KR20020004997A - 치료제 - Google Patents

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니시야마에이지
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미즈따니시게또시
가또이꾸노신
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오미야 히사시
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Abstract

본 발명은 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 함유하는 것을 특징으로 하는, 성장인자 생산 유도작용을 필요로 하는 환자의 치료제 또는 예방제; 성장인자 생산 유도용 식품, 음료 또는 사료; 성장인자 생산 유도용 화장료; 성장인자 생산 조정제를 제공한다.

Description

치료제 {REMEDIES}
해조류 유래의 산성 다당으로는, 녹조류 유래의 람난 (rhamnan) 황산, 홍조류 유래의 황산화 갈락탄, 갈조류 유래의 황산화 푸코오스 함유 다당 등의 황산화 다당이 알려져 있다. 예를 들어, 푸코이단 (fucoidan) 은 갈조류, 극피동물 등에 함유되어 있는 황산화 푸코오스 함유 다당으로, 황산화 푸코오스를 구성당으로 함유하는 것이다. 또, 상어 연골 등도 황산화 다당을 함유하고 있다.
황산화 다당, 예컨대 푸코이단의 생리작용으로는 암 증식 억제활성, 암 전이 억제활성, 항응혈 활성, 항바이러스 활성 등이 알려져 있고, 의약품으로서의 용도 개발이 기대되고 있다.
간세포 증식인자 생산 유도작용을 갖는 물질로는, 헤파린, 헤파린 황산, 평균분자량 4400 ∼ 5600 의 저분자화 헤파린이 알려져 있지만 (일본 공개특허공보 평 6-312941 호), 기타 황산화 다당, 예컨대 푸코이단, 합성 황산화 다당 등의 성장인자 생산 유도작용에 대한 보고는 없다.
본 발명은, 생리활성을 갖는 산성 당화합물의 의약, 식품, 음료, 사료 또는 화장료로서의 용도에 관한 것이다.
도 1 은 가고메 다시마 유래 푸코이단의 DEAE-셀룰로파인 A-800 칼럼 용출 패턴을 나타내는 도면이다.
도 2 는 황산나트륨 용액을 표준시료로 한 황산 함량의 검량선을 나타내는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명에서 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당은, 성장인자 생산 유도작용을 가지면 되고, 특별히 한정되지는 않지만, 알긴산, 펙틴, 펙틴산, 히알루론산 등의 산성 다당, 콘드로이친 황산, 케라탄 황산, 델마탄 황산 등의 황산화 다당, 동물 유래의 황산화 다당, 예컨대 극피동물 유래의 황산화 다당, 어류 유래의 황산화 다당, 예컨대 상어 연골 유래의 황산화 다당, 식물 유래의 산성 다당, 예컨대 쑥 유래의 황산화 다당, 덩굴여지 (苦瓜) 유래의 황산화 다당, 알로에 유래의 황산화 다당, 국화잎 유래의 황산화 다당, 미생물 유래의 황산화 다당, 예컨대 클로렐라 유래의 황산화 다당, 스피룰리나 (Spirulina) 유래의 황산화 다당, 조류 유래의 황산화 다당 등을 바람직하게 사용할 수 있다.
조류 유래의 황산화 다당으로는 조류 유래의 람난 황산, 홍조류 유래의 황산화 갈락탄, 예컨대 우뭇가사리, 강리, 쟈이언트켈프, 프테로크라디아카리라세아, 카라게난 (carrageenan), 한천류, 아가로스, 아가로펙틴, 포르피란, 갈조류 유래의 황산화 푸코오스 함유 다당, 예컨대 푸코이단, 황산화 푸코이단, 황산화 푸코글루크로노만난, 글루크로녹시로프칸, 사루갓산, 글루크로노만노갈락탄, 키실로푸코글루클로난, 아스코피란, 글루클로노갈락토프칸, 황산화 글루클로노프칸 등을 사용할 수 있다. 특히, 푸코이단, 황산화 푸코갈락탄, λ-카라게난, 콘드로이친 황산 B, 콘드로이친 황산 D, 알긴산, 아가로펙틴 등이 본 발명에 바람직하게 사용할 수 있다. 또, 남조류 유래의 산성 다당, 예컨대 스피룰리나 유래의 황산화 다당, 녹조류 유래의 산성 다당, 예컨대 클로렐라 유래의 황산화 다당을 사용할 수 있다. 특히, 스피룰리나 유래의 황산화 다당은 그 간세포 증식인자 생산 유도작용에 의해, 간기능 개선에 유용하며, 예컨대 C 형 간염의 증상 개선에 현저한 효과를 갖는다. 또, 인산 다당류, 예컨대 핵산도 본원발명의 산성 다당에 포함된다.
본 발명에 사용하는 황산화 푸코오스 함유 다당으로는, 바람직하게는 앞에나온 조류 유래의 푸코이단이 예시되는데, 황산화 푸코오스를 구성성분으로 하는 다당으로 성장인자 생산 유도작용을 갖는 것이라면 특별히 한정되지는 않고, 극피동물, 예컨대 해삼, 성게, 불가사리 등 유래의 푸코이단을 사용해도 된다.
이들은 단독으로 또는 2 종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 또, 이들 예시된 산성 다당의 분해물이나 염도 성장인자 생산 유도작용을 나타내는 한, 특별한 제한없이 사용할 수 있다.
이들 산성 다당의 조제는 각각 공지의 방법으로 조제하면 되고, 정제물 또는 그 산성 다당 함유물 등을 본 발명에 사용할 수 있다. 산성 다당 함유물로는 황산화 다당 획분을 바람직하게 사용할 수 있고, 이 획분으로는 조류 유래의 황산화 다당 획분, 상어 연골 유래의 황산화 다당 획분을 바람직하게 사용할 수 있다. 또, 황산화 다당 함유물의 원료로서 조류, 해삼, 상어 연골 등을 사용할 수 있다. 예컨대, 가고메 다시마, 참 다시마, 토로로 다시마, 모자반 (fucus), 큰실말, 오끼나와 큰실말, 미역, 검정말 (黑藻), 대황 (荒布), 감태 (搗布:Ecklonia), 레소니아 니그레센스 (Lessonia nigrescens), 아스코필럼 노도섬 (Ascophyllum nodosum) 등의 다시마목, 나가모쯔모목, 모자반목 등의 해조류는 특히 본 발명의 사용에 바람직한 푸코이단을 많이 함유하고 있어 원료로서 바람직하다.
본 발명에 사용되는 합성 황산화 다당으로는, 성장인자 생산 유도작용을 갖는 것이라면 되고 특별히 한정되지는 않지만, 지금까지 의약품으로 사용되어 온 황산화 다당의 사용이 바람직하다. 이 합성 황산화 다당으로는 덱스트란 황산나트륨이 예시된다. 이 화합물은 Leuconostoc mesenteroides van Tieghem 에 의한 자당의 발효에 의해 생산된 덱스트란의 부분 분해물을 황산화하여 얻은 황산화 에스테르의 나트륨염이다.
또, 본 발명에서는 황산화 전분, 황산화 카드란, 황산화 펙틴 등의 합성 황산화 다당을 사용할 수 있고, 황산화 다당의 황산화에 의해 얻어지는 고황산화 황산화 다당을 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명에 사용하는 황산화 다당의 황산기의 위치는, 성장인자 생산 유도작용을 발현하면 특별히 한정되지는 않지만, 구성당의 2 위가 황산화된 황산화 다당, 푸코이단, λ-카라게난, 콘드로이친 황산 D, 그들의 분해물을 본 발명에 바람직하게 사용할 수 있다. 또, 황산화 다당의 황산 함량 (또는 황산기 수) 은, 성장인자 생산 유도작용을 발현하면 특별히 한정되지 않는다. 산성 다당의 분해물은 올리고당, 단당도 포함하고, 본 발명에서 2 위가 황산기를 갖는 올리고당, 단당, 예컨대 푸코오스-2-황산, 글루코오스-2-황산을 사용할 수 있다. 이들의 황산화 단당, 황산화 올리고당, 황산화 다당은 그들의 일반적인 합성법에 의해 조제해도 되고, 조제물, 정제물을 본 발명에 사용할 수도 있다. 본 발명에서 올리고당은 단당이 2 개 내지 10 개의 범위에서 연결된 당화합물로, 다당은 단당이 11 개 이상 연결된 당화합물로 정의한다.
예컨대 가고메 다시마로부터 푸코이단을 조제하여, 이 푸코이단을 글루쿠론산 함유 푸코이단 (U-푸코이단이라 칭함) 과 글루쿠론산 비함유 푸코이단 (F-푸코이단이라 칭함) 으로 분리할 수 있고, 본 발명의 유효성분으로서 각각의 푸코이단을 사용할 수 있다. 또, 가고메 다시마로부터 황산화 푸코갈락탄을 조제하여사용할 수 있다.
또한, 한천으로부터 아가로펙틴을 조제하여 사용할 수 있다.
U-푸코이단 및 F-푸코이단은 가고메 다시마로부터 푸코이단을 조제한 후, 음이온 교환수지, 계면활성제 등을 이용하여 분리된다. 가고메 다시마 유래의 U-푸코이단 및 F-푸코이단의 존재비는 약 1 : 2 이고, U-푸코이단은 푸코오스, 만노오스, 갈락토오스, 글루쿠론산 등을 함유하며 황산 함량은 약 20 % 이고, F-푸코이단은 푸코오스와 갈락토오스를 함유하며 황산 함량은 약 50 % 이고, 분자량은 두 물질 모두 약 20 만을 중심으로 분포되어 있다 (제 18 회 당질 심포지움 요지집, 제 159 페이지, 1996 년).
예컨대, 가고메 다시마로부터 조제한 푸코이단 용액을 DEAE-셀룰로파인 A-800 칼럼에 적용한 후, NaCl 함유 완충액으로 농도 구배법에 의해 용출시킴으로써, U-푸코이단과 F-푸코이단으로 분리할 수 있다. 도 1 에 그 일례를 나타낸다. 즉, 도 1 은 U-푸코이단과 F-푸코이단의 분리를 나타내는 도면이며, 도면중 앞의 피크가 U-푸코이단, 뒤의 피크가 F-푸코이단이다.
또, 예컨대 우뭇가사리 유래 황산화 다당, 강리 유래의 황산화 다당, 프테로크라디아 유래의 황산화 다당, 다른 조류 유래의 황산화 다당, 모자반 유래의 푸코이단, 큰실말 유래의 푸코이단, 오끼나와 큰실말 유래의 푸코이단, 미역 유래의 푸코이단, 레소니아 유래의 푸코이단, 아스코필럼 유래의 푸코이단, 다른 조류 유래의 푸코이단도 각각 공지의 방법으로 조제하여 본 발명에 사용할 수 있다.
푸코이단을 함유하는 해삼으로는, 예컨대 일본 공개특허공보 평 4-91027 호에 기재된 해삼이 있고, 이 공보에 기재된 방법으로 해삼으로부터 푸코이단을 조제할 수 있다.
또, 본 발명의 성장인자 생산 유도작용을 갖는, 산성 다당의 분해물, 예컨대 황산화 다당, 푸코이단의 분해물은, 효소학적 방법, 화학적 방법, 물리적 방법 등의 공지의 방법으로 조제하여, 목적으로 하는 성장인자 생산 유도작용을 갖는 분해물을 선택하여 사용할 수 있다.
분해물이란, 분해대상으로 하는 산성 다당에 따라 다르지만, 산성 다당을 분해하여 얻은, 대략 분자량이 바람직하게는 10 만 ∼ 200, 보다 바람직하게는 3 만 ∼ 1000 의 범위인 것을 말한다.
본 발명에서 사용하는 산성 다당의 분해물의 바람직한 조제방법으로는 산분해법이 있고, 이 산성 다당을 산분해함으로써, 성장인자 생산 유도작용을 갖는 분해물을 조제할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 산성 다당의 산분해조건은, 성장인자 생산 유도작용을 갖는 분해물 (이하, 본 발명의 분해물이라 칭함) 이 생성되는 조건이라면 특별히 한정되지 않는다.
예컨대 산성 다당을 산성 수용액 등에 용해 또는 현탁하여 반응시킴으로써, 본 발명의 분해물이 생성된다. 또, 반응시에 가열함으로써 본 발명의 분해물 생성에 필요한 시간이 단축된다.
산성 다당을 용해 또는 현탁하는 산의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 염산, 황산, 질산 등의 무기염, 시트르산, 포름산, 아세트산, 락트산, 아스코르브산등의 유기산, 또는 양이온 교환수지, 양이온 교환섬유, 양이온 교환막 등의 고체산이 사용가능하다.
산의 농도도 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 0.0001 ∼ 5 N, 보다 바람직하게는 0.01 ∼ 1 N 정도의 농도에서 사용가능하다. 또, 반응온도도 특별히 한정되지 않지만 바람직하게는 0 ∼ 200℃, 보다 바람직하게는 20 ∼ 130℃ 로 설정하면 된다.
또, 반응시간도 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 수초 ∼ 수일로 설정하면 된다. 산의 종류와 농도, 반응온도 및 반응시간은 본 발명에 사용하는 분해물의 생성량, 분해물의 중합도에 따라 적절히 선택하면 된다. 예컨대, 푸코이단의 분해물의 제조시에는, 시트르산, 락트산, 말산 등의 유기산을 사용하고, 산의 농도는 수 10 mM ∼ 수 M, 가열온도는 50 ∼ 110℃, 바람직하게는 70 ∼ 95℃, 가열시간은 수분 ∼ 24 시간의 범위에서 적절히 선택함으로써 본 발명의 분해물을 조제할 수 있다. 푸코이단의 산분해물로는 가고메 다시마 유래의 푸코이단의 산분해물이 예시되고, 이 분해물은 성장인자 생산 유도작용, 특히 간세포 증식인자 생산 유도작용이 강한 신생리기능을 갖는 식물 섬유로서 사용할 수 있다.
본 발명의 분해물은 성장인자 생산 유도작용을 지표로 분획할 수 있고, 예컨대 산분해물을 겔 여과법, 분자량 분획막에 의한 분획법 등으로 분자량 분획할 수 있다.
겔 여과법의 예로는, 셀룰로파인 GCL-300 을 사용하여, 예컨대 분자량 25000 초과, 분자량 25000 ∼ 10000 초과, 분자량 10000 ∼ 5000 초과, 분자량 5000 이하등의 임의의 분자량 획분을 조제할 수 있고, 셀룰로파인 GCL-25 를 사용하여, 예컨대 분자량 5000 이하의 획분을 분자량 5000 ∼ 3000 초과, 분자량 3000 ∼ 2000 초과, 분자량 2000 ∼ 1000 초과, 분자량 1000 ∼ 500 초과, 분자량 500 이하 등의 임의의 분자량 획분으로 조제할 수 있다.
또, 한외여과막을 사용하여 공업적으로 분자량 분획을 실시할 수 있고, 예컨대 다이세루사 제조 FE10-FUSO382 를 사용함으로써 분자량 30000 이하의 획분을, 동 FE-FUS-T653 을 사용함으로써 분자량 6000 이하의 획분을 조제할 수 있다. 또한 나노필터막을 사용함으로써 분자량 500 이하의 획분을 얻을 수도 있고, 이들 겔 여과법, 분자량 분획법을 조합함으로써 임의의 분자량 획분을 조제할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 성장인자 생산 유도작용을 갖는, 산성 다당의 분해물, 예컨대 푸코이단의 분해물로는, 화학식 I 로 표시되는 화합물, 화학식 Ⅱ 로 표시되는 화합물이 예시되고, 이들 화합물은 국제공개 제 97/26896 호 팜플렛, 국제공개 제 99/41288 호 팜플렛에 기재된 방법으로 조제할 수 있다. 화학식 I 로 표시되는 화합물의 반복구조를 갖는 황산화 다당 및 올리고당도 본 발명의 성장인자 생산 유도작용을 갖는 황산화 다당으로 사용할 수 있다.
화학식 I 로 표시되는 화합물은 앞에 나온 F-푸코이단을, 알테로모나스 종 SN-1009 (FERM BP-5747) 가 생산하는 엔도형 황산화 다당 분해효소 (F-푸코이단 특이적 분해효소) 로 처리하여, 그 분해물로부터 정제함으로써 얻을 수 있다. 이 화합물 중의 황산기의 함량, 부위에 대해서는 그 분해물 중에서, 임의의 것을 정제할 수 있다. 또, 이 분해물 중에는 화학식 I 로 표시되는 화합물의 다량체도함유되어 있어, 목적에 따라 분리, 정제할 수 있다.
화학식 Ⅱ 로 표시되는 화합물은 앞에 나온 U-푸코이단을, 플라보박테리움 종 SA-0082 (FERM BP-5402) 가 생산하는 엔도 황산화 다당 분해효소 (U-푸코이단 특이적 분해효소) 로 처리하여, 그 분해물로부터 정제함으로써 얻을 수 있다. 이 화합물 중의 황산기의 함량, 부위에 대해서는 그 분해물 중에서, 임의의 것을 정제할 수 있다. 또, 이 분해물 중에는 화학식 I 에는 화학식 Ⅱ 로 표시되는 화합물을 기본 골격으로 하는, 그 다량체도 함유되어 있어, 목적에 따라 분리, 정제할 수 있다.
화학식 I 로 표시되는 화합물의 예로는 후술하는 화학식 VI 로 표시되는 화합물이 있다. 또, 화학식 Ⅱ 로 표시되는 화합물의 예로는 후술하는 화학식 VII 로 표시되는 화합물이 있다.
또, 가고메 다시마 유래의 푸코이단을 유기산 존재하에서 가열처리함으로써 글루쿠론산과 만노오스의 중합체를 얻을 수 있고, 이 중합체도 본 발명의 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당으로 사용할 수 있다. 또, 가열처리조건, 가열시간을 조정함으로써 임의 중합도의 중합체를 조제할 수 있다.
본 발명에서의 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당으로는, 합성 황산화 다당이 포함되고, 셀룰로오스, 전분, 만난, 자일렌, 알긴산, 펙틴, 펙틴산, 프락탄, 아라비난, 키틴, 풀루란, 키실로글루칸, 덱스트란, 전분 등의 황산화물을 사용할 수 있다. 또 예컨대, 리보플라난 황산, 키실로플라난 황산, 렌티난 황산, 가드란 황산, 만노피라난 황산 등의 합성 황산화 다당이나 팔미토일기를 갖는 리보플라난 황산 등의 합성 황산화 알킬 다당을 사용할 수 있다. 또한 황산화 다당이나 그 분해물을 황산화함으로써, 고황산화 황산화 다당 또는 고황산화 분해물을 조제할 수 있다. 이들 황산화 다당, 고황산화 황산화 다당, 고황산화 분해물은 각각 공지의 방법으로 조제하면 되고, 그 분해물도 공지의 방법으로 조제하여 본 발명에 사용할 수 있다. 또, 시판하는 덱스트란 황산, 황산화 셀룰로오스를 사용할 수 있고, 그들 합성 황산화 다당 등의 염 등을 사용해도 된다.
산성 올리고당으로는, 바람직하게는 황산화 올리고당을 들 수 있고, 또 산성 단당으로는, 바람직하게는 황산화 단당을 들 수 있고, 각각 구체적으로는, 상기와 동일한 것을 들 수 있다. 이러한 황산화 올리고당 또는 황산화 단당은, 각각 대응하는 올리고당, 단당을 원료로 각각 공지의 방법으로 황산화하여 조제할 수 있다. 또, 이들의 염도 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 황산화 다당, 황산화 올리고당, 황산화 단당의 지방산 유도체 등도 본 발명의 황산화 다당, 황산화 올리고당, 황산화 단당에 포함된다. 이들은 각각 단독으로 또는 2 종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 생산 유도를 원하는 성장인자는, 세포의 성장을 촉진하는 활성을 가지고 있으면 특별히 한정되지 않는데, 간세포 증식인자 (HGF), 신경 성장인자 (NGF), 신경 영양인자, 상피 성장인자, 밀크 유래 성장인자, 선유아세포 성장인자, 뇌유래 선유아세포 성장인자, 산성 선유아세포 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 혈소판 염기성 단백, 결합조직 활성화 펩티드, 인슐린유사 증식인자 (IGF), 콜로니 형성 자극인자, 에리스로포에틴, 스롬보포에틴, T 세포 성장인자, 인터루킨류 (예컨대 인터류킨 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 15), B 세포 성장인자, 연골 유래 인자, 연골유래 성장인자, 골 유래 성장인자, 골격 성장인자, 내피세포 성장인자, 내피세포 유래 성장인자, 눈 유래 성장인자, 정소 유래 성장인자, 세르톨리 (Sertoli's) 세포 유래 성장인자, 유선 자극인자, 척수 유래 성장인자, 마크로퍼지 유래 성장인자, 리사이클간엽 성장인자, 형질전환 증식인자-α, 형질전환 증식인자-β, 헤파린 결합성 EGF 유사 증식인자, 암필레굴린, SDGF, 베타셀룰린, 에피레굴린, 뉴레굴린 1, 2, 3, 혈관내피 증식인자, 뉴로트로핀, BDNF, NT-3, NT-4, NT-5, NT-6, NT-7, 글리어 (glial) 세포주 유래 신경 영양인자, 간(幹)세포인자, 미드카인, 플레이오토로핀, 에프린 (Ephrin), 안지오포이에틴 (Angiopoietin), 액티빈, 종양괴사인자, 인터페론류 등이 예시된다.
이들 중에서는, 간질환의 예방·치료, 신경성 질환의 예방·치료, 당뇨병의 예방·치료라는 관점에서, HGF, NGF, IGF 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종을 본 발명에 관한 유효성분을 사용하여 생산 유도하는 것이 바람직하다.
HGF 는 간세포 증식작용, 단백합성 촉진작용, 담즙 울체 (鬱滯) 개선작용, 나아가 약제에 의한 신장장해의 예방작용 등을 나타낸다. 또 HGF 의 mRNA 는 뇌, 신장, 폐 등에서도 합성되고 있고, 간실질세포, 신장세뇨관세포, 표피세포 등에도 증식활성이 있는, 중배엽성 세포 성장인자이다. 따라서, 간세포 증식인자의 생산을 유도함으로써, 간염, 중증 간염, 극증 간염, 간경변 및 간내 담즙 울체, 만성 신장염, 폐렴, 창상을 치료 또는 예방할 수 있다.
IGF 는 여러 세포에 다양한 생리작용을 갖는다. IGF 의 생산을 유도함으로써, Ⅱ-형 당뇨병 (인슐린 비의존성) 이나 성장장해질환 (소인증) 을 치료 또는 예방할 수 있다.
NGF 는 신경세포의 생존이나 기능을 유지하거나, NGF 의 농도 구배에 따라 신경세포를 신장시키는 내인성 성장인자이며, NGF 의 생산을 유도함으로써, 알츠하이머병 등의 노인치매증이나 말초신경장해, 뇌혈관장해, 뇌종양, 뇌첨 (惱尖), 두부외상 변성질환, 마취약물중독 등에 의한 신경기능의 수복재생을 필요로 하는 질환의 치료 또는 예방을 할 수 있다. 또, 본 발명의 치료제 또는 예방제는 신경영양인자의 생산 유도작용을 나타내고, 본 발명의 치료제 또는 예방제는 또한 NGF·신경영양인자의 생산 유도작용에 의해, 근위축성 측삭경화증, 약제장해성 말초신경장해, 당뇨병성 말초신경장해, 알츠하이머병, 파킨슨병, 감각신경장해, 색소성 망막증, 황반변성증 등의 치료, 예방에 유용하다.
본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염은 성장인자 생산 유도작용을 가지며, 이들 화합물을 유효성분으로서 성장인자 생산을 필요로 하는 질환의 치료제 또는 예방제를 제조할 수 있다.
본 발명의 성장인자 생산 유도를 필요로 하는 환자의 치료제 또는 예방제는, 본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것을 유효성분으로 하여, 이것을 공지의 의약용 담체와 조합하여 제제화하면 된다. 이 제제의 제조는 일반적으로는, 본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및이들의 염에서 선택되는 것을 약학적으로 허용할 수 있는 액상 또는 고체상의 담체와 배합하고, 또 필요에 따라 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제 등을 첨가하여, 정제, 과립제, 산제, 분말제, 캡슐제 등의 고형제, 통상 액제, 현탁제, 유제 등으로 할 수 있다. 또, 이것을 사용하기 전에 적당한 담체의 첨가에 의해 액상으로 할 수 있는 건조품으로 할 수 있다.
의약용 담체는, 상기 제형에 따라 선택할 수 있고, 경구제의 경우에는, 예컨대 전분, 젖당, 백당, 만니톨, 카르복시메틸셀룰로오스, 옥수수전분, 무기염 등이 이용된다. 또, 경구제의 조제에 있어서는, 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 윤택제, 유동성 촉진제, 교미제, 착색제, 향료 등을 배합할 수도 있다.
한편, 비경구제의 경우에는, 통상의 방법에 따라 본 발명의 유효성분인 본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜 및 이들의 염에서 선택되는 것을 희석제로서의 주사용 증류수, 생리식염수, 포도당 수용액, 주사용 식물유, 참기름, 땅콩유, 대두유, 옥수수유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등에 용해 내지 현탁시키고, 필요에 따라 살균제, 안정제, 등장화제, 무통화제 등을 첨가하여 조제된다.
본 발명의 치료제 또는 예방제는, 제형에 따른 적당한 투여 경로로 투여된다. 투여방법도 특별히 한정되지 않고, 내용, 외용 및 주사에 의한 것이 가능하다. 주사제는, 예컨대 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등에 투여할 수 있고, 외용제에는 좌제 등도 포함된다.
본 발명의 치료제 또는 예방제로서의 투여량은, 그 제형, 투여방법, 사용목적 및 이에 적용되는 환자의 연령, 체중, 증상 등에 따라 적절히 설정되고, 일정하지는 않지만 일반적으로는 제제 중에 함유되는 본 발명에서 사용되는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것의 양이 성인 1 일당 바람직하게는 0.01 ∼ 2000 mg/kg 이 되는 양이다. 물론, 투여량은 상기와 같이 여러 조건에 따라 변동되므로, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다. 경구제의 경우, 본 발명의 치료제 또는 예방제는 원하는 투여량의 범위내에서 그대로 경구투여할 수 있는 것 이외에, 임의의 음식품에 첨가하여 일상적으로 섭취시킬 수도 있다. 또, 본 발명에서 사용되는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것을 성장인자 생산 유도용 음식품의 원료로 사용해도 된다.
부분 간절제를 받은 간장은, 신속하게 재생되어 원래 사이즈가 된다. 이 간재생인자의 본체는 오랫동안 밝혀지지 않았지만, 극증 간염환자의 혈장중에 HGF 가 발견되고, 그 환자의 혈장으로부터 단리, 정제되었다 (J. Clin. Invest., 88 414-419, 1988). 또한, 인체 HGF 의 cDNA 도 클로닝되어, HGF 의 1 차 구조도 명확해졌다 (Biochem. Biophys. Res. Commun., 163 967-973, 1989). 또, 세포의 운동성을 항진시키는 scatter factor (SF) 및 종양세포 장해인자인 tumor cytotoxic factor (TCF) 와 HGF 가 동일 물질인 것도 밝혀졌다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 7001-7005, 1991: Biochem. Biophys. Res. Commun., 180 1151-1158, 1991).
HGF 는 간세포뿐만 아니라 담관 상피세포, 신장뇨세관 상피세포, 위점막세포 등 많은 상피세포의 증식을 촉진시킨다. 또, 상피세포의 운동성의 항진이나 혈관신생, 상피세포의 관강 (管腔) 형성에서 보이는 형태형성을 유도하고, HGF 는 매우 다채로운 생리활성을 나타내는 다기능 활성물질이다. 즉, 다양한 장기에 있어서, 그 장기의 장해를 수복할 때의 상피세포의 증식 촉진, 운동성의 항진이나 혈관신생 등의 형태형성의 유도 등을 한다.
HGF 는 간세포 증식작용, 단백합성 촉진작용, 답즙 울체 개선작용, 나아가 약제에 의한 신장장해의 예방작용 등을 나타낸다. 이러한 사실로부터도, 중증 간염, 간경변 및 간내 답즙 울체의 치료약으로 기대되고 있다. 그러나, HGF 그 자체를 치료약으로서 실용화하기에는 이르지 않았다. 또한, 유전자 치료에서 HGF 의 유전자를 도입하는 방법도 시도되고 있지만, 불필요한 시기, 장소에서 작용함에 의한 부작용으로 인해 이것도 실용화되기에는 아직 멀다. 이와 같이, HGF 를 외부에서 투여하는 것이 아니라, 임의로 유도할 수 있는 것이라면, 간염, 간경변, 간내 담즙 울체 등의 HGF 발현 증강을 필요로 하는 질환의 치료 및 예방에 유효하다고 생각되어, 지금까지 IL-1, 프로스타글란딘 E1, E2, 헤파린 등에 유도작용이 확인되고 있다. IL-1, 프로스타글란딘 E1, E2는 HGF 유전자의 전사를 유도함으로써 HGF 의 생산을 유도한다.
한편, 헤파린에는 HGF 생산 유도작용이 알려져 있지만, HGF 유전자의 전사는 유도하지 않고, mRNA 의 번역 이후의 스텝을 촉진하여 HGF 의 생산을 유도한다.즉, HGF 유전자의 전사가 유도되지 않은 상태에서는, HGF 생산 유도효과는 없다. 반대로, HGF 유전자의 전사가 유도된 상태에서는 현저한 생산 유도가 보인다.
또, 본 발명에 관한 유효성분은, 반드시 HGF 등의 성장인자의 전사유도를 직접적으로 실시하는 것은 아니지만, 그들의 전사가 유도될 때, 이러한 전사를 유의하게 촉진하고, 번역 등의 전사 이후의 단계 또한 촉진할 수 있는 것으로 추정되어, 결과적으로 성장인자의 생산의 증강을 유도한다는 작용을 갖는다. 즉, 본 발명에서 말하는 「성장인자 생산 유도작용」이란, 성장인자의 생산의 증강을 유도하는 작용을 의미하고, 이러한 작용은, 예컨대 사람에 대한 유효성분의 투여 전후에서의 성장인자의 증강에 의해 판단한다. 여기서, 「전사가 유도될 때」 란, 상기 언급한 유효 성분이, 예컨대 HGF 의 전사가 필요한 시기에 작용하고, HGF 의 전사가 촉진되고 있는 초기에 그 전사가 더욱 촉진되고, 그 후 HGF 가 과잉생산되지는 않고, 따라서 HGF 의 생산이 체내에 필요할 때에 증강된다는 것을 의미하고 있고, 이로써 매우 안전하게 HGF 의 생산 유도를 행할 수 있다.
본 발명의 치료제 또는 예방제에 있어서는, 본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염의 성장인자 생산 유도작용을 상승적으로 증가시키는 물질을 더 함유시킬 수 있다.
본 발명에서 말하는 「상승적으로 증가시키는 물질」이란, 본 발명에 관한 유효성분과 이 물질을 병용하면, 이 물질에 의해 전사유도가 적극적으로 이루어지고, 결과적으로 본 발명에 관한 유효성분의 성장인자 생산 유도작용이 상승적으로 증가되는 것이다.
본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염의 성장인자 생산 유도작용를 상승적으로 증가시키는 물질로는, 이러한 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염의 성장인자 생산 유도작용을 상승적으로 증가시키는 작용을 갖는 물질이라면 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 사이토카인류, 프로스타글란딘류, 시클로펜텐환을 갖는 화합물, 미녹시딜, 및 염화 칼프로늄에서 선택되는 물질이 예시된다. 또, 생강 등에 함유되는 생강올, 진저올 등, 심황 등에 함유되는 쿠루쿠민 (curcumin) 등도, HGF 생산 유도작용을 증가시키는 물질이며, 본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염의 HGF 생산 유도작용을 상승적으로 증가시키는 물질로서 사용할 수 있다.
사이토카인류로는, 상기 IL-1 등을 들 수 있고, 프로스타글란딘류로는, 상기 프로스타글란딘 E1, E2등을 들 수 있다.
또, 시클로펜텐환을 갖는 화합물로는 하기 화학식 Ⅲ 으로 표시되는 화합물 및 그 유도체가 예시된다.
이들은 각각 단독으로 또는 2 종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
예컨대, 하기 화학식 Ⅲ ∼ V 로 각각 표시되는 시클로펜텐환을 갖는 화합물은, 프로스타글란딘 E1, E2와 마찬가지로, HGF 유전자의 전사를 유도할 수 있고, 본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염과의 상승작용에 의해 HGF 의 생산을 현저하게 증가시킬 수있다. 즉, HGF 의 전사유도작용을 갖는 사이토카인류, 프로스타글란딘류, 시클로펜텐환을 갖는 화합물, 생강 유래 화합물, 심황 유래 화합물에서 선택되는 물질과, 본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염에서 선택되는 것을 혼합물로서 병용함으로써, 본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염의 성장인자 생산 유도작용이 상승적으로 증가되어, 매우 높은 HGF 의 생산 유도효과를 얻을 수 있다.
또, 이 혼합물을 성장인자 생산 유도용 음식품, 또는 사료의 원료로 사용해도 된다.
예컨대 화학식 Ⅲ 으로 표시되는 화합물의 제조방법은 국제공개 제 98/13328 호 팜플렛, 화학식 IV 로 표시되는 화합물은 국제공개 제 98/39291 호 팜플렛, 화학식 V 로 표시되는 화합물은 국제공개 제 98/40346 호 팜플렛에 각각 기재되어 있고, 이들에 기재된 방법으로 제조할 수 있다.
화학식 Ⅲ 으로 표시되는 화합물의 제조방법은 어떠한 방법이라도 되고, 화학합성법 [카보하이드레이트 리서치 (Carbohydrate Res.), 제 2478 권, 제 217 ∼ 222 페이지 (1993), 헬베티카 키미카 액타 (Helvetica Chimica Acta), 제 55 권, 제 2838 ∼ 2844 페이지 (1972)] 로 합성해도 되고, 또 우론산, 우론산 유도체, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 당화합물, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 당화합물 함유물에서 선택되는 적어도 1 종의 가열처리물 중에 생성되는 시클로펜테논, 그 정제물을 사용할 수도 있다. 화학식 IV 로 표시되는 화합물은, 예컨대 화학식 Ⅲ 으로 표시되는 화합물과 글루타티온을 반응시킴으로써 얻을 수 있다. 또, 화학식 V 로 표시되는 화합물은, 예컨대 화학식 Ⅲ 으로 표시되는 화합물과 무수 프로피온산과 반응시킴으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 치료제 또는 예방제에 있어서, 본 발명에서 사용하는 산성 다당,그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염의 성장인자 생산 유도작용을 상승적으로 증가시키는 물질의 함유량은, 이 유도작용을 상승적으로 증가시킬 수 있는 정도라면 되고, 특별히 한정되지 않지만, 통상 성인 1 일당 바람직하게는 0.001 ∼ 2000 mg/kg 이 되는 양이다. 이 유도작용을 상승적으로 증가시키는 물질은, 본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염에서 선택되는 것과 함께 제제화해도 되고, 또 별도로 제제화해도 된다. 제제화의 방법, 투여의 양태는 본 명세서에 기재된 방법에 준하여 실시하면 되고, 성장인자 생산 유도가 상승적으로 증가하는 본 발명이 원하는 효과가 얻어진다.
본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염은, 또한 헤파라나아제 저해활성을 가지며, 암 전이 억제활성, 혈관신생 억제활성을 갖는다. 따라서, 이러한 것에서 선택되는 것을 유효성분으로서 암 전이 억제제, 혈관신생 억제제를 제조, 제공할 수 있다. 특히, 푸코이단 유래의 화학식 I 로 표시되는 화합물은 강력한 헤파라나아제 저해작용과 암 전이 억제작용을 가지며, 이 화합물을 유효성분으로 함유하는 의약 조성물은 암 전이 억제제로서 매우 유용하다. 또, 이 화합물을 함유하여 이루어지는 음식품은 암 전이 억제용, 혈관신생 억제용 음식품으로 평가가 높은 것이다.
성장인자 생산 유도작용을 갖는, 본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염에서 선택되는 것을 함유하여 이루어지는 성장인자 생산 유도용 식품, 음료 또는 사료는, 그 성장인자생산 유도작용에 의해, 본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염에 감수성을 나타내는 성장인자 생산 유도를 필요로 하는 질환의 증상 개선, 예방 또는 후술하는 바와 같이 생물의 컨디션 개선에 매우 유용하다.
본 발명의 식품, 음료 또는 사료, 또는 후술하는 화장료에서 「함유」란, 함유, 첨가, 희석의 의미를 포함하는 것으로, 함유란, 식품, 음료 또는 사료 중에 본 발명에서 사용되는 유효성분이 함유되는 상태를, 첨가란, 식품, 음료 또는 사료의 원료에, 본 발명에서 사용되는 유효성분을 첨가하는 상태를, 희석이란, 본 발명에서 사용되는 유효성분에 식품, 음료 또는 사료의 원료를 첨가하는 상태를 말하는 것이다.
또, 성장인자 생산 유도작용을 상승적으로 증가시키는 상기 물질, 예컨대 사이토카인류, 프로스타글란딘류, 시클로펜텐환을 갖는 화합물에서 선택되는 것을 더 함유시키는 것이, 상기 질환의 증상 개선, 예방 또는 컨디션 개선에 도움을 주는 관점에서 바람직하다.
본 발명의 음식품에 있어서도, 상기 유효성분, 성장인자 또는 성장인자 생산 유도작용을 상승적으로 증가시키는 물질의 바람직한 양태는, 상기 치료제 또는 예방제의 경우와 동일하다. 특히 본 발명의 음식품 또는 사료로는, 간질환 개선, 신경성 질환 개선, 당뇨병 개선이란 관점에서, 간세포 증식인자 생산 유도용, 인슐린유사 증식인자 생산 유도용, 또는 신경성장인자 생산 유도용 음식품 또는 사료가 바람직하다.
본 발명의 식품 또는 음료의 제조법은, 성장인자 생산 유도작용을 갖는 식품 또는 음료가 얻어지는 한 특별히 한정되지 않는다. 예컨대, 배합, 조리, 가공 등은 일반적인 식품에 따르면 되고, 이러한 식품 또는 음료의 제조법으로 제조할 수 있고, 제조된 식품 또는 음료에 성장인자 생산 유도작용을 갖는 본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것이 유효성분으로 함유되어 있으면 된다.
본 발명의 식품 또는 음료는 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 곡물가공품 (밀가루 가공품, 전분류 가공품, 프리믹스 가공품, 면류, 마카로니류, 빵류, 콩잼류, 메밀류, 밀기울, 멥쌀가루로 만든 국수, 당면, 포장떡 등), 유지가공품 (가소성 유지, 튀김기름, 샐러드유, 마요네즈류, 드레싱 등), 대두가공품 (두부류, 된장, 낫또 등), 식육가공품 (햄, 베이컨, 프레스햄, 소시지 등), 수산제품 (냉동 다진 어육, 어묵, 찌꾸와 (생선살을 대꼬챙이에 꿰어 뚫거나 찐 관 모양의 어묵), 한펜 (상어의 다진 어육 등을 말려 만든 것), 사쯔마아게 (어육에 당근, 우엉 등을 넣고 기름에 튀긴 것), 쯔미래 (생선 다진 살에 계란, 소금, 밀가루 등을 넣고 경단처럼 만든 것), 스지 (뼈나 껍질까지 섞어 만든 하치 어묵), 어육 햄, 소시지, 가쯔오부시, 어란 가공품, 수산 통조림, 쯔꾸다니 (어패류와 야채 해초 등을 설탕. 간장으로 조린 반찬) 등), 유제품 (원료유, 크림, 요구르트, 버터, 치즈, 연유, 분유, 아이스크림 등), 야채·과실 가공품 (페이스트류, 잼류, 절임채소류, 과실음료, 야채음료, 믹스음료 등), 과자류 (쵸컬릿, 비스켓류, 과자빵류, 케이크, 떡과자, 쌀과자류 등), 알콜 음료 (정종, 중국술, 와인, 위스키, 소주, 보드카, 브랜디, 짐, 럼주, 맥주, 청량알콜음료, 과실주, 리큐어 등), 기호음료 (녹차, 홍차, 우론차, 커피, 청량음료, 유산음료 등), 조미료 (간장, 소스, 식초, 미림 등), 통조림·병조림·조림포장 식품 (쇠고기덮밥, 솥밥, 팥밥, 카레, 기타 각종 조리식품), 반건조 또는 농축식품 (리버 페이스트, 기타 스프레드, 메밀국수·우동의 다시, 농축 스프류), 건조식품 (즉석면류, 즉석 카레, 인스턴트 커피, 분말 쥬스, 분말 스프, 즉석 된장국, 조리식품, 조리음료, 조리스프 등), 냉동식품 (스키야끼, 챠완무시 (공기에 계란을 풀고 생선묵, 표고, 국물 등을 섞어 공기채로 찐 요리), 장어구이, 햄버그 스테이크, 슈마이, 만두, 각종 스틱, 후루츠 칵테일 등), 고형식품, 액체식품 (스프 등), 향신료류 등의 농산·임산가공품, 축산가공품, 수산가공품 등을 들 수 있다.
본 발명의 식품 또는 음료로는, 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것이 함유되어 있고, 그 생리기능을 발현하기 위한 필요량이 함유되어 있으면 특별히 그 형상에 제한은 없고, 정제, 과립, 캡슐 등의 형상으로 된 경구적으로 섭취가능한 형상물도 포함한다. 성장인자 생산 유도작용을 갖는 조류 유래의 황산화 다당 및 그 분해물, 예컨대 푸코이단 및 그 분해물은, 그 생리작용과 식물섬유기능을 겸비하는 건강식품소재로서, 식품 또는 음료의 제조소재로서 매우 유용하다.
본 발명의 식품 또는 음료 중의 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것 (유효성분) 의 식품 또는 음료 중의 함유량은 특별히 제한되지 않고, 그 관능과생리활성의 면에서 적절히 선택할 수 있는데, 유효성분의 함유량은, 예컨대 식품 100 중량부당 10-9중량부 이상, 바람직하게는 10-7∼ 2 중량부이며, 예컨대 음료 100 중량부당 10-9중량부 이상, 바람직하게는 10-7∼ 2 중량부이다.
또, 성인 1 일당 유효성분이 0.01 ∼ 2000 mg/kg 이 되도록 섭취하면 되고, 경구적으로 성장인자 생산 유도가 이루어진다는 본 발명이 원하는 효과를 얻을 수 있다.
또, 본 발명에 의해, 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것을 함유하여 이루어지는 생물용 사료가 제공된다.
그리고, 이 사료를 생물에게 투여하는 것을 특징으로 하는 생물의 사육방법이 제공된다.
또, 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것을 함유하는 것을 특징으로 하는 생물사육용제가 제공된다.
이들 발명에 있어서, 생물이란 예컨대 양식동물, 페트동물 등이며, 양식동물로는 가축, 실험동물, 가금, 어류, 갑골류 또는 패류가 예시된다.
사료로는 성장인자 생산 유도작용에 기초한 컨디션 개선용 사료가 예시된다.
생물사육용제로는 침지용제, 사료첨가제, 음료용 첨가제가 예시된다.
이들 발명에 있어서, 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물,산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것은, 생물의 사육효율, 예컨대 생존율, 비육율, 산란율, 산자율, 이유율 등을 향상시키는 효과를 갖는다.
성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것은 통상, 대상생물의 체중 1 kg, 1 일당 바람직하게는 0.01 ∼ 2000 mg 투여되고, 인공배합사료의 원료 중에 첨가혼합시키거나, 인공배합사료의 분말원료와 혼합한 후, 다른 원료에 더 첨가혼합시킬 수 있다.
성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것의, 최종적으로 얻어진 대상생물용 사료 중의 함유량은 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 사용하면 되는데, 0.001 ∼ 15 중량% 의 비율이 적당하다. 예컨대, 간기능을 개선한다는 것을 목적으로 하는 경우에는 0.01 ∼ 10 중량% 의 비율이 적당하다.
인공배합사료로는, 어분, 카세인, 오징어 분말 등의 동물성 원료, 대두박 (大豆粕), 소맥분, 전분 등의 식물성 원료, 사료용 효모 등의 미생물 원료, 대구 간유, 오징어 간유 등의 동물성 유지, 대두유, 유채꽃유 등의 식물성 유지, 비타민류, 미네랄류, 아미노산, 항산화제 등을 원료로 하는 인공배합사료를 들 수 있다. 또, 어육 민찌 등의 어류용 사료를 들 수 있다.
본 발명의 사료의 제조방법에 특별한 제한은 없고, 또 배합도 일반 사료에 준하는 것이면 되고, 제조된 사료 중에 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당,그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것의 유효량이 함유되어 있으면 된다.
또, 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것을 풀, 수조, 유지 탱크 또는 사육영역의 물, 해수 등에 직접 첨가하여 대상생물을 침지함으로써 투여할 수도 있다. 이 침지방법은 대상생물의 사료섭취량이 저하되었을 때 특히 유효하다.
물 또는 해수중의 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것의 농도는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 사용하면 되는데, 바람직하게는 0.00001 ∼ 1 중량% 의 비율이 적당하다.
또, 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것을 함유하는 음료를 사육용 음료로서 대상생물에 섭취시켜도 된다.
이 사료 중의 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것의 농도는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 사용하면 되는데, 바람직하게는 0.0001 ∼ 1 중량% 의 비율이 적당하다.
성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것을 유효성분으로 하는 생물사육용제, 예컨대 침지용제, 사료첨가제, 음료용 첨가제는 그 자체 공지의 배합 및 제조방법으로 제조하면 된다.
본 발명을 적용할 수 있는 생물에는 제한은 없지만, 양식동물로는, 말, 소, 돼지, 양, 산양, 낙타, 야마 등의 가축, 마우스, 래트, 몰모트, 토끼 등의 실험동물, 닭, 오리, 칠면조, 타조 등의 가금, 참돔, 돌돔, 광어, 가자미, 방어, 새끼방어, 부시리, 다랑어, 발구지, 은어, 연어·송어류, 자지복, 민물장어, 미꾸라지, 메기 등의 어류, 참새우, 블랙타이거, 장수새우, 꽃게 등의 갑골류 등, 전복, 소라, 가리비, 굴 등의 패류, 페트동물로는 개, 고양이 등을 들 수 있고, 육상·수중동물에 폭넓게 적용할 수 있다.
성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것을 함유하는 사료를 섭취시키는 것, 또는 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것의 함유액에 대상생물을 침지함으로써, 가축, 실험동물, 가금, 어류, 갑골류, 패류, 페트동물 등의 컨디션이 개선되어, 그 결과 대상생물의 세균성 감염증, 바이러스성 감염증이 예방 또는 치료되고, 감염생물에 있어서는 그 증상이 현저하게 개선된다. 또, 대상생물의 건강이 유지되고, 그 생존율, 성장율, 산란율, 산자율, 이유율, 생육율 등의 개선이 현저하다.
또, 이들 양식동물은 (1) 세균감염에 의한 질병이 빈번하게 발생하고, 한정된 영역에서의 양식으로 인해, 전염병이 발생하면 순식간에 감염되어 전멸하며, (2) 기생충병, 영양성 질병, 환경성 질병, 종양 등이 발생하기 쉽고, (3) 좁은 사육영역에서의 양식동물은 스트레스가 많고, 사육시설에 체표면이 긁혀 상처가 생겨, 곳곳에 세균이나 기생충이 부착되기 쉽고, (4) 또, 스트레스에 의해 식욕이 저하되어 성장이 늦어지는 등의 문제가 있었지만, 본 발명의 사료는 그 컨디션 개선작용에 의해, 좁은 영역에서 사육되고 있는 양식동물의 스트레스를 대폭으로 감소시키고, 사육시설에 체표면이 긁히는 일이 발생하지 않고, 식욕이 왕성해져, 성장율, 산자율, 산란율, 이유율, 질병예방율 등을 현저하게 향상시킬 수 있다.
성장인자 생산 유도작용을 갖는, 본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염은 화장료의 유효성분으로서 유용하며, 본 발명에 의해 본 발명에서 사용하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것을 유효성분으로 하는 성장인자, 예컨대 HGF 생산 유도용 화장료가 제공된다.
또, 성장인자 생산 유도작용을 상승적으로 증가시키는 상기 물질, 예컨대 사이토카인류, 프로스타글란딘류, 시클로펜텐환을 갖는 화합물에서 선택되는 것을 함유시키는 것이, 원하는 효과에 도움이 되는 관점에서 바람직하다.
본 발명의 화장료에 있어서도, 상기 유효성분, 성장인자 또는 성장인자 생산 유도작용을 상승적으로 증가시키는 물질의 바람직한 양태는, 상기 치료제 또는 예방제의 경우와 동일하다. 특히 본 발명의 화장료로는, 상피세포의 활성화라는 관점에서, 간세포 증식인자 생산 유도용, 인슐린유사 증식인자 생산 유도용, 또는 신경 성장인자 생산 유도용 화장료가 바람직하다.
이 화장료의 유효성분으로는 푸코이단 및 그 분해물이 특히 바람직하고, 예컨대 F-푸코이단 및/또는 그 분해물, 또는 화학식 I 로 표시되는 화합물을 유효성분으로 하는 성장인자 생산 유도작용, 예컨대 HGF 생산 유도작용을 갖는 바이오 화장품을 제공할 수 있다. 성장인자 생산 유도용 화장료에서의 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염의 함유량은 통상 바람직하게는 0.0001 ∼ 20 중량%, 보다 바람직하게는 0.001 ∼ 5 중량% 이다.
본 발명의 성장인자 생산 유도용, 예컨대 HGF 생산 유도용 화장료는, 공지의 배합에 준하여 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명의 성장인자 생산 유도용 화장료는, 예컨대 로션류, 에멀젼류, 크림류, 팩류, 목욕용제, 세안제, 목욕용 비누 또는 목욕용 세제 등을 포함하는 것이다.
본 발명의 화장료를, 각각의 용도형태에 따라 원하는 양, 예컨대 로션류의 경우는, 예를 들어 사람의 얼굴 전체에 적용하는 경우, 1 회 사용에 바람직하게는 0.01 ∼ 5 g, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 2 g 정도를 사용하면, 상피세포가 활성화되어 아름다운 피부에 효과적이라는 본 발명이 원하는 효과가 얻어진다.
본 발명은 또, 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것을 유효성분으로 함유하는 성장인자 생산 유도제를 제공하는 것인데, 이 생산 유도제는 성장인자의 기능연구, 성장인자에 관련된 질병용 의약의 스크리닝에도 유용하다.
또한 본 발명은, 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것을 유효성분으로 함유하는 성장인자 생산 조정제를 제공한다.
본 발명의 성장인자 생산 유도제, 성장인자 생산 조정제는, 상기 유효성분을 사용하여 공지의 제제화 방법으로 제제를 제조하면 된다. 성장인자 생산 유도제에는, 상기 치료제 등도 그 일례로서 들 수 있다. 또, 본 발명의 성장인자 생산 조정제는, 생체내에서 성장인자의 전사유도 초기에 성장인자의 전사를 촉진하는 제제를 의미한다. 본 발명의 성장인자 생산 조정제에 의해, 성장인자의 생산이 필요한 상태일 때에만 성장인자의 생산이 증강되고, 성장인자의 생산이 과잉이 되지 않도록 하는 현저한 효과를 갖는다.
본 발명에 사용되는 푸코이단 및/또는 그 분해물은 특히 강한 성장인자 생산 유도작용, 성장인자 생산 조정작용을 가지며, 본 발명의 제제에 사용하는 유효성분으로서 매우 유용하다.
종래 HGF 생산 유도작용이 알려져 있던 헤파린은 HGF 의 mRNA 의 전사는 촉진하지 않지만, 푸코이단 및 그 분해물은, HGF 의 mRNA 의 전사가 촉진되고 있는 초기 단계에서 그 mRNA 의 전사를 더욱 촉진한다. 생체내에서는 HGF 의 mRNA 는 평상시에는 전사되지 않고, 필요한 시기에 전사되고 있다. 푸코이단 및 푸코이단 분해물, 예컨대 후술하는 7-12SFd-F 는 생체내에서 HGF 의 전사가 촉진되고 있는 초기에만 그 전사를 더욱 촉진하고, 그 후 HGF 가 과잉생산이 되지 않으며, HGF 의 생산 상황이 체내에 필요할 때에만 촉진된다는 점에서 매우 안전한 HGF 생산 조정물질이다.
따라서, 본 발명의 다른 양태에서는, 상기 치료제 또는 예방제, 음식품 등을 그대로 성장인자 생산 유도를 조정할 목적으로 사용할 수도 있다. 성장인자 생산 조정제의 투여량으로는, 성장인자 생산을 조정하는 것이 가능하다면 특별히 한정되지는 않지만, 본 발명에 관한 유효성분의 투여량, 예컨대 인체에 대한 유효성분의 투여량이 바람직하게는 0.01 ∼ 2000 mg/kg (체중) 이 되는 양을 들 수 있다.
본 발명에 사용하는 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 예컨대 푸코이단 및/또는 그 분해물은 래트에 대한 경구투여에서 1 g/kg 을 경구 1 회 투여해도 사망예는 확인되지 않는다. 또, 덱스트란 황산나트륨도 안전한 화합물이다. 또, 본 발명에서 사용하는 기타 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염은, 그 생리적 유효량을 래트에 경구투여해도 독성은 확인되지 않는다.
또, 다른 양태로서, 본 발명에서는 성장인자 생산 유도작용을 갖는 쑥 추출물, 덩굴여지 추출물, 알로에 추출물, 쑥갓 추출물, 클로렐라 추출물, 및 스피룰리나 추출물에서 선택되는 추출물을 유효성분으로 하는 성장인자 생산 유도를 필요로 하는 환자의 치료제 또는 예방제를 제공해도 된다.
또, 성장인자 생산 유도작용을 갖는 쑥 추출물, 덩굴여지 추출물, 알로에 추출물, 쑥갓 추출물, 클로렐라 추출물 및 스피룰리나 추출물에서 선택되는 추출물을 유효성분으로 함유하는 성장인자 생산 유도용 음식품, 또는 사료를 제공해도 된다.
또한, 성장인자 생산 유도작용을 갖는 쑥 추출물, 덩굴여지 추출물, 알로에 추출물, 쑥갓 추출물, 클로렐라 추출물 및 스피룰리나 추출물에서 선택되는 추출물을 유효성분으로 함유하는 성장인자 생산 유도용 화장량을 제공해도 된다.
이러한 식물, 미생물로부터의 상기 추출물의 추출 정제는, 다음과 같은 공지의 방법으로 실시할 수 있다. 원료인 식물의 과실, 종자, 잎, 줄기, 뿌리, 뿌리줄기 등, 그리고 미생물을, 적당한 시기에 채취하여 그대로 또는 통상 공기건조 등의 건조공정을 행한 후 추출원료로 한다. 원료가 식물의 착즙액이나 수액인 경우 그대로 추출원료로 사용할 수도 있다.
상기 건조시킨 식물체, 미생물로부터의 상기 유효성분을 함유하는 추출물의 추출은, 공지의 방법에 의해 이하와 같이 실시한다. 원료를 분쇄 또는 잘게 절단한 후, 용매를 사용하여 배치식 또는 연속식 추출방법으로 실시할 수 있다. 추출용매로는, 물, 클로로포름 또는 에탄올, 메탄올, 이소프로필알콜 등의 알콜류, 아세톤메틸에틸케톤 등의 케톤류, 아세트산메틸, 아세트산에틸 등의 친수성 또는 친유성 용매를 단독으로 또는 혼합액으로 사용할 수 있다. 추출온도는 통상 0 ∼ 150℃, 바람직하게는 5 ∼ 120℃ 에서 실시한다.
추출을 배치식으로 실시하는 경우, 추출시간은 10 분 ∼ 20 일 정도이며, 용매량은 건조원료당 통상 1 ∼ 30 배 중량, 바람직하게는 2 ∼ 20 배 중량을 사용한다. 추출조작은 교반 또는 침지방치에 의한 것이라도 되고, 또 조합해도 된다. 추출조작은 필요에 따라 2 ∼ 3 회 반복해도 된다. 연속추출법으로는 환류냉각기와 사이펀 (siphon) 을 조합한 속슬레 추출기 (Soxhlet extractor) 를 사용한 방법 등을 들 수 있고, 용매량, 추출시간 등은 상기 배치식 추출법의 조건과 동일하다.
본 발명에 사용되는 추출물에는, 상기 조작에서 얻은 조(粗)추출액으로부터 불용성 잔류물을 여과 또는 원심분리하여 제거한 것도 포함된다. 또, 불용성잔류물을 활성성분으로 사용하는 경우도 있다.
조추출액으로부터의 활성성분의 정제는, 공지의 식물 유래의 활성성분의 정제방법이면 어느 것이라도 되는데, 이상(二相)용매분리법, 칼럼 크로마토그래피법 등을 단독 또는 조합하여 사용하는 것이 바람직하다.
얻어진 추출물을 유효성분으로 하여, 목적에 따라 약제, 음식품, 사료 및 화장료 등을 제조할 수 있다. 이들 제조는 본 발명의 제 1 ∼ 제 3 발명에 관련된 상기 방법에 준하여 실시하면 된다.
각 목적에 따른 제품중의 추출물의 함유량은 그 성장인자 생산 유도작용으로 결정할 수 있는데, 일반적으로 통상 제품중에 바람직하게는 0.001 ∼ 100 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 ∼ 30 중량%, 보다 더 바람직하게는 0.1 ∼ 20 중량% 이다.
또한, 본 발명에 관한 이들 추출물은 그 유효량을 래트에 경구투여해도 독성은 관찰되지 않는다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 기재에 조금도 한정되는 것은 아니다. 또한, 실시예에서의 각 성분의 배합에 대한 % 는 중량% 를 의미한다.
본 발명은 여러 가지 산성 당화합물, 예컨대 산성 다당, 예컨대 푸코이단 등의 새로운 생리작용을 발견하는 것으로, 그 목적은 각종 산성 당화합물, 예컨대 산성 다당, 예컨대 푸코이단 등의 성장인자 생산 유도작용, 특히 간세포 증식인자 생산 유도작용, 인슐린유사 증식인자 생산 유도작용 또는 신경 성장인자 생산 유도작용을 이용한 의약, 식품, 음료, 사료 또는 화장료를 제공하는 것에 있다.
본 발명은 개략적으로 설명하면, 본 발명의 제 1 발명은 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염에서 선택되는 것 (단, 헤파린, 헤파란 황산을 제외) 을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 성장인자 생산 유도를 필요로 하는 환자의 치료제 또는 예방제에 관한 것이다.
본 발명의 제 2 발명은, 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것을 함유하여 이루어지는 성장인자 생산 유도용 식품, 음료 (이하, 음식품이라 하는 경우가 있음) 또는 사료에 관한 것이다.
본 발명의 제 3 발명은, 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것을 함유하여 이루어지는 성장인자 생산 유도용의 화장료에 관한 것이다.
본 발명의 제 4 발명은, 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것을 함유하여 이루어지는 성장인자 생산 조정제에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당으로는, 바람직하게는 황산화 다당이 예시되고, 황산화 다당으로는 조류 유래의 황산화 다당, 동물 유래의 황산화 다당, 예컨대 극피동물 유래의 황산화 다당, 예컨대 해삼 유래의 황산화 다당, 어류 유래의 황산화 다당, 예컨대 상어 연골 유래의 황산화 다당, 미생물 유래의 황산화 다당, 식물 유래의 황산화 다당, 예컨대 쑥 유래의 황산화 다당, 합성 황산화 다당을 바람직하게 사용할 수 있다.
또, 성장인자 생산 유도작용을 갖는 조류 유래의 황산화 다당으로는 람난 황산, 황산화 갈락탄, 또는 황산화 푸코오스 함유 다당을 바람직하게 사용할 수 있다. 합성 황산화 다당으로는 덱스트란 황산나트륨, 황산화 전분, 황산 카드란 (curdle sulfate), 황산화 펙틴 등이 예시되고, 황산화 다당의 황산화에 의해 얻어지는 고황산화 황산화 다당을 바람직하게 사용할 수 있다. 또, 황산화 푸코오스 함유 다당으로는, 푸코이단을 바람직하게 사용할 수 있다. 산성 올리고당으로는 바람직하게는 황산화 올리고당이 있고, 예컨대 황산화 말토오스, 황산화 락토오스, 황산화 수크로오스, 황산화 트레할로오스, 황산화 락툴로오스, 황산화 멜리비오스, 황산화 셀로비오스, 황산화 이소말토오스, 황산화 투라노오스, 황산화 팔라티노오스, 황산화 말토트리오스, 황산화 말토헥사오스, 황산화 말토헵타오스, 황산화 도데실-말토헥사오스, 하기 화학식 I 로 표시되는 화합물 또는 하기 화학식 Ⅱ 로 표시되는 화합물을 사용할 수 있다:
(식중, R 은 OH 또는 OSO3H 이다),
(식중, R 은 OH 또는 OSO3H 이다).
또, 산성 단당으로는, 바람직하게는 황산화 단당이 있으며, 예컨대 황산화 글루코오스, 황산화 갈락토오스, 황산화 자일로오스, 황산화 2-데옥시글루코오스,황산화 탈로오스 및 황산화 만노오스를 사용할 수 있다. 또, 산성 당알콜로는, 당알콜의 황산화물, 예컨대 황산화 글루시톨 등도 사용할 수 있다. 이들 황산화 올리고당, 황산화 단당, 황산화 당알콜은 이들의 일반적인 합성방법으로 조제해도 된다. 이들 당화합물 중의 황산기의 위치, 황산기의 수는, 이들 황산화 올리고당, 황산화 단당, 황산화 당알콜이 성장인자 생산 유도작용을 나타내는 한 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서는 성장인자 생산 유도작용을 갖는, 산성 다당의 분해물도 사용할 수 있다. 이 분해물에는 성장인자 생산 유도작용을 갖는, 분자량 4000 이하의 헤파린 분해물, 헤파란 황산 분해물도 포함된다.
상기 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜로 예시되는 물질은, 각각 단독으로 또는 2 종 이상 혼합하여 사용할 수 있고, 또 그들의 염도 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 성장인자로는 간세포 증식인자, 인슐린유사 증식인자 및 신경 성장인자가 예시된다.
본 발명의 제 1 발명의 치료제 또는 예방제, 제 2 발명의 식품, 음료 또는 사료 및 제 3 발명의 화장료에는, 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 이들의 염의 성장인자 생산 유도작용을 상승적으로 증가시키는 물질을 더 함유시킬 수 있고, 이 물질로는 사이토카인류, 프로스타글란딘류, 시클로펜텐환을 갖는 화합물, 미녹시딜 및 염화 카르프로늄 (carpronium) 에서 선택되는 물질이 예시된다.
또, 본 발명의 제 2 발명의 식품, 음료 또는 사료는, 바람직하게는 간세포 증식인자 생산 유도용, 인슐린유사 증식인자 생산 유도용 또는 신경 성장인자 생산 유도용의 식품, 음료 또는 사료이다.
또, 본 발명의 제 3 발명의 화장료는, 바람직하게는 간세포 증식인자 생산 유도용, 인슐린유사 증식인자 생산 유도용 또는 신경 성장인자 생산 유도용의 화장료이다.
본 발명의 제 3 발명의 화장료로는, 로션류, 에멀젼류, 크림류, 팩류, 목욕용제, 세안제, 목욕용 비누 또는 목욕용 세제가 예시된다.
본 발명에 관한 「산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 및 이들의 염에서 선택되는 것」을 본 명세서에 있어서 단순히 「유효성분」 이라 하는 경우가 있다.
참고예 1
(1) 가고메 다시마를 충분히 건조 후, 건조물 20 kg 를 자유분쇄기 (나라키카이 세이사쿠쇼 제조) 에 의해 분쇄하였다.
수돗물 900 리터에 염화칼슘이수화물 (니혼소다사 제조) 7.3 kg 를 용해하고, 이어서 가고메 다시마 분쇄물 20 kg 를 혼합하였다. 액온 12 ℃ 에서 액온 90℃ 가 될 때까지 수증기흡입에 의해 40 분간 승온시키고, 이어서 교반하에 90 ∼ 95℃ 로 1 시간 보온하고, 이어서 냉각하여 내각물 1100 리터를 얻었다.
이어서, 고액 분리장치 (웨스트패리어세퍼레이터사 제조 CNA 형) 를 사용하여, 냉각물의 고액 분리를 실시하여 약 900 리터의 고액 분리상청액을 조제하였다.
고액 분리상청액 360 리터를 다이셀사 제조 FE10-FC-FUS0382 (분획분자량 3 만) 를 사용하여 20 리터까지 농축하였다. 이어서 수돗물을 20 리터 첨가하고, 또 20 리터까지 농축하는 조작을 5 회 실시하고, 탈염처리를 실시하여 가고메 다시마 유래의 추출액 25 리터를 조제하였다.
이 추출액 1 리터를 동결건조하여 가고메 다시마 유래 푸코이단 건조물 13 g 를 얻었다.
상기 방법에 준하여, 다시마 건조분쇄물로부터 다시마 유래 푸코이단 건조물을 조제하였다. 또 마찬가지로, 레소니아 니그레센스 (Lessonia nigrescence) 의 건조분말 (상품명 시위드 파우더: 안데스 보에키 가부시키가이샤 판매) 로부터 레소니아 니그레센스 유래 푸코이단 건조물을 조제하였다.
(2) 참고예 1-(1) 기재의 푸코이단 건조물 7 g 을 50 mM 의 염화나트륨과 10 % 의 에탄올을 함유하는 20 mM 의 이미다졸 완충액 (pH 8.0) 700 ㎖ 에 용해하고 원심분리에 의해 불용물을 제거하였다. DEAE-셀룰로파인 A-800 칼럼 (φ11.4 cm ×48 cm) 을 동일 완충액으로 평형화하고 원심분리상청을 적용한 후, 동일 완충액으로 세정하고 염화나트륨 50 mM 로부터 1.95 M 의 농축구배에 의해 용출시켰다 (1 프랙션: 250 ㎖). 페놀황산법 및 카르바졸황산법으로 총 당량 및 우론산 함량을 구하고, 용출순으로 프랙션 43 ∼ 49, 프랙션 50 ∼ 55, 프랙션 56 ∼ 67 의 획분을 얻었다. 이어서, 이들 획분을 전기투석에 의해 탈염 후 동결건조하여 프랙션 43 ∼ 49 에서 Ⅰ 획분 (340 mg), 프랙션 50 ∼ 55 에서 Ⅱ 획분 (870 mg), 프랙션 56 ∼ 67 에서 Ⅲ 획분 (2.64 g) 을 각각 조제하였다.
도 1 에 가고메 다시마 황산화 푸코단의 DEAE-셀룰로파인 A-800 칼럼 용출패턴을 나타낸다. 도 1 에서 종축은 카르바졸황산법으로의 530 nm 의 흡광도 (도중 흑색 원), 페놀황산법으로의 480 nm 의 흡광도 (도중 백색 원), 및 전도도 (mS/cm: 도중 백색 사각) 를, 횡축은 프랙션 번호를 나타낸다.
참고예 2
(1) 알테로모나스 종 SN-1009 (FERM BP-5747) 을, 글루코오스 0.25 %, 펩톤 1.0 %, 효모엑기스 0.05 % 를 함유하는 인공해수 (자마린 래버러토리사 제조) pH 8.2 로 이루어지는 배지 600 ㎖ 을 분주하여 살균한 (120℃, 20 분간) 2 리터의 삼각플라스크에 접종하고, 25℃ 에서 26 시간 배양하여 종배양액으로 하였다. 펩톤 1.0 %, 효모엑기스 0.02 %, 하기 참고예 2-(2) 에 기재된 황산화 다당 0.2 %, 및 소포제 (신에츠카가쿠코교사 제조 KM70) 0.01 % 를 함유하는 인공해수 pH 8.0 으로 이루어지는 배지 20 리터를 30 리터용량의 자르발효기에 넣어 120℃, 20 분간 살균하였다. 냉각 후, 상기의 종배양액 600 ㎖ 을 접종하고, 24 ℃ 에서 24 시간, 매분 10 리터의 통기량과 매분 250 회전의 교반속도의 조건에서 배양하였다.배양종료 후, 배양액을 원심분리하여 균체 및 배양상청을 얻었다. 얻어진 배양상청을 배제분자량 1 만의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과기 (ultrafilter) 에 의해 농축 후 85 % 포화 황산암모늄으로 염석하고, 생긴 침전을 원심분리에 의해 모아, 1/10 농도의 인공해수를 함유하는 20 mM 트리스-염산 완충액 (pH 8.2) 에 대해 충분히 투석하여, 600 ㎖ 의 황산화 다당에 선택적으로 작용하는 엔도형 황산화 다당 분해효소액을 조제하였다.
(2) 건조한 가고메 다시마 2 kg 를 직경 1 mm 의 스크린을 장착시킨 커터밀 (마스유키산업사 제조) 에 의해 분쇄하고, 얻어진 다시마의 칩을 20 리터의 80 % 에탄올 중에 현탁하여 25℃ 에서 3 시간 교반하고 여과지로 여과 후, 잔류물을 충분히 세정하였다. 얻어진 잔류물을 95℃ 로 가온한 40 리터의 50 mM 염화나트륨을 함유하는 20 mM 인산나트륨 완충액 pH 6.5 로 현탁하고, 여러 차례 교반하면서 95℃ 에서 2 시간 처리하여 황산화 다당을 추출하였다.
추출액 중의 현탁물을 여과하여 여과액을 조제한 후, 여과 잔류물을 3.5 리터의 100 mM 염화나트륨에 의해 세정하여 다시 여과액을 얻었다.
양쪽 여과액을 합한 후, 30℃ 까지 온도를 낮추고 3000U 의 알긴산리아제 (나가세 생화학공업사 제조) 를 첨가 후, 에탄올을 4 리터 첨가하여 25℃ 에서 24 시간 교반하였다. 이어서, 원심분리를 실시하여, 얻어진 상청을 배제분자량 10 만의 홀로파이버를 구비한 한외여과기에 의해 4 리터로 농축하고, 다시 10 % 의 에탄올을 함유하는 10 mM 염화나트륨에 의해 착색성 물질이 여과되지 않을 때까지 한외여과를 계속하였다.
비여과액중에 생긴 침전은 원심분리에 의해 제거하고, 이 상청을 5℃ 까지 온도를 낮추어 0.5 N 염산에 의해 pH 를 2.0 으로 한 후, 생긴 단백질 등의 침전을 원심분리에 의해 제거하여 얻어진 상청을 신속히 1 N 수산화나트륨에 의해 pH 를 8.0 으로 하였다.
이어서, 배제분자량 10 만의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과기에 의해 한외여과를 실시하고, 20 mM 염화나트륨 pH 8.0 에 의해 완전히 용매치환한 후, 재차 pH 를 8.0 으로 하여 원심분리 후, 동결건조를 실시하여 약 95 g 의 황산화 다당을 조제하였다.
(3) 건조한 가고메 다시마 2 kg 를 직경 1 mm 의 스크린을 장착시킨 커터밀에 의해 분쇄하여 얻어진 다시마의 칩을 20 리터의 80 % 에탄올 중에 현탁하고, 25℃ 에서 3 시간 교반하여 여과지로 여과 후, 잔류물을 충분히 세정하였다. 얻어진 잔류물을 30 ㎖ 의 상기 참고예 2-(1) 에서 조제한 엔도형 황산화 다당 분해효소액, 10 % 의 에탄올, 100 mM 의 염화나트륨, 50 mM 의 염화칼슘, 및 50 mM 의 이미다졸을 함유하는 20 리터의 완충액 (pH 8.0) 에 현탁하여 25℃ 에서 48 시간 교반하였다. 이 현탁액을 그물코의 직경 32 ㎛ 의 스테인리스철망으로 여과하여 잔류물을 50 mM 의 염화칼슘을 함유하는 10 % 의 에탄올로 세정하였다. 다시 그 잔류물을 10 리터의 50 mM 염화칼슘 함유 10 % 에탄올 중에 현탁하여 3 시간 교반 후, 스테인리스철망으로 여과, 세정하였다. 또한 그 잔류물을 동일 조건으로 현탁 후, 16 시간 교반하여 직경 32 ㎛ 의 스테인리스철망으로 여과, 세정하였다.
이렇게 하여 얻어진 여과액 및 세정액을 모아 배제분자량 3000 의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과기에 의해 한외여과하여 여과액과 비여과액으로 분리하였다.
이 여과액을 회전증발기로 약 3 리터로 농축 후, 원심분리하여 상청을 얻었다. 얻어진 상청을 배제분자량 300 의 막을 장착시킨 전기투석기에 의해 탈염하고, 이 용액에 0.1 M 가 되도록 아세트산칼슘을 첨가하여, 생긴 침전을 원심분리에 의해 제거하였다. 이 상청을 미리 50 mM 의 아세트산칼슘에 의해 평형화시킨 DEAE-셀룰로파인 (수지량 4 리터) 에 넣어 50 mM 의 아세트산칼슘 및 50 mM 의 염화나트륨으로 충분히 세정 후, 50 mM ∼ 800 mM 의 염화나트륨의 농도구배에 의해 용출시켰다. 이 때의 분리채취량은 1 개 당 500 ㎖ 로 실시하였다. 분리채취한 획분을 셀룰로오스 아세테이트막 전기영동법 [애널리티컬 바이오케미스트리 (Analytical Biochemistry), 제 37 권, 제 197 ∼ 202 페이지 (1970)] 에 의해 분석한 결과 염화나트륨 농도가 약 0.4 M 로 용출되는 황산화 당 (프랙션 번호 63 부근) 이 균일하였다.
그래서, 우선 프랙션 번호 63 의 액을 150 ㎖ 로 농축 후, 농도가 4 M 이 되도록 염화나트륨을 첨가하고, 미리 4 M 의 염화나트륨에 의해 평형화한 Phenyl-셀룰로파인 (수지량 200 ㎖) 에 넣어 4 M 의 염화나트륨에 의해 충분히 세정하였다. 비흡착성의 황산화 당획분을 모아 배제분자량 300 의 막을 장착시킨 전기투석기에 의해 탈염하여 탈염액 505 ㎖ 을 얻었다.
얻어진 탈염액 중 40 ㎖ 을 10 % 의 에탄올을 함유하는 0.2 M 의 염화나트륨에 의해 평형화시킨 셀룰로파인 GCL-90 의 칼럼 (4.1 cm ×87 cm) 에 넣어 겔여과를 실시하였다. 분리채취는 1 프랙션 당 9.2 ㎖ 로 실시하였다.
전프랙션에 대한 총 당량의 분석을 페놀황산법 [애널리티컬 케미스트리 (Analytical Chemistry), 제 28 권, 제 350 페이지 (1956)] 에 의해 실시하였다.
이 결과, 황산화 당은 하나의 피크를 형성하였기 때문에 그 피크의 중앙부분, 프랙션 번호 63 ∼ 70 을 모아 배제분자량 300 의 막을 장착시킨 전기투석기에 의해 탈염 후, 동결건조하여 112 mg 의 하기 화학식 Ⅵ 으로 표시되는 화합물의 건조품을 얻었다. 이하, 이 화합물을 7-12SFd-F 라 칭한다.
(4) 참고예 1-(2) 에서 조제한 Ⅲ 획분 (F-푸코이단) 의 2.5 % 수용액 80 ㎖ 에 1 M 트리스 염산 완충액 (pH 7.6) 을 16 ㎖, 1 M CaCl2수용액을 16 ㎖, 4 M NaCl 수용액을 24 ㎖, 참고예 2-(1) 에서 얻은 엔도형 황산화 다당 분해효소액을 8 ㎖, 증류수를 176 ㎖ 첨가하여 30℃ 3 시간 가열하였다. 이 효소처리 F-푸코이단 용액을 효소처리 F-푸코이단의 최종 농도가 2 % 가 되도록 회전증발기로 농축하고, 그 후 증류수 중에서 투석조작을 실시하여 2 % 효소처리 F-푸코이단수용액을 조제하였다. 이 시료를 HPLC (칼럼: SB802.5, 칼럼온도: 35℃, 이동상: 50 mM NaCl, 유속: 0.5 ㎖/min, 검출: RI ATT = 8) 로 분석하였다. 그 결과, 시료중의 약 40 % 가 7-12SFd-F 임이 밝혀졌다.
참고예 3
(1) 건조가고메 다시마 2 kg 를 구멍직경 1 mm 의 스크린을 장착한 커터밀 (마스유키산업사 제조) 에 의해 파쇄하여 20 리터의 80 % 에탄올 중에서 25℃, 3 시간 교반 후 여과, 세정하였다. 얻어진 잔류물을 50 mM 의 염화칼슘, 100 mM 의 염화나트륨, 10 % 의 에탄올, 및 참고예 2-(1) 에서 조제한 알테로모나스 종 SN-1009 (FERM BP-5747) 엔도형 황산화 다당 분해효소를 1U 함유하는 20 리터의 30 mM 이미다졸 완충액 (pH 8.2) 에 현탁하여 25℃ 에서 2 일 교반하고, 이어서 구멍직경 32 ㎛ 의 스테인리스철망으로 여과, 세정하였다. 얻어진 잔류물을 100 mM 의 염화나트륨, 10 % 의 에탄올, 및 4 g 의 알긴산리아제 (나가세생화학공업사 제조) 를 함유하는 40 리터의 인산나트륨 완충액 (pH 6.6) 에 현탁하여 25℃, 4 일간 교반 후, 원심분리하여 상청을 얻었다. 얻어진 상청 중에 포함되는 알긴산의 저분자화물을 제거하기 위해 배제분자량 10 만의 홀로파이버를 장착한 한외여과기에 의해 2 리터로 농축 후, 10 % 의 에탄올을 함유하는 100 mM 의 염화나트륨으로 용액 교환하였다. 이 용액에 등량의 400 mM 아세트산칼슘을 첨가 교반 후, 원심분리하여 얻어진 상청을 빙냉하면서 1 N 의 염산으로 pH 2 로 하였다. 생긴 침전을 원심분리에 의해 제거하여, 얻어진 상청을 1 N 의 수산화나트륨에 의해 pH8.0 으로 하였다. 이 용액을 한외여과에 의해 1 리터로 농축 후, 100 mM 의 염화나트륨으로 용액 교환하였다. 이 때 생긴 침전은 원심분리에 의해 제거하였다. 얻어진 상청중의 소수성 물질을 제거하기 위해, 상청에 1 M 이 되도록 염화나트륨을 첨가하여 1 M 의 염화나트륨으로 평형화한 3 리터의 페닐 셀룰로파인 칼럼 (생화학공업 제조) 에 넣어 통과 획분을 모았다. 이 획분을 한외여과에 의해 농축 후, 20 mM 의 염화나트륨으로 용액 교환하여 동결건조하였다. 동결건조물의 중량은 29.3 g 이었다.
(2) 상기의 동결건조물 15 g 을 400 mM 의 염화나트륨 및 국제공개 제 97/26896 호 팜플렛 기재의 플라보박테리움 종 SA-0082 (FERM BP-5402) 를 배양하여 이 배양물에서 얻어진 엔도형 황산화 다당 분해효소를 9U 함유하는 1.5 리터의 50 mM 트리스 염산 완충액에 용해하여 25℃ 에서 6 일간 반응시킨 후, 증발기로 약 300 ㎖ 로 농축하였다. 농축액을 배제분자량 3500 의 투석튜브에 넣어 철저히 투석하고 투석튜브내에 남은 액을 50 mM 의 염화나트륨으로 평형화한 4 리터의 DEAE-셀룰로파인 A-800 에 넣어 50 mM 염화나트륨으로 충분히 세정 후, 50 ∼ 650 mM 의 염화나트륨의 농도구배에 의한 용출을 실시하였다. 또한 동일 칼럼을 650 mM 의 염화나트륨으로 충분히 용출시켰다. 용출획분 중 650 mM 의 염화나트륨으로 용출한 획분을 황산화 푸코갈락탄 획분으로 모아 배제분자량 10 만의 한외여과기에 의해 농축 후, 10 mM 의 염화나트륨으로 용액을 치환하고 동결건조하여 황산화 푸코갈락탄의 동결건조물을 0.85 g 얻었다. 얻어진 황산화 푸코갈락탄은 구성당으로 갈락토오스와 푸코오스를 함유하고 그 몰비는 약 2:1 이었다.
참고예 4
참고예 2-(2) 에서 조제한 황산화 다당 120 g 을 20 mM 의 염화칼슘, 300 mM 의 염화나트륨, 10 % 의 에탄올 및 10U 의 참고예 2-(1) 에서 조제한 엔도형 황산화 다당 분해효소를 함유하는 8 리터의 20 mM 이미다졸 완충액 (pH 7.5) 에 현탁하여 25℃ 에서 3 일간 교반하고, 배제분자량 10 만의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과장치를 사용하여 상기 완충액을 첨가하면서 한외여과하였다.
한외여과내 액에 34U 의 참고예 3-(2) 에서 조제한 엔도형 황산화 다당 분해효소를 첨가하여 25℃ 에서 2 일간 교반하고, 배제분자량 10 만의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과를 실시하여 물을 첨가하면서 한외여과하였다.
여과액을 모아 증발기로 1.5 리터로 농축 후, 탈염장치에 의해 완전히 탈염하고, 미리 30 mM 의 염화나트륨을 포함하는 5 mM 의 이미다졸염산 완충액 (pH 6.5) 으로 평형화한 3 리터의 DEAE-셀룰로파인 A-800 의 칼럼에 넣어 6 리터의 동일 완충액으로 세정 후, 30 mM 내지 50 mM 의 염화나트륨의 농도구배에 의한 용출을 실시하였다. 용출에 필요한 액량은 48 리터였다. 용출액은 180 ㎖ 씩 분리채취하여 그 당함량을 페놀-황산법에 의해 측정하였다. 또, 232 nm 에서의 흡광도도 동시에 측정하였다. 130 mM 내지 170 mM 의 염화나트륨 용출획분이 하나의 피크를 형성하였기 때문에, 이들 획분을 모아 탈염장치에 의해 탈염 후, 동결건조하여 5.85 g 의 올리고당을 얻었다. 이 올리고당은 질량분석에 의해 분자량 1128 이며 NMR 분석에 의해 하기 화학식 Ⅶ 로 표시되는 화합물임을 확인하였다. 이하, 이 화합물을 6-2S 라 칭한다.
참고예 6
시판되고 있는 미역 자주의 건조물 1 kg 을 구멍 직경 1 mm 의 스크린을 장착시킨 커터밀에 의해 파쇄 후, 10 리터의 80 % 에탄올 중에 현탁하여 3 시간 교반 후, 여과에 의해 여과하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 50 mM 의 염화나트륨을 함유하는 40 mM 의 인산 완충액 (pH 6.5) 20 리터에 현탁하여 95℃ 에서 2 시간 처리하였다. 처리액을 37℃ 까지 냉각 후, 10 % 가 되도록 에탄올을 첨가하고, 시판되는 알긴산리아제 K (나가세생화학공업사 제조) 를 12000U 첨가 후, 실온에서 24 시간 교반하였다. 얻어진 처리액을 원심분리하여 그 상청을 배제분자량 10 만의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과기에 의해 2 리터로 농축 후, 생긴 침전을 원심분리에 의해 제거하였다. 얻어진 상청을 5℃ 로 냉각 후 0.5 N 의 염산을 첨가하여 pH 를 2.0 으로 한 후 30 분간 교반하여 생긴 침전을 원심분리에 의해 제거하였다. 상청의 pH 를 0.5 N 의 수산화나트륨에 의해 8.0 으로 하고, 한외여과에 의해 용액을 20 mM 의 염화나트륨으로 치환하였다. 용액의 pH 를 8.0 으로 조정 후, 원심분리하여 얻어진 상청을 동결건조하여 90.5 g 의 미역 자주 유래 푸코이단을 얻었다.
참고예 7
분쇄한 모자반 (Fucus vesiculosus) 의 건조물 1 kg 을 10 리터의 80 % 에탄올 중에 현탁하여 3 시간 교반 후, 여과지에 의해 여과하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 100 mM 의 염화나트륨을 함유하는 30 mM 의 인산 완충액 (pH 6.0) 30 리터에 현탁하여 95℃ 에서 2 시간 처리하였다. 처리액을 37℃ 까지 냉각 후, 100 g 의 활성탄을 첨가하여 30 분간 교반하였다. 시판되는 알긴산리아제 K 를 3000U 첨가 후, 10 % 가 되도록 에탄올을 첨가하여 실온에서 24 시간 교반하였다. 얻어진 처리액을 원심분리하고, 그 상청을 배제분자량 10 만의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과기에 의해 2 리터로 농축 후, 생긴 침전을 원심분리에 의해 제거하였다. 이 상청에 추출액을 첨가하면서 한외여과하여 색소를 제거하였다. 얻어진 비여과액을 5℃ 로 냉각 후, 0.5 N 의 염산을 첨가하여 pH 를 2.0 으로 한 후 30 분간 교반하여 생긴 침전을 원심분리에 의해 제거하였다. 상청의 pH 를 0.5 N 의 수산화나트륨에 의해 8.0 으로 하고, 한외여과에 의해 용액을 20 mM 의 염화나트륨으로 치환하였다. 용액의 pH 를 8.0 으로 조정 후, 원심분리하여 얻어진 상청을 동결건조하여 71 g 의 모자반 유래 푸코이단을 얻었다.
상기 방법에 준하여 아스코필럼 노도섬 (Ascophyllum nodosum) 의 건조분말 (상품명 알긴골드: 안데스 보에키 가부시키가이샤 판매) 로부터 아스코필럼 노도섬유래 푸코이단을 조제하였다.
참고예 8
참고예 1-(1) 에 기재된 방법으로 조제한 가고메 다시마 유래 푸코이단 2 g 을 100 ㎖ 의 물에 용해하여 그 pH 를 시트르산으로 pH 3 으로 조정 후, 100℃ 에서 3 시간 처리하여 해당 푸코이단의 산분해물을 조제하였다. 이 가수분해물을 셀룰로파인 GCL-300, 또는 셀룰로파인 GCL-25 에 의한 겔여과로 분자량분획하여 분자획 25000 초과 (A 획분), 25000 ∼ 10000 초과 (B 획분), 10000 ∼ 5000 초과 (C 획분), 5000 ∼ 2000 초과 (D 획분), 2000 ∼ 500 초과 (E 획분), 500 이하 (F 획분) 으로 분획하였다. 또한 이들 획분 및 산분해물을 각각 탈염 후 동결건조를 실시하여 산분해물 및 산분해물의 각 분획물을 조제하였다.
참고예 9
시판되는 염장큰실말 5 kg 을 20 리터의 에탄올과 혼합하여 가위로 잘게 절단하였다. 하룻밤동안 방치 후 여과지로 여과하여 얻어진 잔류물을 12.5 리터의 물에 현탁하여 95℃ 에서 2 시간 처리하였다. 처리액을 여과지에 의해 여과 후, 350 mM 의 염화나트륨을 함유하는 2.5 % 의 염화세틸피리듐용액을 2600 ㎖ 첨가하여 3 일 방치하였다. 상청부분을 폐기하고 침전부분을 원심분리하여 그 상청도 폐기하였다. 얻어진 침전에 2.5 리터의 350 mM 염화나트륨을 첨가 후, 호모게니저로 균일하게 하여 원심분리하였다. 이 세정조작을 3 회 반복하였다. 얻어진 침전에 400 ㎖ 의 400 mM 염화나트륨을 첨가 후, 균질화기로 균일하게 하고, 80 % 가 되도록 에탄올을 첨가하여 30 분간 교반 후 여과지로 여과하였다.얻어진 잔류물에 500 ㎖ 의 염화나트륨 포화 80 % 에탄올을 첨가 후, 균질화기로 균일하게 하고, 1 리터가 되도록 염화나트륨 포화 에탄올을 첨가하여 30 분간 교반 후 여과지로 여과하였다. 이 세정조작을 여과액의 260 nm 의 흡광도가 0 이 될 때까지 반복하였다 (통상 5 회). 얻어진 잔류물을 1.5 리터의 2 M 염화나트륨에 용해 후, 불용물을 원심분리에 의해 제거하고, 미리 2 M 의 염화나트륨에 의해 평형화한 100 ㎖ 의 DEAE-셀룰로파인 A-800 의 칼럼에 통과시켰다. 통과 획분을 배제분자량 10 만의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과기에 의해 2 리터로 농축 후, 한외여과에 의해 용액을 2 mM 의 염화나트륨으로 치환하였다. 이 용액을 원심분리하고 얻어진 상청을 동결건조하여 22.9 g 의 큰실말 유래 푸코이단을 얻었다.
참고예 10
(1) 건조한 우뭇가사리 50 g 을 가위로 잘게 절단하고 500 ㎖ 의 80 % 에탄올 중에 현탁 후 25℃ 에서 3 시간 교반하여 여과지로 여과하였다. 얻어진 잔류물을 1 리터의 100 mM 염화나트륨을 함유하는 30 mM 의 인산나트륨 완충액 (pH 6.5) 에 현탁하여 95℃ 에서 2 시간 처리 후, 구멍직경 106 ㎛ 의 스테인리스제 체로 여과하였다. 얻어진 여과액에 상기 인산나트륨 완충액을 첨가하여 3 리터로 하고, 5 g 의 활성탄을 첨가하여 25℃ 에서 하룻밤동안 교반 후, 원심분리하였다. 얻어진 상청을 배제분자량 10 만의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과기로 200 ㎖ 에 농축 후, 한외여과기에 의해 용액 교환하여 10 mM 염화나트륨 용액으로 하였다. 용액중의 불용물을 원심분리에 의해 제거 후 동결건조하여, 우뭇가사리 유래 황산화 다당 획분의 건조물 2.3 g 을 얻었다.
(2) 참고예 10-(1) 에 기재된 방법에 의해 건조 강리 50 g 에서 강리 유래 황산화 다당 4.4 g 을 조제하였다. 또, 동일하게 건조 헤테로크라디아 캐피라세라에서 헤테로크라디아 유래 황산화 다당 1.0 g 을 조제하였다.
(3) -① 시판되고 있는 건조 레소니아 니그레센스의 분말 1 kg 를 10 리터의 80 % 에탄올 중에 현탁 후 25℃ 에서 3 시간 교반하여 여과지로 여과하였다. 얻어진 잔류물을 20 리터의 100 mM 염화나트륨을 함유하는 30 mM 의 인산나트륨 완충액 (pH 6.5) 에 현탁하여 95℃ 에서 2 시간 처리 후, 구멍 직경 106 ㎛ 의 스테인리스제 체로 여과하였다. 얻어진 여과액에 100 g 의 활성탄, 2.4 리터의 에탄올, 6,000U 의 알긴산리아제 K 를 첨가하여 25℃ 에서 22 시간 교반 후, 원심분리하였다. 얻어진 상청을 배제분자량 10 만의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과기로 1.2 리터로 농축 후, 원심분리에 의해 불용물을 제거하여 5℃ 에서 24 시간 방치하였다. 생긴 침전을 원심분리에 의해 제거하고 얻어진 상청을 한외여과기에 의해 용액 교환하여 100 mM 염화나트륨 용액으로 하였다. 이 용액을 4 ℃ 이하로 냉각 후 염산에 의해 pH 를 2.0 으로 하여, 생긴 침전을 원심분리에 의해 제거하였다. 얻어진 상청의 pH 를 수산화나트륨에 의해 8.0 으로 하고, 2 리터로 농축 후, 한외여과기에 의해 20 mM 의 염화나트륨에 용액 교환하였다. 이 용액중의 불용물을 원심분리에 의해 제거 후, 동결건조하여 레소니아 유래 푸코이단획분의 건조물을 41 g 얻었다.
(3) -② 상기 동결건조물 6 g 을 100 mM 의 염화나트륨을 함유하는 600 ㎖의 20 mM 이미다졸-염산 완충액 (pH 6) 에 용해하고, 미리 동일 완충액으로 평형화한 5 리터의 DEAE-셀룰로파인 A-800 에 넣어 10 리터의 동일 완충액으로 세정 후, 100 ∼ 1600 mM 의 염화나트륨의 농도구배에 의한 용출을 실시하였다. 용출에 사용한 액량은 13 리터이며 분리채취는 1 개 당 500 ㎖ 로 실시하였다. 용출획분 중 250 mM, 530 mM 및 700 mM 부근의 염화나트륨 용출획분을 각각 500 ㎖ 씩 정제수로 투석하고, 동결건조하여 동결건조물을 각각 DEAE 33 획분, DEAE 37 획분, DEAE 40 획분으로 명명하고 각각 57 mg, 24 mg 및 62 mg 을 얻었다.
참고예 11
해삼을 5 kg 해체하여 내장을 제거하고 체벽을 모았다. 체벽 습중량 200 g 당 500 ㎖ 의 아세톤을 첨가하여 균질화기로 처리 후 여과하여 잔류물을 더 이상 착색물질이 없어 질 때까지 아세톤으로 세정하였다. 이 잔류물을 흡인건조하여 140 g 의 건조물을 얻었다. 이 건조물에 0.4 M 의 식염수 2.8 리터를 첨가하여 100℃ 에서 1 시간 처리 후 여과하여, 잔류물을 0.4 M 의 식염수로 충분히 세정하여 추출액 3.7 리터를 얻었다. 이 추출액에 5 % 의 세틸피리듐클로리드를 침전이 생기지 않을 때까지 첨가하여, 생긴 침전을 원심분리로 모았다. 이 침전을 0.4 M 의 식염수에 현탁 후 다시 원심분리하고, 얻어진 침전에 1 리터의 4 M 식염수를 첨가하여 균질화기로 처리 후, 교반하면서 4 리터의 에탄올을 첨가하여 1 시간 교반 후, 여과하여 침전을 얻었다. 이 침전에 대해 80 % 에탄올에 현탁 후 여과라는 공정을 상청의 260 nm 의 흡광도가 0 이 될 때까지 반복하였다. 얻어진 침전을 2 리터의 2 M 식염수에 현탁하여 불용물을 원심분리에 의해 제거하였다.상청을 배제분자량 3 만의 막을 구비한 한외여과장치에 의해 한외여과하여 완전하게 탈염 후, 동결건조하여 3.7 g 의 해삼 유래 푸코이단을 얻었다.
참고예 12
한천말 (나카라이테스크 가부시키가이샤 제조) 500 mg 를 100 ㎖ 의 증류수에 현탁 후, 가열하여 한천을 용해시켰다. 그 후, 45℃ 까지 냉각하여 45℃ 에서 보온하였다.
이 한천용해액에 X50 β-아가라아제 완충액 (FMC 사 제조: β아가라아제에 부속) 을 2 ㎖ 첨가하고, 1 U/㎕ β아가라아제 (FMC 사 제조) 100 ㎕ 를 첨가하였다. 이 용액을 45℃ 에서 24 시간 보온 후, 2.5 배량의 에탄올을 첨가하여 냉각 후 원심분리하여 침전을 회수하였다. 이 침전을 건조하여 20 ㎖ 의 증류수에 용해하였다. 이 용해액을 동결건조하여 파우더 형상의 아가로팩틴 획분을 조제하였다.
참고예 13
(1) 스피룰리나 플라텐시스 (Spirulina platensis) 의 건조균체 10 g 을 100 ㎖ 의 클로로포름에 현탁하고 여과하여 불용획분을 회수하는 조작을 5 회 반복하였다. 그 후, 100 ㎖ 의 에탄올에 현탁하고 여과하여 불용획분을 회수하는 조작을 3 회 반복하였다. 이 조작으로 얻은 불용획분으로부터 에탄올을 완전히 제거하여 100 ㎖ 의 증류수에 현탁하였다. 이 현탁액을 1 시간 동안 60℃ 에서 보온한 후, 원심분리하여 상청을 얻었다. 이 상청을 다시 여과하고 여과액에 2.5 배량의 에탄올을 첨가하여 -20℃ 에서 냉각한 후, 저온에서 원심분리하여 침전을 얻었다. 이 침전을 증류수에 용해하여 동결건조하여 파우더 형상의 스피룰리나 유래의 황산화 다당을 함유하는 획분을 조제하였다.
(2) 건조 스피룰리나분말 (발매: (주) 스피룰리나연구소) 20 g 을 균질화기 (니혼세이키사 제조) 에 넣어 400 ㎖ 의 아세톤을 첨가하여 8000 rpm 에서 10 분간 균질화시켰다. 균질화물을 여과지로 여과하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 상기의 조작과 동일하게 아세톤 세정을 3 회 반복하여 아세톤 세정 잔류물을 얻었다. 아세톤 세정 잔류물을 아세톤 세정과 동일하게 90 % 에탄올로 4 회, 80 % 에탄올로 4 회 세정하여 에탄올 세정 잔류물을 얻었다.
에탄올 세정 잔류물에 600 ㎖ 의 100 mM 염화나트륨과 10 % 에탄올을 함유하는 30 mM 의 인산 완충액 (pH 7.0) 을 첨가하여 실온에서 18 시간 교반하였다. 이 혼합물을 10000 rpm 으로 40 분간 원심분리하여 상청을 얻었다. 상청에 혼입된 불용물을 여과지로 여과하여 조추출물 (여과액) 을 얻었다. 얻어진 조추출물을 배제분자량 1 만의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과장치로 300 ㎖ 까지 농축한 후, 2 리터의 10 % 에탄올을 함유하는 100 mM 염화나트륨을 첨가하면서 한외여과하였다. 이 후, 10 % 에탄올 및 50 mM 의 염화나트륨을 함유하는 10 mM 이미다졸-염산 완충액 (pH 7.0) 으로 용매치환하여 스피룰리나 고분자획분을 240 ㎖ 을 얻었다.
스피룰리나 고분자획분을 10 % 에탄올 및 50 mM 염화나트륨을 함유하는 10 mM 이미다졸-염산 완충액 (pH 7.0) 으로 평형화한 DEAE-셀룰로파인 A-800 칼럼 (φ3 ×14.2 cm) 에 첨가하여 동일 완충액 360 ㎖ 로 칼럼을 세정한 후, 0.05 M(200 ㎖) 내지 2 M (200 ㎖) 까지의 염화나트륨의 농도구배에 의해 용출시켰다. 용출액은 1 개 당 10 ㎖ 로 분획하였다. 용출획분 중, 프랙션 No. 14 내지 30 까지를 스피룰리나 황산화 다당 획분-Ⅰ (SSP-Ⅰ), 프랙션 No. 69 내지 77 까지를 스피룰리나 황산화 다당 획분-Ⅱ (SSP-Ⅱ), 프랙션 No. 78 내지 83 까지를 스피룰리나 황산화 다당 획분-Ⅲ (SSP-Ⅲ), 프랙션 No. 84 내지 99 까지를 스피룰리나 황산화 다당 획분-Ⅳ (SSP-Ⅳ) 로 각각 명명하였다. SSP-Ⅰ, SSP-Ⅱ, SSP-Ⅲ 및 SSP-Ⅳ 를 증류수에 대해 충분히 투석하여 동결건조한 결과, 각각 200 mg, 260 mg, 100 mg 및 60 mg 이었다.
(3) 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 의 건조균체 10 g 을 100 ㎖ 의 클로로포름에 현탁하고 여과하여 불용획분을 회수하는 조작을 3 회 반복하였다. 그 후, 100 ㎖ 의 에탄올에 현탁하고 여과하여 불용획분을 회수하는 조작을 3 회 반복하였다. 이 조작으로 얻은 불용획분으로부터 에탄올을 완전히 제거하여 100 ㎖ 의 증류수에 현탁하였다. 이 현탁액을 1 시간동안 60℃ 에서 보온한 후, 여과하였다. 여과액에 2.5 배량의 에탄올을 첨가하여 -20℃ 에서 냉각한 후, 저온에서 원심분리하여 침전을 얻었다. 이 침전을 증류수에 용해하고 동결건조하여 파우더 형상의 클로렐라 유래의 황산화 다당을 함유하는 획분을 조제하였다.
(4) 건조클로렐라 분말 (발매: (주) 클로렐라 센터) 20 g 을 균질화기 (니혼세이키사 제조) 에 넣어 400 ㎖ 의 아세톤을 첨가하여 8000 rpm 에서 10 분간 균질화시켰다. 균질화물을 여과지로 여과하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 상기의 조작과 동일하게 아세톤 세정을 3 회 반복하여 아세톤 세정 잔류물을 얻었다. 아세톤 세정 잔류물을 아세톤 세정과 동일하게 90 % 에탄올로 4 회, 80 % 에탄올로 4 회 세정하여 에탄올 세정 잔류물을 얻었다.
에탄올 세정 잔류물에 600 ㎖ 의 100 mM 염화나트륨과 10 % 에탄올을 함유하는 30 mM 의 인산 완충액 (pH 7.0) 을 첨가하여 실온에서 18 시간 교반하였다. 이 혼합물을 10000 rpm 으로 40 분간 원심분리하여 상청을 얻었다. 상청에 혼입된 불용물을 여과지로 여과하여 조추출물 (여과액) 을 얻었다. 얻어진 조추출물을 배제분자량 1 만의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과장치로 310 ㎖ 까지 농축한 후, 3 리터의 10 % 에탄올을 함유하는 100 mM 염화나트륨을 첨가하면서 한외여과하였다. 이 후, 10 % 에탄올 및 50 mM 의 염화나트륨을 함유하는 10 mM 이미다졸-염산 완충액 (pH 7.0) 으로 용매치환하여 클로렐라 고분자획분 203 ㎖ 을 얻었다.
클로렐라 고분자획분을 10 % 에탄올 및 50 mM 염화나트륨을 함유하는 10 mM 이미다졸-염산 완충액 (pH 7.0) 으로 평형화한 DEAE-셀룰로파인 A-800 칼럼 (φ3 ×14.2 cm) 에 첨가하여 동일 완충액 297 ㎖ 로 칼럼을 세정한 후, 0.05 M (200 ㎖) 내지 2 M (200 ㎖) 까지의 염화나트륨의 농도구배에 의해 용출시켰다. 용출액은 1 개 당 10 ㎖ 로 분획하였다. 용출획분 중, 프랙션 No. 63 내지 68 까지를 클로렐라 황산화 다당 획분-Ⅰ (CPS-Ⅰ) 로 명명하고, 프랙션 No. 69 내지 75 까지를 클로렐라 황산화 다당 획분-Ⅱ (CPS-Ⅱ) 로 명명하였다. CPS-Ⅰ 및 CPS-Ⅱ 를 증류수에 대해 충분히 투석하여 동결건조한 결과, 각각 140 mg 및 200mg 이었다.
(5) 시판되고 있는 쑥 (Altemisia princeps pampan: 사카모토칸포도오 제조) 을 분쇄한 쑥분말 10 g 을 100 ㎖ 의 클로로포름에 현탁하고 여과하여 불용획분을 회수하는 조작을 3 회 반복하였다. 그 후, 100 ㎖ 의 에탄올에 현탁하고 여과하여 불용획분을 회수하는 조작을 5 회 반복하였다. 이 조작으로 얻은 불용획분으로부터 에탄올을 완전히 제거하여 100 ㎖ 의 증류수에 현탁하였다. 이 현탁액을 1 시간동안 60℃ 에서 보온한 후, 여과하였다. 여과액에 2.5 배량의 에탄올을 첨가하여 -20℃ 에서 냉각한 후, 저온에서 원심분리하여 침전과 쑥상청획분을 얻었다. 이 침전을 증류수에 용해하고, 동결건조하여 파우더 형상의 쑥 유래 황산화 다당을 함유하는 획분을 조제하였다.
(6) 건조 쑥잎 (발매: 사카모토칸포도오) 50 g 을 균질화기 (니혼세이키사 제조) 에 넣어 500 ㎖ 의 아세톤을 첨가하여 8000 rpm 에서 10 분간 균질화시켰다. 균질화물을 여과지로 여과하여 잔류물을 얻었다. 이상의 조작을 2 회 실시하고, 얻어진 100 g 의 쑥잎 잔류물을 균질화기에 넣어 500 ㎖ 의 아세톤을 첨가하여 8000 rpm 에서 10 분간 균질화시켰다. 균질화물을 여과지로 여과하여 잔류물을 얻었다. 이 조작을 4 회 반복하여 아세톤 세정 잔류물을 얻었다. 아세톤 세정 잔류물을 아세톤 세정과 동일하게 90 % 에탄올로 4 회, 80 % 에탄올로 4 회 세정하여 에탄올 세정 잔류물을 얻었다.
에탄올 세정 잔류물에 5 리터의 100 mM 의 염화나트륨과 10 % 에탄올을 함유하는 30 mM 의 인산 완충액 (pH 8.0) 을 첨가하여 실온에서 19 시간 교반하였다.이 혼합물을 여과지로 여과하여 조추출물 (여과액) 을 얻었다. 얻어진 조추출물을 배제분자량 1 만의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과장치로 2 리터까지 농축한 후, 10 리터의 10 % 에탄올을 함유하는 100 mM 염화나트륨을 첨가하면서 한외여과하였다. 이 후, 500 ㎖ 까지 농축하여 10 % 에탄올 및 50 mM 의 염화나트륨을 함유하는 10 mM 이미다졸-염산 완충액 (pH 7.0) 으로 용매치환하였다. 이 액을 비이커에 옮겨 1 g 의 활성탄을 넣어 실온에서 40 분간 교반한 후, 10000 rpm, 40 분간 원심분리하였다. 상청에 혼입된 활성탄은 여과지로 여과하여 제거하였다. 이와 같이 하여 쑥잎 고분자획분을 560 ㎖ 얻었다.
쑥잎 고분자획분을 10 % 에탄올 및 50 mM 염화나트륨을 함유하는 10 mM 이미다졸-염산 완충액 (pH 7.0) 으로 평형화한 DEAE-셀룰로파인 A-800 칼럼 (φ3.5 ×31 cm) 에 첨가하여 동일 완충액 940 ㎖ 로 칼럼을 세정한 후, 0.05 M (600 ㎖) 내지 2 M (600 ㎖) 까지의 염화나트륨의 농도구배에 의해 용출시켰다. 용출액은 1 개 당 10 ㎖ 로 분획하였다. 용출획분 중, 프랙션 No. 180 내지 202 까지를 쑥잎 산성 다당 획분 (YAP) 으로 명명하고, 프랙션 No. 203 내지 270 까지를 쑥잎 황산화 다당 획분 (YSP) 으로 명명하였다. YAP 를 증류수에 대해 충분히 투석하여 동결건조한 결과, 250 mg 이었다.
쑥 황산화 다당 획분을 더욱 분획하기 위해서는, 쑥잎 황산화 다당 획분을 3 리터의 10 % 에탄올 및 100 mM 염화나트륨을 함유하는 10 mM 이미다졸-염산 완충액 (pH 7.0) 으로 투석하였다. 투석한 황산화 다당획분 (327 ㎖) 을 동일 완충액으로 평형화한 DEAE-셀룰로파인 A-800 칼럼 (φ3 cm ×14.2 cm) 에 첨가하였다.칼럼을 273 ㎖ 의 완충액으로 세정한 후, 0.1 M (200 ㎖) - 2 M (200 ㎖) 의 염화나트륨의 농도구배로 용출하였다. 용출액은 1 개 당 5 ㎖ 로 분획하였다. 용출획분 중, 프랙션 No. 140 내지 154 까지를 쑥잎 황산화 다당 획분-Ⅰ(YSP-Ⅰ) 으로 명명하고, 프랙션 No. 155 내지 200 까지를 쑥잎 황산화 다당 획분-Ⅱ (YSP-Ⅱ) 로 명명하였다. YSP-Ⅰ 과 YSP-Ⅱ 를 각각 증류수에 대해 충분히 투석하여 동결건조한 결과, 20 mg 및 130 mg 이었다.
YSP-Ⅱ (119.4 mg) 에 10 % 에탄올을 59.7 ㎖ 및 0.2 M 염화나트륨을 함유하는 10 mM 이미다졸-염산 완충액 (pH 7.0) 을 첨가하고 실온에서 하룻밤동안 교반하여 용해하였다. 용해한 YSP-Ⅱ 는 동일 완충액으로 평형화한 DEAE-셀룰로파인 A-800 칼럼 (φ2.5 cm ×10.2 cm) 에 첨가하였다. 칼럼을 200 ㎖ 의 완충액으로 세정한 후, 0.2 M (100 ㎖) - 1 M (100 ㎖) 의 염화나트륨의 농도구배로 용출하였다. 용출액은 1 개 당 5 ㎖ 로 분획하였다. 용출획분 중, 프랙션 No. 54 내지 70 까지를 쑥잎 황산화 다당 획분-Ⅱ-2 (YSP-Ⅱ-2) 로 명명하고, 프랙션 No. 71 내지 90 까지를 쑥잎 황산화 다당 획분-Ⅱ-3 (YSP-Ⅱ-3) 으로 명명하고, 프랙션 No. 91 내지 120 까지를 쑥잎 황산화 다당 획분-Ⅱ-4 (YSP-Ⅱ-4) 로 명명하였다. 동결건조한 결과, 각각 39.5 mg, 61 mg, 57.3 mg 이었다.
(7) 시판되고 있는 식용 덩굴여지를 믹서로 분쇄한 분쇄물을 동결건조하여 덩굴여지 건조물을 얻었다. 덩굴여지 건조물 10 g 을 100 ㎖ 의 클로로포름에 현탁하고 여과하여 불용획분을 회수하는 조작을 5 회 반복하였다. 그 후, 100 ㎖ 의 에탄올에 현탁하고 여과하여 불용획분을 회수하는 조작을 3 회 반복하였다.이 조작으로 얻은 불용획분으로부터 에탄올을 완전히 제거하여 100 ㎖ 의 증류수에 현탁하였다. 이 현탁액을 1 시간동안 60℃ 에서 보온한 후, 여과하였다. 여과액에 2.5 배량의 에탄올을 첨가하여 -20℃ 에서 냉각한 후, 저온에서 원심분리하여 침전을 얻었다. 이 침전을 증류수에 용해하고 동결건조하여 파우더 형상의 황산화 다당을 함유하는 획분을 조제하였다.
(8) 시판되고 있는 알로에 아보레센스 (aloe arborescens) 의 잎 5 장에서 투명형상의 엽육 (leaf mesophyll) 부분을 회수하여 동결건조하였다. 이 알로에 엽육 동결건조물 0.481 g 을 100 ㎖ 의 증류수에 현탁하였다. 이 현탁액을 1 시간동안 60℃ 에서 보온한 후, 여과하였다. 여과액에 2.5 배량의 에탄올을 첨가하여 -20℃ 에서 냉각한 후, 저온에서 원심분리하여 침전을 얻었다. 이 침전을 증류수에 용해하고 동결건조하여 파우더 형상의 알로에 엽육 유래 황산화 다당을 함유하는 획분을 조제하였다.
한편, 상기 방법으로 투명형상의 엽육부분을 회수한 나머지인 녹색의 잎표면 부분을 분쇄 후, 동결건조하였다. 그 동결건조물 3.43 g 을 100 ㎖ 의 클로로포름에 현탁하고 여과하여 불용획분을 회수하는 조작을 3 회 반복하였다. 그 후, 100 ㎖ 의 에탄올에 현탁하고 여과하여 불용획분을 회수하는 조작을 3 회 반복하였다. 이 조작으로 얻은 불용획분으로부터 에탄올을 완전히 제거하여 100 ㎖ 의 증류수에 현탁하였다. 이 현탁액을 1 시간동안 60℃ 에서 보온한 후, 여과하였다. 여과액에 2.5 배량의 에탄올을 첨가하여 -20℃ 에서 냉각한 후, 저온에서 원심분리하여 침전을 얻었다. 이 침전을 증류수에 용해하고 동결건조하여파우더 알로에 잎표면물 유래 황산화 다당을 함유하는 획분을 조제하였다.
참고예 14
(1) D-(+)-글루코오스 200 mg (1.1 mmol) 을 피리딘 10 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 피리딘 술퍼트리옥시드 복합체 (Pyr·SO3: 토쿄카세이) 1.05 g (6.6 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하였다. 반응액을 물로 희석하고, 포화 수산화바륨 수용액으로 pH 를 중성부근으로 조정한 후 감압건조하였다. 얻어진 농축물에 다시 물을 첨가하여 다시 감압건조하였다. 이 조작을 한번 더 반복하였다. 얻어진 농축물에 소량의 물을 첨가하여 원심으로 황산바륨의 침전을 제거하고, 얻어진 상청을 양이온교환칼럼 [앰버라이트 IRA-120 (Na+) (오르가노)] 에 이용하였다. 그 결과 얻어진 칼럼 통과 획분을 감압농축하여 황산화 D-(+)-글루코오스 나트륨염 700 mg 를 조제하였다.
(2) D-(+)-갈락토오스 240 mg (1.3 mmol) 을 피리딘 10 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO31.05 g (6.6 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 D-(+)-갈락토오스 나트륨염 406 mg 를 조제하였다.
(3) D-(+)-만노오스 200 mg (1.3 mmol) 을 피리딘 10 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO31.05 g (6.6 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 D-(+)-만노오스 나트륨염 700 mg 를 조제하였다.
(4) 말토오스 205 mg (0.57 mmol) 을 피리딘 10 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO3816 mg (5.2 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 말토오스 나트륨염 520 mg 을 조제하였다.
(5) 말토트리오스 200 mg (0.4 mmol) 을 피리딘 10 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO3700 mg (4.4 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 말토트리오스 나트륨염 420 mg 을 조제하였다.
(6) 트레할로오스 250 mg (0.73 mmol) 을 피리딘 10 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO31.1 g (7 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 트레할로오스 나트륨염 750 mg 을 조제하였다.
(7) 락토오스 222 mg (0.62 mmol) 을 피리딘 10 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO3785 mg (4.9 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 락토오스 나트륨염 476 mg 을 조제하였다.
(8) 수크로오스 220 mg (0.62 mmol) 을 피리딘 10 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO3785 mg (4.9 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 수크로오스 나트륨염 481 mg 을 조제하였다.
(9) 락툴로오스 370 mg (1.08 mmol) 을 피리딘 10 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO31.38 g (8.8 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 락툴로오스 나트륨염 1 g 을 조제하였다.
(10) 멜리비오스 379 mg (0.9 mmol) 을 피리딘 10 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO31.43 mg (9.0 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 멜리비오스 나트륨염 950 mg 을 조제하였다.
(11) D-(+)-자일로오스 150 mg (1.0 mmol) 을 피리딘 10 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO3770 mg (4.8 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 D-(+)-자일로오스 나트륨염 350 mg 을 조제하였다.
(12) 2-데옥시-글루코오스 200 mg (1.2 mmol) 을 피리딘 10 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO3920 mg (5.8 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 2-데옥시-글루코오스 나트륨염 500 mg 을 조제하였다.
(13) D-글루시톨 150 mg (0.83 mmol) 을 피리딘 10 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO3955 mg (6 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 D-글루시톨 나트륨염 570 mg 을 조제하였다.
(14) 셀로비오스 147 mg (0.43 mmol) 을 디메틸술폭시드 5 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO3657 mg (4.13 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 셀로비오스 나트륨염 230 mg 을 얻었다.
(15) 이소말토오스 62 mg (0.18 mmol) 을 피리딜 5 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO3275 mg (1.73 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 이소말토오스 나트륨염 162 mg 을 얻었다.
(16) 투라노오스 293 mg (0.86 mmol) 을 피리딜 5 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO31310 mg (8.22 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 투라노오스 나트륨염 835 mg 을 얻었다.
(17) 팔라티노오스 315 mg (0.875 mmol) 을 피리딜 5 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO31.34 mg (8.4 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 팔라티노오스 나트륨염845 mg 을 얻었다.
(18) α-D-탈로오스 56 mg (0.31 mmol) 을 피리딜 5 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO3300 mg (1.9 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 수분, 60℃ 에서 1 시간 교반하여, 이하 참고예 14-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 D-탈로오스 나트륨염 150 mg 을 얻었다.
(19) α-시클로덱스트린 7 g 의 완전 아세틸화체를 무수아세트산과 황산의 혼합액 (49:1) 에 의해 처리함으로써 말토헥사오스의 완전 아세틸화체를 얻어, 이것을 메탄올 중, 나트륨메톡시드 (NaOMe) 로 탈아세틸화함으로써 말토헥사오스 1.5 g 을 얻었다. 말토헥사오스 79 mg (0.83 mmol), 피페리딘황산 1.33 g 을 디메틸술폭시드 (DMSO) 5 ㎖ 에 용해하여 80℃ 에서 2 시간 교반하였다. 반응액을 냉각 후, 분자량 1000 컷트의 투석막으로 2 일간 투석하였다. 얻어진 투석내액을 양이온교환칼럼 [앰버라이트 IRA-120 (Na+) (오르가노)] 에 이용하였다. 그 결과 얻어진 칼럼 통과 획분을 감압농축하여 황산화 말토헥사오스 나트륨염 167 mg 을 조제하였다.
(20) β-시클로덱스트린 2.2 g 의 완전 아세틸화체를 무수아세트산과 황산의 혼합액 (49:1) 에 의해 처리함으로써 말토헵타오스의 완전 아세틸화체를 얻어 이것을 메탄올 중, NaOMe 로 탈아세틸화함으로써 말토헵타오스 0.5 g 을 얻었다. 말토헵타오스 20 mg (0.83 mmol), 피페리딘황산 325 mg 을 DMSO 5 ㎖ 에 용해하여 80℃ 에서 2 시간 교반한 후, 이하 참고예 14-(19) 와 동일한 조작으로 황산화 말토헵타오스 나트륨염 45.6 mg 을 조제하였다.
(21) 말토헥사오스의 완전 아세틸화체를 디클로로메탄 중, 트리클로로아세트니트릴, 탄산칼륨 존재하에서 교반함으로써, 아세틸화 말토헥사오스의 이미데이트체를 얻었다. 아세틸화 말토헥사오스의 이미데이트체와 도데칸올을 디클로로메탄 중, 트리플루오로메탄술폰산트리메틸시릴을 촉매로 하여 반응하고, 얻어진 반응물을 탈아세틸화함으로써 도데실-말토헥사오스를 얻었다. 도데실-말토헥사오스 370 mg (0.32 mmol) 을 DMSO 10 ㎖ 에 용해하여 80℃ 에서 2 시간 교반한 후, 이하 참고예 14-(19) 와 동일한 조작으로 황산화 도데실-말토헥사오스 나트륨염 700 mg 을 조제하였다.
(22) 스타치 276 mg 을 DMSO 10 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO32.76 g 을 첨가한 후, 80℃ 에서 2 시간 교반하였다. 반응액을 냉각 후, 아세톤을 첨가하여 생긴 불용획분을 메탄올로 수회에 걸쳐 세정한 후, 물로 희석하여 양이온교환칼럼 [앰버라이트 IRA-120 (Na+) (오르가노)] 에 이용하였다. 그 결과 얻어진 칼럼 통과 획분을 감압농축하여 황산화 전분 나트륨염 350 mg 을 조제하였다.
(23) 카드란 111 mg 을 DMSO 5 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO31.11 g 을 첨가한 후, 80℃ 에서 2 시간 교반하였다. 반응액을 냉각후 아세톤을 첨가하여, 생성된 불용획분을 물로 희석하고, 포화 중탄산나트륨수로 pH 중성부근으로 중화한 후, 분자량 1000 컷트의 투석막으로 1 일간 투석하였다. 얻어진 투석내액을 양이온 교환컬럼 [앰버라이트 IRA-120 (Na+) (오르가노)] 에 제공한 후, 감압건조고체화함으로써 황산화 카드란 나트륨염 180 mg 을 조제하였다.
(24) 팩틴 267 mg 을 DMSO 5 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 Pyr·SO32.67 g 을 첨가한 후, 80℃ 에서 2 시간 교반하였다. 반응액을 냉각후, 참고예 14-(23) 과 동일한 조작으로, 황산화 팩틴 나트륨염 384 mg 을 조제하였다.
실시예 1
(1) 1×105cells/㎖ 가 되도록 10 % 소태아 혈청을 포함한 DME 배지에 현탁한 MRC-5 세포 (CCL171 : 다이닛폰세야쿠샤 제조, code. 02-021) 500 ㎕ 를 48 웰의 세포배양 플레이트에 넣고, 37℃, 5 % CO2존재하에서 24 시간 배양후에 1 % 소태아 혈청을 포함한 DME 배지로 교환하였다. 그 후, 시료로서 참고예 1-(1) 에 기재된 가고메 다시마 유래 푸코이단을 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, 다시 24 시간 배양한 후 배지를 회수하여, Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF) ELISA Kit (후나코시샤 제조, Code. RS-0641-00) 를 이용하여, 배지중의 HGF 의 양을 측정하였다.
대조군으로서 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 대조군의 HGF 양은 7.2 ng/㎖ 이며, 이 값을 100 % 로한 각 시료첨가군의 HGF 생산량을 표 1 에 나타낸다. 또한 실험은 모두 2 번 연속으로 실시하여, 그 평균값을 채용하였다.
가고메 다시마 유래 푸코이단(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
0 100
1 214
10 339
100 339
가고메 다시마 유래 푸코이단 첨가군은 증류수 첨가 대조군보다, 유의하게 HGF 의 생산량이 증가하였다. 또한, 헤파린 또는 저분자화 헤파린을 첨가한 경우에 비하여 현저히 HGF 의 생산량이 증가함으로써, 가고메 다시마 유래 푸코이단은 지금까지 HGF 의 생산유도가 확인되어 있는 헤파린 또는 평균분자량 약 5000 의 저분자화 헤파린보다 높은 HGF 생산을 촉진하는 활성을 갖는 것으로 나타났다.
(2) 실시예 1-(1) 과 동일한 조건으로, 참고예 1-(2) 에 기재된 방법으로 조제한 Ⅰ 획분, Ⅱ 획분, Ⅲ 획분, 참고예 2 에 기재된 방법으로 조제한 7-12SFd-F, 참고예 4 에 기재된 방법으로 조제한 6-2S, 참고예 6 에 기재된 방법으로 조제한 미역 자주 유래 푸코이단, 및 참고예 7 에 기재된 방법으로 조제한 모자반 유래 푸코이단 각각의 HGF 생산 유도작용을 측정하였다. 그 결과를 표 2 ~ 4 에 나타낸다.
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
Ⅰ 획분 1 167
100 234
Ⅱ 획분 1 208
100 359
Ⅲ 획분 1 146
100 291
(대조군의 HGF 생산량은 8.3 ng/㎖ 였다)
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
모자반 유래 푸코이단 1 148
10 246
100 335
미역 자주 유래 푸코이단 1 179
10 250
100 291
7-12SFd-F 1 149
10 276
100 339
(대조군의 HGF 생산량은 8.6 ng/㎖ 였다)
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
6-2S 10 112
100 246
(대조군의 HGF 생산량은 9.9 ng/㎖ 였다)
가고메 다시마 유래 푸코이단의 분획물, 즉 U-푸코이단, F-푸코이단, 모자반 유래 푸코이단, 미역 자주 유래 푸코이단, F-푸코이단 유래 7-12SFd-F, U-푸코이단 유래 6-2S 에서 각각 강한 HGF 생산 유도작용이 인정되었다. 또한 참고예 1-(1) 에 기재된 다시마 유래 푸코이단, 레소니아 니그레센스 유래 푸코이단, 참고예 7 에 기재된 아스코필럼 노도섬 유래 푸코이단, 참고예 8 에 기재된 산분해물, 및 A ~ F 획분도 각각 강한 HGF 생산 유도작용이 인정되었다.
(3)-① 참고예 1-(1) 에 기재된 방법으로 조제한 가고메 다시마 유래 푸코이단의 2 % 용액을 시트르산 또는 황산으로 pH 3 으로 조제하고, 각각을 100℃ 로 가열하여, 30 분 후, 1 시간 후, 2 시간 후, 4 시간 후에 각각의 가수분해액을 조제하고, 그 HGF 생산 유도작용을 실시에 1-(1) 과 동일한 조건으로 측정하였다.또한, 시료는 산분해액의 10 배 희석액을 이용하였다.
시료 가열시간 HGF 의 생산량(%)
미분해액 448
황산분해액 30 분간 364
1 시간 385
2 시간 368
4 시간 345
미분해액 480
시트르산 분해액 30 분간 402
1 시간 429
2 시간 397
4 시간 341
(대조군의 HGF 생산량은 8.6 ng/㎖ 였다)
(3)-② 실시예 1-(3)-① 에서 조제한 가고메 다시마 유래 푸코이단의 시트르산 존재하에서의 4 시간 가열처리물을 젤여과에 의하여 분획하였다.
즉, 토요펄 HW40C 1.5 리터를 충진한 칼럼을 물로 평형화하고, 이 칼럼에 가고메 다시마 유래 푸코이단의 가열처리물 10 ㎖ 을 적용하여, 그 후 유속 1 ㎖/분에서 물로 용출하였다. 최초의 680 ㎖ 는 그대로 용출하고, 그 후 14 ㎖ 씩 분획하여 가열처리물의 젤여과 분획물을 얻었다.
이 분획물을 TLC (용매, 아세트산부틸 : 아세트산 : 물 = 3 : 4 : 3, 검출제 오시오놀 황산) 로 분석하고, 점의 패턴에 의하여, 분획 12 ~ 13, 16 ~ 17, 26 ~ 40 등의 젤여과 분획으로 모아 동결건조하였다. 얻어진 각 획분의 동결건조물을 100 mg/㎖ 가 되도록 물에 재용해하여, 그 HGF 생산 유도작용을 실시예 1-(1) 과 동일한 조건으로 측정하였다.
그 결과, 분획 12 ~ 13 및 분획 16 ~ 17 의 각각의 분획물에 HGF 생산유도활성이 인정되었다.
분획 12 ~ 13 의 분획물은 구조결정을 실시하고, 그 분석값은 국제공개 제 97/26896 호 팜플렛에 기재된 하기 화학식 Ⅷ 로 표시되는 화합물의 분석값과 일치하여, 글루쿠론산과 만노오스의 중합체에 HGF 생산유도 활성이 인정되었다.
(4) 시판되고 있는 덱스트란 황산나트륨 (시그마사 제조) 용액을 조제하고, 그 HGF 생산 유도작용을 실시예 1-(1) 에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 표 6 에 나타내는 바와 같이, 덱스트란 황산나트륨은 HGF 생산 유도작용을 나타내었다.
덱스트란 황산나트륨(평균분자량) 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
1 만 1 588
10 655
100 787
8 천 1 395
10 573
100 695
5 천 1 398
10 421
100 565
(대조군의 HGF 생산량은 6.7 ng/㎖ 였다)
(5) 시판되고 있는 λ-카라게난 (나카라이테스크샤 제조) 의 용액을 조제하여, 그 HGF 생산 유도작용을 실시예 1-(1) 의 방법에 따라 측정하였다. 표 7 에 나타내는 바와 같이, λ-카라게난은 HGF 생산 유도작용을 나타내었다.
λ-카라게난(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
1 152
10 140
(대조군의 HGF 생산량은 13.4 ng/㎖ 였다)
(6)-① 시판되고 있는 알긴산 (와코준야쿠샤 제조 : 팽윤성) 용액을 조제하여, 그 HGF 생산 유도작용을 실시예 1-(1) 의 방법에 따라 측정하였다. 표 8 에 나타내는 바와 같이 알긴산은 HGH 생산 유도작용을 나타내었다.
알긴산(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
1 125
10 154
100 327
(대조군의 HGF 량은 7.3 ng/㎖ 였다)
(6)-② 마찬가지로, 알긴산 (팽윤성, 와코준야쿠샤 제조 : 시료 ①), 알긴산 (비팽윤성, 와코준야쿠샤 제조 : 시료 ②), 알긴산 (100 ~ 150 cp, 와코준야쿠샤 제조 : 시료 ③), 알긴산 (300 ~ 400 cp, 와코준야쿠샤 제조 : 시료 ④), 알긴산 (500 ~ 600 cp, 와코준야쿠샤 제조 : 시료 ⑤) 의 HGF 생산유도 활성을 검토하였다. 표 9 에 나타낸 바와 같이, 시료 ① 에서 ⑤ 는 모두 HGF 의 생산을 유도하였다. 이상으로부터, 산성 다당인 알긴산에도 HGF 생산유도 활성이 있음이 명백해졌다.
농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량 (%)
시료 ① 시료 ② 시료 ③ 시료 ④ 시료 ⑤
10 154 138 115 127 104
100 327 158 184 152 187
(시료 ①, ② 의 대조군의 HGF 생산량은 7.3 ng/㎖, 시료 ③, ④, ⑤ 의 대조군의 HGF 생산량은 6.7 ng/㎖ 였다)
(6)-③ 마찬가지로, 팩틴산 (나카라이테스크샤 제조) 의 HGF 생산유도 활성을 검토하였다. 표 10 에 나타낸 바와 같이, 팩틴산은 HGF 의 생산을 유도하였다.
이상으로부터, 산성 다당인 팩틴산에도 HGF 생산유도 활성이 있음이 명백해졌다.
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
팩틴산 1 145
10 218
100 684
(대조군의 HGF 생산량은 5.91 ng/㎖ 였다)
(7) 연어 정자 DNA (가부시키가이샤 니치로샤 제조) 의 HGF 생산유도 활성을 검토하였다. DNA 는 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 표 11 에 나타낸 바와 같이, 연어 정자 DNA 는 HGF 생산유도 활성을 나타내었다.
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
연어 정자 DNA 1 110
10 182
100 285
(대조군의 HGF 생산량은 9.9 ng/㎖ 였다)
(8) 참고예 9, 11 에서 조제한 큰실말 유래 푸코이단, 해삼 유래 푸코이단의 용액을 조제하고, 그 HGF 생산 유도작용을 실시예 1-(1) 의 방법에 따라 측정하였다. 표 12 에 나타내는 바와 같이 각 푸코이단은 HGF 생산 유도작용을 나타내었다.
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
해삼 유래 푸코이단 1 282
10 356
100 495
큰실말 유래 푸코이단 1 218
10 279
100 307
(대조군의 HGF 량은 7.77 ng/㎖ 였다)
(9) 참고예 10 에서 조제한 우뭇가사리 유래 황산화다당 (시료 ①), 강리(江籬) 유래 황산화다당 (시료 ②), 헤테로크라디아 유래 황산화다당 (시료 ③) 의 용액을 조제하여, 실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로 HGF 생산유도 활성을 검토하였다. 시료 ①, ③ 은 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 가 되도록, 시료 ② 는 최종농도가 10, 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 표 13 에 나타낸 바와 같이, 시료 ① 에서 ③ 은 모두 HGF 의 생산을 유도하였다.
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
시료 ① 1 100
10 177
100 169
시료 ② 10 117
100 198
시료 ③ 1 116
10 207
100 228
(대조군의 HGF 생산량은 7.3 ng/㎖ 였다)
(10) 실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로, 참고예 10-(3) 에서 조제한 레소니아 유래 푸코이단 (시료 ①), DEAE33 획분 (시료 ②), DEAE37 획분 (시료 ③), DEAE40 획분 (시료 ④) 의 HGF 생산유도 활성을 검토하였다. 각각의 시료는 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 표 14 에 나타낸 바와 같이, 시료 ① 에서 시료 ④ 는 모두 HGF 의 생산을 유도하였다.
농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량 (%)
시료 ① 시료 ② 시료 ③ 시료 ④
1 138 105 235 121
10 167 221 253 254
100 331 265 261 295
(대조군의 HGF 생산량은 11.5 ng/㎖ 였다)
(11) 실시예 1-(1) 과 동일한 조건으로 참고예 3-(2) 에 기재된 황산화 푸코갈락탄, 참고예 12 에 기재된 아가로펙틴, 콘드로이틴 황산 B (세카가쿠고교샤 제조), 콘드로이틴 황산 D (세카가쿠고교샤 제조) 의 HGF 생산유도 활성을 검토하였다. 각각의 시료는 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다.표 15 ~ 17 에 나타낸 바와 같이, 황산화 푸코갈락탄, 아가로펙틴, 콘드로이틴 황산은 HGF 의 생산을 유도하였다.
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
황산화 푸코갈락탄 1 194
10 355
100 429
(대조군의 HGF 생산량은 4.3 ng/㎖ 였다)
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
아가로펙틴 1 117
10 121
100 256
(대조군의 HGF 생산량은 6.7 ng/㎖ 였다)
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
콘드로이틴 황산 B 1 117
10 121
100 256
콘드로이틴 황산 D 10 119
100 144
(대조군의 HGF 생산량은 11.9 ng/㎖ 였다)
(12) 실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로 참고예 13-(1), 13-(3), 13-(5), 13-(7), 13-(8) 에서 각각 조제한 스피룰리나 유래 황산화다당, 클로렐라 유래 황산화다당, 쑥 유래 황산화다당, 덩굴여지 유래 황산화다당, 알로에 엽육 유래 황산화다당 및 알로에 잎표면물 유래 황산화다당의 HGF 생산유도 활성을 검토하였다.스피룰리나 유래 황산화다당, 쑥 유래 황산화다당은 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 클로렐라 유래 황산화다당, 덩굴여지 유래 황산화다당, 알로에 엽육 유래 황산화다당, 알로에 잎표면물 유래 황산화다당은 각각 최종농도가 1, 10, 100, 1000 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 표 18 ~ 20 에 나타낸 바와 같이, 스피룰리나 유래 황산화다당, 클로렐라 유래 황산화다당, 쑥 유래 황산화다당, 덩굴여지 유래 황산화다당, 알로에 엽육 유래 황산화다당, 알로에 잎표면물 유래 황산화다당은 HGF 의 생산을 유도하였다.
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
스피룰리나 유래 황산화다당 1 149
10 293
100 398
클로렐라 유래 황산화다당 1 108
10 149
100 175
1000 396
(대조군의 HGF 생산량은 7.9 ng/㎖ 였다)
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
쑥 유래 황산화다당 1 137
10 284
100 265
(대조군의 HGF 생산량은 12.7 ng/㎖ 였다)
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
덩굴여지 유래 황산화다당 1 111
10 104
100 133
1000 190
알로에 엽육 유래황산화다당 1 111
10 125
100 150
1000 401
알로에 잎표면물 유래황산화다당 1 106
10 125
100 120
1000 328
(대조군의 HGF 생산량은 8.7 ng/㎖ 였다)
(13) 실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로, 참고예 13-(2) 에서 조제한 스피룰리나 분획물 SSP-Ⅰ (시료 ①), SSP-Ⅱ (시료 ②), SSP-Ⅲ (시료 ③), SSP-Ⅳ (시료 ④) 의 HGF 생산유도 활성을 검토하였다. 각각의 시료는 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 표 21 에 나타낸 바와 같이, 시료 ① 에서 ④ 는 모두 HGF 의 생산을 유도하였다.
농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량 (%)
시료 ① 시료 ② 시료 ③ 시료 ④
1 240 165 141 218
10 243 152 270 282
100 302 212 280 351
(대조군의 HGF 의 생산량은 7.3 ng/㎖ 였다)
(14) 실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로, 참고예 13-(4) 에서 조제한 클로렐라 추출물의 CSP-Ⅰ 획분 (시료 ①), CSP-Ⅱ 획분 (시료 ②) 의 HGF 생산유도 활성을 검토하였다. 시료 ① 은 최종농도가 10, 100 ㎍/㎖, 시료 ② 는 최종농도가 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 표 22 에 나타낸 바와 같이, 시료 ①, ② 는 HGF 의 생산을 유도하였다.
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
시료 ① 10 111
100 173
시료 ② 100 175
(대조군의 HGF 생산량은 11.4 ng/㎖ 였다)
(15) 실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로, 참고예 13-(6) 에서 조제한 쑥 추출물의 YAP 획분 (시료 ①), YSP-Ⅰ 획분 (시료 ②), YSP-Ⅱ 획분 (시료 ③), YSP-Ⅱ-2 획분 (시료 ④), YSP-Ⅱ-3 획분 (시료 ⑤), YSP-Ⅱ-4 획분 (시료 ⑥) 의 HGF 생산유도 활성을 검토하였다. 각각의 시료는 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 표 23, 표 24 에 나타낸 바와 같이, 시료 ① 에서 시료 ⑥ 은 모두 HGF 의 생산을 유도하였다. 특히, YSP-Ⅱ 획분 (시료 ③), YSP-Ⅱ-3 획분 (시료 ④), YSP-Ⅱ-4 획분 (시료 ⑤) 에서 강한 HGF 생산유도 활성이 확인되었다.
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
시료 ① 10 121
100 266
시료 ② 1 104
10 148
100 381
시료 ③ 1 328
10 386
100 390
(대조군의 HGF 생산량은 11.5 ng/㎖ 였다)
농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량 (%)
시료 ④ 시료 ⑤ 시료 ⑥
1 152 290 226
10 462 383 322
100 475 321 314
(대조군의 HGF 생산량은 7.7 ng/㎖ 였다)
(16) 실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로 참고예 14 에서 조제한 황산화 말토오스 나트륨염, 황산화 말토트리오스 나트륨염, 황산화 락토오스 나트륨염, 황산화 수크로오스 나트륨염, 황산화 트레할로오스 나트륨염, 황산화 글루코오스 나트륨염, 황산화 락트로스 나트륨염, 황산화 멜리비오스 나트륨염, 황산화 갈락토오스 나트륨염, 황산화 만노오스 나트륨염, 황산화 자일로오스 나트륨염, 황산화 2-디옥시-글루코오스 나트륨염, 황산화 글루시톨 나트륨염, 황산화 셀로비오스 나트륨염, 황산화 이소말토오스 나트륨염, 황산화 투라노오스 나트륨염, 황산화 팔리티노오스 나트륨염, 황산화 탈로오스나트륨염, 황산화 말토헥사오스 나트륨염, 황산화 말토헵타오스 나트륨염, 황산화 도데실-말토헥사오스 나트륨염, 황산화 전분 나트륨염, 황산화 카드란 나트륨염, 황산화 팩틴 나트륨염의 HGF 생산유도 활성을 검토하였다. 각각의 시료는 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖, 또는 10, 100, 1000 ㎍/㎖, 또는 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 대조군으로서 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 또한 황산화되어 있지 않은 각각의 당도 각각의 황산화당과 동일 농도로 HGF 생산유도 활성을 측정하였다.
표 25 ~ 34 에 나타낸 바와 같이, 황산화 올리고당, 황산화 단당은 HGF 의 생산을 유도하였다. 또한 황산화되어 있지 않은 각각의 당은 HGF 를 유도하지 않았다.
또한 황산화 도데실-말토헥사오스 나트륨염의 결과로부터, 당이 지질에 의하여 수식을 받고 있어도 HGF 생산유도 활성은 유지됨이 명백해졌다.
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
황산화 말토오스 나트륨염 1 142
10 273
100 439
황산화 말토트리오스 나트륨염 1 151
10 286
100 387
(대조군의 HGF 생산량은 8.7 ng/㎖ 였다)
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
황산화 락토오스 나트륨염 1 118
10 185
100 410
황산화 수크로오스 나트륨염 1 173
10 355
100 501
황산화 글루코오스 나트륨염 1 178
10 377
100 864
(대조군의 HGF 생산량은 5.5 ng/㎖ 였다)
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
황산화 트레할로오스 나트륨염 1 277
10 447
100 421
(대조군의 HGF 의 생산량은 4.3 ng/㎖ 였다)
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
황산화 갈락토오스 나트륨염 100 166
(대조군의 HGF 생산량은 12.7 ng/㎖ 였다)
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
황산화 만노오스 나트륨염 1 112
10 175
100 456
(대조군의 HGF 생산량은 6.2 ng/㎖ 였다)
시료 농도(㎍/㎖) HGF 생산량(%)
황산화 락트로스 나트륨염 10 139
100 376
1000 583
황산화 멜리비오스 나트륨염 10 240
100 403
1000 667
황산화 자일로오스 나트륨염 10 110
100 112
1000 284
황산화 2-디옥시글루코오스 나르륨염 10 127
100 102
1000 239
황산화 글루시톨 나트륨염 10 112
100 203
1000 335
(대조군의 HGF 생산량은 5.9 ng/㎖ 였다)
시료 농도(㎍/㎖) HGF 생산량(%)
황산화 셀로비오스 나트륨염 10 100
100 143
1000 546
황산화 이소말토오스 나트륨염 10 134
100 301
1000 477
황산화 투라노오스 나트륨염 10 127
100 203
1000 379
황산화 팔라티노오스 나르륨염 10 132
100 278
1000 519
(대조군의 HGF 생산량은 황산화 셀로비오스 나트륨염이 11.1 ng/㎖, 황산화 이소말토오스 나트륨염이 11.3 ng/㎖, 황산화 투라노오스 나트륨과 황산화 팔라티노오스 나트륨염이 8.6 ng/㎖ 였다)
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
황산화 탈로오스 나트륨염 10 112
100 263
1000 494
(대조군의 HGF 생산량은 9.5 ng/㎖ 였다)
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
황산화 말토헥사오스 나트륨염 10 407
100 571
1000 761
황산화 말토헵타오스 나트륨염 10 341
100 486
1000 706
황산화 도데실-말토헥사오스 나트륨염 10 289
100 371
1000 359
(대조군의 HGF 생산량은 8.15 ng/㎖ 였다)
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
황산화 전분 나트륨염 10 781
100 864
1000 804
황산화 가드란 나트륨염 10 359
100 503
1000 617
황산화 팩틴 나트륨염 10 721
100 780
1000 648
(대조군의 HGF 생산량은 8.15 ng/㎖ 였다)
실시예 2
(1) 실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로 참고예 1-(1) 에 기재된 가고메 다시마 유래 푸코이단과 프로스타글란딘, IL-1 과의 HGF 생산 유도작용에 대한 상승효과에 관하여 검토하였다.
즉, 해당 푸코이단과 PGE1(와코준야쿠샤 제조), IL-1α (젠자임사 제조) 를 동시에 첨가하여, HGF 생산유도 활성의 상승효과를 검토하였다.
푸코이단 시료는 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. PGE1은 0.1, 1, μM, IL-1α 는 1 ng/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 대조군으로서시료와 동량의 증류수를 첨가하였다.
각각, 푸코이단 시료 또는 PGE1, IL-1α의 단독첨가시의 생산량과 비교하여, 그 상승효과에 대하여 검토하였다.
그 결과를 표 35, 36 에 나타낸다. 표 35, 36 에 있어서, 대조군의 HGF 생산량을 100 % 로 하여 나타내었다. 실험은 모두 2 번 연속으로 실시하여 그 평균값을 채용하였다. 표 35, 36 에 나타내는 바와 같이, 푸코이단과 PGE1, 또는 IL-1α의 동시첨가에 의하여 HGF 의 생산유도에 대한 상승효과가 인정되었다.
푸코이단 첨가량(㎍/㎖) PGE1첨가량 (μM)
0 0.1 1
HGF 의 생산량 (%)
0 100 119 157
1 195 334 415
10 331 517 561
100 382 731 682
푸코이단 첨가량(㎍/㎖) IL-1α첨가량 (ng/㎖)
0 1
HGF 의 생산량 (%)
0 100 163
1 206 421
10 350 672
100 403 780
(대조군의 HGF 생산량은 9.1 ng/㎖ 였다)
(2) 실시예 2-(1) 과 동일한 방법으로 참고예 2 의 7-12SFd-F 와 프로스타글란딘, IL-1 과의 HGF 생산 유도작용에 대한 상승효과에 대하여 검토하였다. 7-12SFd-F 와 PGE1, IL-1α를 동시에 첨가하여, HGF 생산유도 활성의 상승효과를 검토하였다. 각각의 7-12SFd-F 는 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 각각의 7-12SFd-F 첨가세포에 동시에 PGE1, IL-1α를 추가로 첨가하였다. PGE1은 0.1, 1 μM, IL-1α는 0.1, 1 ng/㎖ 이 되도록 첨가하였다. 네거티브 대조군으로서, 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 각각, 7-12SFd-F 또는 PGE1, IL-1α의 단독첨가의 생산량과 비교하여 상승효과에 관하여 검토하였다. HGF 의 생산량은 증류수만을 첨가한 네거티브 대조군을 100 % 로 하여 나타내었다. 그 결과를 표 37, 38 에 나타내었다. 실험은 모두 3 번 연속으로 실시하여 그 평균값을 채용하였다.
7-12SFd-F 첨가량(㎍/㎖) PGE1첨가량 (μM)
0 0.1 1
HGF 의 생산량 (%)
0 100 123 170
1 120 158 216
10 218 309 317
100 219 365 382
(대조군의 HGF 생산량은 5.1 ng/㎖ 였다)
7-12SFd-F 첨가량(㎍/㎖) IL-1α첨가량 (ng/㎖)
0 0.1 1
HGF 의 생산량 (%)
0 100 130 151
1 140 168 159
10 191 154 208
100 203 255 222
(대조군의 HGF 생산량은 5.1 ng/㎖ 였다)
실시예 3
(1) 1×105cells/㎖ 가 되도록 10 % 소태아 혈청을 포함한 DMEM 배지에 현탁한 KG-1-C 세포 (글리오머 : 휴먼사이언스 신코자이단 판매) 를 500 ㎕ 씩 48 웰의 세포배양 플레이트에 넣고, 37℃, 5 % CO2존재하에서 하룻밤 배양후에 1 % 소태아 혈청을 포함한 DMEM 배지로 교환하였다. 그 후, 피검시료를 첨가하고 다시 20 시간 배양한 후, 배지를 회수하고 실시예 1 에 기재된 HGF ELISA 키트를 이용하여 배지중의 HGF 의 양을 측정하였다.
피검시료는 각각 최종농도가 참고예 1-(1) 에 기재된 가고메 다시마 유래 푸코이단은 1, 10, 100 ㎍/㎖ 이 되도록, 헤파린 (와코준야쿠샤 제조) 은 1, 10 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 또한 대조군으로서 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 실험은 모두 3 번 연속으로 실시하여 그 평균값을 채용하였다. 결과는 표 39 에 나타낸다. 표 39 에 있어서, 대조군의 HGF 생산량을 100 % 로 하여 나타내었다.
푸코이단 시료를 첨가한 세포군은 모두 증류수 첨가의 대조군보다 유의하게 HGF 의 생산량이 증가하였다. 또한 헤파린 첨가보다 현저히 HGF 의 생산량이 증가하였다. 이로써, 해당 푸코이단에는 지금까지 HGF 의 유도가 확인되어 있는 헤파린보다 높은 HGF 의 생산을 촉진하는 활성이 있는 것으로 나타났다.
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
가고메 다시마 유래 푸코이단 1 194
10 285
100 351
헤파린 나트륨염 1 176
10 215
(대조군의 HGF 생산량은 4.4 ng/㎖ 였다)
(2) 10 % 소태아 혈청을 포함한 RPMI1640 배지에서 배양한 HL-60 세포 (전골수성 백혈병 세포 : ATCC CCL-240) 를 1 ×105cells/㎖ 가 되도록 1 % 소태아 혈청을 포함한 RPMI1640 배지에 현탁하고, 500 ㎕ 씩 48 웰의 세포배양 플레이트에 넣었다. 그 후, 10 nM 의 12-O 테트라데카노일포르볼 13-아세테이트 (TPA : GIBCO BRL 사 제조) 를 첨가하고, 추가로 피검시료를 동시에 첨가하였다. 첨가후 20 시간 배양한 후 배지를 회수하고, HGF ELISA 키트를 이용하여 배지중의 HGF 의 양을 측정하였다.
피검시료는 각각 최종농도가 참고예 1-(1) 에 기재된 가고메 다시마 유래 푸코이단은 1, 10, 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 헤파린은 1, 10 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 대조군으로서 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 실험은 모두 3 번 연속으로 실시하여 그 평균값을 채용하였다. 결과는 표 40 에 나타낸다. 표 40 에 있어서 대조군의 HGF 의 생산량을 100 % 로 하여 나타내었다. 푸코이단 시료를 첨가한 세포군은 모두 증류수 첨가의 대조군보다 유의하게 HGF 의 생산량이 증가하였다. 또한 헤파린 첨가보다 현저히 HGF 의 생산량이 증가하였다. 이로써, 해당 푸코이단에는 지금까지 HGF 의 유도가 확인되어 있는 헤파린보다 높은 HGF 의 생산을 촉진하는 활성이 있는 것으로 나타났다.
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
가고메 다시마 유래 푸코이단 1 191
10 342
100 490
헤파린 나트륨염 1 140
10 189
(대조군의 HGF 의 생산량은 0.4 ng/㎖ 였다).
실시예 4
1 ×105cells/㎖ 가 되도록 10 % 소태아 혈청을 포함한 DME 배지에 현탁한 MRC-5 세포액 500 ㎕ 를 48 웰의 세포배양 플레이트에 넣고, 37℃, 5 % CO2존재하에서 24 시간 배양후에 1 % 소태아 혈청을 포함한 DME 배지로 교환하였다. 그 후, 시료를 첨가하고 다시 24 시간 배양하였다. 이 배지를 회수하고, HGF ELISA 키트를 이용하여 배지중의 HGF 의 양을 측정하였다. 또한, 세포를 PBS 로 세척후, 500 ㎕ 의 세포용해 완충액 (50 mM HEPES pH 7.4, 10 mM EDTA, 0.1 % Triton ×100, 1 mM PMSF, 1 ㎍/㎖ 펩스타틴 A, 1 ㎍/㎖ 류펩틴) 에 용해하였다. 더 완전히 용해시키기 위하여 초음파처리하고 나서, 원심분리하여 상청 (세포추출액) 을 조제하여, 세포내의 HGF 양을 배지중의 HGF 농도와 동일하게 측정하였다.
피검시료인 참고예 1-(1) 에 기재된 가고메 다시마 유래 푸코이단은 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 대조군으로서 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 실험은 모두 2 번 연속으로 실시하여 그 평균값을 채용하였다. 그 결과를 표 41 에 나타낸다. 표 41 에 나타내는 바와 같이, 해당푸코이단 첨가군의 배지중의 HGF 는 증류수 첨가의 대조군보다 유의하게 푸코이단 농도 의존적으로 HGF 양이 증가하였다. 한편, 세포내의 HGF 양은 푸코이단 농도 의존적으로 감소하였다. 다음으로, 세포내외의 토탈 HGF 양은 농도 의존적으로 증가하였다. 이로써, 해당 푸코이단에는 HGF 의 생산을 촉진하는 활성이 있는 동시에 세포중으로부터의 HGF 의 유리를 촉진하는 작용이 있는 것으로 나타났다.
가고메 다시마 유래 푸코이단(㎍/㎖) HGF 의 생산량 (ng/well)
배지중 세포중 전량
대조군 4.2 5.7 9.8
1 9.3 3.2 12.5
10 15.9 0.9 16.8
100 16.9 0.4 17.3
실시예 5
(1) 1 ×105cells/㎖ 가 되도록 10 % 소태아 혈청을 포함한 DME 배지에 현탁한 MRC-5 세포액 500 ㎕ 를 48 웰의 세포배양 플레이트에 넣고, 37℃, 5 % CO2존재하에서 24 시간 배양후에 1 % 소태아 혈청을 포함한 DME 배지로 교환하였다. 그 후, 시료를 첨가하고, 다시 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24 시간 배양한 후 배지를 회수하고, HGF ELISA 키트를 이용하여 배지중의 HGF 의 양을 측정하였다. 참고예 1-(1) 에 기재된 가고메 다시마 유래 푸코이단은 최종농도가 10 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 대조군으로서 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 그 결과를 표 42 에 나타낸다. 표 42 에 나타내는 바와 같이, 푸코이단 첨가군은 대조군보다 유의하게 시간의존적으로 HGF 의 생산량이 증가하였다.
이로써, 푸코이단에는 높은 HGF 의 생산촉진활성이 있어, HGF 의 생산량은 시간이 경과함에 따라 증가하는 것으로 나타났다.
배양시간 (시간)
0 0.5 1 2 4 8 12 24
HGF 의 생산량 (ng/㎖)
대조군 0.02 0.03 0.81 0.90 2.31 3.90 6.94 9.39
푸코이단 첨가 0.19 1.90 5.75 6.87 9.04 15.9 20.1 31.3
(2) 1 ×105cells/㎖ 가 되도록 10 % 소태아 혈청을 포함한 DME 배지에 현탁한 MRC-5 세포 (CCL 171 : 다이닛폰세야쿠 제조, code. 02-021) 500 ㎕ 를 48 웰의 세포배양 플레이트에 넣고, 37℃, 5 % CO2존재하에서 24 시간 배양후에 1 % 소태아 혈청을 포함한 DME 배지로 교환하였다. 그 후, 시료를 첨가하고, 다시 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 시간 배양한 후 배지를 회수하고, Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF) ELISA 키트 (후나코시샤 제조, Code. RS-0641-00) 를 이용하여 배지중의 HGF 의 양을 측정하였다. 다시 배지를 회수한 후 세포를 PBS 로 세척후, 500 ㎕ 의 세포용해 완충액 (50 mM HEPES pH 7.4, 10 mM EDPA, 0.1 % Triton ×100, 1mM PMSF, 1 ㎍/㎖ 펩스타틴 A, 1 ㎍/㎖ 류펩틴) 에 용해하였다. 더 완전히 용해시키기 위하여 초음파처리하고 나서, 원심분리하여 상청 (세포추출액) 을 조제하고, 세포내의 HGF 양을 배지중의 HGF 농도와 동일하게 측정하였다. 참고예 1-(1) 에 기재된 가고메 다시마 유래 푸코이단은 최종농도가 10 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 네거티브 대조군으로서 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 해당 푸코이단 첨가군의 배지중의 HGF 농도는 증류수 첨가의 네거티브 대조군보다 유의하게 시간의존적으로 증가하였다. 한편, 해당 푸코이단 첨가군의 세포내의 HGF 양은 첨가후 4 시간까지 감소하나, 그 후는 일정한 낮은 값이 되었다. 증류수 첨가의 네거티브 대조군에서는 이와 같은 변화는 없고, 항상 증가경향에 있었다. 이로써, 해당 푸코이단에는 세포로부터 HGF 를 유리시키는 효과와 HGF 의 생산을 촉진하는 활성이 있어, HGF 의 생산량은 시간이경과함에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 이들 결과를 표 43 ~ 45 에 나타낸다.
배지중 HGF 양의 시간경과에 따른 변화
0 0.5 1 2 4 8 12 24 48 72
HGF 의 생산량 (ng/well)
대조군 0 0.11 0.19 0.29 1.07 1.56 2.34 3.46 7.45 10.5
푸코이단 첨가 0.51 0.46 1.23 2.86 4.00 6.70 9.15 12.4 22.8 29.3
세포중 HGF 양의 시간경과에 따른 변화
배양시간 (시간)
0 0.5 1 2 4 8 12 24 48 72
HGF 의 생산량 (ng/well)
대조군 0.51 0.52 0.66 0.56 0.71 0.63 0.86 0.73 1.02 1.20
푸코이단 첨가 0.88 0.66 0.45 0.46 0.25 0.29 0.20 0.20 0.18 0.23
배지중과 세포중의 전 HGF 양의 시간경과에 따른 변화
배양시간 (시간)
0 0.5 1 2 4 8 12 24 48 72
HGF 의 생산량 (ng/well)
대조군 0.51 0.63 0.85 0.84 1.78 2.19 3.19 4.19 8.47 11.6
푸코이단 첨가 1.39 1.12 1.68 3.31 4.25 7.00 9.35 12.6 22.9 29.5
(3) 1 ×105cells/㎖ 가 되도록 10 % 소태아 혈청을 포함한 DME 배지에 현탁한 MRC-5 세포 (CCL 171 : 다이닛폰세야쿠 제조, code. 02-021) 500 ㎕ 를 48 웰의 세포배양 플레이트에 넣고, 37℃, 5 % CO2존재하에서 24 시간 배양후에 1 % 소태아 혈청을 포함한 DME 배지로 교환하였다. 그 후, 시료를 첨가하고 다시 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 시간 배양한 후, 배지를 회수하고, Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF) ELISA 키트 (후나코시샤 제조, Code. RS-0641-00) 를 이용하여 배지중의 HGF 의 양을 측정하였다. 다시 배지를 회수한후 세포를 PBS 로 세척후, 500 ㎕ 의 세포용해 완충액 (50 mM HEPES pH 7.4, 10 mM EDPA, 0.1 % Triton ×100, 1mM PMSF, 1 ㎍/㎖ 펩스타틴 A, 1 ㎍/㎖ 류펩틴) 에 용해하였다. 더 완전히 용해시키기 위하여 초음파처리하고 나서, 원심분리하여 상청 (세포추출액) 을 조제하여, 세포내의 HGF 양을 배지중의 HGF 농도와 동일하게 측정하였다. 7-12SFd-F 는 최종농도가 10 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 네거티브 대조군으로서 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 7-12SFd-F 첨가군의 배지중의 HGF 농도는 증류수 첨가의 네거티브 대조군보다 유의하게 시간의존적으로 증가하였다. 한편, 7-12SFd-F 첨가군의 세포내의 HGF 양은 첨가후 한동안은 감소하나, 그 후 증가로 바뀌었다. 증류수 첨가의 네거티브 대조군에서는 이와 같은 변화는 없고, 항상 일정하였다. 이로써, 7-12SFd-F 에는 세포로부터 HGF 를 유리시키는 효과와 높은 HGF 의 생산을 촉진하는 활성이 있어, HGF 의 생산량은 시간이 경과함에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 그 후는 일정한 낮은 값이 되었다. 이들 결과를 표 46 ~ 48 에 나타낸다.
배지중 HGF 양의 시간경과에 따른 변화
배양시간 (시간)
0 0.5 1 2 4 8 12 24 48 72
HGF 의 생산량 (ng/well)
대조군 0.14 0.33 0.36 0.63 1.29 1.60 2.54 3.89 7.99 13.3
7-12SFd-f 첨가 0.48 1.82 2.16 2.53 3.12 4.01 5.84 9.82 17.0 23.5
세포중 HGF 양의 시간경과에 따른 변화
배양시간 (시간)
0 0.5 1 2 4 8 12 24 48 72
HGF 의 생산량 (ng/well)
대조군 2.65 3.11 2.73 2.77 2.31 2.82 2.80 4.61 5.36 6.74
7-12SFd-f 첨가 2.79 1.78 1.65 1.31 1.06 1.31 1.07 1.56 2.66 3.09
배지중과 세포중의 전 HGF 양의 시간경과에 따른 변화
배양시간 (시간)
0 0.5 1 2 4 8 12 24 48 72
HGF 의 생산량 (ng/well)
대조군 2.79 3.43 3.09 3.39 3.60 4.41 5.34 8.50 13.3 20.2
7-12SFd-f 첨가 3.26 3.60 3.81 3.84 4.18 5.31 6.91 11.4 19.7 26.6
(4) 1 ×105cells/㎖ 가 되도록 10 % 소태아 혈청을 포함한 DME 배지에 현탁한 MRC-5 세포 (CCL 171 : 다이닛폰세야쿠 제조, code. 02-021) 500 ㎕ 를 48 웰의 세포배양 플레이트에 넣고, 37℃, 5 % CO2존재하에서 24 시간 배양후에 1 % 소태아 혈청을 포함한 DME 배지로 교환하였다. 그 후, 시료를 첨가하고 다시 24 시간 배양하였다. 이 배지를 회수하고, Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF) ELISA 키트 (후나코시샤 제조, Code. RS-0641-00) 를 이용하여 배지중의 HGF 의 양을 측정하였다. 또한, 세포를 PBS 로 세척후, 500 ㎕ 의 세포용해 완충액 (50 mM HEPES pH 7.4, 10 mM EDPA, 0.1 % Triton ×100, 1mM PMSF, 1 ㎍/㎖ 펩스타틴 A, 1 ㎍/㎖ 류펩틴) 에 용해하였다. 더 완전히 용해시키기 위하여 초음파처리하고 나서, 원심분리하여 상청 (세포추출액) 을 조제하여, 세포내의 HGF 양을 배지중의 HGF 농도와 동일하게 측정하였다. 7-12SFd-F 는 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 네거티브 대조군으로서 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 실험은 모두 3 번 연속으로 실시하여 그 평균값을 채용하였다. 그 결과, 표 49 에 나타내는 바와 같이, 7-12SFd-F 첨가군의 배지중의 HGF 는 증류수 첨가의 네거티브 대조군보다 유의하게 7-12SFd-F 의 농도 의존적으로 HGF 의 생산량이 증가하였다. 한편, 세포내의 HGF 양은 7-12SFd-F 의 농도 의존적으로 감소하였다. 또한 세포내외의 토탈 HGF 양도 농도 의존적으로 증가하였다. 이로써, 7-12SFd-F 에는 세포로부터 HGF 를 유리시키는 효과와 HGF 의 생산을 촉진하는 활성이 있는 것으로 나타났다. 이 결과를 표 49 에 나타낸다.
7-12SFd-F 첨가시의 HGF 생산량
7-12SFd-F 첨가량 (최종농도 ㎍/㎖)
0 1 10 100
HGF 의 생산량 (ng/well)
배지중 5.66 8.46 17.1 22.0
세포중 6.28 6.04 4.15 1.59
전량 11.9 14.5 21.3 23.6
실시예 6
(1) 1 ×105cells/㎖ 가 되도록 10 % 소태아 혈청을 포함한 DME 배지에 현탁한 MRC-5 세포액 500 ㎕ 를 48 웰의 세포배양 플레이트에 넣고, 37℃, 5 % CO2존재하에서 24 시간 배양후에 1 % 소태아 혈청을 포함한 DME 배지로 교환하였다. 그 후, 최종농도가 0, 1, 10 ㎍/㎖ 가 되도록 시클로헥시미드 (단백합성 저해제 : 나카라이테스크샤 제조) 를 첨가하고, 추가로 피검시료를 첨가한 후 24 시간 배양하였다. 이 배지를 회수하고, HGF ELISA 키트를 이용하여 배지중의 HGF 의 양을 측정하였다. 참고예 1-(1) 에 기재된 가고메 다시마 유래 푸코이단은 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 대조군으로서, 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 실험은 모두 2 번 연속으로 실시하여 그 평균치를 채용하였다. 그 결과를 표 50 에 나타낸다. 표 50 에서 대조군의 HGF 의 생산량을 100% 로 표시하였다.
표 50 에 나타내는 바와 같이, 시클로헥시미드를 첨가함으로써, 해당 푸코이단 첨가군의 배지 중의 HGF 농도는 시클로헥시미드 농도 의존적으로 감소하고 있고, 그 저해율은 푸코이단 무첨가 대조군의 시클로헥시미드에 의한 저해와 같은 정도로 시클로헥시미드의 농도에 의존하여 저해되고 있었다. 이들로부터, 푸코이단에 의한 HGF 의 생산 유도에는 단백질 합성이 관여하는 것이 분명해졌다.
가고메 다시마 유래 푸코이단(㎍/㎖) 시클로헥시미드 첨가량 (㎍/㎖)
0 1 10
HGF 의 생산량 대 대조군 비 (%)
대조군 100 35 27
1 226 110 72
10 317 130 110
100 456 206 127
(대조군의 HGF 생산량은 7.3 ng/㎖ 이었다)
(2) 1 ×105cells/㎖ 가 되도록 10 % 소태아 혈청을 함유한 DME 배지에 현탁한 MRC-5 세포 (CCL 171 : 다이니폰 세이야꾸샤 제조, code. 02-021) 500 ㎕ 을 48 웰의 세포 배양 플레이트에 넣고, 37℃, 5 % CO2존재 하에서 24 시간 배양 후에 1 % 소태아 혈청을 함유한 DME 배지로 교환하였다. 그 후, 최종농도가 0, 1, 10 ㎍/㎖ 이 되도록 시클로헥시미드 (단백 합성 저해제 : 나카라이테스크샤 제조)를 첨가하고, 다시 시료를 첨가한 후, 24 시간 배양하였다. 이 배지를 회수하고, Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF) ELISA Kit (푸나코시샤 제조, Code. RS-0641-00) 을 사용하여 배지 중의 HGF 의 양을 측정하였다. 또한, 세포를 PBS 로 세정 후, 500 ㎕ 의 세포 용해 완충액 (50 mM HEPES pH7.4, 10 mM EDTA, 0.1 % Triton ×100, 1mM PMSF, 1 ㎍/㎖ 펩스타틴 A, 1 ㎍/㎖ 류펩틴) 에 용해하였다. 더욱 완전하게 용해시키기 위하여, 초음파 처리한 후, 원심 분리하여 상청 (세포 추출액) 을 조제하고, 세포 내의 HGF 량을 배지 중의 HGF 농도와 동일하게 측정하였다. HGF 의 생산량은 네거티브 대조군 100 % 로서 표시하였다. 저해율은 각 농도의 7-12SFd-F 만을 첨가했을 때의 HGF 생산량을 기준으로 하고, 시클로헥시미드 첨가 획분의 저해율 (%) 을 산출하였다. 7-12SFd-F 는, 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 이 되도록 첨가하였다. 네거티브 대조군으로서, 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 실험은 모두 3 번 연속으로 실시하여 그 평균치를 채용하였다. 그 결과, 표 51, 표 52 에 나타내는 바와 같이, 시클로헥시미드를 첨가함으로써, 7-12SFd-F 첨가군의 배지 중, 세포 중과 배지 중의 합계의 HGF 량은 어느 쪽이나 시클로헥시미드 농도 의존적으로 감소하고 있고, 이들로부터 7-12SFd-F 에 의한 HGF 의 생산 유도는 단순한 세포로부터의 HGF 의 유리가 아니라 단백 합성이 관여하는 것이 분명해졌다.
HGF 생산 유도의 저해 (배지 중)
7-12SFd-F첨가량(㎍/㎖) 시클로헥시미드 첨가량 (㎍/㎖)
0 1 10
HGF 의 생산량 : % /시클로헥시미드 무첨가를 100 % 로 한 경우의 저해율 : %
0 100/0 40/60 40/60
1 124/0 61/51 39/69
10 216/0 88/59 53/75
100 265/0 117/56 74/72
HGF 생산 유도의 저해 (세포 중과 배지 중의 합계)
7-12SFd-F첨가량(㎍/㎖) 시클로헥시미드 첨가량 (㎍/㎖)
0 1 10
HGF 의 생산량 : % /시클로헥시미드 무첨가를 100 % 로 한 경우의 저해율 : %
0 100/0 31/69 27/73
1 104/0 31/70 25/76
10 128/0 38/70 28/78
100 137/0 47/66 37/73
(3) 1 ×105cells/㎖ 이 되도록 10 % 소태아 혈청을 함유한 DME 배지에 현탁한 MRC-5 세포 (CCL 171 : 다이니폰 세이야꾸샤 제조, code. 02-021) 500 ㎕ 을 48 웰의 세포 배양 플레이트에 넣고, 37℃, 5 % CO2존재 하에서 24 시간 배양 후에 1 % 소태아 혈청을 함유한 DME 배지로 교환하였다. 그 후, 최종농도가 0, 0.1, 1 ㎍/㎖ 이 되도록 엑티노마이신 D (RNA 합성 저해제 : 시그마사 제조) 를 첨가하고, 다시 시료를 첨가한 후, 24 시간 배양하였다. 이 배지를 회수하고, Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF) ELISA Kit (푸나코시샤 제조, Code. RS-0641-00) 을 사용하여 배지 중의 HGF 의 양을 측정하였다. HGF 의 생산량은 네거티브 대조군 100 % 로 하여 표시하였다. 저해율은 각 농도의 푸코이단만을 첨가했을 때의 HGF 의 생산량을 기준으로 하여, 엑티노마이신 D 첨가 획분의 저해율 (%) 을 산출하였다. 참고예 1-(1) 기재의 가고메 다시마 유래 푸코이단은 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 이 되도록 첨가하였다. 네거티브 대조군으로서, 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 실험은 모두 2 번 연속으로 실시하고, 그 평균치를 채용하였다. 그 결과, 표 53 에 나타내는 바와 같이, 엑티노마이신 D 를 첨가함으로써, 해당 푸코이단 첨가군의 배지 중의 HGF 농도는 엑티노마이신 D 농도에 의존하여 저해되었다. 이들로부터, 푸코이단에 의한 HGF 의 생산 유도에는 RNA 합성이 관여할 가능성이 시사되고, 단순한 세포로부터의 HGF 의 유리는 아닌 것이 분명해졌다.
가고메 다시마 유래 푸코이단(㎍/㎖) 엑티노마이신 D 첨가량 (㎍/㎖)
0 0.1 1
HGF 의 생산량 : % /엑티노마이신 D 무첨가를 100 % 로 한 경우의 저해율 : %
0 100/0 79/21 83/17
1 244/0 138/43 119/51
10 343/0 224/35 239/30
100 492/0 341/31 285/42
(4) 1 ×105cells/㎖ 가 되도록 10 % 소태아 혈청을 함유한 DME 배지에 현탁한 MRC-5 세포 (CCL 171 : 다이니폰 세이야꾸샤 제조, code. 02-021) 500 ㎕ 을 48 웰의 세포 배양 플레이트에 넣고, 37℃, 5 % CO2존재 하에서 24 시간 배양 후에 1 % 소태아 혈청을 함유한 DME 배지로 교환하였다. 그 후, 최종농도가 0, 0.1, 1 ㎍/㎖ 이 되도록 엑티노마이신 D (RNA 합성 저해제 : 시그마사 제조) 를 첨가하고, 다시 시료를 첨가한 후, 24 시간 배양하였다. 이 배지를 회수하고, Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF) ELISA Kit (푸나코시샤 제조, Code. RS-0641-00) 을 사용하여 배지 중의 HGF 의 양을 측정하였다. 또한, 세포를 PBS 로 세정 후, 500 ㎕ 의 세포 용해 완충액 (50 mM HEPES pH7.4, 10 mM EDTA, 0.1 % TritonX100, 1mM PMSF, 1 ㎍/㎖ 펩스타틴 A, 1 ㎍/㎖ 류펩틴) 에 용해하였다. 더욱 완전하게 용해시키기 위하여, 초음파 처리한 후, 원심 분리하여 상청 (세포 추출액) 을 조제하고, 세포 내의 HGF 량을 배지 중의 HGF 농도와 동일하게 측정하였다. HGF 의 생산량은 네거티브 대조군 100 % 로서 표시하였다. 저해율은 각 농도의 7-12SFd-F 만을 첨가했을 때의 HGF 생산량을 기준으로 하고, 엑티노마이신 D 첨가 획분의 저해율 (%) 을 산출하였다. 7-12SFd-F 는, 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 이 되도록 첨가하였다. 네거티브 대조군으로서, 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 실험은 모두 3 번 연속으로 실시하여 그 평균치를 채용하였다. 그 결과, 표 54, 표 55 에 나타내는 바와 같이, 엑티노마이신 D 를 첨가함으로써, 7-12SFd-F 첨가군의 배지 중, 세포 중과 배지 중의 합계의 HGF 량은 어느 쪽이나 엑티노마이신 D 농도에 의존하여 저해되었다. 이들로부터, 7-12SFd-F 에 의한 HGF 의 생산 유도에는 RNA 합성이 관여할 가능성이 시사되고, 단순한 세포로부터의 HGF 의 유리는 아닌 것이 분명해졌다.
HGF 생산 유도의 저해 (배지 중)
7-12SFd-F첨가량(㎍/㎖) 엑티노마이신 D 첨가량 (㎍/㎖)
0 0.1 1
HGF 의 생산량 : % /엑티노마이신 D 무첨가를 100 % 로 한 경우의 저해율 : %
0 100/0 76/24 80/20
1 130/0 95/27 96/26
10 225/0 182/19 152/32
100 295/0 212/28 187/48
HGF 생산 유도의 저해 (세포 중과 배지 중의 합계)
7-12SFd-F첨가량(㎍/㎖) 엑티노마이신 D 첨가량 (㎍/㎖)
0 0.1 1
HGF 의 생산량 : % /엑티노마이신 D 무첨가를 100 % 로 한 경우의 저해율 : %
0 100/0 61/39 59/41
1 98/0 64/35 61/38
10 113/0 83/27 71/37
100 126/0 91/28 81/36
실시예 7
(1) 7 주령의 수컷 Wistar 래트를 사용하여 외과적 처치에 의해 부분 간 절제를 다음과 같이 실시하였다. 즉, 에테르 마취 하에서 래트를 개복하고, 간장의 약 30 % 부분을 외과용 봉합사로 뿌리 혈관을 결찰한 후, 절제하였다. 개복부는 봉합 바늘로 봉합하였다.
참고예 1-(1) 기재의 가고메 다시마 유래 푸코이단은 절제 직후를 1 회째로 하고 12 시간 간격으로 복강 내 투여하였다. 대조군에는 생리 식염수를 복강 내 투여하였다.
간 절제 후, 24 시간 혹은 72 시간째에 래트를 마취 하에서, 복대동맥에서 채혈하고, 0.1 % 에틸렌디아민 4 아세트산 2 나트륨에 의한 혈장을 원심으로 분리하였다. 혈장 중의 HGF 량은 HGF ELISA 키트 (가부시끼가이샤 토쿠슈 멘에끼 겐큐쇼 제조) 를 사용하여 측정하였다.
결과를 표 56 에 나타낸다. 표 중의 숫자는 평균치 ±표준오차를 표시하고, ( ) 내는 1 군당 래트의 마리수를 나타낸다. 또한, 표 중의 * 은 대조군과비교하여 5 % 이하의 위험율로 유의한 차이를 갖는 것을 의미한다.
투여 시료 투여량(㎎/㎏) 혈장 중 HGF 농도 (ng/㎖)
24 시간 72 시간
생리 식염수(대조군) 0.28 ±0.04 (4) 0.30 ±0.02 (3)
가고메 다시마 유래 푸코이단 0.11 0.40 ±0.12 (4)0.65 ±0.18 (4) 0.52 ±0.06 (5)*0.64 ±0.09 (2)*
푸코이단 투여군은 대조군에 비교하여, 간 절제 24 시간 후에 혈장 중의 HGF 량이 상승하는 경향이 발견되고, 72 시간 후에는 유의한 상승이 발견되었다.
이상, 푸코이단은 HGF 생산을 유도함으로써, 외과적 수술을 필요로 하는 간 질환에서 수술 후의 신속한 재생을 촉진함과 동시에, 잔존 간의 기능 회복에 유용하다.
(2) 7 주령의 수컷 Wistar 래트를 사용하여, 외과적 처치에 의해 부분 간 절제를 실시하였다. 에테르 마취 하에서 개복하고, 간장의 약 30 % 부분을 외과용 봉합사로 뿌리 혈관을 결찰한 후 절제하였다. 개복부는 봉합 바늘에 의해 봉합하였다. 참고예 2-(4) 에서 조제한 효소 처리 F-푸코이단은 절제 직후를 1 회째로 하고, 조석 2 회로 나누어 경구 투약하였다. 대조군에는 생리 식염수를 투여하였다. 간 절제 24 시간 후에 래트를 마취 하에서, 대동맥에서 채혈하고, 0.1 % 에틸렌디아민 4 아세트산 2 나트륨에 의한 혈장을 원심으로 분리하였다. 혈장 중의 HGF 량은 HGF ELISA 키트 (가부시끼가이샤 토쿠슈 멘에끼 겐큐쇼) 를 사용하여 측정하였다.
결과를 표 57 에 나타낸다. 표 중의 숫자는 평균치 ±표준오차를 표시하고, ( ) 내는 1 군 당 래트의 마리수를 나타낸다. 또한, 표 중의 * 은 대조군과 비료하여 1 % 이하의 위험율로 유의한 차이를 갖는 군을 의미한다.
군 혈장 중 HGF 농도 (ng/㎖)
24 시간
생리 식염수 0.184 ±0.33 (6)
효소 처리 F-푸코이단(1 g/kg/day) 0.505 ±0.97* (5)
효소 처리 F-푸코이단 투여군은 대조군에 비교하여 간 절제 24 시간 후에 유의한 상승이 발견되었다.
이상, 푸코이단, 7-12SFd-F 고함유 F-푸코이단은 HGF 생산을 유도함으로써, 외과적 수술을 필요로 하는 간 질환에서 수술 후의 신속한 재생을 촉진함과 동시에, 잔존 간의 기능 회복에 유용하다.
실시예 8
인슐린과 같은 증식 인자의 일종인 h-IGF-1 을 고발현하는 사람 신생아 포피 상피 세포주인 Hs68 세포 (ATCC CRL-1635) 를 10 % 소태아 혈청 (FBS : 바이오 위태커사 제조) 을 함유하는 DMEM 배지 (기브코 BRL 사 제조) 로써 5 % CO2존재 하, 37℃ 에서 세포가 배양기에 포화가 될 때까지 배양하고, 트립신-EDTA 용액 (바이오 위태커사 제조) 으로 세포를 3 ×103개/웰이 되도록 상기 배지에 현탁하며, 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 200 ㎕ 씩 분리 주입하였다. 배양 5 내지 7 일 후, 거의 세포가 배양기에 포화가 된 시점에서 배지를 버리고, 0, 12.3, 37, 111, 333, 1000, 또는 3000 ㎍/㎖ 의 참고예 1-(2) 기재의 I 획분, Ⅱ 획분, Ⅲ 획분, 또는 참고예 1-(1) 기재의 가고메 다시마 유래 푸코이단을 함유하는 상기 배지를 200 ㎕/웰로 첨가하였다. 24 시간의 타임코스를 취하여 1, 4, 12, 24 시간째에 시간 경과적으로 배양 상청을 회수하고, Hs68 세포에 대한 h-IGF 생산 유도 활성을 h-IGF-1 ELISA 키트 (다이어그노스틱스사 제조) 를 사용하여 측정하였다. 결과를 표 58 내지 표 61 에 나타낸다. 또한, 대조는 시료 무첨가이다.
가고메 다시마 유래 푸코이단(㎍/㎖) 배지 중 h-IGF-1 농도(ng/㎖)
1 시간 4 시간 12 시간 24 시간
대조 4.3 2.9 4.1 4.5
12.3 22.9 14.7 10.5 11.8
37 17.5 13.9 10.8 11.4
111 14.6 13.7 10.3 7.8
333 13.8 17.6 9.4 7.7
1000 13.9 14.7 14.6 7.5
3000 15.9 14.0 14.0 7.2
I 획분(㎍/㎖) 배지 중 h-IGF-1 농도(ng/㎖)
1 시간 4 시간 12 시간 24 시간
대조 6.8 5.4 5.0 5.0
12.3 13.9 10.5 7.6 7.3
37 19.0 11.7 8.3 10.1
111 20.4 11.0 9.5 9.9
333 18.7 12.2 10.9 10.3
1000 17.7 13.2 12.7 11.3
3000 19.0 12.1 13.1 11.7
Ⅱ 획분(㎍/㎖) 배지 중 h-IGF-1 농도(ng/㎖)
1 시간 4 시간 12 시간 24 시간
대조 4.3 2.9 4.1 4.5
12.3 18.5 10.2 6.9 7.0
37 20.1 9.9 9.2 9.2
111 20.0 11.1 9.8 8.9
333 16.3 12.7 9.7 9.2
1000 17.0 12.2 10.0 8.8
3000 17.9 11.3 10.0 7.6
Ⅲ 획분(㎍/㎖) 배지 중 h-IGF-1 농도(ng/㎖)
1 시간 4 시간 12 시간 24 시간
대조 4.3 2.9 4.1 4.5
12.3 16.5 10.9 8.5 8.6
37 16.7 10.2 11.1 8.4
111 11.8 11.5 8.6 6.9
333 9.6 11.2 8.0 5.9
1000 7.9 10.4 10.6 6.6
3000 7.1 9.4 9.7 6.2
표 58 내지 표 61 에 나타내는 바와 같이, 가고메 다시마 유래 푸코이단, I 획분, Ⅱ 획분 및 Ⅲ 획분은 h-IGF-1 생산 유도 활성을 나타내었다. h-IGF-1 생산 유도 활성은 12 내지 100 ㎍/㎖ 의 시료 첨가에 의해, 1 시간째에 최고치를 나타내었다. 또한, 각 시료에서 Hs68 세포에 대한 독성, 증식 억제 활성은 인정되지 않았다. 참고예에 기재된 다른 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당 및 이들의 염에 대해서도, 동일하게 h-IGF-1 생산 유도 활성을 인정하였다.
실시예 9
래트 섬유아 L-M 세포 (ATCC CCL-1.2) 를 0.5 % 의 박토펩톤 (Difco 사 제조) 을 함유하는 M119 배지 (ICN 사 제조) 에서 1.5 ×105세포/㎖ 에 현탁하여 96 웰 플레이트에 0.1 ㎖ 씩 뿌려 무균적으로 배양하였다.
3 일간 배양 후, 배지를 제거하고, 0.5 % 의 소태아 혈청 알부민 (시그마사 제조) 을 함유하는 M199 배지로 전환하였다. 여기에, 참고예 1-(1) 기재의 가고메 다시마 유래 푸코이단의 예를 최종농도가 0, 62.5, 250, 1000 ㎍/㎖ 이 되도록 첨가하고, 24 시간 배양하였다. 대조군으로서 증류수를 첨가한 것을 사용하였다. 배양 종료 후, 배양액 중의 NGF 의 농도를 엔자임 이뮤노 어세이법 (NGF Emax Immuno Assay System : 프로메가사 제조) 으로 측정하였다. NGF 의 생산량은 대조군의 NGF 의 생산량을 100 % 로 하여 표시하였다. 실험은 모두 2 번 연속으로 실시하고 그 평균치를 채용하였다. 그 결과, 표 62 에 나타낸다. 표 62 에 나타내는 바와 같이, 가고메 다시마 유래 푸코이단은 농도 의존적으로 L-M 세포의 신경 증식 인자 생산을 촉진하였다. 또한, 그 분획물도 동일한 활성을 나타내었다. 또한, 참고예에 기재된 다른 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당 및 그들의 염도 동일한 NGF 생산 유도 작용을 나타내었다.
시료 농도(㎍/㎖) NGF 의 생산량의 증가(%)
가고메 다시마 유래푸코이단 62.5 117
250 166
1000 179
(대조군의 NGF 생산량은 155 pg/㎖ 이었다)
마찬가지로, 참고예 1-(2) 에 기재된 I 획분, Ⅱ 획분, Ⅲ 획분에 대해서 신경 증식 인자 생산의 촉진 활성을 측정하고, 각 획분에 활성을 인정하였다. 그 결과를 표 63 에 나타낸다. 또한, 참고예에 기재된 다른 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당 및 그들의 염도 동일하게 NGF 생산 유도 작용을 나타내었다.
시료 농도(㎍/㎖) NGF 의 생산량의 증가(%)
I 획분 250 505.6
500 619.6
1000 806.5
Ⅱ 획분 250 664.5
500 864.5
1000 1137.4
Ⅲ 획분 250 1021.1
500 1187.0
1000 1265.0
(대조군의 NGF 생산량은 50.03 pg/㎖ 이었다)
실시예 10
(1) 수컷 C/3H/He 마우스를 니혼 SLC 사에서 구입하여 예비 사육 후, 5 주령부터 실험에 사용하였다. 참고예 1-(1) 에서 조제한 가고메 다시마 유래 푸코이단을 에탄올로 3 % 농도로 현탁 용해하고, 마우스의 등부분에 1 마리 당 200 ㎕ 씩 도포하였다. 대조군에는 에탄올을 동일하게 도포하였다. 투여는 1 일 1 회로 하고, 연일 8 일 실시하였다. 투여 개시 9 일째에 피부를 박리하고, 피부 중의 HGF 활성을 ELISA 키트 (가부시끼가이샤 토쿠슈 멘에끼 겐큐쇼) 로 측정하였다.
결과를 표 64 에 나타낸다. 표 중의 숫자는 5 예의 평균치 ±표준오차를 표시한다.
피부 중에서 추출한 HGF 활성은 푸코이단 도포군에서는 대조군보다 분명하게 상승하고, 푸코이단 도포에 의한 HGF 생산 유도 작용이 인정되었다.
피부 중 HGF 활성(ng/g tissue)
대조군 (N=5) 16.31 ±2.86
푸코이단 도포군 (N=5) 104.46 ±4.05
표준치 ±평균오차
(2) 후술의 실시예 26-(1) 기재의 본 발명의 화장수와, 푸코이단을 함유하지 않은 대조의 화장수를 비교하여, 20 내지 35 세 성인 여성 25 명에 대해서 블라인드로 관능 검사를 실시하였다. 그 결과, 보다 유효하다고 판정한 인수를 표 65 에 나타낸다.
피부의 촉촉함 피부의 부드러움 피부의 탄력
본 발명의 화장수 21 19 16
대조의 화장수 5 6 9
이상의 결과, 푸코이단의 HGF 생산 유도 작용에 의해, 푸코이단 배합의 본 발명의 화장수는 피부의 촉촉함, 부드러움, 탄력 모두가 우수함이 나타났다.
실시예 11
(1) 참고예 1-(2) 기재의 방법으로 조제한 F-푸코이단 98 ㎎ 을 DMSO 5 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 피페리딘 황산 980 ㎎ 을 첨가한 후, 80℃ 에서 2 시간 교반하였다. 반응액을 냉각 후, 분자량 1000 컷의 투석막으로 2 일간 투석하였다. 얻어진 투석 내액을 양이온 교환 칼럼〔앰버라이트 IRA-120 (Na+)〕에 제공한 후, 감압 건고함으로써 F-푸코이단의 고황산화체 98 ㎎ 을 조제하였다.
(2) 참고예 2 기재의 방법으로 조제한 7-12SFd-F 34 ㎎ 을 DMSO 4 ㎖ 에 용해하고, 그 후, 실시예 11-(1) 과 동일한 조작으로 7-12SFd-F 의 고황산화체 98 ㎎ 을 조제하였다.
(3) 실시예 1 과 동일한 방법으로, 실시예 11-(1) 에서 조제한 F-푸코이단의 고황산화체 (시료 ①), 실시예 11-(2) 에서 조제한 7-12SFd-F 의 고황산화체 (시료 ②), 참고예 1-(2) 에서 조제한 F-푸코이단 (시료 ③), 및 참고예 2 에서 조제한 7-12SFd-F (시료 ④) 의 HGF 생산 유도 활성을 검토하였다. 각각의 시료는 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 이 되도록 첨가하였다. 대조군으로서 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다.
그 결과를 표 66 에 나타낸다. 표 66 에서, 대조군의 HGF 생산량을 100 % 로 표시하였다. 실험은 모두 2 번 연속으로 실시하여 그 평균치를 채용하였다. 표 66 에 나타낸 바와 같이, 시료 ① 내지 ④ 는 HGF 의 생산을 유도하였다. 또한, 고황산화체에서, 그 HGF 생산 유도 활성은 미고황산화 처리의 것보다 상승하였다. 이로부터, 이미 존재하는 천연의 황산화당도 다시 황산화 처리를 실시함으로써 그 HGF 생산 유도 활성이 증강하는 것이 분명해졌다.
또한, 황산 함량의 정량은 각각의 시료의 1 N HCl 0.2 ㎖ (1 내지 10 ㎎/㎖) 용액을 105℃ 에서 4 시간 가열하고, 그 중 0.1 ㎖ 에 0.1 N HCl 용액 1.9 ㎖ 와 1 % 염화바륨-0.5 % 젤라틴 용액 0.25 ㎖ 을 첨가하여 20 분간 방치 후, 500 nm 의 흡광도를 측정함으로써 실시하였다. 검량선은 0, 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20 mM 황산나트륨의 1 N HCl 용액을 표준 시료로서 작성하고, 이 검량선으로부터 각 시료의 황산 함량 (SO3환산) 을 구하였다. 이 검량선은 도 2 에, 각 시료의 황산 함량은 표 67 에 나타낸다.
농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량 (%)
시료 ① 시료 ② 시료 ③ 시료 ④
1 346 192 312 192
10 715 214 493 229
100 794 499 598 355
(대조군의 HGF 생산량은 8.15 ng/㎖ 이었다)
시료 황산 함량 (SO3환산, %)
F-푸코이단 40
F-푸코이단의 고황산화체 47
7-12SFd-F 40
7-12SFd-F 의 고황산화체 48
실시예 12
10 % 소태아 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 배양한 NHDF 세포 (인체 정상 피부 섬유아세포 : Bio Wittaker사 제조) 를 1 ×105cells/㎖ 이 되도록 10 % 소태아 혈청을 함유한 DMEM 배지에 현탁하고, 500 ㎕ 씩 48 웰의 세포 배양 플레이트에 넣어 24 시간 배양하였다. 그 후, 1 % 소태아 혈청을 함유한 DMEM 배지로 교환하고, 10 nM 의 테트라데카노일포르볼 13-아세테이트 (TPA: 기브코 BRL 사 제조) 와 시료를 첨가하였다. 첨가 후 20 시간 배양한 후, 배지를 회수하고, Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF) ELISA Kit (푸나코시샤 제조, Code. RS-0641-00) 을 사용하여 배지 중의 HGF 의 양을 측정하였다. HGF 의 생산량은 네거티브 대조군을 100 % 로 하여 표시하였다. 시료는, 각각 최종농도가 참고예1-(1) 기재의 푸코이단이 1, 10, 100 ㎍/㎖ 이 되도록 첨가하였다. 헤파린은 1, 10 ㎍/㎖ 이 되도록 첨가하였다. 네거티브 대조군으로서, 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 유도 실험의 배양은 시료 첨가와 동시에 10 nM 의 TPA 를 첨가하여 실시하였다. 실험은 모두 3 번 연속으로 실시하고, 그 평균치를 채용하였다. 그 결과를 표 68 에 나타낸다. 푸코이단을 첨가한 세포군은 모두 증류수 첨가의 네거티브 대조군보다 유의하게 HGF 의 생산량이 증가하였다. 또한, 헤파린 첨가보다도 현저하게 HGF 의 생산량이 증가하였다. 이에 따라, 참고예 1-(1) 기재의 푸코이단은 이제까지 HGF 의 유도가 확인되고 있는 헤파린보다 높은 HGF 의 생산을 촉진하는 활성이 있는 것이 나타났다.
농도(㎍/㎖) 헤파린 푸코이단
0 100 100
1 950 1140
10 2170 2470
100 - 2770
(단, 대조군의 HGF 생산량은 0.20 ng/㎖ 이었다)
실시예 13
10 % 소태아 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 배양한 Hs68 세포 (인체 신생아 포피 세포 : 다이니폰 세이야꾸샤 제조 ATCC CRL-1635) 를 1 ×105cells/㎖ 이 되도록 10 % 소태아 혈청을 함유한 DMEM 배지에 현탁하고, 500 ㎕ 씩 48 웰의 세포 배양 플레이트에 넣어 24 시간 배양하였다. 그 후, 1 % 소태아 혈청을 함유한 DMEM 배지로 교환하고, 10 nM 의 TPA 와 시료를 첨가하였다. 또한, TPA 를 첨가하지 않고 시료만을 첨가하는 구분도 동일하게 실시하였다. 이 배지를 회수하여 Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF) ELISA Kit 를 사용하여 배지 중의 HGF 의 양을 측정하였다. 또한, 세포를 PBS 로 세정 후, 500 ㎕ 의 세포 용해 완충액 (50 mM HEPES pH7.4, 10 mM EDTA, 0.1 % Triton ×100, 1mM PMSF, 1 ㎍/㎖ 펩스타틴 A, 1 ㎍/㎖ 류펩틴) 에 용해하였다. 더욱 완전하게 용해시키기 위하여, 초음파 처리한 후, 원심 분리하여 상청 (세포 추출액) 을 조제하고, 세포 내의 HGF 량을 배지 중의 HGF 농도와 동일하게 측정하였다. 참고예 2-(3) 에서 조제한 7-12SFd-F 는, 최종농도가 0.1, 1, 10, 100 ㎍/㎖ 이 되도록 첨가하였다. 네거티브 대조군으로서, 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 실험은 모두 3 번 연속으로 실시하여 그 평균치를 채용하였다. 그 결과를 표 69 내지 표 71 에 나타낸다. TPA 무첨가에서 현저한 HGF 의 생산은 인정되지 않았다. 그러나, TPA 를 첨가한 경우는, 세포 중의 HGF 량은 7-12SFd-F 의 농도 의존적으로 저하하고, 배지 중의 HGF 량과 토탈 HGF 량은 7-12SFd-F 의 농도 의존적으로 증가하며, 또한 토탈 HGF 량은 무첨가의 대조군보다 유의하게 증가하였다. 또한, 이렇게 mRNA 가 증가하고 있는 경우의 HGF 량의 증가는 TPA 무처리에서 mRNA 량이 적은 경우와 비교하여 매우 현저한 것이었다. 이로부터, 7-12SFd-F 은 mRNA 의 전사가 촉진되고, 대량의 HGF 가 필요해지고 있는 경우는 HGF 의 유리와 생산을 현저하게 촉진시키는 것이 분명해졌다.
Hs68/7-12SFd-F 배지 중 HGF 량 (pg/Well)
7-12SFd-F(㎍/㎖) TPA 없음 10 nMTPA
0 N.D. 65.54
0.1 N.D. 71.04
1 N.D. 99.25
10 N.D. 226.14
100 N.D. 260.49
N.D. 는 검출 한계 이하를 나타낸다.
Hs68/7-12SFd-F 세포 중 HGF 량 (pg/Well)
7-12SFd-F(㎍/㎖) TPA 없음 10 nMTPA
0 98.62 155.65
0.1 87.60 151.99
1 62.47 142.17
10 N.D. 120.70
100 N.D. 95.67
N.D. 는 검출 한계 이하를 나타낸다.
Hs68/7-12SFd-F 토탈 HGF 량 (pg/Well)
7-12SFd-F(㎍/㎖) TPA 없음 10 nMTPA
0 221.19
0.1 223.02
1 241.42
10 346.84
100 356.05
실시예 14
10 % 소태아 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 배양한 MRC-5 세포 (CCL 171 : 다이니폰 세이야꾸샤 제조 code. 02-021) 를 2.5 ×105cells/㎖ 이 되도록 10 % 소태아 혈청을 함유한 DMEM 배지에 현탁하고, 6 웰의 세포 배양 플레이트에 넣어 5 % 탄산 가스 존재 하, 37℃ 에서 24 시간 배양을 실시하였다. 그 후, 1 % 소태아혈청을 함유한 DMEM 배지로 교환하고, 다시 22 시간 배양을 실시하였다. 그 후, 최종농도가 100 ㎍/㎖ 가 되도록 참고예 2-(3) 에서 조제한 7-12SFd-F 을, 1 ㎍/㎖ 이 되도록 LM 헤파린 (Celsus laboratories 샤 제조) 을, 1μM 이 되도록 디메틸술폭시드 (DMSO) 에 용해시킨 프로스타글란딘 E1(PGE1) (와코 쥰야꾸 고교샤 제조) 을 첨가한 각각의 배양액으로 교환하였다. 대조군으로서, DMSO 를 첨가한 배지를 사용하였다. 또한, 상기 각 첨가물의 용매가 모두 1 % 가 되도록 첨가하였다. 다시 배양을 실시하고, 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 시간째에 모든 RNA 의 추출을 실시하였다. 모든 RNA 의 추출에는 RNeasy Mini Kit (QIAGEN사 제조) 를 사용하였다. RT-PCR 은 RNA PCR Kit ver. 2.1 (타카라 슈조사 제조, R019A) 를 사용하였다. 역전사 반응은 모든 RNA 에 열변성 처리를 실시한 후, 랜덤 프라이머 (N6) (타카라 슈조사 제조, 3801) 를 사용하여 30℃ 에서 10 분, 42 ℃ 에서 30 분, 99 ℃ 에서 5 분으로 실시하였다. HGF 의 mRNA 를 검출하기 위하여, 센스프라이머로서 배열표의 배열 번호 1 에 기재된 프라이머를, 안티센스 프라이머로서 배열표의 배열 번호 2 에 기재된 프라이머를 사용하였다. 이 프라이머에 의해 증폭되는 산물은 415 bp 이다. 또한, 반정량적인 실험을 실시하기 위하여 하우스 키핑 유전자인 β-액틴의 검출도 실시하였다. 프라이머는 센스 프라이머로서 배열표의 배열 번호 3 에 기재된 프라이머를, 안티센스 프라이머로서 배열표의 배열 번호 4 에 기재된 프라이머를 사용하였다. 이 프라이머에 의해 증폭되는 산물은 275 bp 이다. PCR 은 PJ9600 (퍼킨엘머사 제조) 에 의해 실시하였다. PCR 사이클은 열변성을 94 ℃ 에서 2 분 실시한 후, 열변성을 94 ℃ 에서 30 초, 어닐링을 59 ℃ 에서 30 초, 신장 반응을 72 ℃ 에서 60 초의 사이클로 24 사이클 실시하였다. 반응 후, 2 % 아가로스겔 전기 영동 및 에티듐 브로마이드 염색을 실시하고, UV 조사 하에서 겔을 관찰하였다. 모든 샘플에서 HGF 의 mRNA 가 검출되었다. 대조군에 비교하여 PGE1에 의한 mRNA 의 유도는 인정되었지만, 7-12SFd-F 및 LM 헤파린에 의한 mRNA 의 유도는 인정되지 않았다. 이로부터, 항상 HGF 의 mRNA 를 전사하고 있는 상태에서는, 7-12SFd-F 및 LM 헤파린의 첨가에 의한 HGF 의 mRNA 의 전사의 촉진은 일어나지 않는 것이 분명해지고, 7-12SFd-F 및 LM 헤파린은 과잉의 HGF 의 생산 유도를 일으키지 않는 것이 분명해졌다.
실시예 15
실시예 13 에서 사용한 HS68 세포 대신에 NHDF 세포 (인체 정상 피부 섬유아세포 : Bio Whittaker사 제조) 를 사용하고, 그 외에는 실시예 13 과 동일하게 하여 NHDF 세포에서의 7-12SFd-F 에 의한 HGF 생산 유도 활성에 대하여 조사하였다. 그 결과를 표 72 내지 표 74 에 나타낸다.
TPA 무첨가에서 세포 중의 HGF 량은 7-12SFd-F 의 농도 의존적으로 저하하고, 배지 중의 HGF 량과 토탈 HGF 량은 7-12SFd-F 의 농도 의존적으로 증가하며, 또한 토탈 HGF 량은 7-12SFd-F 무첨가의 대조군보다 유의하게 증가하였다. 이로부터, TPA 무처리와 같은 HGF 의 mRNA 이 적은 경우에도 세포 표면의 HGF 의 유리와 HGF 의 합성의 양방을 촉진시키는 것이 분명해졌다. 또한, TPA 를 첨가한 경우는, 세포 중의 HGF 량은 7-12SFd-F 의 농도 의존적으로 저하하고, 배지 중의 HGF 량과 토탈 HGF 량은 7-12SFd-F 의 농도 의존적으로 증가하며, 또한, 토탈 HGF 량은 7-12SFd-F 무첨가의 대조군보다 유의하게 증가하였다. 또한, 이렇게 mRNA 가 증가하고 있는 경우의 HGF 량의 증가는, TPA 무첨가에서 mRNA 량이 적은 경우과 비교하여 매우 현저한 것이었다. 이로부터, 7-12SFd-F 는 mRNA 이 소량인 경우는 적은대로 HGF 의 유리와 생산을 촉진시키고, 또한, mRNA 의 전사가 촉진되며, 대량의 HGF 가 필요해지고 있는 경우는 HGF 의 유리와 생산을 현저하게 촉진하는 것이 분명해졌다.
NHDF/7-12SFd-F 배지 중 HGF 량 (ng/Well)
7-12SFd-F(㎍/㎖) TPA 없음 10 nMTPA
0 N.D. 0.39
1 0.05 0.68
10 0.18 1.22
100 0.385 1.625
N.D. 는 검출 한계 이하를 나타낸다.
NHDF/7-12SFd-F 세포 중 HGF 량 (ng/Well)
7-12SFd-F(㎍/㎖) TPA 없음 10 nMTPA
0 0.185 0.24
1 0.145 0.19
10 0.075 0.12
100 0.025 0.055
NHDF/7-12SFd-F 토탈 HGF 량 (ng/Well)
7-12SFd-F(㎍/㎖) TPA 없음 10 nMTPA
0 0.63
1 0.195 0.87
10 0.255 1.335
100 0.41 1.68
실시예 16
10 % 소태아 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 배양한 NHDF 세포 (인체 정상 피부 섬유아세포) 를 2.5 ×105cells/㎖ 이 되도록 10 % 소태아 혈청을 함유한 DMEM 배지에 현탁하고, 2 ㎕ 씩 6 웰의 세포 배양 플레이트에 넣어 5 % 탄산가스 존재 하, 37℃ 에서 24 시간 배양하였다. 그 후, 1 % 소태아 혈청을 함유한 DMEM 배지로 교환하고, 10 nM 의 테트라데카노일포르볼 13-아세테이트 (TPA: 기브코 BRL 사 제조) 와 참고예 2-(3) 에서 조제한 7-12SFd-F 를 최종농도가 100 ㎍/㎖ 이 되도록 첨가하였다. 또한, TPA 를 첨가하지 않고, 7-12SFd-F 만을 첨가하는 구분도 동일하게 실시하였다. 또한, 배양을 실시하고, 4, 6, 8, 10 시간째에 모든 RNA 의 추출을 실시하였다. 모든 RNA 의 추출에는 RNeasy Mini Kit (QIAGEN) 을 사용하였다. RT-PCR 은 PCR 의 사이클을 28 사이클로 한 것 이외는 모두 실시예 14 와 동일하게 실시하였다. 반응 후, 2 % 아가로스겔 전기 영동 및 에티듐 브로마이드 염색을 실시하고, UV 조사 하에서 겔을 관찰하였다.
그 결과, TPA 무첨가의 경우, HGF 의 mRNA 의 전사량은 매우 적지만, 7-12SFd-F 의 첨가에 의해, 첨가 후 4 시간에서 약간의 mRNA 전사량 상승이 발견되었다. 한편, TPA 의 첨가에 의해, HGF 의 mRNA 량은 어느 시간에서도 현저하게상승하였다. TPA 와 7-12SFd-F 을 첨가한 경우는 TPA 만을 첨가한 경우와 비교하여 HGF 의 mRNA 량이 첨가 후, 4 시간에서 증가하고 있는 것이 분명해졌지만, 6 시간에서는 7-12SFd-F 의 첨가에 의한 차이는 없었다. 즉, 7-12SFd-F 는, HGF 를 필요로 하여 mRNA 의 전사가 활발하게 실시되기 시작한 초기에, 현저하게 그 전사를 촉진시키지만, 그 후 그 촉진 효과는 소실하는 것이 분명해졌다. 이로부터, 7-12SFd-F 은 HGF 가 필요해진 순간의 HGF 생산을 유도하고, 그 후 과잉의 HGF 생산을 유도하는 일은 없는 것이 분명해졌다.
실시예 17
10 % 소태아 혈청을 함유한 RPMI 1640 배지에서 배양한 HL60 세포 (인체 전골추성 백혈병 세포) 를 5 ×105cells/㎖ 이 되도록 1 % 소태아 혈청을 함유한 RPMI 1640 배지에 현탁하고, 500 ㎕ 씩 48 웰의 세포 배양 플레이트에 넣었다. 그 후, 10 nM 의 TPA 를 첨가하고, 다시 시료를 첨가하였다. 첨가 후 24 시간 배양하였다. 또한, TPA 를 첨가하지 않고 시료만을 첨가하는 구분도 동일하게 실시하였다. 이 배지를 회수하고, Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF) ELISA Kit 를 사용하여 배양 중의 HGF 의 양을 측정하였다. 또한, 세포를 PBS 로 세정 후, 500 ㎕ 의 세포 용해 완충액 (50 mM HEPES pH7.4, 10 mM EDTA, 0.1 % Triton ×100, 1mM PMSF, 1 ㎍/㎖ 펩스타틴 A, 1 ㎍/㎖ 류펩틴) 에 용해하였다. 더욱 완전하게 용해시키기 위하여, 초음파 처리한 후, 원심 분리하여 상청 (세포 추출액) 을 조제하고, 세포 내의 HGF 량을 배지 중의 HGF 농도와 동일하게측정하였다. 참고예 2-(3) 에서 조제한 7-12SFd-F 은 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 이 되도록 첨가하였다. 네거티브 대조군으로서, 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 실험은 모두 3 번 연속으로 실시하여 그 평균치를 채용하였다. 그 결과를 표 75 내지 표 77 에 나타낸다.
TPA 무첨가에서, 세포 중의 HGF 량은 7-12SFd-F 의 농도에 의한 변화는 없었다. 배지 중의 HGF 량도 100 ㎍/㎖ 으로 증가가 발견되었지만, 7-12SFd-F 의 농도에 의한 현저한 변화는 없었다. 또한, TPA 를 첨가한 경우는, 세포 중의 HGF 량은 7-12SFd-F 의 농도에 의한 변화는 없었지만, 전체적으로 낮은 값이 되어 있었다. 한편, 배지 중의 HGF 량과 토탈 HGF 량은 7-12SFd-F 의 농도 의존적으로 현저하게 증가하고, 또한 토탈 HGF 량은 7-12SFd-F 무첨가의 대조군보다 유의하게 증가하였다. 또한, 이러한 mRNA 가 증가하고 있는 경우의 HGF 량의 증가는, TPA 무첨가에서 mRNA 량이 적은 경우와 비교하여 매우 현저한 것이었다. 이로부터, 7-12SFd-F 은 mRNA 의 전사가 촉진되고, 대량의 HGF 가 필요해지고 있는 경우는 HGF 의 유리와 생산을 현저하게 촉진하는 것이 분명해졌다.
HL60/7-12SFd-F 배지 중 HGF 량 (pg/Well)
7-12SFd-F(㎍/㎖) TPA 없음 10 nMTPA
0 76.74 261.60
1 67.10 295.94
10 78.54 464.55
100 162.85 843.84
HL60/7-12SFd-F 세포 중 HGF 량 (pg/Well)
7-12SFd-F(㎍/㎖) TPA 없음 10 nMTPA
0 294.12 83.37
1 276.67 89.39
10 236.30 67.09
100 257.04 85.77
HL60/7-12SFd-F 토탈 HGF 량 (pg/Well)
7-12SFd-F(㎍/㎖) TPA 없음 10 nMTPA
0 370.85 344.97
1 343.77 385.32
10 314.84 531.64
100 420.26 929.60
실시예 18
10 % 소태아 혈청을 함유한 RPMI 1640 배지에서 배양한 HL60 세포 (인체 전골추성 백혈병 세포) 를 5 ×105cells/㎖ 이 되도록 1 % 소태아 혈청을 함유한 RPMI 1640 배지에 현탁하고, 2 ㎖ 씩 6 웰의 세포 배양 플레이트에 넣었다. 그 후, 10 nM 의 TPA 와 참고예 2-(3) 에서 조제한 7-12SFd-F 를 최종농도가 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 또한, TPA 를 첨가하지 않고 7-12SFd-F 만을 첨가하는 구분도 동일하게 실시하였다. 또한, 배양을 실시하고, 4, 6, 8, 10 시간째에 모든 RNA 의 추출을 실시하였다. 모든 RNA 의 추출에는 RNeasy Mini Kit (QIAGEN사 제조) 를 사용하였다. RT-PCR 사이클을 32 사이클로 한 것 이외는 실시예 14 와 동일하게 실시하였다. 반응 후, 2 % 아가로스겔 전기 영동 및 에티듐 브로마이드 염색을 실시하고, UV 조사 하에서 겔을 관찰하였다.
그 결과, TPA 무첨가의 경우, HGF 의 mRNA 의 전사량은 매우 적지만, 7-12SFd-F 의 첨가에 의해 첨가 후 4 시간에서 약간의 HGF 의 mRNA 량의 상승이 발견되었다. 한편, TPA 의 첨가에 의해 HGF 의 mRNA 량은 어느 시간에도 현저하게 상승하였다. TPA 와 7-12SFd-F 를 첨가한 경우는, TPA 만을 첨가한 경우와 비교하여, HGF 의 mRNA 량이 첨가 후 4 시간에서 증가하고 있는 것이 분명해졌지만, 6 시간에서는 7-12SFd-F 의 첨가에 의한 차이는 없었다. 즉, 7-12SFd-F 은 HGF 를 필요로 하여 RNA 의 전사가 활발하게 실시되기 시작한 초기에서, 현저하게 그 전사를 촉진시키지만, 그 후 그 촉진 효과는 소실하는 것이 분명해졌다. 이로부터, 7-12SFd-F 은 HGF 가 필요해진 순간의 HGF 생산을 유도하고, 그 후 과잉의 HGF 생산을 유도하는 일이 없는 것이 분명해졌다.
실시예 19
(1) 시판되는 쑥갓을 동결 건조하여 쑥갓 동결 건조물을 얻었다. 이 쑥갓 동결 건조물을 분쇄한 쑥갓 분말 10 g 을 100 ㎖ 의 클로로포름에 현탁하고, 여과하여 불용 획분을 회수하는 조작을 3 회 반복하였다. 그 후, 100 ㎖ 의 에탄올에 현탁하여 여과하고, 불용 획분을 회수하는 조작을 3 회 반복하였다. 이 조작에서 얻은 불용 획분으로부터 에탄올을 완전하게 제거하고, 100 ㎖ 의 증류수에 현탁하였다. 이 현탁액을 1 시간 60℃ 에서 보온한 후, 여과하였다. 여과액에 2.5 배량의 에탄올을 첨가하여 -20℃ 로 냉각한 후, 저온에서 원심 분리하여 침전을 얻었다. 이 침전을 증류수에 용해하고, 동결 건조하여 파우더형의 당을 함유하는 획분, 쑥갓 추출물을 얻었다.
(2) 실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로, 실시예 19-(1) 에서 조제한 쑥갓 추출물의 HGF 생산 유도 활성을 검토하였다. 시료는 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 이 되도록 첨가하였다. 네거티브 대조군으로서 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. HGF 의 생산량은 네거티브 대조군 100 % 로서 표시하였다. 그 결과를 표 78 에 나타내었다. 실험은 모두 2 번 연속으로 실시하고 그 평균치를 채용하였다. 표 78 에 나타낸 바와 같이, 쑥갓 추출물은 HGF 의 생산을 유도하였다.
쑥갓 추출물 (㎍/㎖) HGF 의 생산량 (%)
1 125
10 148
100 314
(단, 대조군의 HGF 생산량은 8.21 ng/㎖ 이었다)
실시예 20
실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로, 참고예 13-(5) 에서 조제한 쑥 상청 획분의 HGF 생산 유도 활성을 측정하였다. 단, 쑥 상청 획분은 배지량의 1/1000 량을 첨가하였다. 그 결과를 표 79 에 나타내었다. 그 결과, 쑥 추출물은 에탄올 침전에서 침전하지 않는 획분에도 HGF 생산 유도 활성이 있는 것이 분명해졌다. 이로부터, 에탄올 침전에서 침전하지 않는 저분자 획분에도 활성이 있는 것이 생각되었다.
쑥 상청 획분첨가량 HGF 의 생산량(%)
0 100
1/1000 첨가 463
(단, 대조군의 HGF 생산량은 4.31 ng/㎖ 이었다)
실시예 21
(1) 건조 쑥잎 (발매 : 사카모토 칸보토오) 50 g 을 균질화기 (니혼 세이키샤 제조) 에 넣고, 500 ㎖ 의 아세톤을 첨가하여 8000 rpm 에서 10 분간 균질화시켜서, 여과지로 여과하여 잔류물을 얻었다. 이상의 조작을 2 번 실시하여 얻어진 100 g 의 쑥잎의 잔류물을 균질화기에 넣고, 500 ㎖ 의 아세톤에 첨가하여 8000 rpm 에서 10 분간 균질화시켜서, 여과지로 여과하여 잔류물을 얻었다. 이 조작을 4 회 반복하고, 아세톤 세정 잔류물을 얻었다. 아세톤 세정 잔류물을 아세톤 세정과 동일하도록 90 % 에탄올로 4 회, 80 % 에탄올로 4 회 세정하고, 에탄올 세정 잔류물을 얻었다. 이상의 조작을 처음부터 다시 한번 실시하고, 합하여 200 g 의 쑥잎의 에탄올 세정 잔류물을 얻었다.
(2) 에탄올 세정 잔류물에 10 리터의 100 mM 염화나트륨과 10 % 에탄올을 함유하는 30 mM 의 인산 완충액 (pH 8.0) 을 첨가하고, 실온에서 19 시간 교반하며, 여과지로 여과하여 조추출물 (여과액) 을 얻었다. 얻어진 조추출물을 배제 분자량 1 만의 홀로화이버를 장착시킨 한외여과 장치로 2 리터까지 농축한 후, 20 리터의 10 % 에탄올을 함유하는 100 mM 염화나트륨을 첨가하면서 한외여과하였다. 이 후, 668 ㎖ 까지 농축하고, 1 g 의 활성탄을 넣어 실온에서 30 분 교반한 후, 10000 rpm , 40 분 원심 분리하여 활성탄을 제거하였다. 상등액에 남은 미량의 활성탄은 No.5c 의 필터로 제거하였다. 활성탄 처리액으로부터 66.8 ㎖ 를 취하고, 증류수로 충분하게 투석한 후, 동결 건조하여 670 ㎎ 의 건조물을 얻었다.이 건조물을 쑥 고분자 획분 (YPS) 이라 명명하였다. 남은 601.2 ㎖ 의 활성탄 처리액을 한외여과 장치에 넣고, 10 % 에탄올 및 50 mM 염화나트륨을 함유하는 10 mM 이미다졸 염산 완충액 (pH7.0) 으로 용매 치환하여 용매 치환 쑥 고분자 획분을 얻었다.
(3) 용매 치환 쑥 고분자 획분을 10 % 에탄올 및 50 mM 염화나트륨을 함유하는 10 mM 이미다졸 염산 완충액 (pH7.0) 으로 평형화한 DEAE-셀로파인 A-800 칼럼 (Φ4.05 ×37.8 cm) 에 첨가하여 동일한 완충액 1200 ㎖ 으로 칼럼을 세정한 후, 0.1 M (1000 ㎖) 로부터 2 M (1000 ㎖) 까지의 염화나트륨의 농도구배에 의해 용출시켰다. 용출액은 1 개 당 30 ㎖ 로 분획하였다. 용출 획분 중, 프랙션 13 으로부터 33 까지를 쑥잎 고분자 획분-I (YPS-I) 로 명명하고, 프랙션 No.69 로부터 78 까지를 쑥잎 고분자 획분-Ⅱ (YPS-Ⅱ) 라고 명명하고, 프랙션 No.79 로부터 137 까지를 쑥잎 고분자 획분-Ⅲ (YPS-Ⅲ) 라고 명명하였다. YPS-I, YPS-Ⅱ, YPS-Ⅲ 를 증류수에 대하여 충분히 투석하고, 동결 건조하였다. 각각의 동결 건조물을 530 ㎎, 420 ㎎, 380 ㎎ 을 얻었다.
(4) YPS-Ⅲ 을 다시 분획하기 위하여, 200 ㎎ 의 YPS-Ⅲ 을 50 ㎖ 의 4 M 염화나트륨을 함유하는 5 mM 이미다졸-염산 완충액 (pH8.0) 에 용해하고, 동일한 완충액으로 평형화한 페닐-셀룰로파인 칼럼 (Φ3.1 ×14.3 cm) 에 첨가하였다. 200 ㎖ 의 동일한 완충액으로 세정한 후, 각각 200 ㎖ 의 1 M 염화나트륨을 함유하는 5 mM 이미다졸-염산 완충액 (pH8.0), 200 ㎖ 의 증류수, 200 ㎖ 의 에탄올로 용출하였다.
용출액은 1 개 당 10 ㎖ 으로 분획하였다. 용출 획분 중, 프랙션 1 로부터 32 까지를 쑥잎 고분자 획분-Ⅲ-1 (YPS-Ⅲ-1) 이라 명명하고, 프랙션 No.33 으로부터 53 까지를 쑥잎 고분자 획분-Ⅲ-2 (YPS-Ⅲ-2) 라 명명하고, 프랙션 No.54 로부터 66 까지를 쑥잎 고분자 획분-Ⅲ-3 (YPS-Ⅲ-3) 이라 명명하였다. YPS-Ⅲ-1, YPS-Ⅲ-2, YPS-Ⅲ-3 을 물에 대하여 충분하게 투석 후, 동결 건조하여 각각의 동결 건조물을 20.11 ㎎, 32.59 ㎎, 113.75 ㎎ 을 얻었다.
(5) 실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로 실시예 21-(2), 21-(3) 에서 조제한 쑥 추출물의 분획물, YPS (시료 ①), YPS-I (시료 ②), YPS-Ⅱ (시료 ③), YPS-Ⅲ (시료 ④) 의 HGF 생산 유도 활성을 측정하였다. 그 결과를 표 80 에 나타내었다. 그 결과, 이들 쑥 추출물의 분획물은 HGF 생산 유도 활성을 나타내었다.
시료 농도(㎍/㎖) HGF 의 생산량(%)
시료 ① 0 100
1 214
10 267
100 215
시료 ② 0 100
1 121
10 113
100 260
시료 ③ 0 100
10 129
100 243
시료 ④ 0 100
1 232
10 323
100 272
(단, 대조군의 HGF 생산량은 8.43 ng/㎖ 이었다)
(6) 실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로 실시예 21-(4) 에서 조제한 쑥 추출물의 분획물, YPS-Ⅲ-1 (시료 ①), YPS-Ⅲ-2 (시료 ②), YPS-Ⅲ-3 (시료 ③) 의 HGF 생산 유도 활성을 측정하였다. 그 결과를 표 81 에 나타내었다. 그 결과, 이들 쑥 추출물의 분획물은 HGF 생산 유도 활성을 나타내었다.
첨가량(㎍/㎖) HGF 의 생산량 (%)
시료 ① 시료 ② 시료 ③
0 100 100 100
1 188 290 247
10 181 304 217
100 348 295 243
(단, 대조군의 HGF 생산량은 8.26 ng/㎖ 이었다)
실시예 22
참고예 1-(1) 기재의 가고메 다시마 유래 푸코이단 30 g 을 증류수 12 L 에 실온에서 30 분간 교반 용해하였다. 이 현탁액을 10000 ×g 으로 40 분간 원심 분리하고, 그 상액을 수집하였다. 이들을 멤브레인 필터 (0.22 ㎛) (밀리포아사 제조) 로 무균 여과하고, 동결 건조품 21.4 g 을 얻었다. 이것을 다카라 다시마 푸코이단 Bf (이하, 푸코이단 Bf 라 칭함) 으로 하였다.
실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로 푸코이단 Bf (시료 ①) 의 HGF 생산 유도 활성을 측정하였다. 그 결과를 표 82 에 나타내었다. 단, 실험은 2 번 연속으로 실시하고, 그 평균치를 채용하였다. 그 결과, 푸코이단 Bf 는 HGF 생산 유도 활성을 나타내었다.
첨가량(㎍/㎖) HGF 의 생산량 (%)시료 ①
0 100
1 209
10 333
100 377
(단, 대조군의 HGF 생산량은 9.17 ng/㎖ 이었다)
실시예 23
(1) 건조 가고메 다시마 500 g 을 가늘게 자르고, 10 L 의 80 % 에탄올로 세정 후, 50 L 의 1 mM 염화칼륨을 함유하는 10 % 에탄올 중에서 25℃ 에서 3 일간 교반하며, 그물코의 직경 32 ㎛ 인 스텐레스 철망으로 여과하여 여과액 약 45 L 를 얻었다. 이 여과액 34 L 을 80℃ 에서 3 시간 가열한 후, 50℃ 까지 냉각하였다. 이것을 분자량 1 만 커트의 한외여과 OMEGA 컷 (필트론사 제조) 로 액온 50℃ 로 유지하면서 농축하였다. 또한, 50℃ 로 가온한 증류수 5 L 에서 탈염을 실시하고, 동 증류수 200 ㎖ 을 첨가하여 유로를 2 회 세정하여 회수하여 농축액 1.5 L 을 얻었다. 이것을 동결 건조하여 8.2 g 의 F-rich 푸코이단을 얻었다.
(2) 실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로 실시예 23-(1) 에서 조제한 F-rich 푸코이단 (시료 ①) 의 HGF 생산 유도 활성을 측정하였다. 그 결과를 표 83 에 나타내었다. 그 결과, F-rich 는 HGF 생산 유도 활성을 나타내었다.
첨가량(㎍/㎖) HGF 의 생산량 (%)시료 ①
0 100
1 117
10 186
100 244
(단, 대조군의 HGF 생산량은 9.60 ng/㎖ 이었다)
실시예 24
10 % 소태아 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 배양한 NHDF 세포 (인체 정상 피부 섬유아세포) 를 1 ×105cells/㎖ 이 되도록 10 % 소태아 혈청을 함유한 DMEM 배지에 현탁하고, 500 ㎕ 씩 48 웰의 세포 배양 플레이트에 넣어 24 시간 배양하였다. 그 후, 1 % 소태아 혈청을 함유한 DMEM 배지로 교환하고, 10 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖ 의 미녹시딜 (와코 쥰야꾸 고교샤 제조) 과 시료를 첨가하였다. 또한, F-rich 푸코이단 첨가시에 대해서는, 미녹시딜 1 ㎍/㎖ 첨가에 대해서도 시험을 실시하였다. 또한, 미녹시딜을 첨가하지 않고 시료만을 첨가하는 구분도 동일하게 실시하였다. 이 배지를 회수하고, Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF) ELISA Kit 를 사용하여 배지 중의 HGF 의 양을 측정하였다. 시료로서, 실시예 22 에서 조제한 푸코이단 Bf, 실시예 23 에서 조제한 F-rich 푸코이단, 참고예 2-(3) 에서 조제한 7-12SFd-F 을 최종농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖ 이 되도록 첨가하였다. 또한, 푸코이단 Bf 에 대해서는 최종농도가 0.1 ㎍/㎖ 인 첨가에 대해서도 시험을 실시하였다. 네거티브 대조군으로서, 시료와 동량의 증류수를 첨가하였다. 실험은 모두 3 번 연속으로 실시하고 그 평균치를 채용하였다. 그 결과를 표 84 내지 86 에 나타낸다.
미녹시딜 무첨가에서, 배지 중의 HGF 의 양은 푸코이단 Bf, F-rich 푸코이단, 7-12SFd-F 의 농도 의존적으로 증가하고, 무첨가의 대조군보다 유의하게 증가하였다. 이로부터, 미녹시딜 무처리와 같은 HGF 의 mRNA 이 적은 경우에도, 세포 표면의 HGF 의 유리와 HGF 의 합성의 양방을 촉진할 수 있는 것이 분명해졌다. 또한, 미녹시딜을 첨가한 경우는, 배지 중의 HGF 량은 푸코이단 Bf, F-rich 푸코이단, 7-12SFd-F 의 농도 의존적으로 증가하고, 무첨가의 대조군보다 유의하게 증가하였다. 또한, 이렇게 mRNA 가 증가하고 있는 경우의 HGF 량의 증가는 미녹시딜 무처리에서 mRNA 량이 적은 경우와 비교하여 매우 현저한 것이었다. 이로부터, 푸코이단 Bf, F-rich 푸코이단, 7-12SFd-F 은 mRNA 이 적은 경우는 적은대로 HGF 의 유리와 생산을 촉진하고, 또한, mRNA 이 대량으로 존재하여 대량의 HGF 가 필요해지고 있는 경우는, HGF 의 유리와 생산을 현저하게 촉진시키는 것이 분명해졌다.
NHDF/푸코이단 Bf 배지 중 HGF 농도 (pg/㎖)
푸코이단 Bf(㎍/㎖) 미녹시딜 없음 미녹시딜10 ㎍/㎖ 미녹시딜100 ㎍/㎖
0 N.D. 126.04 148.83
0.1 300.20 307.00 478.90
1 428.83 448.17 624.60
10 791.93 799.90 794.20
100 729.33 709.97 860.23
N.D. 는 검출 한계 이하를 나타낸다.
NHDF/F-rich 푸코이단 배지 중 HGF 농도 (pg/㎖)
F-rich푸코이단(㎍/㎖) 미녹시딜없음 미녹시딜1 ㎍/㎖ 미녹시딜10 ㎍/㎖ 미녹시딜100 ㎍/㎖
0 N.D. N.D. N.D. N.D.
1 132.75 N.T. N.T. 203.03
10 316.90 239.90 310.20 434.10
100 369.33 372.70 372.70 537.87
N.D. 는 검출 한계 이하를 나타낸다. 또한, N.T. 는 평가하지 않은 것을 나타낸다.
NHDF/7-12SFd-F 배지 중 HGF 농도 (pg/㎖)
7-12SFd-F(㎍/㎖) 미녹시딜 없음 미녹시딜10 ㎍/㎖ 미녹시딜100 ㎍/㎖
0 N.D. N.D. 137.20
1 228.73 164.00 378.30
10 345.93 376.07 450.83
100 439.67 483.20 820.10
N.D. 는 검출 한계 이하를 나타낸다.
실시예 25
마우스 (CDF1 계 암컷 7 주령, 체중 : 약 20 ㎏) 에 갈락토사민 (20 ㎎/마우스) 와 LPS (리포폴리사카라이드 : 0.03 ㎍/마우스) 를 동시에 복강 내 투여하고, 극증 간염에 의한 치사 모델을 제작하여 참고예 1-(1) 기재의 푸코이단에 의한 연명 효과를 검토하였다. 푸코이단은 증류수에서 10 % 로 조정하고, 10 ㎖/㎏ 체중 (푸코이단으로서 1 g/㎏) 의 용량으로 칼락토사민과 LPS 동시 투여의 1 시간 전 및 1 시간 후의 2 회 강제 경구 투여하였다. 대조군에는 동일하게 증류수를 투여하였다.
실험 개시 72 시간 후의 생존율은 대조군에서 8 예 중 1 예, 푸코이단 투여군에서 8 예 중 7 예이고, 푸코이단 투여에 의해 현저한 연명 효과가 관찰되었다. 또한, 생존예에서의 혈청 생화학치에도 개선 효과가 관찰되었다. 그 결과를 표 87 에 나타내었다.
군 GPT (U/1) GOT (U/1) 총 빌리루빈(㎎/dl)
대조군 385 613 1.0
푸코이단 투여군 94±22 233 ±53 0.3 ±0.02
실시예 26
(1) 가고메 다시마 500 g 을 잘게 절단하고, 10 리터의 80 % 에탄올로 세정 후, 50 리터의 1 mM 염화칼륨을 함유하는 10 % 에탄올 중에서 내부 직경 40 ㎝ 용기에서 25℃ 에서 2 일간, 1 분 당 120 회전의 속도로 교반하고, 푸코이단을 추출하며, 추출물을 그물코가 32 ㎛ 인 스텐레스 철망으로 여과하여 푸코이단 용액을 조제하였다.
상기 푸코이단 용액 46 리터에 1 g 의 팜 오일 (카오샤 제조 : 화장품용) 을 1 리터의 에탄올에 용해하여 조제한, 팜 오일 용액 1 리터를 교반하면서 첨가하고, 다시 1 리터의 글리세롤을 첨가하여 화장수를 조제하였다.
(2) 실시예 26-(1) 에서 조제한 푸코이단 용액에 최종농도가 0.02 % 가 되도록 젤라틴 및 향료를 첨가하여 젤라틴 사용의 화장수를 얻었다. 또한, 동일하게 콜라겐을 첨가하여 콜라겐 사용의 화장수를 얻었다.
기탁된 생물 재료
(1) 기탁 기관의 명칭ㆍ수신처
통상 산업성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소
일본국 쯔꾸바시 히가시 1 초메 1 반 3 고 (우편번호 305)
(2) 기탁된 미생물
(i) 알테로모나스 (Alteromonas) 종 SN-1009
원 기탁일 : 1996 년 2 월 13 일
국제 기탁으로의 이관 청구일 : 1996 년 11 월 15 일
수탁 번호 : FERM BP-5747
(ⅱ) 플라보박테리움 (Flavobacterium) 종 SA-0082
원 기탁일 : 1995 년 3 월 29 일
국제 기탁으로의 이관 청구일 : 1996 년 2 월 15 일
수탁 번호 : FERM BP-5402
본 발명에 의해 성장 인자 생산 유도 활성을 나타내는 물질을 유효 성분으로서 함유하는 성장 인자 생산을 요하는 질환에 유효한 의약이 제공된다. 상기 의약은 생체 내에서의 HGF 생산 유도 활성, h-IGF 생산 유도 활성, NGFㆍ신경 영양 인자 생산 유도 활성 등을 갖고, 간염, 당뇨병, 암, 신경성 질환 등의 이들 성장 인자의 생산을 필요로 하는 질환의 치료제 또는 예방제로서 유용하다.
또한, 성장 인자 생산 유도 작용을 갖는 산성 다당, 황산화 다당, 예컨대 푸코이단, 덱스트란 황산나트륨, 콘드로이친 황산 고함유 상어 연골 추출물, 이들의 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당 및 이들의 염으로부터 선택되는 것을 사용하여음식품을 제조하는 것이 가능해지고, 일상의 음식품으로서 섭취함으로써, 성장 인자의 생산을 요하는 질환의 증상 개선 등이 가능해진다. 또한, 동일한 생리 기능을 갖는 사료가 제공된다.
따라서, HGF 생산 유도 작용을 갖는, 본 발명에서 사용하는 산성 다당, 황산화 푸코오스 함유 다당, 예컨대 푸코이단, 이들의 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당 및 이들의 염으로부터 선택되는 것을 유효 성분으로 하는 기능성 음식품, 기능성 사료는, 그 성장 인자 생산 유도 작용에 의해 생체의 항상성의 유지에 유용한 기능성 음식품, 또는 사료이다.
본 발명에 의해 HGF 생산 유도용 바이오 화장료도 제공되고, 이들은 피부의 건강 관리 등에 매우 유용하다. 또한, 암 전이 억제제도 제공된다.
또한, 성장 인자의 생산 유도제도 제공되고, 해당 유도제는 성장 인자의 기능 연구, 성장 인자에 관련하는 질환용 의약의 스크리닝에 유용하다.

Claims (32)

  1. 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 것 (단, 헤파린, 헤파란황산은 제외함) 을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 성장인자 생산유도를 요하는 질환의 치료제 또는 예방제.
  2. 제 1 항에 있어서, 산성 다당이 황산화 다당인 치료제 또는 예방제.
  3. 제 2 항에 있어서, 황산화 다당이 조류 유래의 황산화 다당, 동물 유래의 황산화 다당, 식물 유래의 황산화 다당, 미생물 유래의 황산화 다당 또는 어류 유래의 황산화 다당인 치료제 또는 예방제.
  4. 제 2 항에 있어서, 황산화 다당이 합성 황산화 다당인 치료제 또는 예방제.
  5. 제 2 항에 있어서, 황산화 다당이 푸코이단인 치료제 또는 예방제.
  6. 제 1 항에 있어서, 산성 단당이 황산화 글루코오스, 황산화 갈락토오스, 황산화 자일로오스, 황산화 2-데옥시글루코오스, 황산화 탈로오스 또는 황산화 만노오스인 치료제 또는 예방제.
  7. 제 1 항에 있어서, 산성 올리고당이 황산화 말토오스, 황산화 락토오스, 황산화 수크로오스, 황산화 트레할로오스, 황산화 락툴로오스, 황산화 멜리비오스, 황산화 셀로비오스, 황산화 이소말토오스, 황산화 투라노오스, 황산화 팔라티노오스, 황산화 말토트리오스, 황산화 말토헥사오스, 황산화 말토헵타오스, 황산화 도데실-말토헥사오스, 하기 화학식 I 로 표시되는 화합물 및 하기 화학식 Ⅱ 로 표시되는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 황산화 올리고당인 치료제 또는 예방제:
    [화학식 I]
    (식중, R 은 OH 또는 OSO3H 이다)
    [화학식 Ⅱ]
    (식중, R 은 OH 또는 OSO3H 이다).
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 성장인자가 간세포 증식인자, 인슐린유사 증식인자 또는 신경성장인자인 치료제 또는 예방제.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 그들 염의 성장인자 생산 유도작용을 상승적으로 증가시키는 물질을 추가로 함유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 치료제 또는 예방제.
  10. 제 9 항에 있어서, 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 그들 염의 성장인자 생산 유도작용을 상승적으로 증가시키는 물질이 사이토카인류, 프로스타글란딘류 및 시클로펜텐환을 갖는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 물질인 치료제 또는 예방제.
  11. 성장인자 생산 유도작용을 갖는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜 및 이들 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 함유하여 이루어지는 성장인자 생산유도용 식품, 음료 또는 사료.
  12. 제 11 항에 있어서, 산성 다당이 황산화 다당인 식품, 음료 또는 사료.
  13. 제 12 항에 있어서, 황산화 다당이 조류 유래의 황산화 다당, 동물 유래의 황산화 다당, 식물 유래의 황산화 다당, 미생물 유래의 황산화 다당 또는 어류 유래의 황산화 다당인 식품, 음료 또는 사료.
  14. 제 12 항에 있어서, 황산화 다당이 합성 황산화 다당인 식품, 음료 또는 사료.
  15. 제 12 항에 있어서, 황산화 다당이 푸코이단인 식품, 음료 또는 사료.
  16. 제 11 항에 있어서, 산성 단당이 황산화 글루코오스, 황산화 갈락토오스, 황산화 자일로오스, 황산화 2-데옥시글루코오스, 황산화 탈로오스 또는 황산화 만노오스인 식품, 음료 또는 사료.
  17. 제 11 항에 있어서, 산성 올리고당이 황산화 말토오스, 황산화 락토오스, 황산화 수크로오스, 황산화 트레할로오스, 황산화 락툴로오스, 황산화 멜리비오스, 황산화 셀로비오스, 황산화 이소말토오스, 황산화 투라노오스, 황산화 팔라티노오스, 황산화 말토트리오스, 황산화 말토헥사오스, 황산화 말토헵타오스, 황산화 도데실-말토헥사오스, 하기 화학식 I 로 표시되는 화합물 및 하기 화학식 Ⅱ 로 표시되는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 황산화 올리고당인 식품, 음료 또는 사료:
    [화학식 I]
    (식중, R 은 OH 또는 OSO3H 이다)
    [화학식 Ⅱ]
    (식중, R 은 OH 또는 OSO3H 이다).
  18. 제 11 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 간세포 증식인자 생산유도용, 인슐린유사 증식인자 생산유도용 또는 신경 성장인자 생산유도용인 식품, 음료 또는 사료.
  19. 제 11 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 그들 염의 성장인자 생산 유도작용을 상승적으로 증가시키는 물질을 추가로 함유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 식품, 음료 또는 사료.
  20. 제 19 항에 있어서, 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 그들 염의 성장인자 생산 유도작용을 상승적으로 증가시키는 물질이사이토카인류, 프로스타글란딘류 및 시클로펜텐환을 갖는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 물질인 식품, 음료 또는 사료.
  21. 성장인자 생산 유도작용을 하는 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜 및 이들 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 함유하여 이루어지는 성장인자 생산유도용 화장료.
  22. 제 21 항에 있어서, 산성 다당이 황산화 다당인 화장료.
  23. 제 22 항에 있어서, 황산화 다당이 조류 유래의 황산화 다당, 동물 유래의 황산화 다당, 식물 유래의 황산화 다당, 미생물 유래의 황산화 다당 또는 어류 유래의 황산화 다당인 화장료.
  24. 제 22 항에 있어서, 황산화 다당이 합성 황산화 다당인 화장료.
  25. 제 22 항에 있어서, 황산화 다당이 푸코이단인 화장료.
  26. 제 21 항에 있어서, 산성 단당이 황산화 글루코오스, 황산화 갈락토오스, 황산화 자일로오스, 황산화 2-데옥시글루코오스, 황산화 탈로오스 또는 황산화 만노오스인 화장료.
  27. 제 21 항에 있어서, 산성 올리고당이 황산화 말토오스, 황산화 락토오스, 황산화 수크로오스, 황산화 트레할로오스, 황산화 락툴로오스, 황산화 멜리비오스, 황산화 셀로비오스, 황산화 이소말토오스, 황산화 투라노오스, 황산화 팔라티노오스, 황산화 말토트리오스, 황산화 말토헥사오스, 황산화 말토헵타오스, 황산화 도데실-말토헥사오스, 하기 화학식 I 로 표시되는 화합물 및 하기 화학식 Ⅱ 로 표시되는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 황산화 올리고당인 화장료:
    [화학식 I]
    (식중, R 은 OH 또는 OSO3H 이다)
    [화학식 Ⅱ]
    (식중, R 은 OH 또는 OSO3H 이다).
  28. 제 21 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 간세포 증식인자 생산유도용, 인슐린유사 증식인자 생산유도용 또는 신경 성장인자 생산유도용의 화장료.
  29. 제 21 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 그들 염의 성장인자 생산 유도작용을 상승적으로 증가시키는 물질을 추가로 함유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 화장료.
  30. 제 29 항에 있어서, 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜, 또는 그들 염의 성장인자 생산 유도작용을 상승적으로 증가시키는 물질이 사이토카인류, 프로스타글란딘류 및 시클로펜텐환을 갖는 화합물에서 선택되는 물질인 화장료.
  31. 제 21 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 로션류, 에멀젼류, 크림류, 팩류, 목욕용제, 세안제, 목욕용 비누, 또는 목욕용 세제인 화장료.
  32. 산성 다당, 그 분해물, 산성 올리고당, 산성 단당, 산성 당알콜 및 이들 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 성장인자 생산조정제.
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