PBS and fluorescently stained to distinguish living cells using Fixable Viability Dye (Thermo).
  • the staining method follows the manufacturer's protocol.
  • a fluorescent antibody was diluted and added to the cell solution, followed by staining for 20 minutes at 4°C.
  • the cells were stuffed using Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Thermo) and processed to have permeability. After the cells were released in a cell permeabilization buffer, fluorescent antibodies were diluted and added to the cell solution for cell nucleus and intracellular molecule staining, followed by staining for 45 minutes at 4°C.
  • iTregs induced regulatory T cells
  • the isolated spleen dendritic cells were placed in a 96 well round-bottom microplate with chitosan at the corresponding concentration and 10 ng/ml, a culture solution containing GM-CSF of 200 ul (RPMI 1640, 10% fetal bovine serum, 5% penicillin/strepto).
  • a culture solution containing GM-CSF of 200 ul RPMI 1640, 10% fetal bovine serum, 5% penicillin/strepto.
  • Mycin, 2 mM L-glutamine, 1 mM sodium pyruvate, non-essential amino acid solution, beta-mercaptoethanol was incubated for 14 hours.
  • the regulatory T cell induction condition is to treat 0.1 ug/ml of anti-CD3, 100U IL-2, 0.1 ng/ml of TGF-beta, and 10 ng/ml of GM-CSF, and the essential condition for T cell survival is 0.01 ug/ml of anti-CD3, 2U IL-2, and 10 ng/ml of GM-CSF were treated, and fluorescence staining was performed after the culture was completed.
  • chitosan was orally administered to mice for 1 week.
  • drinking water treated with 1% DSS was provided instead of normal water.
  • the oral administration of chitosan was started to the mouse, the weight of the mouse was measured, and when the body weight decreased to a level of less than 85% of the starting body weight, the mouse was euthanized.
  • the large intestine of the mouse was excised and the length was measured. Thereafter, as described above, cells in the mucosal intrinsic layer and cells in the mesenteric lymph node were separated and analyzed.
  • MALDI-TOF MS spectroscopy was performed to confirm the molecular weight and molecular weight distribution of 1 kda chitosan.
  • the H AC peak of chitosan was observed in the vicinity of 1.9 to 2.0 ppm, and as a result of integrating the area of the H2-6 peak observed between 3.4 to 4.0 ppm, (a) 1 kda chitosan as shown in FIG. It was confirmed that 2.6%, (b) 5 kda chitosan had 11%, and (c) 15 kda chitosan had 15% acetyl groups.
  • the dendritic cells were cultured under conditions treated with 2,500 ug/ml of 1 kda, 5 kda, and 15 kda chitosan, respectively.
  • the dendritic cells activated by the above culture were subjected to regulatory T cell differentiation conditions (0.1 ug/ml of anti-CD3, 100 U IL-2, 0.1 ng/ml of TGF-beta, 10 ng/ml of GM- CSF treatment), it was confirmed whether it was possible to induce differentiation of non-activated helper T cells into regulatory T cells.
  • regulatory T cell differentiation conditions 0.1 ug/ml of anti-CD3, 100 U IL-2, 0.1 ng/ml of TGF-beta, 10 ng/ml of GM- CSF treatment.
  • Fig. 3a 1 was kda chitosan is significantly induced the differentiation of Foxp3 + regulatory T cells, was followed by 5 kda chitosan also it confirmed induce the differentiation of significantly Foxp3 + regulatory T cells.
  • the degree of induction of differentiation of inactive helper T cells into regulatory T cells according to the concentrations of 1 kda, 5 kda and 15 kda chitosan was confirmed.
  • the concentration is between 1000 and 2500 ug/ml, and was measured by increasing the concentration by 250 ug/ml.
  • the dendritic cells were cultured under conditions treated with 2,500 ug/ml of 1 kda, 5 kda, and 15 kda chitosan, respectively.
  • the dendritic cells activated by the above culture are essential for the survival of auxiliary T cells (treatment with minimal T cell activating factor, in principle, induction of differentiation into specific T cells is not possible, 0.01 ug/ml of anti-CD3, 2U IL) -2, 10 ng/ml of GM-CSF), an experiment was conducted to confirm whether it was possible to induce differentiation of inactive helper T cells into regulatory T cells.
  • Fig. 4a 1 was kda chitosan is significantly induced the differentiation of Foxp3 + regulatory T cells, was followed by 5 kda chitosan also it confirmed induce the differentiation of significantly Foxp3 + regulatory T cells.
  • T-bet a marker of helper T1 cells
  • GATA3 a marker of helper T2 cells
  • mice which were the subjects of the experiment, were divided into a total of 4 experimental groups.
  • 1 Phosphate-based Saline (PBS) oral administration and general drinking water supply conditions 2 PBS oral administration and 1% DSS-treated drinking water supply conditions, 3 200 ul oral administration of 1 kda chitosan at a concentration of 5 mg/ml And 1% DSS-treated drinking water supply conditions, 4 1 kda chitosan at a concentration of 25 mg/ml 200ul oral administration and 1% DSS-treated drinking water supply conditions experimental group.
  • PBS Phosphate-based Saline
  • PBS or 1 kda chitosan of the above two concentrations was orally administered for a week, and then drinking water was treated with 1% DSS, and the length of the colon was measured. It is known that the length of the colon shortens when inducing enteritis.
  • the present invention was the first to identify the molecular weight range and the degree of acetylation of chitosan that induces an immunosuppressive response, and the composition for immunosuppression according to the present invention induces differentiation of inactive auxiliary T cells into CD4 + Foxp3 + regulatory T cells to regulate the above.
  • T cells secrete IL-10 it is expected to be useful as an effective substance that can replace existing therapeutic agents in the field of developing therapeutic agents for irritable immune diseases or inflammatory diseases as they can suppress the immune response.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 키토산을 포함하는 면역억제용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 미활성 보조 T 세포를 조절 T 세포로 분화 유도하는, 89 % 이상 탈아세틸화되고 5 kda 이하의 분자량을 가지는 키토산을 포함하는 면역억제용 조성물 및 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 과도한 면역반응으로 야기되는 알레르기, 염증 질환 등의 자가면역질환의 치료에 키토산을 적용하기 위해 예의 연구한 결과, 면역억제 반응을 유도하는 키토산의 분자량 범위와 아세틸화 정도를 최초로 규명하였는바, 미활성 보조 T 세포를 CD4+Foxp3+ 조절 T 세포로 분화 유도하여 상기 조절 T 세포가 IL-10을 분비함으로써, 면역반응을 억제할 수 있어 면역 질환 또는 염증성 질환의 치료에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

키토산을 포함하는 면역억제용 조성물 및 이의 용도
본 발명은 키토산을 포함하는 면역억제용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 미활성 보조 T 세포에서 조절 T 세포로의 분화를 유도하는, 89 % 이상 탈아세틸화되고 5 kda 이하의 분자량을 가지는 키토산을 포함하는 면역억제용 조성물 및 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
키토산은 갑각류의 껍질, 곤충의 외골격, 균류의 세포벽을 구성하고 있는 바이오 폴리머인 키틴을 탈아세틸화하여 얻을 수 있다. 보다 구체적으로, 키틴은 수산화나트륨을 처리한 염기 환경에서 탈아세틸화되고 염산, 아질산 등의 산처리 또는 chitinase, chitosanase, 펩신, 라이소자임 등의 효소를 사용하여 사슬이 절단되어 저분자 키토산이 된다.
키토산은 뛰어난 생체 적합성과 생분해성, 상처 치료, 지혈, 항균 작용 등의 다양한 특성을 가지기 때문에 생체 재료로 폭 넓게 응용되고 있다. 예컨대 이식제, 접착제, 지혈제 또는 약물 전달체 등 다양한 생체 재료로 사용되고 있으며 특히 키토산이 나타내는 면역 조절 활성 및 항암 활성을 이용한 건강기능식품이 다수 제조 및 판매되고 있다.
키토산의 면역 기능 관련 효과로는 면역 활성을 통한 염증 유발 효과뿐만 아니라 상기 효과와 상반되는 면역 작용 억제를 통한 항염증 효과가 보고되는데 상기와 같은 상반된 효과가 나타나는 원인에 대해서는 명확하게 밝혀진 바가 없다.
또한 단순히 키토산에 내재된 속성인 면역 조절 활성을 이용하여 질환 치료에 적용하는 연구 (한국 등록특허공보 제 10-1468479호)는 다수 존재하나 키토산의 물성에 기초한 면역 활성의 제어를 통한 질환 치료에 관한 연구는 아직 전무한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 과도한 면역반응으로 야기되는 알레르기, 염증 질환 등의 면역 질환의 치료에 키토산을 적용하기 위해 연구한 결과, 키토산의 상반된 면역 활성이 키토산의 유래 원료, 키토산의 제조 및 정제 과정에 의해 결정되는 탈아세틸화 정도, 단백질 및 키토산의 분자량 차이로부터 기인한다는 것 및 키토산의 면역억제 반응을 유도하는 키토산의 분자량 범위와 아세틸화 정도를 최초로 규명하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 89 % 이상 탈아세틸화되고 5 kda 이하의 분자량을 가지는 키토산을 포함하는, 면역억제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는, 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는, 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는, 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 89 % 이상 탈아세틸화되고 5 kda 이하의 분자량을 가지는 키토산을 포함하는. 면역억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 미활성 보조 T 세포 (naive T cell)를 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg)로 분화 유도할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조절 T 세포는 CD4+ Foxp3+ 조절 T 세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조절 T 세포는 인터루킨-10 (Interleukin-10, IL-10)을 분비할 수 있다.
또한 본 발명은 조성물을 유효성분으로 포함하는, 과민 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 과민 면역 질환은 과민성 대장 증후군, 궤양성 장염, 크론병 아토피 피부염, 알레르기성 비염, 접촉성 피부염, 천식, 건선, 피부경화증 (scleroderma), 퇴행성 신경질환, 백반증, 및 자가면역질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 루푸스, 제1형 당뇨병, 중증 근무력증, 통풍, 강직성 척추염, 전신성 경피증 (scleroderma), 길리안-바레 증후군 (Guilian-Barre syndrome), 피부근염 (dermatomyositis), 다발성근염 (polymyositis), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 자가면역성 뇌척수염, 천포창, 크론병, 쇼그렌 증후군 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 염증성 질환은 부종, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 관절염, 골관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염 및 신장염으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한 본 발명은 조성물을 유효성분으로 포함하는, 과민 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 조성물을 유효성분으로 포함하는, 과민 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 과민 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 약학적 조성물의, 과민 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명자들은 과도한 면역반응으로 야기되는 알레르기, 자가면역질환, 염증 질환 등의 과민 면역질환의 치료에 키토산을 적용하기 위해 연구한 결과, 면역억제 반응을 유도하는 키토산의 분자량 범위와 아세틸화 정도를 최초로 규명하였는바, 미활성 보조 T 세포를 CD4+Foxp3+ 조절 T 세포로 분화 유도하여 상기 조절 T 세포가 IL-10을 분비함으로써, 면역반응을 억제할 수 있어 과민 면역 질환 또는 염증성 질환의 치료에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 키토산이 T 세포의 분화에 영향을 주어 면역을 억제하는 기전을 개략적으로 표현한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2a는 키토산의 물리적 특성을 보여주는 결과로서, MALDI-TOF MS 실험을 통해 본 발명에 따른 키토산의 분자량과 분자량 분포 함량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 키토산의 물리적 특성을 보여주는 결과로서, NMR을 통해 본 발명에 따른 키토산의 아세틸기 함량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 키토산의 조절 T 세포 분화 유도 기능을 보여주는 결과로서, in vitro에서 특정 농도의 1 kda, 5 kda 및 15 kda 키토산을 처리하여 배양한 수지상 세포를 미활성 CD4+ 보조 T 세포와 함께 조절 T 세포 분화 가능 조건에서 배양하였을 때, Foxp3+ 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 키토산의 조절 T 세포 분화 유도 기능을 보여주는 결과로서, 1 kda, 5 kda 및 15 kda 키토산의 농도에 따른 Foxp3+ 발현량을 확인한 결과 (적색 막대는 1 Kda 키토산, 청색 막대는 5 Kda 키토산, 회색 막대는 15 Kda 키토산을 처리한 결과를 나타냄)를 나타낸 것이다.
도 4a는 키토산의 조절 T 세포 분화 유도 기능을 보여주는 결과로서, in vitro에서 특정 농도의 1 kda, 5 kda 및 15 kda 키토산을 처리하여 배양한 수지상 세포를 미활성 CD4+ 보조 T 세포와 함께 보조 T 세포 생존 필수 조건에서 배양하였을 때, Foxp3+ 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 키토산의 조절 T 세포 분화 유도 기능을 보여주는 결과로서, 상기 조건에서 조절 T 세포의 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4c는 키토산의 조절 T 세포 분화 유도 기능을 보여주는 결과로서, T helper 1 세포의 표지자인 T-bet, T helper 2 세포의 표지자인 GATA3의 발현 여부를 확인한 결과 (도 4c)를 나타낸 것이다.
도 5a는 키토산을 처리한 DSS 유도 대장염 동물 모델의 대장 내 점막고유층 (Lamina propria) 및 장간막 림프절에서 분비되는 사이토카인을 보여주는 결과로서, DSS 유도 대장염 동물 모델에 1 kda 키토산을 처리 후 체중의 감소 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 키토산을 처리한 DSS 유도 대장염 동물 모델의 대장 내 점막고유층 (Lamina propria) 및 장간막 림프절에서 분비되는 사이토카인을 보여주는 결과로서, DSS 유도 대장염 동물 모델에 1 kda 키토산을 처리 후 결장의 길이 감소 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5c는 키토산을 처리한 DSS 유도 대장염 동물 모델의 대장 내 점막고유층 (Lamina propria) 및 장간막 림프절에서 분비되는 사이토카인을 보여주는 결과로서, 대장 내 점막고유층에서 분비되는 사이토카인을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5d는 키토산을 처리한 DSS 유도 대장염 동물 모델의 대장 내 점막고유층 (Lamina propria) 및 장간막 림프절에서 분비되는 사이토카인을 보여주는 결과로서, 장간막 림프절에서 분비되는 사이토카인을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 과도한 면역반응으로 야기되는 자가면역질환, 알레르기, 염증 질환 등의 과민면역질환의 치료에 키토산을 적용하기 위해 연구한 결과, 면역억제 반응을 유도하는 키토산의 분자량 범위와 아세틸화 정도를 최초로 규명하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 89 % 이상 탈아세틸화되고 5 kda 이하의 분자량을 가지는 키토산을 포함하는 면역억제용 조성물을 제공한다. 상기 면역억제용 조성물에서, 바람직하게는 키토산의 탈아세틸화도는 89 % 이상 97.4 % 이하이고 키토산의 분자량 범위는 1 Kda 이상 5 Kda 이하이나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 조성물은 미활성 보조 T 세포 (naive T cell)를 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg)로 분화 유도할 수 있고, 상기 조절 T 세포는 CD4+Foxp3+ 조절 T 세포일 수 있으며, 상기 조절 T 세포는 IL-10을 분비하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, “미활성 보조 T 세포 (naive T cell)”는 CD4 분자를 표지자로 가지는 보조 T 림프구 (Helper T cell) 또는　도움 T 세포로 불리며　특히 분화와 성숙을 거쳤지만 아직 말초에서 항원을 만나지 못한 T 세포를 말한다.　항원제시세포에 제시된 MHC:항원 복합체를 만나면 T 세포 수용체 신호 전달 과정 (T-Cell Receptor signaling pathway)을 통해 항원을 인식하고 효과 T 세포 (effector T cell)로 활성화되어 후천적 면역 반응이 시작된다. 표면에는 세포 접착 분자 (cell adhesion molecule)인　L-셀렉틴 (CD62L)이 미활성 상태의 표지자로서 존재하는 한편, 효과 T 세포의 특징인　CD25,　CD44,　CD69 등은 거의 존재하지 않는다. 상기 활성화 과정은 다음과 같다. T 세포의 활성화는 전술한 바와 같이 미활성 T 세포가 MHC:항원 복합체를 만나면서 이루어진다. 미활성 T 세포의 T 세포 수용체가 MHC:항원 복합체와 결합하게 되면 T 세포의　CD45　단백질이 세포 내부의 Fyn 단백질을 탈인산화한다. 탈인산화로 활성화된 Fyn은 T 세포 항원 수용체의 보조 단백질 사슬인　CD3　감마(γ), 델타(δ), 엡실론(ε) 및 제타(ζ) 사슬의 ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif)을 인산화한다. ITAM이 인산화된 CD3 단백질의 제타 사슬에는 ZAP-70 단백질이 결합하며, T 세포의 보조 수용체인 CD4에 부착되어 있는 Lck 단백질이 ZAP-70 단백질을 인산화한다. Lck 단백질에 의해 인산화되어 활성화된 ZAP-70 단백질은 LAT 단백질과 SLP-76 단백질을 인산화하여 NFκAP-1 및 NFAT 등의 전사 인자를 활성화하는 신호 반응을 촉발시킨다. NFκAP-1 및 NFAT와 같은 전사 인자들은 인터루킨-2 (Interleuking-2, IL-2)의 발현을 촉진함으로써 T 세포가 분열 및 분화할 수 있게 한다.
또한 본 발명에 있어서, “조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg)”는 면역계를 조절하는 T 세포들 중 한 집단으로, 자가항원 및 일부 외부 항원에 대한 면역학적 관용 (Immune-tolerance)을 유지하고 과도한 면역반응을 억제한다. 조절 T 세포는 일반적으로 효과 T 세포 (effector T cell)의 유도와 확산을 억제하거나 하향 조절한다. 마우스 모델 실험에서 조절 T 세포의 분화에 따라 자가면역질환 및 암을 치료할 수 있으며, 장기이식을 용이하게 할 수 있다고 보고된다. 모든 T 세포는 골수의 간세포로부터 만들어지며, 흉선에서 계통을 이어간다. 모든 T 세포는 CD4-CD8-TCR-세포로 DN (double-negative stage) 단계에서 시작하며, 개별 세포들은 그 자신의 T 세포 수용체 유전자들을 조정하여 고유한 T 세포 수용체 구조를 만들게 된다. CD4와 CD8을 발현하는 DP (double-positive)단계가 되면 가슴샘 상피 내 피질 세포의 MHC 분자와의 결합을 통해 T 세포 수용체의 자가항원 반응성을 검사한다. 자가항원에 의한 신호를 받으면 DP T 세포는 각각 CD4 또는 CD8을 발현하는 SP (single-positive) 단계가 된다. 조절 T 세포의 선별은 SP단계에서 흉선 내에서 MHC class II를 발현하는 항원제시세포들에서 일어난다. 조절 T 세포는 자가 펩티드 (self-peptide) 쪽으로 강한 친화성을 보인다. 조절 T 세포의 선별 과정은 자가 펩티드-MHCII 분자와 T 세포 수용체 간의 상호작용에서의 친화성에 의해 결정되며 조절 T 세포가 되기 위해 선별되는 과정을 'Negative Selection' 과정이라고 한다. 강한 신호를 받은 T 세포는 세포자살 (apoptotic death)을 하게 되고, 약한 신호를 받은 세포는 살아 남아 효과 세포로 선별된다. 만약 T 세포가 중간 세기의 신호를 받으면, 조절 T 세포가 된다. T 세포 활성 과정의 확률적인 특성 때문에, TCR이 주어진 모든 T 세포 집단은 종국에는 효과 T 세포 (Teff)와 조절 T 세포 (Treg)의 혼합물이 된다고 보고된다.　
또한 본 발명에 있어서, “유도 조절 T 세포 (induced regulatory T cell, iTreg)(CD4+CD25+Foxp3+)”는 면역관용과 연관된 억제성 세포이다. 유도 조절 T 세포 (iTreg)는 일반적인 미활성 CD4+ 보조 T 세포로부터 흉선 밖에서 발달한다. 유도 조절 T 세포 (iTreg)와 흉선 유래 조절 T 세포 (nTreg)가 기능적으로 비슷한 면을 공유하지만, 유도 조절 T 세포는 최근에 '필수적이며 쓸모 없지 않은, 조절 반응 내에서 TCR 다양성을 확대시킴을 통해서 부분적으로 자연 조절 T 세포를 보충하는 조절 소집단' 인 것으로 보고된다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 과민 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 대상으로 하는 질환인 “과민 면역 질환”은 과민성 대장 증후군, 궤양성 장염, 크론병 아토피 피부염, 알레르기성 비염, 접촉성 피부염, 천식, 건선, 피부경화증 (scleroderma), 퇴행성 신경질환, 백반증 및 자가면역질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 대상으로 하는 질환인 “자가면역질환”은 자가 면역이 원인이 되어 나타나는 질병으로 신체의 정상적인 조직 및 분자, 세포 등에 대해 과도한 면역 반응을 일으킨 것이다. 다시 말해 면역반응이 실수로 건강한 세포를 해롭게 보고 그들을 공격하는 것이다. 또한 자가면역질환은 다양한 림프구 중에 체내 자기 자신의 분자와 반응하는 수용체를 가지는 림프구에 의해 나타나기도 한다. 상기의 자기 반응성 림프구들이 제거되거나 불활성되지 않는다면 면역계는 결국 자신의 세포 또는 조직을 공격하게 되는 것이다. 하지만 정상의 경우 림프구들이 골수 및 흉선에서 성숙되는 동안 자기 반응성이 점검되며 이러한 과정 동안 자기 분자에 특이적인 수용체를 가진 림프구들은 세포자살에 의해 죽거나 무반응세포로 변하게 된다. 결과적으로 비자기 분자와 반응하는 림프구만 남게 되고 이러한 과정을 자기관용기작 (Self-tolerance)이라고 한다. 만약 자기관용기작이 정상적이지 못할 경우에는 자가면역질환을 유발하게 된다. 이러한 자가면역질환으로는 류마티스성 관절염, 루푸스, 제1형 당뇨병, 중증 근무력증, 통풍, 강직성 척추염, 전신성 경피증 (scleroderma), 길리안-바레 증후군 (Guilian-Barre syndrome), 피부근염 (dermatomyositis), 다발성근염 (polymyositis), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 자가면역성 뇌척수염, 천포창, 크론병, 쇼그렌 증후군 및 베체트 병등이 있으며, 본 발명에 따른 자가면역질환은 상기으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 대상으로 하는 질환인 “염증성 질환”은 부종, 알레르기, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 관절염, 골관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염 및 신장염으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 면역 질환 또는 염증성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 면역 질환 또는 염증성 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명자들은 실시예를 통해 89 % 이상 탈아세틸화되고 5 kda 이하의 분자량을 가지는 키토산의 미활성 보조 T 세포 (naive T cell)를 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg)로 분화 유도를 통한 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료 기능을 규명하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 본 발명에 따른 1 kda 키토산이 2.6 %의 아세틸기를 가지고 (탈아세틸화도는 97.4 %), 5 kda 키토산은 11 % 아세틸기를 가지며 (탈아세틸화도는 89 %), 15 kda 키토산은 15 %의 아세틸기 (탈아세틸화도는 85 %)를 가짐을 확인하였다 (실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 마우스의 비장에서 분리된 수지상 세포에 1 kda, 5 kda 및 15 kda 키토산을 각각 처리하여 배양하고, 조절 T 세포 분화 가능 조건에서 미활성 보조 T 세포를 조절 T 세포로 분화 유도할 수 있는지 실험한 결과, 1 kda 키토산이 Foxp3+ 조절 T 세포의 분화를 가장 많이 유도하였음을 확인하였으며, 1 kda, 5 kda 및 15 kda 키토산의 농도에 따른 미활성 보조 T 세포의 조절 T 세포로의 분화 유도 정도를 확인한 결과, 1 kda 키토산이 Foxp3+ 조절 T 세포의 분화를 가장 많이 유도하였고 5 kda 키토산도 유사한 분화 유도 양상을 나타냄을 확인하였다 (실시예 3-1 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 마우스의 비장에서 분리된 수지상 세포에 1 kda, 5 kda 및 15 kda 키토산을 각각 처리하여 배양하고, 보조 T 세포 생존 필수 조건에서 미활성 보조 T 세포를 조절 T 세포로 분화 유도할 수 있는지 실험한 결과 1 kda 키토산이 Foxp3+ 조절 T 세포의 분화를 가장 많이 유도하였음을 확인하였으며, 1 kda 키토산을 처리하였을 때 효과 T 세포의 서로 다른 표지자인 T-bet 및 GATA3의 발현 수준이 모두 감소함을 확인하였다 (실시예 3-2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 1 kda 키토산을 25 mg/ml 농도로 200 ul 경구 투여 및 1 % DSS를 처리한 식수 공급 조건의 실험군에서 Foxp3+ 조절 T 세포가 유의적으로 증가함을 확인하였으며, 대장의 점막고유층 내에서 항염증 기능의 사이토카인인 IL-10 의 분비가 증가함을 확인하였는데, 이는 DSS에 의해 유발된 대장염의 염증 증상을 조절 T 세포가 완화시킬 수 있음을 의미하는 것이다 (실시예 4 참조).
상기 실시예 결과들은 89 % 이상 탈아세틸화되고 5 kda 이하의 분자량을 가지는 키토산이, 미활성 보조 T 세포를 조절 T 세포로 분화 유도를 통해, 면역 질환 또는 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 기능을 나타냄을 확인한 것으로, 이는 상기 키토산을 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 이용할 수 있음을 시사한다.
본 발명에 따른 상기 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 89 % 이상 탈아세틸화되고 5 kda 이하의 분자량을 가지는 키토산을 포함하는. 면역억제용 조성물을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 상기 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 89 % 이상 탈아세틸화되고 5 kda 이하의 분자량을 가지는 키토산을 포함하되, 상기 키토산은 1000 내지 2500 ug/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1250 내지 2500 ug/ml, 1500 내지 2500 ug/ml, 1750 내지 2500 ug/ml 및 2000 내지 2500 ug/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2250 내지 2500 ug/ml의 농도로 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 예방 또는 치료용 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으나, 바람직하게는 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 예방 또는 치료용 조성물은 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 89 % 이상 탈아세틸화되고 5 kda 이하의 분자량을 가지는 키토산을 포함하는, 면역억제용 조성물을 유효성분으로 포함하는, 면역 질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 이때 상기 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 89 % 이상 탈아세틸화되고 5 kda 이하의 분자량을 가지는 키토산을 포함하되, 상기 키토산은 1000 내지 2500 ug/ml의 농도로 포함될 수 있으며 바람직하게는 1250 내지 2500 ug/ml, 1500 내지 2500 ug/ml, 1750 내지 2500 ug/ml 및 2000 내지 2500 ug/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2250 내지 2500 ug/ml의 농도로 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물의, 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 89 % 이상 탈아세틸화되고 5 kda 이하의 분자량을 가지는 키토산을 포함하는. 면역억제용 조성물을 유효성분으로 포함하는, 과민 면역 질환 또는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 상기 조성물은 과민 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있으며, 본 발명의 과민 면역 질환 또는 염증성 질환 개선 효과를 갖는 화합물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시 본 발명의 화합물은 원료에 대하여 15 중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효 성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.20 g, 바람직하게는 약 0.04 내지 0.10 g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료 의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한 본 발명은 89 % 이상 탈아세틸화되고 5 kda 이하의 분자량을 가지는 키토산을 포함하는, 면역억제용 조성물을 유효성분으로 포함하는, 면역 질환 또는 염증성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 조성물은 화장료의 조성물로 이용될 수 있으며 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징 워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 메이크업 베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스 또는 바디 세정제 등으로 제형화될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 화장료 조성물로 사용 시 화장료의 제형에 맞게 물질을 더 첨가할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있고, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로 서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있으며, 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 또한 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되는데, 바람직하게는 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타 히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으며, 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우 에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험 준비 및 실험 방법
1-1. 키토산 분자량 및 아세틸화 정도 (탈아세틸화 정도) 분석 (NMR, MALDI-TOF MS)
1, 5kda 키토올리고당 (chitooligosaccharide)은 문헌에서 명시된 방법으로 정제된 것을 이용하여 실험에 사용하였으며 15kda 키토산 (Polysciences, Inc., USA)을 구입하였다. 키토산의 분자량과 분자량 분포 측정은 1 kda 키토산을 50 % methanol에 녹이고 matrix로는　2,5-dihydroxybenzoic acid를 30 % ethanol에 용해한 후 샘플 용액과 matrix 용액을 1:1 부피 비로 혼합하고　MALDI-TOF Mass spectrometer (Autoflex LRF speed, Bruker, USA)를 이용하였다. 아세틸화 정도는 1 kda, 5 kda, 15 kda 키토산을 2 % v/v　deuterium chloride/deuterium oxide에 1 mg/ml 농도로 용해한 후 1DH Nuclear Magnetic　Resonance (NMR)　spectrometer　(Bruker　avance　III ascend 500,　Bruker,　USA)를 이용하여 데이터를 얻었으며, HAc의 peak 면적과 H2-6 peak 면적 값을 이용하여 하기의 식 1을 이용하여 아세틸화 정도 (탈아세틸화 정도)를 계산하였다.
[식 1]
Degree　of　acetylation　(%) = (2xHAc/H2-6) x 100
1-2. 마우스
C57BL/6 마우스는 포항공과대학교 생명공학연구센터의 실험 동물실에서 유지되었으며 모든 실험 과정은 포항공과대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 진행하였다. 모든 실험 과정에서 성별과 주령이 일치하는 5~7 주령 이내의 마우스를 사용하였다. 마우스는 경추 탈골 또는 이산화탄소를 이용하여 안락사 시켰다.
1-3. 세포 분리
비장 수지상 세포를 분리하는 방법은 다음과 같다. 마우스를 안락사 시킨 후 비장을 채취하여 가위를 이용해 비장을 작은 조각으로 절개하였다. 0.5 mg/ml collagenase D (Roche) 및 DNase I (Sigma-Aldrich, USA)을 이용하여 조직을 분해하고 적혈구를 제거한 뒤 CD11c magnetic bead (Milltenyi)를 이용하여 Magnet-associated cell sorting (MACS) 과정을 통해 CD11c+ 수지상 세포를 분리하였다.
또한 비장 내 미활성 CD4+ 보조 T 세포를 분리하는 방법은 다음과 같다. Easysep Streptavidin Rapidsphere Kit (Stem Cell)를 사용하여 CD4+ CD25+ CD44- T 세포를 분리하였다.
또한 대장 내 점막고유층 (Lamina propria)의 T 세포를 분리하는 방법은 다음과 같다. 먼저 안락사 시킨 마우스에서 대장을 절제한 후, 장을 세로로 절개하여 점막 및 점액질을 제거하였다. 장을 작게 조각 낸 후, 10 mM EDTA, 20 mM HEPES, 1mM 피루브산나트륨, 3 % 소 태아 혈청 (Fetal Bovine Serum) 및 PBS를 포함하는 완충 용액에서 37 ℃ 조건에서 20분 동안 배양하였다. 이를 통해 장의 상피 세포를 모두 분리하여 제거하였다. 그 다음으로 PBS로 조직의 겉면을 정리한 후 0.5 mg/ml collagenase D와 DNase I, 3 % 소 태아 혈청, 20 mM HEPES, 1 mM 피루브산나트륨을 포함하는 RPMI 1640 배양액에 작게 조각 내어 넣고 37 ℃ 조건에서 45분 동안 배양하여 장 조직과 점막고유층 (Lamina propria) 내 림프구를 분리하였다. 마지막으로 상층액을 분리한 후 퍼콜 (Percoll, GE Healthcare) 농도 구배에 따라 40 %, 75 %로 분리한 후, RT 조건 및 2000 rpm에서 원심 분리하였으며 서로 다른 두 농도의 퍼콜 사이 중간 층에 있는 세포를 채취하여 형광 염색을 위해 사용하였다.
1-4. 유세포 분석
분리한 세포는 PBS에 풀어 Fixable Viability Dye (Thermo)를 이용해 살아있는 세포를 구별하기 위한 형광 염색을 진행하였다. 염색 방법은 제조사의 프로토콜을 따른다. 세포 표면 분자의 형광 염색을 위해 형광 항체를 희석하여 세포 용액에 추가한 후 4 ℃ 조건에서 20분 동안 염색하였다. 세포 내 분자의 염색을 진행하기 전 Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Thermo)를 이용하여 세포를 박제하고 투과성을 가지도록 가공하였다. 세포 투과화 버퍼 (Permeabilization Buffer)에 세포를 푼 후, 세포핵 및 세포질 내 분자 염색을 위해 형광 항체를 희석하여 세포 용액에 추가한 후 4 ℃ 조건에서 45분 동안 염색하였다. 이후 PBS로 완충용액을 교체한 후 유세포 분석기를 이용해 분석하였다. 상기 분석에는 LSR Fortessa 5 laser (BD Bioscience) 장비를 사용하였고, 분석 소프트웨어로는 Flowjo (Tree Star)를 이용하였다. 형광 염색에 사용한 항체의 분자 및 클론명은 CD4 (Biolegend, RM4-5), Foxp3 (Thermo, FJK-16s), T-bet (Thermo, 4B10), GATA3 (Thermo, TWAJ), IL-10 (Biolegend, JES5-16E3), IFN-gamma (Thermo, XMG1.2), IL-17 (Thermo, 17B7)이다.
1-5. 시험관 내 유도 조절 T 세포 (induced regulatory T cells, iTreg)의 분화
분리된 비장 내 수지상 세포를 96 well round-bottom microplate에 해당 농도의 키토산 및 10 ng/ml, 총 200 ul인 GM-CSF를 포함하는 배양액 (RPMI 1640, 10 % 소 태아 혈청, 5 % 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 비필수아미노산 용액, 베타-머캅토에탄올)에 14시간 동안 배양하였다.
다음으로 상기의 키토산과 함께 배양된 수지상 세포 및 분리된 비장 내의 미활성 CD4+ 보조 T 세포를 72시간 동안 공동 배양하였다. 이 때 조절 T 세포 유도 조건은 0.1 ug/ml의 anti-CD3, 100U IL-2, 0.1 ng/ml의 TGF-beta, 10 ng/ml의 GM-CSF를 처리하는 것이며, T 세포 생존 필수 조건은 0.01 ug/ml의 anti-CD3, 2U IL-2, 10ng/ml의 GM-CSF를 처리하는 것이며 상기 배양을 완료한 후 형광 염색을 진행하였다.
1-6. DSS 유도 대장염 모델
먼저 키토산을 마우스에 1주일 동안 경구 투여하였다. 그 다음으로 1% DSS를 처리한 식수를 일반수 대신 제공하였다. 마우스에게 키토산의 경구 투여를 시작하였을 때부터 상기 마우스의 체중을 측정하였으며 체중이 시작 체중의 85 % 미만 수준으로 감소하였을 때 안락사 시켰다.
그 다음으로 상기 마우스의 대장을 절제한 후 길이를 측정하였다. 이후 전술한 바와 같이 점막고유층 내 세포와 장간막림프절 내 세포를 분리하여 분석하였다.
1-7. 통계 분석
통계 분석은 Graphpad Prism 소프트웨어를 이용하였다. In vitro 실험의 모든 분석 결과는 unpaired Student's t-test를 이용하였으며, in vivo 실험의 분석에서는 Bonferroni's multiple comparison test를 이용하였다. P-value > 0.05 일 때 통계적으로 유의미하다고 판단하였다.
실시예 2. 키토산의 분자량 및 아세틸화 정도 확인
2-1. 1 kda 키토산의 분자량 및 분자량 분포 확인
MALDI-TOF MS spectroscopy를 1 kda 키토산의 분자량과 분자량 분포를 확인하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 2a 및 하기 표 1에 나타낸 바와 같으며 이를 토대로 Mn 942.89, Mw 1061.57 및 dispersity (Mw/Mn) 1.13으로 확인하였다.
m/z Types Degree of polymerization Ion composition
Measured Calculated
524.58 524.47 [M+Na]+ 3 (GlcN)3
686.03 685.63 [M+Na]+ 4 (GlcN)4
828.49 828.80 [M+Na-H2O]+ 5 (GlcN)5
846.93 846.80 [M+Na]+ 5 (GlcN)5
989.94 989.95 [M+Na-H2O]+ 6 (GlcN)6
1150 1151.11 [M+Na-H2O]+ 7 (GlcN)7
1311.45 1312.27 [M+Na-H2O]+ 8 (GlcN)8
1472.91 1473.43 [M+Na-H2O]+ 9 (GlcN)9
1634.36 1634.59 [M+Na-H2O]+ 10 (GlcN)10
1795.81 1795.75 [M+Na-H2O]+ 11 (GlcN)11
2-2. 키토산의 아세틸화 정도 (탈아세틸화 정도) 확인 실험에 사용된 키토산의 아세틸기 함량을 확인하기 위해, NMR 실험을 수행하였다.
그 결과, 키토산의 HAC peak가 1.9 내지 2.0 ppm 부근에서 관찰되었으며, 3.4 내지 4.0 ppm 사이에서 관찰되는 H2-6 peak의 넓이를 적분한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 (a) 1 kda 키토산은 2.6 %, (b) 5 kda 키토산은 11 %, (c) 15 kda 키토산은 15 %의 아세틸기를 가지고 있음을 확인하였다.
다시 말해 1 kda 키토산의 탈아세틸화도는 97.4 %, 5 kda 키토산의 탈아세틸화도는 89 %, 15 kda 키토산의 탈아세틸화도는 85 %임을 확인한 것이다.
각 분자량 별 키토산의 중합도 (DP)를 토대로 사슬 하나 당 결합하고 있는 아세틸기 수를 계산한 결과 1 kda (DP= 6) 키토산은 0.13 개, 5 kda (DP=28) 키토산은 3 개, 15 kda (DP=83) 키토산은 12.45 개의 아세틸기를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 마우스를 이용한 키토산의 면역 조절 기능의 확인
3-1. 조절 T 세포 분화 가능 조건에서 키토산의 조절 T 세포 유도 기능의 확인
마우스의 비장에서 수지상 세포를 분리한 후 2500 ug/ml 농도의 1 kda, 5 kda 및 15 kda 키토산을 각각 처리한 조건에서 상기 수지상 세포를 배양하였다.
그 다음으로 상기 배양으로 활성화된 수지상 세포가, 조절 T 세포 분화 가능 조건 (0.1 ug/ml의 anti-CD3, 100 U IL-2, 0.1 ng/ml의 TGF-beta, 10 ng/ml의 GM-CSF를 처리)에서, 활성화되지 않은 보조 T 세포를 조절 T 세포로 분화 유도시킬 수 있는지 여부를 확인하였다. 이때, 2500 ug/ml 농도의 1 kda, 5 kda 및 15 kda 키토산은 T세포에 대하여 독성을 나타내지 않았다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 1 kda 키토산이 유의적으로 Foxp3+ 조절 T 세포의 분화를 유도하였고, 그 다음으로 5 kda 키토산도 유의적으로 Foxp3+ 조절 T 세포의 분화를 유도함을 확인하였다.
또한 1 kda, 5 kda 및 15 kda 키토산의 농도에 따른 미활성 보조 T 세포의 조절 T 세포로의 분화 유도 정도를 확인하였다. 상기 농도는 1000 내지 2500 ug/ml 사이이며, 250 ug/ml씩 농도를 증가시켜 측정하였다.
그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이 1 kda, 5 kda 및 15 kda 키토산의 농도가 증가할수록 조절 T 세포로의 분화 유도가 더 많이 됨을 확인하였다. 보다 구체적으로 1 kda 키토산이 Foxp3+ 조절 T 세포의 분화를 가장 많이 유도하였고 5 kda 키토산도 유사한 분화 유도 양상을 나타냈으나, 분화 유도 정도는 1 kda 키토산에 비해 현저히 작음을 확인하였다. 15 kda 키토산의 경우 Foxp3+ 조절 T 세포를 유도하지 못함을 확인하였다 (적색 막대는 1 Kda 키토산, 청색 막대는 5 Kda 키토산, 회색 막대는 15 Kda 키토산을 처리한 결과를 나타냄).
3-2. 보조 T 세포 생존 필수 조건에서 키토산의 조절 T 세포 유도 기능의 확인
마우스의 비장에서 수지상 세포를 분리한 후 2500 ug/ml 농도의 1 kda, 5 kda 및 15 kda 키토산을 각각 처리한 조건에서 상기 수지상 세포를 배양하였다.
그 다음으로 상기 배양으로 활성화된 수지상 세포가, 보조 T 세포 생존 필수 조건 (최소한의 T 세포 활성 인자 처리, 원칙적으로는 특정 T 세포로의 분화 유도 불가, 0.01 ug/ml의 anti-CD3, 2U IL-2, 10 ng/ml의 GM-CSF를 처리)에서, 미활성 보조 T 세포를 조절 T 세포로 분화 유도시킬 수 있는지 여부를 확인하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 1 kda 키토산이 유의적으로 Foxp3+ 조절 T 세포의 분화를 유도하였고, 그 다음으로 5 kda 키토산도 유의적으로 Foxp3+ 조절 T 세포의 분화를 유도함을 확인하였다.
또한 도 4b에 나타낸 바와 같이, 1kda 키토산 2500 ug/ml를 처리한 조건에서 조절 T 세포의 세포 생존율을 확인하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 1 kda 키토산 2500 ug/ml를 처리한 조건에서 조절 T 세포의 세포 생존율은 감소하지 않음을 확인하였다.
또한 보조 T1 세포 (helper T1 cell)의 표지자인 T-bet, 보조 T2 세포 (helper T2 cell)의 표지자인 GATA3의 발현 여부를 확인하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이 1 kda 키토산을 처리하였을 때 T-bet 및 GATA3의 발현 수준이 모두 감소함을 확인하였다.
실시예 4. 덱스트란 황산나트륨 (Dextran SodiumSulfate, DSS) 유도 대장염 모델을 이용한 키토산의 염증 억제 기능의 확인
본 실험과 관련하여, 실험 대상인 마우스를 총 4개의 실험군을 나누었다. ① Phosphate-based Saline (PBS) 경구 투여 및 일반 식수 공급 조건의 실험군, ② PBS 경구 투여 및 1 % DSS를 처리한 식수 공급 조건의 실험군, ③ 1 kda 키토산을 5 mg/ml 농도로 200 ul 경구 투여 및 1 % DSS를 처리한 식수 공급 조건의 실험군, ④ 1 kda 키토산을 25 mg/ml 농도로 200ul 경구 투여 및 1 % DSS를 처리한 식수 공급 조건의 실험군.
PBS 또는 상기 두 가지 농도의 1 kda 키토산을 일주일 동안 경구 투여한 후, 식수를 1 % DSS를 처리하여 공급하고 실험군의 체중을 측정하였다.
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 DSS 식수 공급 일주일 째부터 ② 실험군의 체중이 감소하기 시작하였으며, 25 mg/ml 농도의 1 kda 키토산을 경구 투여한 ④ 실험군의 경우 체중의 감소 정도가 유의적으로 감소함을 확인하였다.
또한 PBS 또는 상기 두 가지 농도의 1 kda 키토산을 일주일 동안 경구 투여한 후, 식수를 1 % DSS를 처리하여 공급하고 결장의 길이를 측정하였다. 장염 유도 시 결장의 길이는 짧아지는 것으로 알려져 있다.
그 결과, 5b에 나타낸 바와 같이 결장의 길이도 ② 실험군에 비해 ④ 실험군에서 결장 길이의 감소 정도가 유의적으로 감소함을 확인하였다 (이는 대장염 증상이 완화되는 것을 의미).
또한 체중이 85% 이하로 감소하였을 때 마우스의 결장 내의 Foxp3+ 조절 T 세포의 분화 여 및 분비된 사이토카인을 분석하였다.
그 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이 Foxp3+ 조절 T 세포가 ④ 실험군에서 유의적으로 증가함을 확인하였으며, 항염증 기능의 사이토카인인 IL-10, IL-17 및 IFN-γ의 분비가 증가함을 확인하였다. 여기서, IL-10은 Foxp3+ 조절 T 세포에 의해 생성 유도되는 것으로 알려져 있다.
상기의 결과들은 키토산에 의해 분화 유도된 조절 T 세포가 DSS에 의해 유발된 대장염의 염증 증상을 완화시켰음을 의미하는 것이다.
또한 장간막 림프절 내의 Foxp3+ 조절 T 세포의 분화 여부 및 분비된 사이토카인을 분석하였다.
그 결과, 도 5d에 나타낸 바와 같이 ④ 실험군에서 Foxp3+ 조절 T 세포 분화 유도가 대조군인 ① 실험군과 비슷한 정도로 적게 일어남을 확인하였으며, 항염증 기능의 사이토카인인 IL-10, IL-17 및 IFN-γ의 분비 정도 역시 ① 실험군과 비슷한 정도로 적게 분비됨을 확인하였다.
상기의 결과는 장내 면역반응의 결과가 림프절까지 확장되지 않음을 의미하는 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 면역억제 반응을 유도하는 키토산의 분자량 범위와 아세틸화 정도를 최초로 규명하였으며, 본 발명에 따른 면역 억제용 조성물은 미활성 보조 T 세포를 CD4+Foxp3+ 조절 T 세포로 분화 유도하여 상기 조절 T 세포가 IL-10을 분비함으로써, 면역반응을 억제할 수 있어 과민 면역 질환 또는 염증성 질환의 치료제 개발 분야에서 기존의 치료제를 대체할 수 있는 유효물질로 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Claims (12)

  1. 89 % 이상 탈아세틸화되고 5 kda 이하의 분자량을 가지는 키토산을 포함하는, 면역억제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 미활성 보조 T 세포 (naive T cell)를 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg)로 분화 유도하는 것을 특징으로 하는, 면역억제용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 조절 T 세포는 CD4+Foxp3+ 조절 T 세포인 것을 특징으로 하는, 면역억제용 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 조절 T 세포는 IL-10을 분비하는 것을 특징으로 하는, 면역억제용 조성물.
  5. 제1항의 조성물을 유효성분으로 포함하는, 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 면역 질환은 과민성 대장 증후군, 궤양성 장염, 크론병 아토피 피부염, 알레르기성 비염, 접촉성 피부염, 천식, 건선, 피부경화증 (scleroderma), 퇴행성 신경질환, 백반증 및 자가면역질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 루푸스, 제1형 당뇨병, 중증 근무력증, 통풍, 강직성 척추염, 전신성 경피증 (scleroderma), 길리안-바레 증후군 (Guilian-Barre syndrome), 피부근염 (dermatomyositis), 다발성근염 (polymyositis), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 자가면역성 뇌척수염, 천포창, 크론병, 쇼그렌 증후군 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 부종, 알레르기, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 관절염, 골관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염 및 신장염으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  9. 제1항의 조성물을 유효성분으로 포함하는, 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  10. 제1항의 조성물을 유효성분으로 포함하는, 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  11. 89 % 이상 탈아세틸화되고 5 kda 이하의 분자량을 가지는 키토산을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료방법.
  12. 89 % 이상 탈아세틸화되고 5 kda 이하의 분자량을 가지는 키토산을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의, 면역 질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용도.
PCT/KR2020/012741 2019-09-23 2020-09-22 키토산을 포함하는 면역억제용 조성물 및 이의 용도 WO2021060792A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190117058A KR102511613B1 (ko) 2019-09-23 2019-09-23 키토산을 포함하는 면역억제용 조성물 및 이의 용도
KR10-2019-0117058 2019-09-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021060792A1 true WO2021060792A1 (ko) 2021-04-01

Family

ID=75165876

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2020/012741 WO2021060792A1 (ko) 2019-09-23 2020-09-22 키토산을 포함하는 면역억제용 조성물 및 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102511613B1 (ko)
WO (1) WO2021060792A1 (ko)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050004057A1 (en) * 2001-12-14 2005-01-06 Isabelle Boucher Chitosan oligosaccharides and uses thereof
KR20130047855A (ko) * 2011-11-01 2013-05-09 가톨릭대학교 산학협력단 항천식 활성을 갖는 저분자량 키토산 올리고당 및 이를 함유하는 약학 조성물
KR20140094775A (ko) * 2013-01-23 2014-07-31 대구가톨릭대학교산학협력단 수용성 키토산을 유효성분으로 함유하는 항암 또는 항염 활성을 갖는 약학적 조성물
KR101468479B1 (ko) * 2007-02-14 2014-12-05 폴리켐 에스.에이. 조갑 염증 질환의 치료를 위한 키토산의 용도
KR20190074157A (ko) * 2017-12-19 2019-06-27 한국세라믹기술원 키토산을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물 및 이의 제조방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013038776A1 (ja) * 2011-09-15 2013-03-21 国立大学法人鳥取大学 炎症性腸疾患治療剤

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050004057A1 (en) * 2001-12-14 2005-01-06 Isabelle Boucher Chitosan oligosaccharides and uses thereof
KR101468479B1 (ko) * 2007-02-14 2014-12-05 폴리켐 에스.에이. 조갑 염증 질환의 치료를 위한 키토산의 용도
KR20130047855A (ko) * 2011-11-01 2013-05-09 가톨릭대학교 산학협력단 항천식 활성을 갖는 저분자량 키토산 올리고당 및 이를 함유하는 약학 조성물
KR20140094775A (ko) * 2013-01-23 2014-07-31 대구가톨릭대학교산학협력단 수용성 키토산을 유효성분으로 함유하는 항암 또는 항염 활성을 갖는 약학적 조성물
KR20190074157A (ko) * 2017-12-19 2019-06-27 한국세라믹기술원 키토산을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물 및 이의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210035388A (ko) 2021-04-01
KR102511613B1 (ko) 2023-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2006211485B2 (en) Bacterial glycolipid activation of CD1d-restricted NKT cells
EP2575877B1 (en) Novel immunoadjuvant compounds and uses thereof
KR20180136395A (ko) 신규한 비피도박테리움 비피덤 균주 및 균주 유래 다당체
WO2014042325A1 (ko) 아포-9'-푸코잔티논 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물
WO2021060792A1 (ko) 키토산을 포함하는 면역억제용 조성물 및 이의 용도
WO2012050269A1 (ko) 결핵균의 rv0351 단백질을 포함하는 수지상 세포의 성숙화 촉진용 조성물
WO2021242056A1 (ko) 비피도박테리움 속 균주, 및 그의 유래의 소포체 및 그의 항염증 및 항균 용도
TWI716249B (zh) 戈氏副擬桿菌的脂多醣用於抑制發炎反應之用途
Taverniti et al. In vitro assessment of the ability of probiotics, blueberry and food carbohydrates to prevent S. pyogenes adhesion on pharyngeal epithelium and modulate immune responses
KR102226729B1 (ko) Treg 세포를 유도하는 효모 유래 다당체의 구조 및 기능 특성
US7928088B2 (en) Th1 cell differentiation accelerator
WO2013025074A2 (ko) 유홍초 추출물 또는 유홍초 유래 화합물을 함유하는 항암 또는 항산화 조성물
WO2019078381A1 (ko) 엔테로코커스 패칼리스, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 근육감퇴, 약화 및 근위축 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 식품 조성물 및 식품첨가제
WO2022145680A1 (ko) 마이크로코커스 루테우스 유래 세포외 소포를 포함하는 호중구성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2023282622A1 (ko) 락토바실러스 사케아이 또는 이로부터 유래된 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 치료용 조성물
WO2024034735A1 (ko) L-ahg를 포함하는 면역 억제용 조성물
WO2021242057A1 (ko) 락토바실러스 속 균주, 및 그의 유래의 소포체 및 그의 항염증 및 항균 용도
이재원 The Role of Toll-like Receptors in Oral Bacteria-Induced Regulation of Major Histocompatibility Complex Ⅰ in Human Submandibular Gland Cells
WO2017026697A1 (ko) 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 면역 조절용 조성물
WO2017122915A1 (ko) 집먼지진드기 유래 알레르겐에 의한 과민반응 면역조절제
WO2016148448A2 (ko) 암백신 조성물 및 키트
ZHISONG Immunomodulatory properties of polysaccharide-protein complex from lycium barbarum L.

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20868175

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20868175

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1