CN1355703A - 治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了需要生长因子产生诱导的疾病的治疗剂或预防剂;生长因子产生诱导用食品、饮料或饲料;生长因子产生诱导用化妆品;生长因子产生调节剂,其特征在于含有选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇及其盐的物质。

Description

治疗剂
技术领域
本发明涉及具有生理活性的酸性糖化合物作为药品、食品、饮料、饲料、或化妆品的用途。
背景技术
作为由海藻由来的酸性多糖，已知有含有绿藻类由来的硫酸鼠李聚糖(ラムナン)，红藻类由来的硫酸化半乳聚糖，褐藻类由来的硫酸化岩藻糖的多糖等硫酸化多糖。例如，岩藻依聚糖是在褐藻类、棘皮动物等中含有的含硫酸化岩藻糖的多糖，是含有硫酸化岩藻糖作为构成糖的物质。另外，鲨鱼软骨等也含有硫酸化多糖。
作为硫酸化多糖的生理作用，例如岩藻依聚糖，已知有癌增殖抑制活性，癌转移抑制活性，抗凝血活性，抗病毒活性等，因此期待其作为药物用途的开发。
作为具有肝细胞增殖因子产生诱导作用的物质，已知有肝素、硫酸乙酰肝素、平均分子量4400～5600的低分子量肝素(特开平6-312941号公报)，但是，没有关于其他的硫酸多糖，例如岩藻依聚糖、合成的硫酸化多糖等对生长因子产生有诱导作用的报告。
发明的公开
本发明发现了各种酸性糖化合物，例如酸性多糖，如岩藻依聚糖等的新的生理作用，其目的是提供利用各种酸性糖化合物，例如酸性多糖，如岩藻依聚糖等的生长因子产生诱导作用，特别是肝细胞增殖因子产生诱导作用、胰岛素样增殖因子产生诱导作用或神经生长因子产生诱导作用的药品、食品、饮料、饲料或化妆品。
如果概述本发明，本发明的第1项发明是涉及需要生长因子产生诱导的疾病的治疗剂或预防剂，其特征在于含有选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、及它们的盐的物质(条件是，肝素，硫酸乙酰肝素除外)作为有效成分。
本发明的第2项发明涉及含有选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、及它们的盐的物质形成的生长因子产生诱导用食品、饮料(以下称为饮食品)或饲料。
本发明的第3项发明涉及含有选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、及它们的盐的物质形成的生长因子产生诱导用化妆品。
本发明的第4项发明涉及含有选自酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、及它们的盐的物质形成的生长因子产生调节剂。
在本发明中，作为具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖，优选以硫酸化多糖为例，作为硫酸化多糖可适当使用藻类由来的硫酸化多糖；动物由来的硫酸化多糖，例如棘皮动物由来的硫酸化多糖，如海参由来的硫酸化多糖；鱼类由来的硫酸化多糖，例如鲨鱼软骨由来的硫酸化多糖；微生物由来的硫酸化多糖；植物由来的硫酸化多糖，例如艾蒿由来的硫酸化多糖；合成的硫酸化多糖。
另外，作为具有生长因子产生诱导作用的藻类由来的硫酸化多糖，可适当使用含有硫酸鼠李聚糖，硫酸化半乳聚糖，或硫酸化岩藻糖的多糖。作为合成的硫酸多糖可适当使用例如葡聚糖硫酸钠，硫酸化淀粉，硫酸化カ一ドラン，硫酸化果胶等，通过将硫酸化多糖进一步硫酸化得到的高硫酸化硫酸化多糖。另外，作为含有硫酸化岩藻糖的多糖可适当使用岩藻依聚糖。作为酸性寡糖优选硫酸化寡糖，可使用例如硫酸化麦芽糖，硫酸化乳糖，硫酸化蔗糖，硫酸化海藻糖，硫酸化乳果糖，硫酸化蜜二糖，硫酸化纤维二糖，硫酸化异麦芽糖，硫酸化松二糖，硫酸化パラチノ一ス，硫酸化麦芽三糖，硫酸化麦芽六糖，硫酸化麦芽七糖，硫酸化十二烷基麦芽六糖，下述式(I)所示化合物或下述式(II)所示化合物。
Figure A0080905100111
(式中R表示OH或OSO3H。)
Figure A0080905100112
(式中R表示OH或OSO3H。)
作为酸性单糖，优选硫酸化单糖，可使用例如，硫酸化葡萄糖，硫酸化半乳糖，硫酸化木糖，硫酸化2-脱氧葡萄糖，硫酸化太洛糖和硫酸化甘露糖。作为酸性糖醇可使用糖醇的硫酸化物，例如硫酸化葡糖醇。这些硫酸化寡糖、硫酸化单糖、硫酸化糖醇可用一般的合成方法制备。只要这些硫酸化寡糖、硫酸化单糖、硫酸化糖醇显示生长因子产生诱导作用，对这些糖化合物中的硫酸基位置、硫酸基数量没有特别的限制。
在本发明中也可使用有生长因子产生诱导作用的酸性多糖降解物。该降解物中也包括具有生长因子产生诱导作用的分子量4000以下的肝素降解物、硫酸乙酰肝素降解物。
前述酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇中所列举的物质可以单独使用也可以2种以上混合使用，另外，也可适当使用它们的盐。
在本发明中，作为生长因子可列举肝细胞增殖因子、胰岛素样增殖因子和神经生长因子。
在本发明的第1项发明的治疗剂或预防剂，第2项发明的食品、饮料或饲料，第3项发明的化妆品中，可进一步含有可协同增效酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇或它们的盐的生长因子产生诱导作用的物质，作为该物质可列举选自细胞因子类，前列腺素类，含有环戊烯环的化合物，米诺地尔和氯化三甲胺丁酸甲酯中的物质。
另外，本发明第2项发明的食品、饮料或饲料，优选是具有肝细胞增殖因子产生诱导作用、胰岛素样增殖因子产生诱导作用或神经生长因子产生诱导作用的食品、饮料或饲料。
另外，本发明第3项发明的化妆品，优选是具有肝细胞增殖因子产生诱导作用、胰岛素样增殖因子产生诱导作用或神经生长因子产生诱导作用的化妆品。
作为本发明第3项发明的化妆品，可列举洗剂类、乳液类、膏霜类、面膜剂，浴用剂，洗面剂，浴用皂或浴用洗涤剂等。
另外，本发明中的“选自酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、及它们的盐的物质”在本说明书中有时简称为“有效成分”。
附图的简要说明
图1是显示ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖在DEAE-CellulofineA-800柱上的洗脱曲线的图。
图2是将硫酸钠溶液作为标准试剂显示硫酸含量的检量线图。
发明实施的最佳方式
在本发明中，所谓具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖，可以是任何具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖，对此没有特别的限制，可适当使用海藻酸、果胶、果胶酸、透明质酸等酸性多糖；硫酸软骨素，硫酸角质素，硫酸皮肤素等硫酸化多糖；动物由来的硫酸化多糖，例如，棘皮动物由来的硫酸化多糖；鱼类由来的硫酸化多糖，例如鲨鱼软骨由来的硫酸化多糖；植物由来到硫酸化多糖，例如，艾蒿由来的硫酸化多糖，苦瓜由来的硫酸多糖，芦荟由来的硫酸多糖，菊叶由来的硫酸多糖；微生物由来的硫酸多糖，例如小球藻属由来的硫酸多糖，螺旋藻属由来的硫酸多糖；藻类由来的硫酸多糖等。
作为藻类由来的硫酸多糖可使用藻类由来的硫酸鼠李聚糖，红藻类由来的硫酸化半乳聚糖，例如石花菜，江篱属，巨藻，プテロクラディァカピラセァ，角叉菜胶，琼脂类，琼脂糖，琼脂胶，金属卟啉，褐藻类由来的含有硫酸化岩藻糖的多糖，例如，岩藻依聚糖，硫酸化岩藻半乳聚糖，硫酸化岩藻葡糖甘露聚糖、葡糖木糖脱氧半乳聚糖、サルガッサン、葡萄甘露半乳聚糖、木糖岩藻葡聚糖、ァスコフィラン、葡糖半乳岩藻聚糖、硫酸化葡糖岩藻聚糖等。特别是，岩藻依聚糖，硫酸化岩藻半乳聚糖，λ-角叉菜胶、硫酸软骨素B、硫酸软骨素D、海藻酸、琼脂胶等在本发明中可优选使用。另外，也可使用蓝藻类由来的酸性多糖，例如螺旋藻属由来的硫酸化多糖，绿藻类由来的酸性多糖，例如小球藻属由来的硫酸化多糖。特别是，螺旋藻属由来的硫酸化多糖通过其肝细胞增殖因子产生诱导作用对肝功能的改善是有用的，例如，可显著改善C型肝炎的症状。另外，磷酸化多糖，例如核酸也包括在本发明的酸性多糖中。
作为本发明中使用的含有硫酸化岩藻糖的多糖，优选可列举前述藻类由来的岩藻依聚糖，但是只要是有硫酸化岩藻糖作为构成成分且具有生长因子产生诱导作用的都可以，对此没有特别的限制，可使用棘皮动物，例如海参、海胆、海星等由来的岩藻依聚糖。
这些可单独或2种以上混合使用。另外，只要这些所例示酸性多糖的降解物或盐也显示生长因子诱导作用，对此没有特别的限制，也可使用这些所例示酸性多糖的降解物或盐。
这些酸性多糖可分别使用公知的方法制备，纯化物或该酸性多糖含有物均可在本发明中使用。作为酸性多糖含有物优选使用硫酸化多糖部分，作为该部分优选使用藻类由来的硫酸化多糖部分、鲨鱼软骨由来的硫酸化多糖部分。另外，作为硫酸化多糖含有物的原料藻类，可使用海参、鲨鱼软骨等。例如，ガゴメ昆布、昆布、トロロ昆布、墨角藻、海蕴属、冲绳岛海蕴属、裙带菜属、鹅掌菜、爱胜蚓属、昆布属、巨藻属(レッソニァニグレセンス)、岩衣藻等昆布目、索藻目、岩藻目等海藻由于大量含有本发明中优选使用的岩藻依聚糖，因此，作为原料是优选的。
作为在本发明中使用的合成的硫酸化多糖，只要是具有生长因子产生诱导作用的都可以，对此没有特别的限制，优选使用到目前为止作为药物使用的硫酸化多糖。作为该合成的硫酸化多糖可列举葡聚糖硫酸钠。该化合物是将通过Leuconostoc mesenteroides vanTieghem蔗糖发酵产生的葡聚糖的部分降解物硫酸化得到的硫酸酯的钠盐。
另外在本发明中也可使用硫酸化淀粉、硫酸化カ一ドラン、硫酸化果胶等合成的硫酸化多糖，优选使用通过进一步将硫酸化多糖硫酸化得到的高硫酸化硫酸化多糖。
对在本发明中使用的硫酸化多糖的硫酸基位置没有特别的限制，只要其显示生长因子长生诱导作用即可。构成糖的2位被硫酸化的硫酸化多糖，岩藻依聚糖，λ-角叉菜胶，硫酸软骨素D，它们的降解物可在本发明中优选使用。另外，对硫酸化多糖的硫酸含量(或硫酸基数)没有特别的限制，只要有生长因子产生诱导作用就可以。另外，酸性多糖的降解物也包括寡糖、单糖，在本发明中可使用具有2位硫酸基的寡糖、单糖，例如岩藻糖-2-硫酸，葡萄糖-2-硫酸。这些硫酸化单糖、硫酸化寡糖、硫酸化多糖可使用一般的合成方法制备，制备产物、纯化物也可用于本发明。本发明中的寡糖是指2～10个单糖形成的化合物，多糖是指11个以上的单糖形成的化合物。
例如，从ガゴメ昆布制备的岩藻依聚糖，该岩藻依聚糖可分离为含有葡糖醛酸的岩藻依聚糖(U-岩藻依聚糖)和不含葡糖醛酸的岩藻依聚糖(F-岩藻依聚糖)，作为本发明的有效成分可分别使用这些岩藻依聚糖。另外，可从ガゴメ昆布制备硫酸化岩藻半乳聚糖并使用。
另外，可从琼脂制备琼脂胶并使用。
U-岩藻依聚糖和F-岩藻依聚糖可从ガゴメ昆布制备岩藻依聚糖后，用阴离子交换树脂、表面活性剂等分离。ガゴメ昆布由来的U-岩藻依聚糖和F-岩藻依聚糖的存在比为约1∶2，U-岩藻依聚糖含有岩藻糖、甘露糖、半乳糖、葡糖醛酸等，硫酸含量为约20％，F-岩藻依聚糖含有岩藻糖和半乳糖，硫酸含量为约50％，两物质的分子量都以20万为中心分布(第18次糖专题论文集摘要集，159页，1996年)。
例如可将从ガゴメ昆布制备的岩藻依聚糖溶液应用于DEAE-Cellulofine A-800柱后，通过使用含有NaCl的缓冲液的浓度梯度法洗脱，分离U-岩藻依聚糖和F-岩藻依聚糖。图1中显示一个例子。即，图1是表示U-岩藻依聚糖和F-岩藻依聚糖的分离图，图中，前面的峰是U-岩藻依聚糖，后面的峰是F-岩藻依聚糖。
另外，例如石芪菜由来的硫酸化多糖，江篱属由来的硫酸化多糖，プテロクラディァ由来的硫酸化多糖，其它藻类由来的硫酸化多糖，墨角藻由来的岩藻依聚糖，海蕴属由来的岩藻依聚糖，冲绳岛海蕴属由来的岩藻依聚糖，裙带菜属由来的岩藻依聚糖，巨藻属由来的岩藻依聚糖，岩衣藻由来的岩藻依聚糖，其它藻类由来的岩藻依聚糖也可分别用公知的方法制备，并在本发明中使用。
作为含有岩藻依聚糖的海参，有例如特开平4-91027号公报中记载的海参，也可用该公报中记载的方法从海参制备岩藻依聚糖。
另外，本发明的具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖降解物，例如硫酸化多糖、岩藻依聚糖的降解物，可用酶学方法、化学方法、物理方法等公知的方法制备，选择所需的具有生长因子产生诱导作用的降解物，并使用。
另外，降解物是指将作为降解对象的酸性多糖降解得到的分子量优选在约10万～200，更优选约3万～1000范围的物质。
作为在本发明使用的酸性多糖降解物的优选制备方法是酸降解法，可通过将该酸性多糖酸降解制备具有生长因子产生诱导作用的降解物。
对于本发明使用的酸性多糖的酸降解条件没有特别的限制，只要可生成具有生长因子产生诱导作用的降解物即可。
例如，将酸性多糖溶解或悬浮于酸性水溶液等中，通过反应生成本发明的降解物。另外，可通过在反应时，加热缩短生成本发明降解物所需的时间。
对于将酸性多糖溶解或悬浮的酸的种类没有特别的限制，可使用盐酸、硫酸、硝酸等无机盐，柠檬酸，甲酸，乙酸，乳酸，抗坏血酸等有机酸，或阳离子交换树脂、阳离子交换纤维、阳离子交换膜等固体酸。
对于酸的浓度没有特别的限制，可在优选0.0001～5当量，更优选0.01～1当量左右的浓度使用。另外，对于反应温度也没有特定的限制，可设定在优选0～200℃，更优选20～130℃。
另外，对于反应时间也没有特别的限制，可设定在优选数秒～数天。酸的种类和浓度、反应温度和反应时间可根据本发明中使用的降解物的生成量、降解物的聚合度进行适当选择。例如，在制备岩藻依聚糖的降解物时，可使柠檬酸、乳酸、苹果酸等有机酸，在酸浓度10mM～数M，加热温度50～110℃，优选70～95℃，加热时间在数分～24小时的范围进行适当选择，可制造本发明的降解物。作为岩藻依聚糖的酸降解物可列举ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖的酸降解物，该降解物可作为具有强的生长因子产生诱导作用，特别是肝细胞增殖因子产生诱导作用的新生理功能的食物纤维使用。
本发明的降解物可将生长因子产生诱导作用作为指标进行分级，例如，可将酸降解物用凝胶过滤法、分子量分级膜等分级法进行分子量分级。
作为凝胶过滤法的例子，可使用Cellulofine GCL-300，制备例如分子量超过25000，分子量25000～超过10000，分子量10000～超过5000，分子量5000以下等任意分子量组分；可使用CellulofineGCL-25将分子量5000以下的组分制备成例如分子量5000～超过3000，分子量3000～超过2000，分子量2000～超过1000，分子量1000～超过500，分子量500以下等任意分子量组分。
另外，可使用超滤膜在工业上进行分子量分级。例如，通过使用Daicel社制的FE10-FUS0382，可制备分子量30000以下的组分，使用相同公司制的FE-FUS-T653，可制备分子量6000以下的组分。另外，可使用纳米膜得到分子量500以下的组分，通过将这些凝胶过滤法、分子量分级法组合，可制备任意分子量的组分。
在本发明中可使用的具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖降解物，例如作为岩藻依聚糖的降解物可列举式(I)所示化合物、式(II)所示化合物，这些化合物可使用国际公开97/26896和99/41288号公报中记载的方法制备。另外，具有式(I)所示化合物重复构造的硫酸化多糖和寡糖也可作为本发明的具有生长因子产生诱导作用的硫酸化多糖使用。
通过将前述F-岩藻依聚糖用交替单孢菌属SN-1009(FERM BP-5747)产生的末端型硫酸化多糖降解酶(F-岩藻依聚糖特异性降解酶)处理，纯化其降解物，可得到式(I)所示的化合物。关于该化合物中硫酸基的含量、部位，可从其降解物中纯化任意物质。另外，当该降解物中含有式(I)所示化合物的聚合物时，可根据需要进行分离、纯化。
通过将前述U-岩藻依聚糖用黄杆菌属SA-0082(FERM BP-5402)产生的末端型硫酸化多糖降解酶(U-岩藻依聚糖特异性降解酶)处理，纯化其降解物，可得到式(II)所示的化合物。关于该化合物中硫酸基的含量、部位，可从其降解物中纯化任意物质。另外，当该降解物中含有式(II)所示化合物作为基本骨架结构的聚合物时，可根据需要进行分离、纯化。
作为式(I)所示化合物的例子有后述式(VI)所示化合物。另外，作为式(II)所示化合物的例子有后述式(VII)所示化合物。
另外，可将ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖在有机酸存在下通过加热处理得到葡糖醛酸和甘露糖的聚合物，该聚合物也可作为本发明的具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖使用。另外可通过调整加热条件、加热时间制备任意聚合度的聚合体。
作为在本发明中具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖，包括合成的硫酸化多糖，可使用纤维素、淀粉、甘露聚糖、木聚糖、海藻酸、果胶、果胶酸、果聚糖、阿拉伯聚糖、壳聚糖、茁霉多糖、木糖葡聚糖、葡聚糖、淀粉等的硫酸化物。另外，还可使用例如硫酸呋喃核聚糖、硫酸呋喃木聚糖、硫酸蘑菇多糖、カ一ドラン硫酸、硫酸吡喃甘露聚糖等合成的硫酸化多糖或具有十六烷酰基的硫酸呋喃木聚糖等合成的硫酸化烷基多糖。可通过将硫酸化多糖或其降解物进一步硫酸化制备高硫酸化的硫酸化多糖或高硫酸化降解物。这些的硫酸化多糖、高硫酸化的硫酸化多糖、高硫酸化降解物可分别用公知的方法制备，其降解物也可用公知的方法制备，并在本发明中使用。另外，可使用市售的硫酸葡聚糖、硫酸化纤维素，也可使用这些合成的硫酸化多糖等的盐。
作为酸性寡糖，优选可列举硫酸化寡糖，另外，作为酸性单糖，优选可列举硫酸化单糖，它们的具体例子可列举与前述相同的物质。硫酸化寡糖或硫酸化单糖，可使用相应的寡糖、单糖作为原料，用公知的方法进行硫酸化制备。另外，也可使用它们的盐。另外，硫酸化多糖、硫酸化寡糖、硫酸化单糖的脂肪酸衍生物等也包括在本发明的硫酸化多糖、硫酸化寡糖、硫酸化单糖中。这些可单独或2种以上混合使用。
在本发明中所希望诱导产生的生长因子是指具有促进细胞成长活性的因子，对此没有特别的限制，可列举肝细胞增殖因子(HGF)、神经生长因子(NGF)、神经营养性因子、上皮生长因子、牛奶由来的生长因子、成纤维细胞生长因子、脑由来的成纤维细胞生长因子，酸性成纤维细胞生长因子、血小板由来的生长因子、血小板碱性蛋白、结缔组织活化肽，胰岛素样增殖因子(IGF)，菌落形成刺激因子，红细胞生成素、血拴形成素、T细胞生长因子、白介素类(例如白介素2、3、4、5、7、9、11、15)，B细胞生长因子，软骨由来的因子，软骨由来的生长因子，骨由来的生长因子，骨胳生长因子，内皮细胞生长因子，内皮细胞由来的生长因子，眼由来的生长因子，睾丸由来的生长因子，塞尔托利氏细胞由来的生长因子，乳腺刺激因子，脊髓由来的生长因子，巨噬细胞由来的生长因子，再生中胚层生长因子，转化增殖因子-α，转化增殖因子-β，肝素结合性EGF样增殖因子，ァンフィレグリン，SDGF、β-动物纤维素、表皮调节蛋白(ェピレグリン)、神经调节蛋白1，2，3、血管内皮增殖因子、神经营养蛋白、BDNF、NT-3、NT-4、NT-5、NT-6、NT-7、神经胶质细胞系由来的神经营养性因子，干细胞因子、midkine、pleiotrophin、ephrin、血管生成素、苯丙酸诺龙、肿瘤坏死因子、干扰素等。
其中，从肝病的预防、治疗，神经性疾病的预防、治疗，糖尿病的预防、治疗的观点考虑，优选使用选自HGF、NGF、IGF的至少一种在本发明中作为有效成分产生诱导。
HGF显示肝细胞增殖作用，蛋白合成促进作用，胆汁阻滞改善作用，以及预防药物引起的肾病的作用等。另外，HGF的mRNA也在脑、肾脏、肺等合成，它是对肝细胞、肾小管细胞、表皮细胞等具有增殖活性的中胚层细胞生长因子。因此，通过诱导肝细胞增殖因子的产生，可进行肝炎、重症肝炎、暴发性肝炎、肝硬化和肝内胆汁阻滞、慢性肾炎、肺炎、创伤的治疗或预防。
IGF在各种细胞中具有各种生理作用。通过诱导IGF的产生，可进行II-型糖尿病(非胰岛素依赖性)或成长障碍(矮小症)的治疗或预防。
NGF是维持神经细胞的生存或机能，根据NGF的浓度梯度可将神经细胞伸长的内因性生长因子，通过诱导NGF的产生，可进行阿耳茨海默氏病等老年痴呆症或末梢神经障碍、脑血管障碍、脑瘤、脑根尖炎、头部外伤变性疾病、麻醉药物中毒引起的需要神经机能修复再生的治疗或预防。另外，本发明的治疗剂或预防剂显示神经营养性因子的产生诱导作用，进一步通过本发明的治疗剂或预防剂对NGF神经营养性因子的产生诱导作用，其在肌肉萎缩性侧索硬化、药物障碍性末梢神经障碍，糖尿病性末梢神经障碍，阿尔海默氏病、帕金森氏病、感觉神经障碍、色素性视网膜炎、黄斑变性疾病等的治疗、预防中是有用的。
本发明中使用的酸性多糖，其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇，或它们的盐具有生长因子产生诱导作用，可以将这些化合物作为有效成分制造需要生长因子产生的疾病的治疗剂或预防剂。
本发明的需要生长因子产生诱导的疾病的治疗剂或预防剂，可将选自在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、以及它们的盐的物质作为有效成分，将其与公知的药用载体组合形成制剂。该制剂的制造一般是将选自在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、以及它们的盐的物质与药学上允许的液状或固体载体混合，且根据需要，加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等，制成片剂、颗粒剂、散剂、粉末剂、胶囊等固体制剂，常用的液剂、悬浮剂、乳剂等。另外，也可在其使用前通过添加适当的载体，不形成液体，而得到干燥品。
药用载体可根据上述剂型进行选择。口服制剂，可利用淀粉、乳糖、白糖、甘露糖醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。另外，制备口服制剂时，可进一步混合粘合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂、着色剂、香料等。
另一方面，非口服制剂，可按照常规方法，将作为本发明有效成分的选自在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇和它们的盐的物质溶解或悬浮于作为稀释剂的注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇中，根据需要加入灭菌剂、稳定剂、等渗化试剂、无痛化试剂等制备。
本发明的治疗剂或预防剂可根据剂型以适当的给药途径给药。对给药方法没有特别的限制，可内用、外用或注射使用。注射剂可通过例如静脉内、肌肉内、皮下、皮内等给药，外用剂中也包括栓剂。
作为本发明治疗剂或预防剂的给药量，可根据其剂型、给药方法、使用目的和适用该药的患者的年龄、体重、症状等适当设定，是可变的，一般制剂中所含的选自在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇和它们的盐的物质的量优选成人每日0.01～2000mg/kg。当然，由于给药量可根据前述各种条件变动，有时比上述给药量少就足够了，有时需要超过上述范围。口服给药时，本发明的治疗剂或预防剂可在所需给药范围内直接原样给药，除此之外，也可将其添加到任意的饮食品中日常摄取。也可将选自在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇和它们的盐的物质作为生长因子产生诱导用饮食品的原料使用。
接受部分肝切除的肝脏，迅速再生，回到原来的尺寸。尽管对于该肝再生因子的本质多年来并不明确，但在暴发性肝炎患者的血浆中发现了HGF，并从患者的血浆中将其分离、纯化出来(J.Clin.Invest.，88 414-419，1988)。进一步，克隆了人HGFcDNA，并明确了HGF的一级结构(Biochem.Biophys.Res.Commun.，163 967-973，1989)。另外，阐明了促进细胞运动的分散因子(SF)和作为肿瘤细胞障碍因子的肿瘤细胞毒性因子(tumor cytotoxic factr(TCF))与HGF是同一物质(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88 7001-7005，1991；Biochem.Biophys.Res.Commun.，180 1151-1158，1991)。
HGF不仅对肝细胞，而且对胆管上皮细胞、肾小管上皮细胞、胃粘膜细胞等多种上皮细胞的增殖有促进作用。另外，可诱导如在促进上皮细胞的运动性或血管形成、上皮细胞的管腔形成中所见的形态形成，HGF是显示多彩的生理活性的多功能性物质。即，在各种脏器中HGF诱导在修复脏器障碍时上皮细胞的增殖促进，运动性促进或血管形成等形态形成。
HGF显示肝细胞增殖作用，蛋白合成促进作用，胆汁阻滞改善作用，以及预防药物引起的肾病的作用等。从这些事实，可期待其作为重症肝炎、肝硬化和肝内胆汁阻滞的治疗剂。但是，HGF本身作为治疗剂还没有达到实用化的程度。尽管也试验了在遗传基因治疗中导入HGF遗传基因的方法，但由于在不需要的时间、场所作用引起的副作用，该应用离实用化还很远。这样，可以断定，如果HGF不从外部给药可任意诱导，则其在肝炎、肝硬化、肝内胆汁阻滞等需要HGF表达的疾病的治疗和预防中是有效的，到目前为止，确认了IL-1、前列腺素E1、E2、肝素等对其有诱导作用。IL-1、前列腺素E1、E2通过诱导HGF遗传因子的转录诱导HGF的产生。
另一方面，已知肝素有HGF产生诱导作用，它不诱导HGF遗传基因的转录，而是通过促进mRNA翻译之后的步骤诱导HGF的产生。即，在HGF遗传基因的转录不被诱导的状态，没有HGF产生诱导效果。相反，在HGF遗传基因的转录被诱导的状态中，发现可显著诱导HGF的产生。
另外，本发明中的有效成分不一定是直接进行HGF等生长因子转录诱导的物质，但是可推断它是在转录被诱导时，可有效促进转录，进一步可促进翻译等转录之后的阶段的物质，其结果具有所谓诱导生长因子的产生的增强作用。即，本发明中所谓的“生长因子产生诱导作用”是指，诱导生长因子产生的增强的作用，该作用可通过例如对人使用有效成分给药前后的生长因子的增强进行判断。这里。“在转录被诱导时”是指例如HGF的转录在其需要时进行，通过前述有效成分，在HGF转录被促进的初期其转录被进一步促进，之后，不过剩产生HGF，因此，HGF的生产在体内需要时被增强，通过这样可极其安全地进行HGF的产生诱导。
在本发明的治疗剂或预防剂中还可进一步含有可协同增加在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的生长因子产生诱导作用的物质。
本发明中所谓“可协同增加的物质”是指，如果将本发明的有效成分与该物质并用，通过该物质积极进行转录诱导，其结果本发明有效成分的生长因子产生诱导作用被协同增加的物质。
作为协同增加在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的生长因子产生诱导作用的物质，只要是具有可协同增加这些酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的生长因子产生诱导作用的物质都可以，对此没有特别的限制，例如可列举选自细胞因子类，前列腺素类，含有环戊烯环的化合物，米诺地尔和氯化三甲胺丁酸甲酯中的物质。另外，生姜等中含有的生姜酚、姜醇等，姜黄等中含有的姜黄色素等也是增加HGF产生诱导作用的物质，也可作为协同增加在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的HGF产生诱导作用的物质使用。
作为细胞因子类，可列举前述IL-1等，作为前列腺素类，可列举前述前列腺素E1、E2等。
另外，作为具有环戊烯环的化合物，可列举下述式(III)所代表的化合物及其衍生物。
这些可单独使用，也可2种以上混合使用。
例如，下述式(III)～(V)分别代表的具有环戊烯环的化合物与前列腺素E1、E2相同，可诱导HGF遗传基因的转录，通过与在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的协同作用，可显著增加HGF的产生。即，通过将选自细胞因子类，前列腺素类，含有环戊烯环的化合物，生姜由来的化合物，姜黄由来的化合物等具有HGF转录诱导作用的物质与选自在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐中的物质混合作为混合物并用，可得到在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐含的生长因子产生诱导作用被协同增加的，非常高的HGF产生诱导效果。
另外，也可将该混合物作为生长因子产生诱导用饮食品或饲料的原料使用。
Figure A0080905100231
Figure A0080905100233
例如，式(III)所代表的化合物的制备方法记载于国际公开第98/13328号公报中，式(IV)所代表的化合物的制备方法记载于国际公开第98/39291号公报中，式(V)所代表的化合物的制备方法记载于国际公开第98/40346号公报中，可通过这些制备方法制备这些化合物。
式(III)所代表的化合物的制备方法可以是任何方法，可使用化学合成法合成[CarbohydrateRes.，第2478卷，217～222页(1993)，Helvetica Chimica Acta，第55卷，2838～2844页(1972)]。另外，可使用至少一种选自糖醛酸、糖醛酸衍生物、含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖化合物，含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖化合物的含有物中的物质，将其加热处理中生成的环戊烯酮、或其纯化物。式(IV)所示化合物例如可通过使式(III)所示化合物与谷胱甘肽反应得到。另外，式(V)所示化合物可通过使式(III)所示化合物与丙酸酐反应得到。
在本发明的治疗剂或预防剂中，协同增加在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的生长因子产生诱导作用的物质的含有量只要是可协同增加该诱导作用的程度就可以，对此没有特别的限制，通常为成人每天优选0.001～2000mg/kg的量。协同增加该诱导作用的物质可以与选自在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质合并进行制剂化，也可分别进行制剂化。制剂化的方法、给药方式可按照本说明书中记载的方法进行，并因此可获得本发明所期望的生长因子产生诱导被协同增加的效果。
在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐还具有乙酰肝素酶(ヘパラナ一ゼ)抑制活性，癌转移抑制活性、血管生成抑制活性。因此，将选自这些物质的物质作为有效成分可制造、提供癌转移抑制剂、血管生成抑制剂。特别是岩藻依聚糖由来的式(I)所示化合物具有很强的乙酰肝素酶抑制作用和癌转移抑制作用，含有该化合物作为有效成分的药物组合物作为癌转移抑制剂是极其有用的。另外，含有该化合物形成的饮食品作为抑制癌转移用、抑制血管生成用饮食品是非常有价值的。
含有具有生长因子产生诱导作用的，选自在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质形成的生长因子产生诱导用食品、饮料或饲料通过其生长因子产生诱导作用，在改善、预防对在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐显示感受性的需要生长因子产生诱导的疾病的症状或后述的改善生物的身体条件中是极其有用的。
另外，本发明的食品、饮料或饲料，或后述化妆品中所说的“含有”包括含有、添加、稀释的意思。含有是指食品、饮料或饲料中含有本发明的有效成分的状态，添加是指向食品、饮料或饲料的原料中添加本发明的有效成分的状态，稀释是指在本发明使用的有效成分中添加食品、饮料或饲料的原料状态。
另外，进一步含有协同增加生长因子产生诱导作用的前述物质，例如，选自细胞因子类、前列腺素类、具有环戊烯环的化合物的物质，从有助于改善、预防前述疾病或改善身体条件的观点考虑是优选的。
另外，在本发明的饮食品中，前述有效成分、生长因子、或可协同增加生长因子产生诱导作用的物质的优选状态与前述治疗剂或预防剂的情况相同。特别是作为本发明的饮食品或饲料，从改善肝病、改善神经性疾病、改善糖尿病的观点看，优选是肝细胞增殖因子产生诱导用、胰岛素样增殖因子产生诱导用、或神经生长因子长生诱导用饮食品或饲料。
本发明的食品或饮料的制造方法只要是可得到具有生长因子产生诱导作用的该食品或饮料即可，对此没有特别的限制。例如，配合、调理、加工等可按照一般食品中使用的方法，通过这些食品或饮料的制备方法可制备本发明的食品或饮料，所制备的食品或饮料中可含有具有生长因子产生诱导作用的选自在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质作为有效成分。
对本发明的食品或饮料没有特别的限制，可列举例如谷物加工品(小麦粉加工品、淀粉类加工品、预混合加工品、面条类、通心面类、面包类、馅类、荞麦面类、麸、米粉、粉条、包装饼等)，油脂加工品(可塑性油脂、油炸食品油、色拉油、蛋黄酱类、调味品等)，大豆加工品(豆腐、豆浆、发酵大豆等)，肉类加工品(火腿、熏猪肉、压制火腿、香肠等)，水产制品(冷冻磨碎的鱼肉、鱼糕、烤鱼卷、鱼肉山芋方形蒸饼、油炸鱼丸子、汆鱼丸子、筋、鱼肉火腿、香肠、木鱼、鱼子加工品、水产罐头、用条料煮的鱼、贝一类的小菜等)，乳制品(原料奶、乳酪、酸乳酪、黄油、干酪、炼乳、粉乳、冰淇凌等)，蔬菜、果实加工品(糊类、酱类、腌制物类、果汁饮料、蔬菜饮料、混合饮料等)，糖果类(巧克力、饼干类、带馅面包、蛋糕、米粉点心、米饼类等)，酒精饮料(日本酒、中国酒、葡萄酒、威士忌酒、日本烧酒、伏特加酒、白兰地酒、杜松子酒、朗姆酒、啤酒、清凉酒精饮料、果汁酒、利口酒等)，嗜好饮料(绿茶、红茶、乌龙茶、咖啡、清凉饮料、乳酸饮料等)，调味料(酱油、沙司，醋、甜米酒等)，罐装·瓶装·袋装食品(牛肉饭、釜饭、红豆饭、咖哩饭、其它各种调理好的食品)，半干或浓缩食品(猪肝酱、涂抹食品、荞麦面·面条的汁、浓缩汤类)、，干燥食品(方便面、速食咖哩饭、速溶咖啡、果汁粉、汤粉、速食酱汁、调理好的食品、调理好的饮料、调理好的汤等)，冷冻食品(日本火锅、鸡蛋羹、烤鳗鱼、汉堡牛肉饼、烧麦、饺子、各种冰棍、水果鸡尾酒等)，固体食品，液体食品(汤等)，香料等农业·林业加工品，畜牧业加工品，水产加工品等。
作为本发明的食品或饮料，含有选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质，只要含有表达其生理功能所需的量即可，对其形状没有特别的限制，包括药片状、颗粒状、胶囊等经口服可摄取的形状。另外，具有生长因子产生诱导作用的藻类由来的硫酸化多糖及其降解物，例如岩藻依聚糖及其降解物，作为同时具有该生理作用和食物纤维功能的健康食品的原料、食品或饮料的制造原料是极其有用的。
对于本发明的食品或饮料中选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质(有效成分)在食品或饮料中的含量没有特别的限制，可从功能和生理活性上进行适当选择，但是有效成分的含量，例如，每100重量份食品含有10-9重量份以上，优选10-7～2重量份，例如，每100重量份饮料含有10-9重量份以上，优选10-7～2重量份。
另外，成人每天最好摄取有效成分达到0.01～2000mg/kg，这样可达到本发明所希望的经口服进行生长因子产生诱导的效果。
另外，本发明还提供了含有选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质形成的生物用饲料。
并进一步提供了生物的饲养方法，其特征在于使用该饲料喂养生物。
另外，提供了生物饲养剂，其特征在于含有选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质。
在本发明中，生物是指例如养殖动物、宠物动物等，作为养殖动物可列举家畜、试验动物、家禽、鱼类、甲壳纲动物或贝类动物。
作为饲料可列举基于生长因子产生诱导作用的改善身体状况用的饲料。
作为生物饲养剂可列举浸渍剂、饲料添加剂、饮料添加剂。
在本发明中，选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质具有提高生物饲养效率，例如生存率、肥育率、产卵率、产子率、断奶率等效果。
选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质，通常对于对象生物1kg体重每天给与0.01～2000mg，可在人工混合饲料的原料中混合添加，也可与人工混合饲料的粉末原料混合后，再添加到其它原料中混合添加。
对于选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质在最终得到的对象生物用饲料中的含量没有特别的限制，可根据目的适当使用，在0.001～15重量％的比例是合适的。例如，以改善肝功能为目的时，0.01～10重量％的比例是合适的。
作为人工混合饲料，可列举鱼粉、酪蛋白、鱿鱼肉等动物性原料，大豆粕、小麦粉、淀粉等植物性原料、饲料用酵母等微生物原料，鳕鱼肝油、鱿鱼肝油等动物性油脂，大豆油、菜籽油等植物性油脂，维生素类，矿物质类，氨基酸类，抗氧化剂等作为原料的人工混合饲料。另外，可列举鱼肉切碎物等鱼类用饲料。
对于本发明饲料的制备方法没有特别的限制，另外，可按照一般的饲料混合配制，只要所制造的饲料中含有有效量的选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质即可。
另外，选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质可直接添加到池塘、水槽、贮水池或饲养领域的水、海水等中，或通过将对象生物浸渍给与。该浸渍方法在对象生物的饲料摄取量降低时特别有效。
对于水或海水中的选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质的浓度没有特别的限制，可根据目的适当使用，优选0.00001～1重量％的比例是合适的。
另外，也可将含有选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质的饮料作为饲养用饮料让对象生物摄取。
对于该饮料中的选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质的浓度没有特别的限制，可根据目的适当使用，优选0.0001～1重量％的比例是合适的。
含有选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质作为有效成分形成的生物饲养剂，例如浸渍剂、饲料添加剂、饮料添加剂可分别用公知的混合和制造方法制作。
作为在本发明中适用的生物，没有特别的限制，作为养殖生物可列举马、牛、猪、羊、山羊、骆驼、骆羊等家畜，小鼠、大鼠、天竺鼠、兔子等试验动物，鸡、鸭子、火鸡、鸵鸟等家禽，真鲷、条石鲷、牙鲆、蝶鱼、鰤鱼、黄尾笛鲷、黄条鰤、金枪鱼、大甲鯵、香鱼、鲑鱼类，红鳍圆鲀、鳗鲡、泥鳅、鲇鱼等鱼类，对虾、黑虎虾(プラックタィガ一)、对虾(タィショゥェビ)、青蟹等甲壳类等，鲍、丽口螺属、扇贝、牡蛎等贝类，作为宠物动物可列举狗、猫等，可广泛用于陆地·水中的动物。
可通过摄取含有选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质，或将对象生物浸渍于含有选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质的液体，改善家畜、试验动物、家禽、鱼类、甲壳纲动物、贝类、宠物动物等身体状况，其结果，可预防或治疗对象生物的细菌感染症、病毒感染症，并可显著改善感染动物的疾病症状。另外，可保持对象生物的健康，显著提高其生存率、成长率、产卵率、产子率、断奶率、生育率等。
另外，这些养殖动物存在(1)经常发生细菌感染引起的疾病，由于在限定的范围内养殖，一旦发生传染病，很快被感染导致全部死亡，(2)很容易发生寄生虫病、营养性疾病、环境性疾病、肿瘤等，(3)在狭窄的区域内饲养的动物压力大，会发生体表被饲养设施擦伤的情况，个体很容易被细菌或寄生虫附着，(4)另外，由于压力，食物摄取很少，成长缓慢等问题，但是本发明的饲料，通过其改善身体状况的作用，可大幅度降低在狭窄区域内饲养的动物的压力，不发生饲养设施对体表的擦伤，使食欲旺盛，可显著提高成长率、产子率、产卵率、断奶率、疾病预防率等。
具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐作为化妆品的有效成分是有用的，按照本发明，将选自在本发明中使用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质作为有效成分可提供生长因子，例如HGF产生诱导用化妆品。
另外，含有协同增加生长因子产生诱导作用的前述物质，例如，选自细胞因子类，前列腺素类，含有环戊烯环的化合物的物质，从达到所希望的效果的观点看是优选的。
另外，在本发明的化妆品中，前述有效成分、生长因子、或协同增加生长因子产生诱导作用的物质的优选状态与前述治疗剂或预防剂相同。特别是，作为本发明的化妆品，从活化上皮细胞的观点看，优选是肝细胞增殖因子产生诱导用、胰岛素样因子产生诱导用、或神经生长因子产生诱导用的化妆品。
作为该化妆品的有效成分，特别优选岩藻依聚糖及其降解物，可提供例如F-岩藻依聚糖和/或其降解物，或式(I)所示的化合物作为有效成分形成的具有生长因子产生诱导用，例如HGF产生诱导用生物化妆品。在生长因子产生诱导用化妆品中的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的含量通常为0.001～20重量％，更优选0.001～5重量％。
本发明的生长因子产生诱导用例如，HGF产生诱导用化妆品，可按照公知的混合常规方法制造，作为本发明的生长因子产生诱导用化妆品，包含例如洗剂类、乳液类、膏霜类、面膜类，浴用类，洗面类，浴用皂或浴用洗涤剂等。
本发明的化妆品分别根据其用途形态所使用的量可以是，例如洗剂时，例如对于人整个脸使用的情况，每次使用优选0.01～5g，更优选0.1～2g左右，由于可活化上皮细胞，因此可得到本发明所谓美肤效果。
本发明还提供了含有选自酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质作为有效成分的生长因子产生诱导剂，该产生诱导剂在生长因子的功能研究、与生长因子相关疾病用药物的筛选是有用的。
另外，本发明还提供了含有选自酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的物质作为有效成分的生长因子产生调节剂。
本发明的生长因子产生诱导剂、生长因子产生调节剂使用上述有效成分，可用公知的制剂化法制备制剂。作为生长因子产生诱导剂，可列举上述治疗剂等作为其一个例子。另外，本发明的生长因子产生调节剂是指在生物体内，在生长因子转录诱导的初期促进生长因子转录的制剂。通过本发明的生长因子产生调节剂具有只在需要生长因子产生的状态增强生长因子的产生，而不会使生长因子的产生过剩的显著效果。
在本发明中使用的岩藻依聚糖和/或其降解物具有特别强的生长因子产生诱导作用、生长因子产生调节作用，作为在本发明的制剂中使用的有效成分是极其有用的。
以前已知具有HGF产生诱导作用的肝素不促进HGF的mRNA的转录，但是岩藻依聚糖及其降解物在HGF的mRNA转录被促进的初期阶段，进一步促进其mRNA的转录。在生物体内，平常不进行HGF的mRNA的转录，在必要时才转录。岩藻依聚糖及其降解物，例如后述的7～12SFd-F，只在生物体内HGF的转录被促进的初期进一步促进其转录，之后不会过剩生产HGF，HGF的生产状况只有在体内需要时才被促进，从这一点看，是极其安全的HGF产生调节物质。
因此，在本发明的其它方案中，前述治疗剂或预防剂、饮食品等可直接用于调节生长因子产生诱导的目的。作为生长因子产生调节剂的给药量，只要可调节生长因子的产生即可，对此没有特别的限制，但在本发明中该有效成分的给药量，可列举例如对于人的有效成分的给药量为优选0.01～2000mg/kg(体重)。
另外，使用在本发明中使用的具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖，例如岩藻依聚糖和/或其降解物对于大鼠即使以1g/kg口服单次给药，也没有发现死亡的例子。另外，葡聚糖硫酸钠也是安全的化合物。另外，在本发明中使用的其它酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐，用其生理有效量对大鼠口服给药，都没有发现毒性。
另外，作为另一方案，在本发明提供了需要生长因子产生诱导的疾病的治疗剂或预防剂，它是将选自艾蒿萃取物、苦瓜萃取物、芦荟萃取物、茼蒿萃取物、小球藻属萃取物和螺旋藻属萃取物的具有生长因子产生诱导作用的萃取物作为有效成分形成的。
另外，提供了含有选自艾蒿萃取物、苦瓜萃取物、芦荟萃取物、茼蒿萃取物、小球藻属萃取物和螺旋藻属萃取物的具有生长因子产生诱导作用的萃取物作为有效成分的生长因子产生诱导用饮食品、或饲料。
另外，提供了含有选自艾蒿萃取物、苦瓜萃取物、芦荟萃取物、茼蒿萃取物、小球藻属萃取物和螺旋藻属萃取物的具有生长因子产生诱导作用的萃取物作为有效成分的生长因子产生诱导用化妆品。
从这些植物、微生物萃取出的前述萃取物的纯化可用以下公知的方法进行。在适当的时期采集作为原料植物的果实、种子、叶、茎、根、根茎等，或微生物，直接或进行空气干燥等干燥步骤后，形成萃取原料。原料为植物的榨汁液或树液时，可直接作为萃取原料使用。
从上述干燥动植物体、微生物萃取出含有前述有效成分的萃取物可按照以下的公知方法进行。将原料粉碎或切细后，用溶剂使用批量式或连续式萃取方法进行。作为萃取溶剂，可使用水、氯仿或乙醇、甲醇、异丙醇等醇类、丙酮、甲乙酮等酮类，乙酸甲酯、乙酸乙酯等亲水性或亲油性的溶剂，可单独使用或以混合液使用。萃取温度通常为0～150℃，优选在5～120℃进行。
以批量式进行时，萃取时间为10分钟～20天左右，通常溶剂使用量相当于原料的1～30倍重量，优选2～20倍重量。萃取操作可以是通过搅拌或通过浸渍放置，或组合使用。萃取操作可根据需要反复2～3次。作为连续萃取法可列举使用将回流冷却器和虹吸管组合形成的索格斯利特萃取器的方法，溶剂量、萃取时间等与前述批量式萃取方法的条件相同。
本发明使用的萃取物中含有在前期操作中得到的粗萃取液中通过过滤或离心分离除去的残渣。另外不溶性残渣被做为活性残渣使用的场合也有。
从粗萃取液中纯化活性成分可使用公知的从植物提取活性成分的纯化方法，优选使用两相溶剂分离法、柱色谱法等，可单独使用或组合使用。
将所得萃取物作为有效成分，根据目的可制造药物、饮食品、饲料和化妆品等。其制造方法可按照本发明的第1～第3项发明中所述的前述方法进行。
根据各目的制品中萃取物的含有量可根据其生长因子产生诱导作用进行决定，在通常的制品中，优选0.001～100重量％，更优选0.01～30重量，进一步优选0.1～20重量％。
另外，本发明中使用的这些萃取物，以其有效量对大鼠给药，没有发现毒性。
下面，列举实施例，对本发明进行更具体地说明，但是本发明并不限于这些实施例。另外，实施例中各成分的混合中的％是重量％。参考例1
(1)将ガゴメ昆布充分干燥后，干燥物20kg用自由粉碎机(奈良机械制作所制)粉碎。
在自来水900升中溶解氯化钙二水合物(日本曹达社制)7.3kg，然后混合ガゴメ昆布粉碎物20kg。通过吹入水蒸气使液温由12℃升温至90℃加热40分钟，然后在搅拌下在90～95℃保温1小时，冷却，得到冷却物1100升。
用固液分离装置(West Farrier Separator社制CNA型)将冷却物进行固液分离，制备约900升的固液分离上清液。
将固液分离上清液360升用DAICEL社制的FE10-FC-FUS0382(分级分子量3万)浓缩至20升。加入自来水20升，然后再浓缩至20升，反复该操作5次，进行脱盐处理，得到ガゴメ昆布由来的提取液25升。
将该提取液1升进行冷冻干燥，得到ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖干燥物13g。
按照上述方法从昆布干燥粉碎物制备昆布由来的岩藻依聚糖干燥物。且同样，从巨藻属(Lessonia nigrescence)的干燥粉末(商品名Seaweed Powder：Andesu贸易株式会社出售)制备巨藻属由来的岩藻依聚糖干燥物。
(2)将参考例1-(1)记载的岩藻依聚糖干燥物7g溶解于含有50mM氯化钠和10％乙醇的20mM咪唑缓冲液(pH8.0)700ml中，通过离心分离除去不溶物。将DEAE-Cellulofine A-800柱(φll.4cm×48cm)用相同的缓冲液平衡化，将离心分离后的上清液加到柱子上，用同种缓冲液洗涤，用50mM到1.95M浓度梯度的氯化钠洗脱(1个馏分：250ml)。用苯酚硫酸法和咔唑硫酸法，求出总糖量和糖醛酸含量，洗脱依次得到馏分43～49，馏分50～55，馏分56～67的组分。接着，将这些组份通过电透析脱盐后冷冻干燥，分别从馏分43～49制备出组分I(340mg)，从馏分50～55制备出组分II(870mg)，从馏分56～67制备出组分III(2.64g)。
在图1中显示ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖的DEAE-Cellulofine A-800柱洗脱曲线。在图1中，纵轴是用咔唑硫酸法在530nm的吸光度(图中黑点)，用苯酚硫酸法在480nm的吸光度(图中白点)和电导率(mS/cm：图中白色方块)，横轴是馏分序号。参考例2
(1)将交替单胞菌属SN-1009(FERM BP-5747)接种于注入了含有葡萄糖0.25％，胨1.0％，酵母提取物0.05％的人工海水(JamarinLaboratory社制)pH8.2形成的培养基600ml并灭菌(120℃，20分钟)的2升三角烧瓶中，在25℃培养26小时作为种培养液。将含有胨1.0％，酵母提取物0.02％，下述参考例2-(2)中记载的硫酸化多糖0.2％和消泡剂(信越化学工业社制KM70)0.01％的人工海水pH8.0形成的培养基20升放入容积30升的发酵缸中，在120℃杀菌20分钟。冷却后，将上述种培养液600ml接种，在24℃，每分钟10升的通气量和每分钟250转的搅拌速度下培养24小时。培养完成后，将培养液离心分离，得到菌体和培养上清液。将所得培养上清液通过装备有排除分子量1万的空心纤维的超滤机浓缩后，用85％的饱和硫酸铵盐析，通过离心分离收集生成的沉淀，用含有1/10浓度的人工海水的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.2)进行充分透析，制备600ml对硫酸化多糖具有选择性作用的末端型硫酸化多糖降解酶液。
(2)将干燥的ガゴメ昆布2kg用装备有直径1mm的滤网的切割磨机(增幸产业社制)粉碎，将所得昆布片悬浮于20升80％乙醇中，在25℃搅拌3小时，用滤纸过滤后，将残渣充分洗净。将所得残渣悬浮于加热至95℃的40升含50mM氯化钠的20mM磷酸钠缓冲液pH6.5中，间歇搅拌的同时在95℃处理2小时，萃取出硫酸化多糖。
将萃取液中的悬浮物过滤，制备滤液后，过滤残渣用3.5升100mM氯化钠洗净，进一步得到滤液。
将两滤液合并后，降温至30℃，添加3000U的海藻酸裂解酶(Nagase生化学工业社制)之后，加入乙醇4升，在25℃搅拌24小时。接着，进行离心分离，所得上清液通过装备有排除分子量10万的空心纤维的超滤机浓缩至4升后，进一步用含有10％乙醇的100mM氯化钠连续超滤至着色性物质不再被滤出。
非过滤液中生成的沉淀通过离心分离除去，将该上清液降温至5℃，用0.5N盐酸调至pH2.0后，用离心分离除去生成的蛋白质等沉淀，所得上清液迅速用1N氢氧化钠调至pH8.0。
接着，通过装备有排除分子量10万的空心纤维的超滤机进行超滤，用20mM氯化钠pH8.0完全置换溶剂后，再次调至pH8.0，离心分离后，进行冷冻干燥，得到约95g的硫酸化多糖。
(3)将干燥的ガゴメ昆布2kg用装备有直径1mm的滤网的切割磨机粉碎，将所得昆布片悬浮于20升80％乙醇中，在25℃搅拌3小时，用滤纸过滤后，将残渣充分洗净。将所得残渣悬浮于含有上述参考例2-(1)制备的末端型硫酸化多糖降解酶液30ml、10％乙醇、100mM氯化钠、50mM氯化钙和50mM咪唑的20升缓冲液(pH8.2)中，在25℃搅拌48小时。将该悬浮液用网目直径32μm的不锈钢金属丝网过滤，残渣用含有50mM氯化钙的10％乙醇洗净。再将残渣悬浮于10升含50mM氯化钙的10％乙醇中，搅拌3小时后，用不锈钢金属丝网过滤，洗净。进一步将残渣在同样条件下悬浮后，搅拌16小时，用直径32μm的不锈钢金属丝网过滤，洗净。
收集如此得到的滤液和洗涤液，通过装备有排除分子量3000的空心纤维的超滤机超滤，分离为滤液和非滤液。
将该滤液用旋转蒸发器浓缩至约3升后，离心分离得到上清液。所得上清液通过装备有排除分子量300的膜的电透析器脱盐，向该溶液中加入醋酸钙使之达到0.1M，通过离心分离除去生成的沉淀。将上清液加到预先用50mM的醋酸钙平衡化的DEAE-Cellulofine(树脂量4升)柱上，用50mM醋酸钙和50mM氯化钠充分洗净后，用50mM～800mM的氯化钠梯度洗脱。此时以分馏量每瓶500ml进行。用纤维素醋酸酯膜电泳法[Analytical Biochemistry第37卷，197～202页(1970)]分析分馏组分时，氯化钠浓度约0.4M时洗脱出的硫酸化多糖(馏分63附近)是均一的。
接着，首先将馏分63的液体浓缩至150ml，加入氯化钠使浓度达到4M，将其加到预先用4M的氯化钠平衡化的苯基-Cellulofine(树脂量200ml)柱上，用4M的氯化钠充分洗净。收集非吸附性的硫酸化糖组分，通过装备有排除分子量300的膜的电透析器脱盐，得到脱盐液505ml。
将所得脱盐液中的40ml加到含有10％乙醇的0.2M氯化钠平衡的Cellulofine GCL-900(4.1cm×87cm)柱上，进行凝胶过滤。以每个馏分9.2ml进行收集。
用苯酚硫酸法[Analytical Chemistry第28卷，350页(1956)]对全部馏分进行总糖量分析。
结果，由于硫酸化糖形成一个峰，收集该峰的中央部分馏分63～70，通过装备有排除分子量300的膜的电透析器脱盐后，冷冻干燥，得到112mg下式(VI)所示化合物的干燥品。下面，将该化合物称为7-12SFd-F。
(4)向参考例1-(2)制备的III组分(F-岩藻依聚糖)的2.5％水溶液80ml中加入1M的Tris-盐酸缓冲液(pH7.6)16ml、1M CaCl2水溶液16ml、4M NaCl水溶液24ml、参考例2-(1)得到的末端型硫酸化多糖降解酶液8ml、蒸馏水176ml，在30℃加热3小时。将该酶处理的F-岩藻依聚糖溶液用旋转蒸发器浓缩至F-岩藻依聚糖的最终浓度为2％，然后在蒸馏水中进行透析操作，制备2％酶处理的F-岩藻依聚糖水溶液。将该试验材料用HPLC(柱：SB802.5，柱温：35℃，流动相：50mM NaCl，流速L0.5ml/min，检测；RI ATT＝8)进行分析。结果，该试验材料中有约40％的7-12SFd-F。参考例3
(1)将干燥的ガゴメ昆布2kg用装备有孔径1mm的滤网的切割磨机(增幸产业社制)粉碎，将所得昆布片悬浮于20升80％乙醇中，在25℃搅拌3小时，过滤后洗净。将所得残渣悬浮于含有50mM氯化钙、100mM氯化钠、10％乙醇和上述参考例2-(1)制备的交替单胞菌属SN-1009(FERM BP-5747)末端型硫酸化多糖降解酶1U的20升30mM咪唑缓冲液(pH8.2)中，在25℃搅拌2天。然后，用孔径32μm的不锈钢金属丝网过滤，洗净。将所得残渣悬浮于含有100mM氯化钠、10％乙醇和4g海藻酸裂解酶(Nagase生化学工业社制)的40升磷酸钠缓冲液(pH6.6)中，在25℃搅拌4天后，离心分离得到上清液。为除去所得上清液中含有的海藻酸低分子量产物，通过装备有排除分子量10万的空心纤维的超滤机浓缩至2升后，用含有10％乙醇的100mM氯化钠进行溶液交换。向该溶液中加入等量的400mM醋酸钙搅拌后，离心分离，所得上清液用冰冷却的同时，用1N盐酸调至pH2。离心分离除去生成的沉淀，所得上清液用1N的氢氧化钠调至pH8.0。将该溶液超滤浓缩至1升后，用100mM氯化钠进行溶液交换。通过离心分离除去此时生成的沉淀。为除去所得上清液中的疏水性物质，向上清液中加入氯化钠使之达到1M，将其加到用1M氯化钠平衡的3升苯基Cellulofine柱(生化学工业制)，收集流出的组分。将该组分用超滤机浓缩后，用20mM的氯化钠进行溶液交换，冷冻干燥。冷冻干燥物的重量为29.3g。
(2)将上述冷冻干燥物15g溶解于含有400mM氯化钠和培养国际公开97/26896号说明书中记载的黄杆菌属SA-0082(FERM BP-5402)，从该培养物得到的末端型硫酸化多糖降解酶9U的1.5升50mMTris-盐酸缓冲液中，在25℃反应6天后，用蒸发器浓缩至约300ml。将浓缩液放入排除分子量3500的透析管中彻底透析，将透析管内残存的液体加到用50mM氯化钠平衡化的4升DEAE-Cellulofine A-800柱中，用50mM氯化钠充分洗净后，用50～650mM的氯化钠进行浓度梯度洗脱。进一步将该柱用650mM的氯化钠充分洗脱。将洗脱出的组分中用650mM的氯化钠洗脱的组分作为硫酸化岩藻半乳聚糖组分收集，用排除分子量10万的超滤机浓缩后，用10mM的氯化钠进行溶液置换，冷冻干燥，得到硫酸化岩藻半乳聚糖的冷冻干燥物0.85g。所得硫酸化岩藻半乳聚糖的糖构成含有半乳糖和岩藻糖，其摩尔比为约2∶1。参考例4
将参考例2-(2)制备的硫酸化多糖120g悬浮于含有20mM氯化钙、300mM氯化钠、10％乙醇和10U参考例2-(1)制备的末端型硫酸化多糖降解酶的8升20mM咪唑缓冲液(PH7.5)中，在25℃搅拌3天，使用装备有排除分子量10万的空心纤维的超滤机，添加上述缓冲液的同时进行超滤。
向超滤液中加入34U参考例3-(2)制备的末端型硫酸化多糖降解酶，在25℃搅拌2天，通过装备有排除分子量10万的空心纤维的超滤机进行超滤，在加水的同时进行超滤。
收集滤液，用蒸发器浓缩至1.5升后，用脱盐装置完全脱盐，加入到预先用含有30mM氯化钠的5mM咪唑-盐酸缓冲液(PH6.5)平衡化的3升DEAE-Cellulofine A-800柱上，用6升同样的缓冲液洗净后，用30mM～500mM的氯化钠通过浓度梯度进行洗脱。洗脱所需液量为48升。将洗脱液按每瓶180ml分取，通过苯酚～硫酸法测定其含糖量。同时测定在232nm的吸光度。由于用130mM～170mM的氯化钠洗脱出的组分形成一个峰，因此，收集该组分，用脱盐装置脱盐后，冷冻干燥，得到5.85g的寡糖。该寡糖的质量分析显示分子量为1128，NMR分析确认其是下式(VII)所示的化合物。下面，将该化合物称为6-2S。
Figure A0080905100381
参考例6
将市售的裙带菜干燥物1kg用装备有孔径1mm的滤网的切割磨机破碎后，悬浮于10升80％的乙醇中，搅拌3小时后，用滤纸过滤，得到残渣。将残渣悬浮于含有50mM氯化钠的40mM磷酸缓冲液(PH6.5)20升中，在95℃处理2小时。将处理液冷却至37℃后，加入乙醇使之达到10％，加入市售的海藻酸裂解酶K(Nagase生化学工业社制)12000U后，在室温搅拌24小时。将所得处理液离心分离，将上清液通过装备有排除分子量10万的空心纤维的超滤机浓缩至2升后，通过离心分离除去生成的沉淀。将所得上清液冷却至5℃后，加入0.5N的盐酸调至PH2.0，之后搅拌30分钟，通过离心分离除去生成的沉淀。用0.5N的氢氧化钠将上清液的PH调至8.0，通过超滤将溶液置换为20mM的氯化钠。将溶液的PH调至8.0后，离心分离，将所得上清液冷冻干燥，得到90.5g裙带菜由来的岩藻依聚糖。参考例7
将粉碎的墨角藻(Fucus vesiculousus)的干燥物1kg悬浮于10升80％乙醇中，搅拌3小时后，用滤纸过滤，得到残渣。将残渣悬浮于含有100mM氯化钠的30mM磷酸缓冲液(PH6.0)30升中，在95℃处理2小时。将处理液冷却至37℃后，加入100g活性炭搅拌30分钟。加入市售的海藻酸裂解酶K 3000U后，加入乙醇使之达到10％，在室温搅拌24小时。将所得处理液离心分离，将上清液通过装备有排除分子量10万的空心纤维的超滤机浓缩至2升后，通过离心分离除去生成的沉淀。向该上清液中加入萃取液的同时进行超滤，除去色素。将所得非滤液冷却至5℃后，加入0.5N的盐酸调至PH2.0，之后搅拌30分钟，通过离心分离除去生成的沉淀。用0.5N的氢氧化钠将上清液的PH调至8.0，通过超滤将溶液置换为20mM的氯化钠。将溶液的PH调至8.0后，离心分离，将所得上清液冷冻干燥，得到71g墨角藻由来的岩藻依聚糖。
按照上述方法，从岩衣藻(Ascophyllum nodosum)的干燥物粉末(商品名Algin Gold：Andesu贸易株式会社销售)制备岩衣藻由来的岩藻依聚糖。参考例8
将按照参考例1-(1)记载的方法制备的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖2g溶解于100ml水中，用柠檬酸调至pH3后，在100℃处理3小时，调制该岩藻依聚糖的酸降解物。将该水降解物用CellulofineGCL-300或Cellulofine GCL-25凝胶过滤，分级分子量，分级为分子量超过25000(A组分)，25000～超过10000(B组分)，10000～超过5000(C组分)，5000～超过2000(D组分)，2000～超过500(E组分)，500以下(F组分)。进一步将这些组分和酸降解物分别脱盐后进行冷冻干燥，制备酸降解物和酸降解物的各分级物。参考例9
将市售的盐藏海蕴属5kg与20升乙醇混合，用剪刀剪断。放置1晚后用滤纸过滤，将所得残渣悬浮于12.5升水中，在95℃处理2小时。将处理液用滤纸过滤后，添加含有350mM氯化钠的2.5％的氯化十六烷基吡啶鎓溶液2600ml，放置3天。废弃上清液，将沉淀部分离心分离，废弃上清液。向所得沉淀中加入2.5升350mM的氯化钠后，用匀化器匀化，离心分离。重复该洗涤操作3次。向所得沉淀中加入400ml的400mM氯化钠后，用匀化器匀化，加入乙醇使之达到80％，搅拌30分钟后用滤纸过滤。向所得残渣中加入500ml的饱和氯化钠80％乙醇溶液，之后，用匀化器匀化，加入饱和氯化钠乙醇溶液使之达到1升，搅拌30分钟后用滤纸过滤。反复该洗涤操作直到滤液在260nm的吸光度达到0为止(通常为5次)。将所得残渣溶解于1.5升2M的氯化钠溶液中后，离心分离除去不溶物，使其流出预先用2M的氯化钠平衡化的100mlDEAE Cellulofine A-800柱。将流出的组分通过装备有排除分子量10万的空心纤维的超滤机浓缩至2升后，通过超滤将溶液置换为2mM氯化钠。将该溶液离心分离，将所得上清液冷冻干燥，得到22.9g海蕴属由来的岩藻依聚糖。参考例10
(1)将干燥的石花菜50g用剪刀剪断，将其悬浮于500ml的80％乙醇中后在25℃搅拌3小时，用滤纸过滤。将所得残渣悬浮于1升含有100mM氯化钠的30mM磷酸钠缓冲液(PH6.5)中，在95℃处理2小时后，用孔径106μm的不锈钢制滤网过滤。向所得滤液中加入上述磷酸缓冲液，达到3升，加入5g活性炭，在25℃搅拌一夜后，离心分离。所得上清液通过装备有排除分子量10万的空心纤维的超滤机浓缩至200ml后，通过超滤机进行溶液交换，交换为10mM氯化钠溶液。通过离心分离除去溶液中的不溶物后，冷冻干燥，得到石花菜由来的硫酸化多糖组分2.3g。
(2)使用参考例10-(1)中记载的方法，从江篱属50g制备得到江篱属由来的硫酸化多糖4.4g。另外，同样地从ペテロクラディァキャピラセラ制备得到ペテロクラディァ由来的硫酸化多糖1.0g。
(3)-①将市售的干燥巨藻属粉末1kg悬浮于10升80％乙醇中后在25℃搅拌3小时，用滤纸过滤。将所得残渣悬浮于20升含有100mM氯化钠的30mM磷酸钠缓冲液(PH6.5)中，在95℃处理2小时后，用孔径106μm的不锈钢制滤网过滤。向所得滤液中加入100g活性炭，2.4升乙醇，6000U的海藻酸裂解酶K，在25℃搅拌22小时后，离心分离。所得上清液通过装备有排除分子量10万的空心纤维的超滤机浓缩至1.2升后，通过离心分离除去不溶物，在5℃放置24小时。通过离心分离除去生成的沉淀，所得上清液用超滤机进行溶液交换，交换为100mM氯化钠溶液。将该溶液冷却至4℃以下后，用盐酸调至PH2.0，离心分离除去生成的沉淀。用氢氧化钠将所得上清液的PH调制8.0，浓缩至2升后，用超滤机置换为20mM的氯化钠溶液。通过离心分离除去该溶液中的不溶物后，冷冻干燥，得到巨藻属由来的硫酸化多糖组分的干燥物41g。
(3)-②将上述冷冻干燥物6g溶解于含有100mM氯化钠的20mM咪唑-盐酸缓冲液(PH6)600ml中，将其加到预先用同种缓冲液平衡化的5升DEAE-Cellulofine A-800柱上，用10升同样的缓冲液洗净后，用100～1600mM氯化钠溶液进行梯度洗脱。洗脱中使用的液量为13升，以每瓶500ml进行收集。洗脱组分中，分别将用250mM、530mM和700mM附近的氯化钠洗脱组分用500ml纯水透析，冷冻干燥，将冷冻干燥产物分别命名为DEAE馏分33、DEAE馏分37、DEAE馏分40，分别得到57mg、24mg和62mg。参考例11
将海参(マナマコ)5kg解体，除去内脏，收集体壁。相对于体壁湿重200g加入500ml丙酮，用匀化器处理后过滤，将残渣用丙酮洗涤直到其上没有着色物质为止。将该残渣抽吸干燥，得到140g的干燥物。向该干燥物中加入0.4M的是盐水2.8升，在100℃处理1小时后，过滤，残渣用0.4M的食盐水充分洗净，得到萃取液3.7升。向该萃取液中加入十六烷基吡啶鎓氯化物直到不生成沉淀为止，过滤收集生成的沉淀。将该沉淀悬浮于0.4M的食盐水中之后再次离心分离，向所得沉淀中加入1升4M食盐水，用匀化器处理后，搅拌的同时加入4升乙醇，搅拌1小时后，过滤，得到沉淀。对于该沉淀，重复所谓将其悬浮于80％乙醇中后过滤的步骤直到上清液在260nm的吸光度为0。将所得沉淀悬浮于2升2M食盐水中，通过离心分离除去不溶物，上清液通过装备有排除分子量3万的膜的超滤装置超滤，完全脱盐后，冷冻干燥，得到海参由来的岩藻依聚糖3.7g。参考例12
将500mg琼脂粉末(nakelaitesque株式会社制)悬浮于100ml蒸馏水中之后，加热，使琼脂溶解。之后，冷却至45℃，在45℃保温。
向该琼脂溶液中加入X50β琼脂糖酶缓冲液(FMC社制：附属在β琼脂糖酶中)2ml，1U/μlβ琼脂糖酶(FMC社制)100μl。将该溶液在45℃保温24小时后，加入2.5倍量的乙醇，冷却后离心分离，回收沉淀。将该沉淀干燥，溶解于20ml的蒸馏水中。将该溶解液冷冻干燥，制备得到粉末状的琼脂胶组分。参考例13
(1)将螺旋藻属(Spirulina platensis)干燥菌体10g悬浮于100ml氯仿中，过滤，回收不溶组分的操作反复进行5次。之后，悬浮于100ml乙醇中，过滤，回收不溶组分的操作重复3次。从该操作得到的不溶组分中完全除去乙醇，将其悬浮于100ml的蒸馏水中。将该悬浮液在60℃保温1小时后，离心分离得到上清液。将该上清液进一步过滤，向滤液中加入2.5倍量的乙醇，在-20℃冷却后，在低温离心分离得到沉淀。将该沉淀溶解于蒸馏水中，冷冻干燥，制备得到粉末状的螺旋藻属由来的含硫酸化多糖的组分。
(2)将干燥螺旋藻属粉末(出售商：(株)螺旋藻属研究所)20g放入匀化器(日本精机社制)，加入400ml的丙酮，在8000rpm匀化10分钟。将匀化产物用滤纸过滤，得到残渣。用与前述操作相同的方式将残渣用丙酮洗涤，重复该操作3次，得到丙酮洗净的残渣。将丙酮洗净的残渣用与丙酮洗涤同样的方式，用90％乙醇洗涤4次，80％乙醇洗涤4次，得到乙醇洗净的残渣。
向乙醇洗净的残渣中加入600ml含有100mM氯化钠和10％乙醇的30mM磷酸缓冲液(pH7.0)，在室温搅拌18小时。将该混合物在10000rpm离心分离40分钟，得到上清液。将上清液中混入的不溶物用滤纸过滤，得到粗萃取物(滤液)。将所得粗萃取物通过装备有排除分子量1万的空心纤维的超滤装置浓缩至300ml后，加入2升含有10％乙醇的100mM氯化钠的同时进行超滤。之后，用含有10％乙醇和50mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)进行溶剂置换，得到240ml螺旋藻属高分子组分。
将螺旋藻属高分子组分加到被含有10％乙醇和50mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)平衡化的DEAE-Cellulofine A-800柱(φ3×14.2cm)上，用同样的缓冲液360ml将柱子洗净后，用0.05M(200ml)到2M(200ml)的氯化钠进行梯度洗脱。洗脱液以每瓶10ml分馏。洗脱出的组分中，分别将馏分No.14～30命名为螺旋藻属硫酸化多糖组分-I(SSP-I)，馏分No.69～77命名为螺旋藻属硫酸化多糖组分-II(SSP-II)，馏分No.78～83命名为螺旋藻属硫酸化多糖组分-III(SSP-III)，馏分No.84～99命名为螺旋藻属硫酸化多糖组分-IV(SSP-IV)。将SSP-I、SSP-II、SSP-III和SSP-IV分别用蒸馏水充分透析，冷冻干燥，分别得到200mg、260mg、100mg和60mg。
(3)将小球藻属(Chlorella vulgaris)的干燥菌体10g悬浮于100ml氯仿中，过滤回收不溶组分，重复该操作3次。之后，将其悬浮于100ml乙醇中，过滤，回收不溶组分，重复该操作3次。从该操作得到的不溶组分中完全除去乙醇，将其悬浮于100ml蒸馏水中。将该悬浮液在60℃保温1小时后，过滤。向滤液中添加2.5倍量的乙醇，在-20℃冷却后，在低温离心分离，得到沉淀。将该沉淀溶解于蒸馏水中，冷冻干燥，制备得到粉末状的小球藻属由来的含有硫酸化多糖的组分。
(4)将干燥小球藻属粉末(出售商：(株)Chlorella Center)20g放入匀化器(日本精机社制)，加入400ml的丙酮，在8000rpm匀化10分钟。将匀化产物用滤纸过滤，得到残渣。用与前述操作相同的方式将残渣用丙酮洗涤，重复该操作3次，得到丙酮洗净的残渣。将丙酮洗净的残渣用与丙酮洗涤同样的方式，用90％乙醇洗涤4次，80％乙醇洗涤4次，得到乙醇洗净的残渣。
向乙醇洗净的残渣中加入600ml含有100mM氯化钠和10％乙醇的30mM磷酸缓冲液(pH7.0)，在室温搅拌18小时。将该混合物在10000rpm离心分离40分钟，得到上清液。将上清液中混入的不溶物用滤纸过滤，得到粗萃取物(滤液)。将所得粗萃取物通过装备有排除分子量1万的空心纤维的超滤装置浓缩至310ml后，加入3升含有10％乙醇的100mM氯化钠的同时进行超滤。之后，用含有10％乙醇和50mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)进行溶剂置换，得到203ml小球藻属高分子组分。
将小球藻属高分子组分加到被含有10％乙醇和50mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)平衡化的DEAE-Cellulofine A-800柱(φ3×14.2cm)上，用同样的缓冲液297ml将柱子洗净后，用0.05M(200ml)到2M(200ml)的氯化钠进行梯度洗脱。洗脱液以每瓶10ml分馏。洗脱出的组分中，分别将馏分No.63～68命名为小球藻属硫酸化多糖组分-I(CPS-I)，馏分No.69～75命名为小球藻属硫酸化多糖组分-II(CPS-II)。将CPS-I和CPS-II分别用蒸馏水充分透析，冷冻干燥，分别得到140mg和200mg。
(5)将市售的艾蒿(Altemisia princeps pampan：阪本汉方堂制)粉碎后的艾蒿粉末10g悬浮于100ml氯仿中，过滤回收不溶组分，重复该操作3次。之后，将其悬浮于100ml乙醇中，过滤，回收不溶组分，重复该操作5次。从该操作得到的不溶组分中完全除去乙醇，将其悬浮于100ml蒸馏水中。将该悬浮液在60℃保温1小时后，过滤。向滤液中添加2.5倍量的乙醇，在-20℃冷却后，在低温离心分离，得到沉淀和艾蒿上清液组分。将该沉淀溶解于蒸馏水中，冷冻干燥，制备得到粉末状的艾蒿由来的含有硫酸化多糖的组分。
(6)将干燥艾蒿叶(出售商：阪本汉方堂)50g放入匀化器(日本精机社制)，加入500ml的丙酮，在8000rpm匀化10分钟。将匀化产物用滤纸过滤，得到残渣。重复上述操作2次，将所得100g艾蒿叶残渣放入匀化器，加入500ml的丙酮，在8000rpm匀化10分钟。将匀化产物用滤纸过滤，得到残渣。重复该操作4次，得到丙酮洗净的残渣。将丙酮洗净的残渣用与丙酮洗涤同样的方式，用90％乙醇洗涤4次，80％乙醇洗涤4次，得到乙醇洗净的残渣。
向乙醇洗净的残渣中加入5升含有100mM氯化钠和10％乙醇的30mM磷酸缓冲液(pH8.0)，在室温搅拌19小时。将该混合物用滤纸过滤，得到粗萃取物(滤液)。将所得粗萃取物通过装备有排除分子量1万的空心纤维的超滤装置浓缩至2升后，加入10升含有10％乙醇的100mM氯化钠的同时进行超滤。之后，浓缩至500ml，用含有10％乙醇和50mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)进行溶剂置换，将该液体移入烧杯中，加入1g活性炭，在室温搅拌40分钟后，在10000rpm离心分离40分钟。将上清液中混入的活性炭用滤纸过滤，除去。这样，得到艾蒿叶高分子组分560ml。
将艾蒿叶高分子组分加到被含有10％乙醇和50mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)平衡化的DEAE-Cellulofine A-800柱(φ3.5×31cm)上，用同样的缓冲液940ml将柱子洗净后，用0.05M(600ml)到2M(600ml)的氯化钠进行梯度洗脱。洗脱液以每瓶10ml分馏。洗脱出的组分中，分别将馏分No.180～202命名为艾蒿叶酸性多糖组分(YAP)，馏分No.203～270命名为艾蒿叶硫酸化多糖组分(YSP)。将YAP用蒸馏水充分透析，冷冻干燥，得到250mg。
为了将艾蒿叶硫酸化多糖组分进一步分级，将艾蒿叶硫酸化多糖组分用3升含有10％乙醇和100mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)进行透析。将透析的硫酸化多糖组分(327ml)加到用同样的缓冲液平衡化的DEAE-Cellulofine A-800柱(φ3×14.2cm)上。将柱子用273ml的缓冲液洗净后，用0.1M(200ml)到2M(200ml)的氯化钠进行梯度洗脱。洗脱液以每瓶5ml分馏。洗脱出的组分中，分别将馏分No.140～154命名为艾蒿叶硫酸化多糖组分-I(YSP-I)，馏分No.155～200命名为艾蒿叶硫酸化多糖组分-II(YSP-II)。将YSP-I和YSP-II用蒸馏水充分透析，冷冻干燥，分别得到20mg和130mg。
向YSP-II(119.4mg)中加入10％乙醇59.7ml和含有0.2M氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)，在室温搅拌一夜，溶解。将YSP-II加到用同样的缓冲液平衡化的DEAE-Cellulofine A-800柱(φ2.5×10.2cm)上。将柱子用200ml的缓冲液洗净后，用0.2M(100ml)到1M(100ml)的氯化钠进行梯度洗脱。洗脱液以每瓶5ml分馏。洗脱出的组分中，分别将馏分No.54～70命名为艾蒿叶硫酸化多糖组分-II-2(YSP-II-2)，馏分No.71～90命名为艾蒿叶硫酸化多糖组分-II-3(YSP-II-3)，馏分No.91～120命名为艾蒿叶硫酸化多糖组分-II-4(YSP-II-4)。将YSP-II-2、YSP-II-3和YSP-II-4分别用蒸馏水充分透析，冷冻干燥，分别得到39.5mg、61mg和57.3mg。
(7)将市售的食用苦瓜用搅拌机粉碎得到的粉碎物冷冻干燥，得到苦瓜干燥物。将苦瓜干燥物10g悬浮于100ml氯仿中，过滤回收不溶组分，重复该操作5次。之后，将其悬浮于100ml乙醇中，过滤，回收不溶组分，重复该操作3次。从该操作得到的不溶组分中完全除去乙醇，将其悬浮于100ml蒸馏水中。将该悬浮液在60℃保温1小时后，过滤。向滤液中添加2.5倍量的乙醇，在-20℃冷却后，在低温离心分离，得到沉淀。将该沉淀溶解于蒸馏水中，冷冻干燥，制备得到粉末状的含有硫酸化多糖的组分。
(8)从5枚市售芦荟叶中回收透明状的叶肉部分，冷冻干燥。将该芦荟叶肉冷冻干燥物0.481g悬浮于100ml蒸馏水中。将该悬浮液在60℃保温1小时后，过滤。向滤液中添加2.5倍量的乙醇，在-20℃冷却后，在低温离心分离，得到沉淀。将该沉淀溶解于蒸馏水中，冷冻干燥，制备得到粉末状的芦荟叶肉由来的含有硫酸化多糖的组分。
另一方面，将用上述方法回收透明叶肉部分残留的绿色液表面部分粉碎后，冷冻干燥。将该冷冻干燥物3.43g悬浮于100ml氯仿中，过滤回收不溶组分，重复该操作3次。之后，将其悬浮于100ml乙醇中，过滤，回收不溶组分，重复该操作3次。从该操作得到的不溶组分中完全除去乙醇，将其悬浮于100ml蒸馏水中。将该悬浮液在60℃保温1小时后，过滤。向滤液中添加2.5倍量的乙醇，在-20℃冷却后，在低温离心分离，得到沉淀。将该沉淀溶解于蒸馏水中，冷冻干燥，制备得到粉末状的芦荟叶表面由来的含有硫酸化多糖的组分。参考例14
(1)将D-(+)-葡萄糖200mg(1.1mmol)溶解于吡啶10ml中，在室温加入吡啶三氧化硫复合物(Pyr·SO3：东京化成)1.05g(6.6mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。将反应液用水稀释，用饱和氢氧化钡水溶液将PH调至中性附近，然后减压干燥。向所得浓缩物中再次加入水，再次减压干燥。再重复一次该操作。向所得浓缩物中加入少量水，离心除去硫酸钡沉淀，将所得上清液加到阳离子交换柱[Amberlite IRA-120(Na+)(Organo)]上，其结果，将从柱中流出的组分减压浓缩，得到硫酸化D-(+)-葡萄糖钠盐700mg。
(2)将D-(+)-半乳糖240mg(1.3mmol)溶解于吡啶10ml中，在室温加入Pyr·SO31.05g(6.6mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化D-(+)-半乳糖钠盐406mg。
(3)将D-(+)-甘露糖200mg(1.3mmol)溶解于吡啶10ml中，在室温加入Pyr·SO31.05g(6.6mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化D-(+)-甘露糖钠盐700mg。
(4)将麦芽糖205mg(0.57mmol)溶解于吡啶10ml中，在室温加入Pyr·SO3 816mg(5.2mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化麦芽糖钠盐520mg。
(5)将麦芽三糖200mg(0.4mmol)溶解于吡啶10ml中，在室温加入Pyr·SO3700mg(4.4mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化麦芽三糖钠盐420mg。
(6)将海藻糖250mg(0.73mmol)溶解于吡啶10ml中，在室温加入Pyr·SO31.1g(7mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化海藻糖钠盐750mg。
(7)将乳糖222mg(0.62mmol)溶解于吡啶10ml中，在室温加入Pyr·SO3785mg(4.9mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化乳糖钠盐406mg。
(8)将蔗糖220mg(0.62mmol)溶解于吡啶10ml中，在室温加入Pyr·SO3785mg(4.9mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化蔗糖钠盐481mg。
(9)将乳果糖370mg(1.08mmol)溶解于吡啶10ml中，在室温加入Pyr·SO31.38g(8.8mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化乳果糖钠盐406mg。
(10)将蜜二糖379mg(0.9mmol)溶解于吡啶10ml中，在室温加入Pyr·SO3 1.43g(9.0mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化蜜二糖钠盐950mg。
(11)将D-(+)-木糖150mg(1.0mmol)溶解于吡啶10ml中，在室温加入Pyr·SO3770mg(4.8mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化D-(+)-木糖钠盐350mg。
(12)将2-脱氧葡萄糖200mg(1.2mmol)溶解于吡啶10ml中，在室温加入Pyr·SO3 920mg(5.8mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化2-脱氧葡萄糖钠盐500mg。
(13)将D-山梨醇150mg(0.83mmol)溶解于吡啶10ml中，在室温加入Pyr·SO3955mg(6mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化D-山梨醇钠盐570mg。
(14)将纤维二糖147mg(0.43mmol)溶解于二甲基亚砜5ml中，在室温加入Pyr·SO3657mg(4.13mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化纤维二糖钠盐230mg。
(15)将异麦芽糖62mg(0.18mmol)溶解于吡啶5ml中，在室温加入Pyr·SO3275mg(1.73mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化异麦芽糖钠盐162mg。
(16)将松二糖293mg(0.86mmol)溶解于吡啶5ml中，在室温加入Pyr·SO31310mg(8.22mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化松二糖钠盐835mg。
(17)将パラチノ一ス315mg(0.875mmol)溶解于吡啶5ml中，在室温加入Pyr·SO31.34g(8.4mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化パラチノ一ス钠盐845mg。
(18)将α-D-太洛糖56mg(0.31mmol)溶解于吡啶5ml中，在室温加入Pyr·SO3300mg(1.9mmol)后，在室温搅拌数分钟，在60℃搅拌1小时。下面，按照参考例14-(1)进行同样的操作，得到硫酸化D-太洛糖钠盐150mg。
(19)将全乙酰化α-环糊精7g用乙酸酐和硫酸的混合液(49∶1)处理，得到全乙酰化麦芽六糖，将其在甲醇中通过甲醇钠(NaOMe)脱乙酰化，得到麦芽六糖1.5g。将麦芽六糖79mg(0.83mmol)、哌啶硫酸1.33g溶解于二甲基亚砜(DMSO)5ml中，在80℃搅拌2小时。将反应液冷却后，用排除分子量1000的透析膜透析2天。将所得透析内液加到阳离子交换柱[Amberlite IRA-120(Na+)(Organo)]上，其结果，将从柱中流出的组分减压浓缩，得到硫酸化麦芽六糖钠盐167mg。
(20)将全乙酰化β-环糊精2.2g用乙酸酐和硫酸的混合液(49∶1)处理，得到全乙酰化麦芽七糖，将其在甲醇中通过甲醇钠(NaOMe)脱乙酰化，得到麦芽七糖0.5g。将麦芽七糖20mg(0.83mmol)、吡啶硫酸325mg溶解于DMSO 5ml中，在80℃搅拌2小时。之后，按照参考例14-(19)进行同样的操作，得到硫酸化麦芽七糖钠盐45.6mg。
(21)将全乙酰化麦芽六糖在二氯甲烷中，在三氯乙腈、碳酸钾存在下搅拌，得到乙酰化麦芽六糖的ィミデ一ト体。将乙酰化麦芽六糖的ィミデ一ト体和十二烷醇在二氯甲烷中，以三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯作为催化剂进行反应，将所得反应物脱乙酰化得到十二烷基麦芽六糖。将十二烷基麦芽六糖370mg(0.32mmol)溶解于DMSO10ml中，在80℃搅拌2小时后，下面按照参考例14-(19)进行同样的操作，得到硫酸化十二烷基麦芽六糖钠盐700mg。
(22)将淀粉276mg溶解于DMSO 10ml中，在室温加入Pyr·SO32.76g后，在80℃搅拌2小时。将反应液冷却后，加入丙酮，生成的不溶组分用甲醇洗涤数次后，用水稀释，加到阳离子交换柱[Amberlite IRA-120(Na+)(Organo)]上。其结果，将从柱中流出的组分减压浓缩，得到硫酸化淀粉钠盐350mg。
(23)将カ一ドラン111mg溶解于DMSO 5ml中，在室温加入Pyr·SO31.11g后，在80℃搅拌2小时。将反应液冷却后，加入丙酮，生成的不溶组分用水稀释，用饱和碳酸钠水溶液中和至PH中性附近后，用排除分子量1000的透析膜透析1天。将所得透析内液加到阳离子交换柱[Amberlite IRA-120(Na+)(Organo)]上后，通过减压干燥得到硫酸化カ一ドラン钠盐180mg。
(24)将果胶267mg溶解于DMSO 5ml中，在室温加入Pyr·SO32.67g后，在80℃搅拌2小时。将反应液冷却后，按照参考例14-(23)进行同样的操作，得到硫酸化果胶钠盐384mg。
实施例1
(1)含10％胎牛血清的DME培养基中悬浮的MRC-5细胞(CCL171：大日本制药社制，code.02-021)500μl加到48孔细胞培养板中，以使浓度为1×105细胞/ml，在37℃、5％CO2存在下培养24小时后，将培养基交换为含1％胎牛血清的DME培养基。之后，添加作为样品的参考例1-(1)中记载的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖，使其最终浓度分别达到1、10、100μg/ml，再培养24小时后，回收培养基，使用Quantikine人肝细胞增殖因子(HGF)ELISA试剂盒(Funakoshi社制、Code.RS-0641-00)，测定培养基中的HGF量。
作为对照，使用与样品等量的蒸馏水。对照的HGF量7.2ng/ml，将该值作为100％，各样品添加区的HGF产生量如表1所示。另外，该实验全部进行2次，取其平均值。
                  表1
 ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖(μg/ml)   HGF产生量(％)
            0110100     100214339339
添加ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖组与添加蒸馏水的对照组相比，HGF的产生量明显增加。另外，与添加肝素或低分子量肝素相比，由于HGF的产生量显著增加，因此，ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖与到目前为止被确认诱导产生HGF的肝素或平均分子量约5000的低分子量肝素相比具有更高的促进HGF产生活性。
(2)在与实施例1-(1)同样的条件下，分别测定用参考例1-(2)记载的方法制备的组分I、组分II、组分III，用参考例2记载的方法制备的7-12SFd-F、用参考例4的方法制备的6-2S、用参考例6记载的方法制备裙带菜由来的岩藻依聚糖，和用参考例7记载的方法制备的墨角藻由来的岩藻依聚糖的HGF产生诱导作用。其结果如表2～4所示。
                    表2
   样品          浓度          HGF产生量
               (μg/ml)          (％)
   组分I          1               167
                 100              234
   组分II         1               208
                 100              359
   组分III        1               146
                 100              291(对照的HGF产生量为8.3ng/ml)。
              表3
 样品                  浓度      HGF产生量
                      (μg/ml)      (％)墨角藻由来的岩藻依聚糖        1          148
                          10         246
                          100        335裙带菜由来的岩藻依聚糖        1          179
                          10         250
                          100        291
 7-12SFd-F                1          149
                          10         276
                          100        339(对照的HGF产生量为8.6ng/ml)。
                     表4
    样品                 浓度     HGF产生量
                        (μg/ml)    (％)
    6-2S                   10        112
                           100       246
(对照的HGF产生量为9.9ng/ml)。
可确认ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖的分馏物即，U-岩藻依聚糖、F-岩藻依聚糖、墨角藻由来的岩藻依聚糖、裙带菜由来的岩藻依聚糖、F-岩藻依聚糖由来的7-12SFd-F、U-岩藻依聚糖由来的6-2S分别具有强的HGF产生诱导作用。另外，可确认参考例1-(1)记载的昆布由来的岩藻依聚糖、巨藻属由来的岩藻依聚糖、参考例7记载的岩衣藻由来的岩藻依聚糖、参考例8记载的酸降解物、以及组分A～F也分别具有强的HGF产生诱导作用。
(3)-①将用参考例1-(1)记载的方法制备的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖的2％溶液用柠檬酸或硫酸调至PH3，分别在100℃加热30分钟后、1小时后、2小时后、4小时后制备它们的水解液，用与实施例1-(1)同样的条件测定其HGF产生诱导作用。另外，样品使用酸降解液的10倍稀释液。
                    表5
    样品   加热时间     HGF产生量(％)
    未降解液     448
    硫酸降解液   30分钟1小时2小时4小时     364385368345
    未降解液     480
    柠檬酸降解液   30分钟1小时2小时4小时     402429397341
(对照的HGF产生量为8.6ng/ml)。
(3)-②将实施例1-(3)-①制备的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖在柠檬酸存在下的加热4小时的处理物通过凝胶过滤分级。
即，将用TOYOPEARL HW40C 1.5升填充的柱子用水平衡化，将ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖加热处理物10ml加到该柱上，以流速1ml/分用水洗脱。最初的680ml原样流走，之后以一份14ml分馏，得到加热处理物的凝胶过滤分馏物。
将该分馏物用TLC(溶剂：乙酸丁酯∶乙酸∶水＝3∶4∶3，检测剂硫酸苔黑酚)分析，更具点滴试样，收集组分12～13、16～17、26～40等凝胶过滤组分，冷冻干燥。将所得各组分的冷冻干燥物再溶解于水，使之达到100mg/ml，用与实施例1-(1)同样的条件测定其HGF产生诱导作用。
其结果，确认组分12～13和组分16～17的各分馏物有HGF产生诱导作用。
将组分12～13的分馏物进行结构确定，其分析值与国际公开97/26896号中记载的下式(VIII)所示化合物的分析值一致，可确认葡糖醛酸和甘露糖的聚合物有HGF产生诱导活性。
Figure A0080905100541
(4)制备市售葡聚糖硫酸钠溶液(Sigma社制)，按照实施例1-(1)的方法测定其HGF产生诱导作用。如表6所示，葡聚糖硫酸钠显示HGF产生诱导作用。
                        表6
葡聚糖硫酸钠       浓度       HGF产生量
(平均分子量)     (μg/ml)       (％)
    1万              1           588
                     10          655
                     100         787
    8千              1           395
                     10          573
                     100         695
    5千              1           398
                     10          421
                     100         565
(对照的HGF产生量为6.7ng/ml)。
(5)制备市售λ-角叉菜胶的溶液(nacalaitesque社制)，按照实施例1-(1)的方法测定其HGF产生诱导作用。如表7所示，λ-角叉菜胶显示HGF产生诱导作用。
                表7
  λ-角叉菜胶       HGF产生量
    (μg/ml)          (％)
       1              152
       10             140
(对照的HGF产生量为13.4ng/ml)。
(6)-①制备市售海藻酸的溶液(和光纯药社制：膨润性)，按照实施例1-(1)的方法测定其HGF产生诱导作用。如表8所示，海藻酸显示HGF产生诱导作用。
              表8
   海藻酸          HGF产生量
  (μg/ml)           (％)
     1               125
     10              154
     100             327(对照的HGF产生量为7.3ng/ml)。
(6)-②同样地，分别研究海藻酸(膨润性、和光纯药社制：样品①)、海藻酸(非膨润性、和光纯药社制：样品②)、海藻酸(100～150cp、和光纯药社制：样品③)、海藻酸(300～400cp、和光纯药社制：样品④)、海藻酸(500～600cp、和光纯药社制：样品⑤)的HGF产生诱导活性。如表9所示，样品①～⑤全都可诱导HGF的产生。从以上可知，作为酸性多糖的海藻酸也具有HGF产生诱导活性。
                表9
  浓度                   HGF的产生量(％)
(μg/ml)    样品①    样品②    样品③    样品④    样品⑤
  10         154       138       115       127       104
  100        327       158       184       152       187(样品①、②的对照组的HGF产生量为7.3ng/ml，样品③、④、⑤的对照组的HGF产生量为6.7ng/ml)。
(6)-③同样地，研究果胶酸(nacalaitesque社制)的HGF产生诱导活性。如表10所示，果胶酸诱导HGF的产生。从以上可知，作为酸性多糖的果胶酸也具有HGF产生诱导活性。
             表10
样品       浓度      HGF产生量
         (μg/ml)      (％)果胶酸       1          145
            10         218
            100        684(对照组的HGF产生量为9.9ng/ml)。
(7)研究鲑鱼精子DNA(株式会社Nichiro社制)的HGF产生诱导活性。添加DNA使其最终浓度达到1、10、100μg/ml。如表11所示，鲑鱼精子DNA显示HGF产生诱导活性。
                  表11
样品        浓度     HGF的产生量
          (μg/ml)      (％)鲑鱼精子DNA      1          110
             10         182
             100        285(对照组的HGF产生量为9.9ng/ml)。
(8)制备参考例9、11制备得到的海蕴属由来的岩藻依聚糖溶液，按照实施例1-(1)的方法测定其HGF产生诱导作用。如表12所示，各岩藻依聚糖显示HGF产生诱导作用。
              表12样品                    浓度      HGF产生量
                  (μg/ml)      (％)海参由来的岩藻依聚糖     1          282
                     10         356
                     100        495海蕴属由来的岩藻依聚糖   1          218
                     10         279
                     100        307(对照组的HGF产生量为7.77ng/ml)。
(9)制备参考例10制备得到的石芪菜由来的硫酸化多糖(样品①)、江篱属由来的硫酸化多糖(样品②)、从ペテロクラディァ由来的硫酸化多糖(样品③)的溶液，用实施例1-(1)的同样方法研究HGF产生诱导活性。添加样品使样品①、③的最终浓度为1、10、100μg/ml，样品②的最终浓度为10、100μg/ml。如表13所示，样品①～③全部可诱导HGF产生。
                   表13
样品           浓度         HGF的产生量
             (μg/ml)          (％)
样品①          1              100
                10             177
                100            169
样品②          10             117
                100            198
样品③          1              116
                10             207
                100            228(对照组的HGF产生量为7.3ng/ml)。
(10)按照实施例1-(1)的同样方法，研究参考例10-(3)制备得到的巨藻属由来的岩藻依聚糖(样品①)、DEAE组分33(样品②)、DEAE组分37(样品③)、DEAE组分40(样品④)的HGF产生诱导活性。添加各样品达到最终浓度为1、10、100μg/ml。如表14所示，样品①～④全部可诱导HGF的产生。
                     表14
  浓度             HGF的产生量(％)(μg/ml)    样品①    样品②    样品③    样品④
  1        138       105       235       121
  10       167       221       253       254
  100      331       265       261       295(对照组的HGF产生量为11.5ng/ml)。
(11)在与实施例1-(1)同样的条件下，研究参考例3-(2)记载的硫酸化岩藻半乳聚糖、参考例12中记载的琼脂胶、硫酸软骨素B(生化学工业社制)、硫酸软骨素D(生化学工业社制)的HGF的产生诱导活性。添加各样品达到最终浓度为1、10、100μg/ml。如表15～17所示，硫酸化岩藻半乳聚糖、琼脂胶、硫酸软骨素都可诱导HGF的产生。
                    表15
  样品              浓度         HGF的产生量
                  (μg/ml)           (％)硫酸化岩藻半乳聚糖       1               194
                     10              355
                     100             429(对照组的HGF产生量为4.3ng/ml)。
                     表16
   样品             浓度         HGF的产生量
                  (μg/ml)           (％)
  琼脂胶             1               117
                     10              121
                     100             256(对照组的HGF产生量为6.7ng/ml)。
                     表17
    样品              浓度         HGF的产生量
                    (μg/ml)          (％)
硫酸软骨素B             1             117
                        10            121
                        100           256
硫酸软骨素D             10            119
                        100           114(对照组的HGF产生量为11.9ng/ml)。
(12)按照实施例1-(1)的同样方法，研究参考例13-(1)、13-(3)、13-(5)、13-(8)分别制备得到的螺旋藻属由来的硫酸化多糖、小球藻属由来的硫酸化多糖、艾蒿由来的硫酸化多糖、苦瓜有赖低硫酸化多糖、芦荟叶肉由来的硫酸化多糖、和芦荟叶表面物由来的硫酸化多糖的HGF产生诱导活性。添加螺旋藻属由来的硫酸化多糖、艾蒿由来的硫酸化多糖，使其最终浓度达到1、10、100μg/ml。添加小球藻属由来的硫酸化多糖、苦瓜由来的硫酸化多糖、芦荟叶肉由来的硫酸化多糖、芦荟叶表面物由来的硫酸化多糖，使其最终浓度达到1、10、100、1000μg/ml。如表18～20所示，螺旋藻属由来的硫酸化多糖、小球藻属由来的硫酸化多糖、艾蒿由来的硫酸化多糖、苦瓜由来的硫酸化多糖、芦荟叶肉由来的硫酸化多糖、和芦荟叶表面物由来的硫酸化多糖都可诱导HGF的产生。
                    表18
  样品     浓度(μg/ml)  HGF的产生量(％)
  螺旋藻属由来的硫酸化多糖     110100     149293398
  小球藻属由来的硫酸化多糖     1101001000     108149175396
(对照组的HGF产生量为7.9ng/ml)
                      表19
    样品               浓度         HGF的产生量
                     (μg/ml)         (％)艾蒿由来的硫酸化多糖        1             137
                        10            284
                        100           265(对照组的HGF产生量为12.7ng/ml)。
               表20
    样品             浓度      HGF的产生量
                   (μg/ml)     (％)苦瓜由来的硫酸化多糖      1          111
                      10         104
                      100        133
                      1000       190芦荟叶肉由来的硫酸化多糖  1          111
                      10         125
                      100        150
                      1000       401芦荟叶表面物由来的硫酸化  1          106
      多糖            10         125
                      100        120
                      1000       328(对照组的HGF产生量为8.7ng/ml)。
(13)按照实施例1-(1)的同样方法，研究参考例13-(2)制备得到的螺旋藻属馏分SSP-I(样品①)、SSP-II(样品②)、SSP-III(样品③)和SSP-IV(样品④)的HGF产生诱导活性。添加各样品使最终浓度达到1、10、100μg/ml。如表21所示，样品①～④全部可诱导HGF的产生。
                        表21
 浓度                HGF的产生量(％)(μg/ml)    样品①    样品②    样品③    样品④
  1         240       165       141       218
  10        243       152       270       282
  100       302       212       280       351(对照组的HGF产生量为7.3ng/ml)。
(14)按照实施例1-(1)的同样方法，研究参考例13-(4)制备得到的小球藻属萃取物CSP-I组分(样品①)、CSP-II(样品②)的HGF产生诱导活性。添加样品①使最终浓度达到10、100μg/ml。添加样品②使最终浓度达到100μg/ml。如表22所示，样品①、②全部可诱导HGF的产生。
              表22
样品        浓度     HGF的产生量
          (μg/ml)      (％)
样品①       10         111
             100        173
样品②       100        175(对照组的HGF产生量为11.4ng/ml)。
(15)按照实施例1-(1)的同样方法，研究参考例13-(6)制备得到的艾蒿萃取物组分YAP(样品①)、组分YSP-I(样品②)、组分YSP-II(样品③)、组分YSP-II-2(样品④)、组分YSP-II-3(样品⑤)、组分YSP-II-4(样品⑥)的HGF产生诱导活性。添加各样品使最终浓度达到1、10、100μg/ml。如表23、24所示，样品①～⑥全部可诱导HGF的产生。特别是可确认组分YSP-II(样品③)、组分YSP-II-3(样品④)、组分YSP-II-4(样品⑤)有强的HGF产生诱导活性。
                    表23
  样品            浓度         HGF的产生量
                (μg/ml)          (％)
  样品①           10             121
                   100            266
  样品②           1              104
                   10             148
                   100            381
  样品③           1              328
                   10             386
                   100            390(对照组的HGF产生量为11.5ng/ml)。
                  表24
  浓度           HGF的产生量(％)
(μg/ml)    样品④    样品⑤    样品⑥
  1          152       290       226
  10         462       383       322
  100        475       321       314(对照组的HGF产生量为7.7ng/ml)。
(16)按照实施例1-(1)的同样方法，研究参考例14制备得到的硫酸化麦芽糖钠盐、硫酸化麦芽三糖钠盐、硫酸化乳糖钠盐、硫酸化蔗糖钠盐、硫酸化海藻糖钠盐、硫酸化葡萄糖钠盐、硫酸化乳果糖钠盐、硫酸化蜜二糖钠盐、硫酸化半乳糖钠盐、硫酸化甘露糖钠盐、硫酸化木糖钠盐、硫酸化2-脱氧葡萄糖钠盐、硫酸化山梨醇钠盐、硫酸化纤维二糖钠盐、硫酸化异麦芽糖钠盐、硫硫酸化松二糖钠盐、硫酸化パラチノ一ス钠盐、硫酸化太洛糖钠盐、硫酸化麦芽六糖钠盐、硫酸化麦芽七糖钠盐、硫酸化十二烷基麦芽六糖钠盐、硫酸化淀粉钠盐、硫酸化カ一ドラン钠盐、硫酸化果胶钠盐的HGF产生诱导活性。添加各样品使最终浓度分别达到1、10、100μg/ml或10、100、1000μg/ml或100μg/ml。作为对照，添加等量的蒸馏水。另外，在与各硫酸化糖相同的浓度测定各非硫酸化糖的HGF产生诱导活性。
如表25～34所示，硫酸化寡糖、硫酸化单糖可诱导HGF的产生。另外，为非硫酸化的各糖不诱导HGF的产生。
另外，从硫酸化十二烷基麦芽六糖钠盐的结果可知，即使糖被脂质修饰，也保持HGF产生诱导活性。
              表25
  样品          浓度        HGF的产生量
              (μg/ml)         (％)硫酸化麦芽糖钠盐     1              142
                 10             273
                 100            439硫酸化麦芽三糖钠盐   1              151
                 10             286
                 100            387(对照组的HGF产生量为8.7ng/ml)。
                   表26
 样品            浓度         HGF的产生量
               (μg/ml)         (％)硫酸化乳糖钠盐        1             118
                  10            185
                  100           410硫酸化蔗糖钠盐        1             173
                  10            355
                  100           501硫酸化葡萄糖钠盐      1             178
                  10            377
                  100           864(对照组的HGF产生量为5.5ng/ml)。
                    表27
  样品            浓度        HGF的产生量
                (μg/ml)         (％)硫酸化海藻糖钠盐       1             277
                   10            447
                   100           421(对照组的HGF产生量为4.3ng/ml)。
                  表28
  样品            浓度       HGF的产生量
                (μg/ml)        (％)硫酸化半乳糖钠盐      100           166(对照组的HGF产生量为12.7ng/ml)。
                   表29
  样品            浓度       HGF的产生量
                (μg/ml)        (％)硫酸化甘露糖钠盐        1           112
                    10          175
                    100         456(对照组的HGF产生量为6.2ng/ml)。
                 表30
  样品           浓度      HGF的产生量
               (μg/ml)       (％)硫酸化乳果糖钠盐      10          139
                  100         376
                  1000        583硫酸化蜜二糖钠盐      10          240
                  100         403
                  1000        667硫酸化木糖钠盐        10          110
                  100         112
                  1000        284硫酸化2-脱氧葡萄糖    10          127
  钠盐            100         102
                  1000        239硫酸化山梨醇钠盐      10          112
                  100         203
                  1000        335(对照组的HGF产生量为5.9ng/ml)。
                表31
   样品          浓度        HGF的产生量
               (μg/ml)         (％)硫酸化纤维二糖钠盐    10            100
                  100           143
                  1000          546硫酸化异麦芽糖钠盐    10            134
                  100           301
                  1000          477硫酸化松二糖钠盐      10            127
                  100           203
                  1000          379硫酸化パラチノ一ス    10            132
   钠盐           100           278
                  1000          519(硫酸化纤维二糖钠盐的对照组HGF产生量为11.1ng/ml，硫酸化异麦芽糖钠盐的对照组HGF产生量为11.3ng/ml，硫酸化松二糖钠盐的对照组HGF产生量为8.6ng/ml。)
                      表32
  样品                浓度     HGF的产生量
                    (μg/ml)      (％)硫酸化太洛糖钠盐           10         112
                       100        263
                       1000       494(对照组的HGF产生量为9.5ng/ml)。
                     表33
  样品              浓度     HGF的产生量
                  (μg/ml)      (％)硫酸化麦芽六糖钠盐       10          407
                     100         571
                     1000        761硫酸化麦芽七糖钠盐       10          341
                     100         486
                     1000        706硫酸化十二烷基麦芽       10          289
 六糖钠盐            100         371
                     1000        359(对照组的HGF产生量为8.15ng/ml)。
                      表34样品                     浓度      HGF的产生量
                   (μg/ml)       (％)硫酸化淀粉钠盐            10          781
                      100         864
                      1000        804硫酸化カ一ドラン钠盐      10          359
                      100         503
                      1000        617硫酸化果胶钠盐            10          721
                      100         780
                      1000        648(对照组的HGF产生量为8.15ng/ml)。
实施例2
(1)按照实施例1-(1)的同样方法，对参考例1-(1)记载的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖和前列腺素、IL-1的HGF产生诱导作用的协同效果进行研究。
即，同时添加该岩藻依聚糖和PGE1(和光纯药社制)、IL-1α(Genzyme社制)，研究HGF产生诱导活性的协同效果。
添加岩藻依聚糖使其最终浓度达到1、10、100μg/ml。添加PGE1达到0.1、1μM，IL-1α达到1ng/ml。作为对照，添加等量的蒸馏水。
与分别添加岩藻依聚糖试样或PGE1、IL-1α时的产生量比较，研究起协同效果。
其结果如表35、36所示。在表35、36中，将对照的HGF产生量定为100％。试验全都进行两次取平均值。如表35、36所示，可确认通过与岩藻依聚糖一起同时添加PGE1或IL-1α，对HGF的产生诱导有协同作用。
                      表35岩藻依聚糖的添加量          PGE1添加量(μM)
  (μg/ml)              0       0.1      1
                           HGF的产生量(％)
     0                 100      119      157
     1                 195      334      415
     10                331      517      561
     100               382      731      682
                         表36岩藻依聚糖添加量          IL-1α添加量(ng/ml)
(μg/ml)                 0                1
                          HGF的产生量(％)
   0                    100              163
   1                    206              421
   10                   350              672
   100                  403              780(对照组的HGF产生量为9.1ng/ml)。
(2)按照实施例2-(1)的同样方法，对参考例2的7-12SFd-F和前列腺素、IL-1的HGF产生诱导作用的协同效果进行研究。即，同时添加7-12SFd-F和PGE1、IL-1α，研究HGF产生诱导活性的协同效果。添加7-12SFd-F使其最终浓度达到1、10、100μg/ml。分别向添加了7-12SFd-F的细胞进一步添加PGE1、IL-1α。添加PGE1达到0.1、1μM，IL-1α达到0.1、1ng/m1。作为反面对照，添加等量的蒸馏水。与分别添加7-12SFd-F或PGE1、IL-1α时的产生量比较，研究其协同效果。HGF的产生量将只添加蒸馏水的反面对照定为100％。其结果如表37/38所示。试验全都进行三次取平均值。
                     表37
7-12SFd-F的添加量         PGE1添加量(μM)
    (μg/m1)            0        0.1       1
                           HGF的产生量(％)
       0               100       123      170
       1               120       158      216
       10              218       309      317
       100             219       365      382(对照组的HGF产生量为5.1ng/m1)。
                        表38
7-12SFd-F的添加量       IL-1α添加量(ng/m1)
    (μg/m1)            0      0.1      1
                        HGF的产生量(％)
        0              100     130     151
        1              140     168     159
        10             191     154     208
        100            203     255     222(对照组的HGF产生量为5.1ng/m1)。
实施例3
(1)将悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM培养基的KG-1-C细胞(G1yoma：Human Science振兴财团出售)加入48孔细胞培养板，每孔500μl，达到1×105细胞/ml，在37℃、5％CO2存在下培养一夜后，用含有1％胎牛血清的DMEM培养基交换。之后，添加试样，再培养20小时，回收培养基，使用实施例1记载的HGF ELISA试剂盒，测定培养基中HGF的量。被检试样最终浓度分别是：添加参考例1-(1)记载的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖达到1、10、100μg/ml，肝素(和光纯药社制)达到1、10μg/ml。另外，作为对照，添加与试样等量的蒸馏水。试验全部进行3次，取其平均值。结果如表39所示。在表39中，对照的HGF产生量为100％。
所有添加岩藻依聚糖试样的细胞组比添加蒸馏水的对照组的HGF产生量有明显增加。另外，与添加肝素相比HGF的产生量也显著增加。由此可知，该岩藻依聚糖比到目前为止确认有HGF诱导作用的肝素显示更高的HGF产生促进活性。
                     表39
   试样               浓度       HGF的产生量
                     (μg/ml)       (％)ガゴメ昆布由来的          1           194
 岩藻依聚糖             10          285
                        100         351
  肝素钠盐              1           176
                        10          215(对照组的HGF产生量为4.4ng/ml)。
(2)将在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养的HL-60细胞(前骨髓性白血病细胞：ATCC CCL-240)悬浮于含有1％胎牛血清的RPMI1640培养基中达到浓度1×105细胞/ml，将其加入48孔细胞培养板，每孔500μl。之后，添加10nM的12-O-十四烷酰佛波醇13-醋酸酯(TPA：Gibro BRL社制)，并同时添加被检试样。添加后培养20小时后，回收培养基，使用HGF ELISA试剂盒，测定培养基中HGF的量。
被检试样最终浓度分别是：添加参考例1-(1)记载的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖达到1、10、100μg/ml。添加肝素达到1、10μg/ml。作为对照，添加与试样等量的蒸馏水。试验全部进行3次，取其平均值。结果如表40所示。在表40中，对照的HGF产生量为100％。
所有添加岩藻依聚糖试样的细胞组比添加蒸馏水的对照组的HGF产生量有明显增加。另外，与添加肝素相比HGF的产生量也显著增加。由此可知，该岩藻依聚糖比到目前为止确认有HGF诱导作用的肝素显示更高的HGF产生促进活性。
                    表40
    试样           浓度      HGF的产生量
                 (μg/ml)       (％)ガゴメ昆布由来的岩      1           191
 藻依聚糖           10          342
                    100         490
 肝素钠盐           1           140
                    10          189(对照组的HGF产生量为0.4ng/ml)。
实施例4
将悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM培养基的MRC-5细胞液加入48孔细胞培养板，每孔500μl，达到1×105细胞/ml，在37℃、5％CO2存在下培养24小时后，用含有1％胎牛血清的DMEM培养基交换。之后，添加试样，再培养24小时，回收培养基，使用HGF ELISA试剂盒，测定培养基中HGF的量。进一步，将细胞用PBS洗净后，将其溶解于500μl的细胞溶解缓冲液(50mM HEPES pH7.4、10mM EDTA、0.1％Triton X100、1mM PMSF、1μg/ml胃蛋白酶抑制剂A、1μg/ml亮肽素)。为了使其完全溶解可用超声波处理，之后离心分离制备上清液(细胞萃取液)，用与测定培养基中HGF浓度的同样方法测定细胞内的HGF量。
被检试样最终浓度分别是：添加参考例1-(1)记载的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖达到1、10、100μg/ml。作为对照，添加与试样等量的蒸馏水。试验全部进行2次，取其平均值。结果如表41所示。如表41所示，该添加岩藻依聚糖添加组的培养基中的HGF量比添加蒸馏水的对照组中的量以依赖于岩藻依聚糖浓度的方式显著增加。另一方面，细胞内的HGF量以依存于岩藻依聚糖浓度的方式减少。然后，细胞内外的总HCF量浓度依赖地增加。由此可知，该岩藻依聚糖显示促进HGF产生的活性和从细胞中促进HGF的游离运动。
                  表41ガゴメ昆布由来的岩藻           HGF产生量(ng/孔)依聚糖(μg/ml)         培养基中    细胞中    总量
 对照                  4.2        5.7      9.8
  1                    9.3        3.2      12.5
  10                   15.9       0.9      16.8
  100                  16.9       0.4      17.3
实施例5
(1)将悬浮于含有10％胎牛血清的DME培养基的MRC-5细胞液500μl加入48孔细胞培养板，达到1×105细胞/ml，在37℃、5％CO2存在下培养24小时后，用含有1％胎牛血清的DME培养基交换。之后，添加试样，培养0、0.5、1、2、4、8、12、24小时后，回收培养基，使用HGF ELISA试剂盒，测定培养基中HGF的量。添加参考例1-(1)记载的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖使最终浓度达到10μg/ml，作为对照，添加与试样等量的蒸馏水。结果如表42所示。如表42所示，岩藻依聚糖添加组比对照组以时间依存方式显著增加HGF的产生量。由此显示，岩藻依聚糖具有高的HGF产生促进活性，HGF的产生随着时间的增加而增加。
                      表42
                      培养时间(小时)
      0     0.5   1     2     4     8     12    24
                     HGF的产生量(ng/ml)对照      0.02  0.03  0.81  0.90  2.31  3.90  6.94  9.39添加岩藻  0.19  1.90  5.75  6.87  9.04  15.9  20.1  31.3依聚糖
(2)将悬浮于含有10％胎牛血清的DME培养基的MRC-5细胞(CCL171：大日本制药社制，code.02-021)500μl加入48孔细胞培养板，达到1×105细胞/ml，在37℃、5％CO2存在下培养24小时后，用含有1％胎牛血清的DMEM培养基交换。之后，添加试样，培养0、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72小时后，回收培养基，使用Quantikine人肝细胞增殖因子(HGF)ELISA试剂盒(Funakoshi社制，code.RS-0641-00)，测定培养基中HGF的量。进一步，回收培养基后，将细胞用PBS洗净后，将其溶解于500μl的细胞溶解缓冲液(50mM HEPES pH7.4、10mM EDTA、0.1％Triton X100、1mM PMSF、1μ/ml胃蛋白酶抑制剂A、1μg/ml亮肽素)。为了使其完全溶解可用超声波处理，之后离心分离制备上清液(细胞萃取液)，用与测定培养基中HGF浓度的同样方法测定细胞内的HGF量。添加参考例1-(1)记载的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖使其最终浓度达到10μg/ml。作为反面对照，添加与试样等量的蒸馏水。该岩藻依聚糖添加组的培养基中的HGF浓度比反面对照组以时间依存方式显著增加。另一方面，该岩藻依聚糖添加组的细胞内的HGF量，从添加后到4小时是减少的，但其后保持在一定的低值。在添加蒸馏水的反面对照组中，没有这样的变化，通常显示增加的倾向。由此显示，该岩藻依聚糖具有从细胞中游离HGF的效果和HGF产生促进活性，HGF的产生随着时间的增加而增加。该结果如表43～45所示。
           表43培养基中HGF量随时间的变化
      0     0.5    1     2     4     8     12    24    48    72
                    HGF的产生量(ng/孔)对照      0     0.11   0.19  0.29  1.07  1.56  2.34  3.46  7.45  10.5添加岩藻  0.51  0.46   1.23  2.86  4.00  6.70  9.15  12.4  22.8  29.3依聚糖
             表44细胞中HGF量随时间的变化
                    培养时间(小时)
      0     0.5   1     2     4     8     12    24    48    72
                 HGF的产生量(ng/孔)对照      0.51  0.52  0.66  0.56  0.71  0.63  0.86  0.73  1.02  1.20添加岩藻  0.88  0.66  0.45  0.46  0.25  0.29  0.20  0.20  0.18  0.23依聚糖表45培养基中和细胞中总HGF量随时间的变化
                     培养时间(小时)
      0     0.5   1     2     4     8     12    24    48    72
                  HGF的产生量(ng/孔)对照      0.51  0.63  0.85  0.84  1.78  2.19  3.19  4.19  8.47  11.6添加岩藻  1.39  1.12  1.68  3.31  4.25  7.00  9.35  12.6  22.9  29.5依聚糖
(3)将悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM培养基的MRC-5细胞(CCL171：大日本制药社制，code.02-021)500μl加入48孔细胞培养板，达到1×105细胞/ml，在37℃、5％CO2存在下培养24小时后，用含有1％胎牛血清的DME培养基交换。之后，添加试样，培养0、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72小时后，回收培养基，使用Quantikine人肝细胞增殖因子(HGF)ELISA试剂盒(Funakoshi社制，code.RS-0641-00)，测定培养基中HGF的量。进一步，回收培养基后，将细胞用PBS洗净后，将其溶解于500μl的细胞溶解缓冲液(50mM HEPES pH7.4、10mM EDTA、0.1％Triton X100、1mM PMSF、1μ/ml胃蛋白酶抑制剂A、1μg/ml亮肽素)。为了使其完全溶解可用超声波处理，之后离心分离制备上清液(细胞萃取液)，用与测定培养基中HGF浓度的同样方法测定细胞内的HGF量。添加7-12SFd-F使其最终浓度达到10μg/ml。作为反面对照，添加与试样等量的蒸馏水。该7-12SFd-F添加组的培养基中的HGF浓度比反面对照组以时间依存方式显著增加。另一方面，该7-12SFd-F添加组的细胞内的HGF量，添加后不久是减少的，但之后又转为增加。在添加蒸馏水的反面对照组中，没有这样的变化，通常显示一定值。由此显示，该7-12SFd-F具有从细胞中游离HGF的效果和HGF产生促进活性，HGF的产生随着时间的增加而增加。之后其保持在一定低值。该结果如表46～48所示。
表46培养基中HGF量随时间的变化
                    培养时间(小时)
     0    0.5    1     2     4     8     12    24    48    72
                   HGF的产生量(ng/孔)对照    0.14  0.33   0.36  0.63  1.29  1.60  2.54  3.89  7.99  13.3添加7-  0.48  1.82   2.16  2.53  3.12  4.01  5.84  9.82  17.0  23.512SFd-F表47细胞中HGF量随时间的变化
                   培养时间(小时)
    0     0.5   1     2     4     8     12    24    48    72
                 HGF的产生量(ng/孔)对照    2.65  3.11  2.73  2.77  2.31  2.82  2.80  4.61  5.36  6.74添加7-  2.79  1.78  1.65  1.31  1.06  1.31  1.07  1.56  2.66  3.0912SFd-F表48培养基中和细胞中总HGF量随时间的变化
                   培养时间(小时)
    0     0.5   1     2     4     8     12    24    48    72
                 HGF的产生量(ng/孔)对照    2.79  3.43  3.09  3.39  3.60  4.41  5.34  8.50  13.3  20.2添加7-  3.26  3.60  3.81  3.84  4.18  5.31  6.91  11.4  19.7  26.612SFd-F
(4)将悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM培养基的MRC-5细胞(CCL171：大日本制药社制，code.02-021)500μl加入48孔细胞培养板，达到1×105细胞/ml，在37℃、5％CO2存在下培养24小时后，用含有1％胎牛血清的DME培养基交换。之后，添加试样，培养进一步培养24小时。回收培养基，使用Quantikine人肝细胞增殖因子(HGF)ELISA试剂盒(Funakoshi社制，code.RS-0641-00)，测定培养基中HGF的量。进一步，将细胞用PBS洗净后，将其溶解于500μl的细胞溶解缓冲液(50mM HEPES pH7.4、10mM EDTA、0.1％Triton X100、1mM PMSF、1μ/ml胃蛋白酶抑制剂A、1μg/ml亮肽素)。为了使其完全溶解可用超声波处理，之后离心分离制备上清液(细胞萃取液)，用与测定培养基中HGF浓度的同样方法测定细胞内的HGF量。添加7-12SFd-F使其最终浓度达到1、10、100μg/ml。作为反面对照，添加与试样等量的蒸馏水。所有试验都进行3次取其平均值。结果如表49所示。该7-12SFd-F添加组的培养基中的HGF浓度比反面对照组以7-12SFd-F浓度依存方式显著增加。另一方面，该7-12SFd-F添加组的细胞内的HGF量以7-12SFd-F浓度依存方式减少。细胞外的总HGF量以浓度依存方式增加。由此显示，该7-12SFd-F具有从细胞中游离HGF的效果和HGF产生促进活性。该结果如表49所示。
       表49  添加7-12SFd-F时HGF的产生量
           7-12SFd-F添加量(最终浓度μg/ml)
          0        1         10       100
                  HGF的产生量(ng/孔)培养基中      5.66     8.46      17.1     22.0细胞中        6.28     6.04      4.15     1.59总量          11.9     14.5      21.3     23.6
实施例6
(1)将悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM培养基的MRC-5细胞液500μl加入48孔细胞培养板，达到1×105细胞/ml，在37℃、5％CO2存在下培养24小时后，用含有1％胎牛血清的DME培养基交换。之后，添加放线菌酮(蛋白合成抑制剂：nacalaitesque社制)，使之最终浓度达到0、1、10μg/ml，进一步添加被检试样后，培养24小时。回收培养基，使用HGF ELISA试剂盒，测定培养基中HGF的量。添加参考例1-(1)记载的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖使最终浓度达到1、10、100μg/ml。作为对照，添加与试样等量的蒸馏水。试验全部进行2次取其平均值。结果如表50所示。在表50中，对照组的HGF产生量定为100％。
如表50所示，通过添加放线菌酮，岩藻依聚糖添加组培养基中的HGF浓度以放线菌酮浓度依存方式减少。其抑制率以放线菌酮浓度依存方式抑制，与未添加岩藻依聚糖的对照组的放线菌酮引起的抑制具有相同的水平。由此可知，在岩藻依聚糖引起的HGF的产生诱导中涉及蛋白合成。
                    表50ガゴメ昆布由来      放线菌酮的添加量(μg/ml)的岩藻依聚糖         0         1        10(μg/ml)           HGF产生量与对照组之比(％)对照             100        35       27
1               226        110      72
10              317        130      110
100             456        206      127(对照组的HGF产生量为7.3ng/ml)。
(2)将悬浮于含有10％胎牛血清的DME培养基的MRC-5细胞(CCL171：大日本制药社制，code.02-021)500μl加入48孔细胞培养板，达到1×105细胞/ml，在37℃、5％CO2存在下培养24小时后，用含有1％胎牛血清的DMEM培养基交换。之后，添加放线菌酮(蛋白合成抑制剂：ナカラィテスク社制)，使之最终浓度达到0、1、10μg/ml，进一步添加被检试样后，培养24小时。回收培养基，使用Quantikine人肝细胞增殖因子(HGF)ELISA试剂盒(Funakoshi社制，code.RS-0641-00)，测定培养基中HGF的量。进一步，将细胞用PBS洗净后，将其溶解于500μl的细胞溶解缓冲液(50mM HEPESpH7.4、10mM EDTA、0.1％Triton X100、1mM PMSF、1μ/ml胃蛋白酶抑制剂A、1μg/ml亮肽素)。为了使其完全溶解可用超声波处理，之后离心分离制备上清液(细胞萃取液)，用与测定培养基中HGF浓度的同样方法测定细胞内的HGF量。HGF的产生量，将反面对照作为100％。抑制率是以只添加各浓度的7-12SFd-F时的HGF产生量为基准，算出添加放线菌酮组分的抑制率(％)。添加7-12SFd-F使其最终浓度达到1、10、100μg/ml。作为反面对照，添加与试样等量的蒸馏水。所有试验都进行3次取其平均值。其结果如表51、52所示，通过添加放线菌酮，7-12SFd-F添加组的培养基中、细胞中和培养基中的合计HGF量都以放线菌酮浓度依存方式减少。由此表明，7-12SFd-F对HGF的产生诱导，不是简单地从细胞中游离HGF，而是与蛋白合成有关。表51  HGF产生诱导的抑制(培养基中)7-12SFd-F添        放线菌酮的添加量(μg/ml)加量(μg/ml)        0          1         10
          HGF产生量：％/未添加放线菌酮时作为
                   100％的抑制率：％
   0          100/0      40/60      40/60
   1          124/0      61/51      39/69
   10         216/0      88/59      53/75
   100        265/0      117/56     74/72表52  HGF产生诱导的抑制(细胞中和培养基中合计)7-12S Fd-F添       放线菌酮的添加量(μg/ml)加量(μg/ml)         0          1        10
          HGF产生量：％/未添加放线菌酮时作为
                  100％的抑制率：％
    0          100/0      31/69     27/73
    1          104/0      31/70     25/76
    10         128/0      38/70     28/78
    100        137/0      47/66     37/73
(3)将悬浮于含有10％胎牛血清的DME培养基的MRC-5细胞(CCL171：大日本制药社制，code.02-021)500μl加入48孔细胞培养板，达到1×105细胞/ml，在37℃、5％CO2存在下培养24小时后，用含有1％胎牛血清的DMEM培养基交换。之后，添加放线菌素D(RNA合成抑制剂：Sigma社制)，使之最终浓度达到0、0.1、1μg/ml，进一步添加被检试样后，培养24小时。回收培养基，使用Quantikine人肝细胞增殖因子(HGF)ELISA试剂盒(Funakoshi社制，code.RS-0641-00)，测定培养基中HGF的量。HGF的产生量，将反面对照作为100％。抑制率是以只添加各浓度的岩藻依聚糖时的HGF产生量为基准，算出添加放线菌素D组分的抑制率(％)。添加参考例1-(1)记载的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖使其最终浓度达到1、10、100μg/ml。作为反面对照，添加与试样等量的蒸馏水。所有试验都进行2次取其平均值。其结果如表53所示，通过添加放线菌素D，该岩藻依聚糖添加组的培养基中的HGF浓度以放线菌素D浓度依存方式被抑制。由此暗示，在岩藻依聚糖引起的HGF的产生诱导中，存在与RNA合成有关的可能性，表明不是简单地从细胞中游离HGF。
                      表53ガゴメ昆布由来        放线菌素D添加量(μg/ml)的岩藻依聚糖          0          0.1        1(μg/ml)        HGF产生量：％/未添加放线菌素D时作
                      为100％的抑制率：％
 0              100/0       79/21     83/17
 1              244/0       138/43    119/51
 10             343/0       224/35    239/30
 100            492/0       341/31    285/42
(4)将悬浮于含有10％胎牛血清的DME培养基的MRC-5细胞(CCL171：大日本制药社制，code.02-021)500μl加入48孔细胞培养板，达到1×105细胞/ml，在37℃、5％CO2存在下培养24小时后，用含有1％胎牛血清的DME培养基交换。之后，添加放线菌素D(RNA合成抑制剂：Sigma社制)，使之最终浓度达到0、0.1、1μg/ml，进一步添加被检试样后，培养24小时。回收培养基，使用Quantikine人肝细胞增殖因子(HGF)ELISA试剂盒(Funakoshi社制，code.RS-0641-00)，测定培养基中HGF的量。进一步，将细胞用PBS洗净后，将其溶解于500μl的细胞溶解缓冲液(50mM HEPES pH7.4、10mM EDTA、0.1％Triton X100、1mM PMSF、1μ/ml胃蛋白酶抑制剂A、1μg/ml亮肽素)。为了使其完全溶解可用超声波处理，之后离心分离制备上清液(细胞萃取液)，用与测定培养基中HGF浓度的同样方法测定细胞内的HGF量。HGF的产生量，将反面对照作为100％。抑制率是以只添加各浓度的7-12SFd-F时的HGF产生量为基准，算出添加放线菌素D组分的抑制率(％)。添加7-12SFd-F使其最终浓度达到1、10、100μg/ml。作为反面对照，添加与试样等量的蒸馏水。所有试验都进行3次取其平均值。其结果如表54、55所示，通过添加放线菌素D，7-12SFd-F添加组的培养基中、细胞中和培养基中的合计HGF量都以放线菌素D浓度依存方式减少。由此暗示，在7-12SFd-F引起的HGF的产生诱导中，存在与RNA合成有关的可能性，表明不是简单地从细胞中游离HGF。
       表54 HGF产生诱导的抑制(培养基中)7-12SFd-F添加          放线菌素D的添加量(μg/ml)量(μg/ml)              0         0.1        1
                 HGF产生量：％/未添加放线菌素D时
                      作为100％的抑制率：％
     0            100/0      76/24      80/20
     1            130/0      95/27      96/26
     10           225/0      182/19     152/32
     100          295/0      212/28     187/48表55 HGF产生诱导的抑制(细胞中和培养基中合计)7-12SFd-F添加           放线菌素D的添加量(μg/ml)量(μg/ml)            0         0.1          1
                 HGF产生量：％/未添加放线菌素D时作为
                          100％的抑制率：％
  0              100/0      61/39       59/41
  1              98/0       64/35       61/38
  10             113/0      83/27       71/37
  100            126/0      91/28       81/36
实施例7
(1)使用7周龄的雄性Wistar大鼠，通过外科处理如下进行切除部分肝脏。即，在乙醚麻醉下，将大鼠剖腹，将根部血管用外科用缝合线结扎后切除约30％的肝脏。将切开的腹部用缝合针缝合。
切除后，立刻使用参考例1-(1)记载的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖第一次给药，以后间隔12小时腹膜内给药。在对照组内使用生理盐水腹膜内给药。
肝切除后，在第24小时或72小时，从麻醉状态下的大鼠腹大动脉采血，用0.1％的乙二胺四乙酸二钠盐将血浆离心分离。用HGFELISA试剂盒(株式会社特殊免疫研究所)测定血浆中的HGF量。
结果如表56所示。表中的数字表示平均值±标准误差，( )内表示每组中大鼠的只数。另外，表中的*表示与对照组相比在5％以下的显著水平有明显的差异。
                          表56
该药试样          给药量       血浆中HGF浓度(ng/ml)
                 (mg/kg)      24小时          72小时
生理盐水                  0.28±0.04(4)    0.30±0.02(3)
(对照组)ガゴメ昆布由来的岩     0.1    0.40±0.12(4)    0.52±0.06(5)*
藻依聚糖            1     0.65±0.18(4)    0.64±0.09(2)*
岩藻依聚糖给药组与对照组相比，在肝切除后24小时后可观察到血浆中HGF量上升的倾向，在72小时后可观察到明显的上升。
从以上可知，由于岩藻依聚糖诱导HGF的产生，因此在需要外科手术的肝病的术后促进肝迅速再生和恢复残存肝功能中是有用的。
(2)使用7周龄的雄性Wistar大鼠，通过外科处理切除部分肝脏。在乙醚麻醉下剖腹，将根部血管用外科用缝合线结扎后切除约30％的肝脏。将切开的腹部用缝合针缝合。切除后，立刻使用参考例2-(4)制备的酶处理的F-岩藻依聚糖第一次给药，以后早晚两次分开口服给药。在对照组内使用生理盐水给药。肝切除后，在第24小时后从麻醉状态下的大鼠腹大动脉采血，用0.1％的乙二胺四乙酸二钠盐将血浆离心分离。用HGF ELISA试剂盒(株式会社特殊免疫研究所)测定血浆中的HGF量。
结果如表57所示。表中的数字表示平均值±标准误差，( )内表示每组中大鼠的只数。另外，表中的*表示与对照组相比在5％以下的显著水平有明显的差异。
                        表57
                          血浆中HGF浓度(ng/ml)
   组                          24小时
生理盐水                    0.184±0.33(6)酶处理的F-岩藻依聚糖            0.505±0.97*(5)
(1g/kg/天)
酶处理的F-岩藻依聚糖给药组与对照组相比，在肝切除后24小时后可观察到明显的上升。
从以上可知，由于大量含有7-12SFd-F的F-岩藻依聚糖诱导HGF的产生，因此在需要外科手术的肝病的术后促进肝迅速再生和恢复残存肝功能中是有用的。
实施例8
将高度表达作为胰岛素样增殖因子一种的h-IGF-1的人新生儿包皮上皮细胞株Hs68细胞(ATCC CRL-1635)在含有10％胎牛血清(FBS：Bio Whittaker社制)的DMEM培养基(Gibco BRL社制)中，在5％CO2存在下，37℃培养至细胞在培养器中饱和为止，用胰蛋白酶-EDTA溶液(Bio Whittaker社制)将细胞悬浮于上述培养基使其达到3×103个/孔，分别向96孔微滴板的各孔中加入200μl。培养5～7天后，在细胞几乎将培养器饱和时除去培养基，分别向每孔中加入含有0、12.3、37、111、333、1000、或3000μg/ml的参考例1-(2)中记载的组分I、组分II、组分III、或参考例1-(1)中记载的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖的上述培养基200μl。用24小时的时间取样，回收经过1、4、12、24小时的培养上清液，用h-IGF-1ELISA试剂盒(Diagnostique社制)测定对于Hs68细胞的H-IGF产生诱导活性。结果如表58～61所示。另外，作为对照不添加试样。
               表58ガゴメ昆布由来    培养基中h-IGF-1浓度的岩藻依聚糖            (ng/ml)(μg/ml)    1小时     4小时    12小时  24小时对照      4.3       2.9      4.1     4.512.3      22.9      14.7     10.5    11.837        17.5      13.9     10.8    11.4111       14.6      13.7     10.3    7.8333       13.8      17.6     9.4     7.71000      13.9      14.7     14.6    7.53000      15.9      14.0     14.0    7.2
                 表59组分I           培养基中h-IGF-1浓度(μg/ml)                (ng/ml)
         1小时    4小时    12小时   24小时对照       6.8      5.4      5.0     5.012.3       13.9     10.5     7.6     7.337         19.0     11.7     8.3     10.1111        20.4     11.0     9.5     9.9333        18.7     12.2     10.9    10.31000       17.7     13.2     12.7    11.33000       19.0     12.1     13.1    11.7
            表60组分II         培养基中h-IGF-1浓度(μg/ml)             (ng/ml)
      1小时     4小时    12小时  24小时对照    4.3       2.9      4.1     4.512.3    18.5      10.2     6.9     7.037      20.1      9.9      9.2     9.2111     20.0      11.1     9.8     8.9333     16.3      12.7     9.7     9.21000    17.0      12.2     10.0    8.83000    17.9      11.3     10.0    7.6
           表61组分III      培养基中h-IGF-1浓度(μg/ml)            (ng/ml)
      1小时    4小时    12小时    24小时对照    4.3      2.9      4.1       4.512.3    16.5    10.9      8.5       8.637      16.7  . 10.2      11.1      8.4111     11.8    11.5      8.6       6.9333     9.6     11.2      8.0       5.91000    7.9     10.4      10.6      6.63000    7.1     9.4       9.7       6.2
如表58～61所示，ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖、组分I、组分II、和组分III显示h-IGF-1产生诱导活性。通过添加12～100μg/ml的试样，h-IGF-1产生诱导活性在第1小时显示最高值。另外，没有发现各试样对Hs68细胞的毒性、增殖抑制活性。对于参考例中记载的其它酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖以及它们的盐，也同样可确认有h-IGF-1产生诱导活性。
实施例9
将大鼠成纤维L-M细胞(ATCC CCL-1.2)悬浮于含有0.5％bactopepton(Difco社制)的M199培养基(ICN社制)，达到1.5×105细胞/ml，将其加入96孔板，每孔0.1ml，进行无菌培养。
培养3天后，除去培养基，用含有0.5％的牛血清白蛋白(Sigma社制)的M199培养基置换。向其中加入参考例1-(1)中记载的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖达到浓度0、62.5、250、1000μg/ml，培养24小时。作为对照使用添加蒸馏水的物质。培养完成后，用酶免疫分析法(NGF Emax Immuno Assay System：Promega社制)测定培养液中的NGF浓度。将对照的NGF产生量作为100％，所有试验进行2次取平均值。结果列于表62。如表62所示，ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖以浓度依存方式促进L-M细胞神经增殖因子的产生。另外，其分馏组分也显示同样的活性。另外，参考例中记载的其它酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖以及它们的盐，也同样显示NGF产生诱导活性。
                  表62试样             浓度       NGF产生量的增加
               (μg/ml)        (％)ガゴメ昆布由来       62.5          117的岩藻依聚糖        250           166
                 1000          179(对照组的NGF产生量为155pg/ml)。
用同样的方式测定参考例1-(2)中记载的组分I、组分II、组分III的促进神经增殖因子产生的活性，确认各组分有活性。其结果如表63所示。另外，参考例中记载的其它酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖以及它们的盐，也同样显示NGF产生诱导作用。
               表63
试样         浓度       NGF产生量的增加
           (μg/ml)         (％)
组分I        250            505.6
             500            619.6
             1000           806.5
组分II       250            664.5
             500            864.5
             1000           1137.4
组分III      250            1021.1
             500            1187.0
             1000           1265.0(对照组的NGF产生量为50.03pg/ml)。
实施例10
(1)从日本SLC社购入雄性C3H/He小鼠，预备饲养后用5周龄的小鼠进行试验。将参考例1-(1)制备的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖用乙醇悬浮溶解达到3％浓度，向每只小鼠的背部涂布200μl。对照组用乙醇进行同样的涂布。给药1天1次，连续进行8天。在给药开始的第9天，将皮肤剥离，用ELISA试剂盒(株式会社特殊免疫研究所)测定皮肤中的HGF活性。
结果如表64所示。表中的数字表示的是5个例子的平均值±标准误差。
在岩藻依聚糖涂布组中从皮肤中萃取的HGF活性比对照组有明显的上升，可确认涂布岩藻依聚糖有HGF产生诱导作用。
                  表64
                         皮肤中HGF活性
                          (ng/g组织)
 对照组(N＝5)             16.31±2.86岩藻依聚糖涂布组(N＝5)      104.46±4.05平均值±标准偏差
(2)将后述实施例26-(1)记载对本发明的化妆水和不含岩藻依聚糖的对照化妆水进行比较，对20～35岁的成人女性25人在她们不知情的情况下进行功能检查。其结果，有效结果和判定人数如表65所示。
                     表65
             皮肤湿润     皮肤光滑    皮肤有弹性本发明的化妆水      21           19           16对照化妆水        5            6            9
从以上结果可知，通过岩藻依聚糖的HGF产生诱导作用，混合了岩藻依聚糖的本发明的化妆水在皮肤的湿润、光滑、弹性方面都显示出优秀的效果。
实施例11
(1)将用参考例1-(2)记载的方法制备的F-岩藻依聚糖98mg溶解于DMS0 5ml中，在室温加入980mg哌啶硫酸后，在80℃搅拌2小时。将反应液冷却后，用排除分子量1000的透析膜透析2天。所得透析内液加入到阳离子交换柱[Amberlite IRA-120(Na+)]上，通过减压干燥制备F-岩藻依聚糖的高硫酸化物。
(2)将按照参考例2记载的方法制备的7-12SFd-F 34mg溶解于DMS0 4ml中，之后，按照实施例11-(1)的同样操作，制备7-12SFd-F的高硫酸化物。
(3)按照实施例1的同样方法，测定实施例11-(1)制备的F-岩藻依聚糖的高硫酸化物(试样①)、实施例11-(2)制备的7-12SFd-F的高硫酸化物(试样②)、参考例1-(2)制备的F-岩藻依聚糖(试样③)、和参考例2制备的7-12SFd-F(试样④)的HGF产生活性。添加各试样使其最终浓度分别达到1、10、100μg/ml。作为对照，添加与试样等量的蒸馏水。
其结果如表66所示，在表66中，将对照的HGF生产量作为100％。所有试验都进行2次取其平均值。如表66所示，样品①～④都诱导HGF的产生。另外，高硫酸化物的HGF产生诱导活性比未高硫酸化处理的物质高。由此可知，通过将已存在的天然硫酸化糖进一步进行硫酸化处理可增强其HGF产生诱导活性。
另外，通过将各试样的1N HCl 0.2ml(1～10mg/ml)溶液在105℃加热4小时，之后向0.1ml中加入0.1N HCl溶液1.9ml和1％氯化钡-0.5％明胶溶液0.25ml，放置20分钟后，在500nm测定吸光度进行硫酸含量的定量。检量线是将0、1、3、5、7、10、15、10mM硫酸钠的1N HCl溶液作为标准试样做成的，从这些检量线求出各试样的硫酸含量(换算为SO3)。该检量线如图2所示，各试样的硫酸含量如表67所示。
                         表66浓度                     HGF的产生量(％)(μg/ml)      试样①    试样②    试样③    试样④1            346       192       312       19210           715       214       493       229100          794       499       598       355(对照组的HGF产生量为8.15ng/ml)。
                     表67
    试样                 硫酸含量(换算为SO3，％)
 F-岩藻依聚糖                      40F-岩藻依聚糖的高硫酸化物               47
 7-12SFd-F                         407-12SFd-F的高硫酸化物                  48
实施例12
将在含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养的NHDF细胞(人正常皮肤成纤维细胞：Bio Wittaker社制)悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，达到1×105细胞/ml，将其加入48孔细胞培养板，每孔500μl，培养24小时。之后，用含有1％胎牛血清的DMEM培养基交换，之后，添加10nM的十四烷酰佛波醇13-醋酸酯(TPA：Gibco BRL社制)和试样。再培养20小时，回收培养基，使用Quantikine人肝细胞增殖因子(HGF)ELISA试剂盒(Funakoshi社制、Code.RS-0641-00)，测定培养基中的HGF量。HGF产生量将反面对照作为100％。各试样的最终浓度分别是：添加参考例1-(1)记载的岩藻依聚糖达到1、10、100μg/ml，添加肝素达到1、10μg/ml。作为反面对照，添加与试样等量的蒸馏水。诱导试验的培养，在添加试样的同时添加10nM的TPA。试验全部进行3次，取其平均值。结果如表68所示。所有添加岩藻依聚糖试样的细胞组比添加蒸馏水的对照组的HGF产生量有明显增加。另外，与添加肝素相比，HGF的产生量也显著增加。由此可知，参考例1-(1)记载的岩藻依聚糖比到目前为止确认有HGF诱导作用的肝素显示更高的HGF产生促进活性。
            表68浓度        肝素     岩藻依聚糖(μg/ml)
0         100         100
1         950         1140
10        2170        2470
100        -          2770(条件是，对照组的HGF产生量为0.20ng/ml)。
实施例13
将在含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养的Hs68细胞(人新生儿包皮细胞：大日本制药社制，ATCC CRL-1635)悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，达到1×105细胞/ml，将其加入48孔细胞培养板，每孔500μl，培养24小时。之后，用含有1％胎牛血清的DMEM培养基交换，添加10nM的TPA和试样。另外，不添加TPA，只添加试样作为区分同样进行。回收培养基，使用Quantikine人肝细胞增殖因子(HGF)ELISA试剂盒，测定培养基中HGF的量。进一步，将细胞用PBS洗净后，将其溶解于500μl的细胞溶解缓冲液(50mMHEPES pH7.4、10mM EDTA、0.1％Triton X100、1mM PMSF、1μ/ml胃蛋白酶抑制剂A、1μg/ml亮肽素)。为了使其完全溶解可用超声波处理，之后离心分离制备上清液(细胞萃取液)，用与测定培养基中HGF浓度的同样方法测定细胞内的HGF量。添加参考例2-(3)制备的7-12SFd-F，使其最终浓度达到0.1、1、10、100μg/ml。作为反面对照，添加与试样等量的蒸馏水。所有试验都进行3次取其平均值。其结果如表69～71所示。在不添加TPA的情况下没有观察到显著的HGF产生。但是，添加TPA时，细胞中的HGF量以7-12SFd-F的浓度依存方式降低，培养基中的HGF量和总HGF量以7-12SFd-F的浓度依存方式增加。另外，总HGF量与不添加TPA的对照组相比有明显的增加。另外，HGF的增加，在这样的mRNA增加的情况下与无TPA处理的mRNA很少的情况相比，有非常显著的增加。由此可知，7-12SFd-F促进mRNA的转录，在需要大量的HGF时，可显著促进HGF的游离和产生。表69 Hs68/7-12SFd-F培养基中HGF量(pg/孔)
7-12SFd-F         无TPA         10nMTPA
(μg/ml)
   0               N.D.          65.54
   0.1             N.D.          71.04
   1               N.D.          99.25
   10              N.D.          226.14
   100             N.D.          260.49N.D.表示在检出界限以下。表70 Hs68/7-12SFd-F细胞中HGF量(pg/孔)
 7-12SFd-F       无TPA           10nMTPA
 (μg/ml)
    0            98.62           155.65
    0.1          87.60           151.99
    1            62.47           142.17
    10           N.D.            120.70
    100          N.D.            95.67N.D.表示在检出界限以下。表71 Hs68/7-12SFd-F总HGF量(pg/孔)7-12SFd-F      无TPA      10nMTPA(μg/ml)
  0                       221.19
  0.1                     223.02
  1                       241.42
  10                      346.84
  100                     356.05
实施例14
将在含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养的MRC-5细胞(CCL171：大日本制药社制，code.02-021)悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，达到2.5×105细胞/ml，将其加入6孔细胞培养板，在5％二氧化碳存在下，在37℃培养24小时。之后，用含有1％胎牛血清的DMEM培养基交换，再培养22小时。然后，分别用添加了参考例2-(3)制备的7-12SFd-F最终浓度达到100μg/ml的培养液，添加LM肝素(Celsus laboratories社制)达到1μg/ml的培养液，添加溶于二甲基亚砜(DMSO)中的前列腺素E1(PGE1)(和光纯药工业社制)达到1μM的培养液进行交换。作为对照，使用添加了DMSO的培养基。另外，添加上述各添加物的溶剂使它们都达到1％。进一步进行培养，在第0、2、4、6、8、10、12、24小时萃取出全部RNA。在萃取全部RNA时使用Rneasy Mini试剂盒(QIAGEN)社制。RT-PCR使用RNA PCR试剂盒ver.2.1(宝酒造社制R019A)。在进行全RNA热变性处理后，使用随机引物(N6)(宝酒造社制，3801)在30℃进行10分钟，42℃进行30分钟，99℃进行5分钟逆转录反应。为检测HGF的mRNA，作为有义引物使用序列表序列序号1中记载的引物，作为反义引物使用序列表序列序号2中记载的引物。通过该引物扩增的产物为415bp。另外，为进行半定量的试验，也进行作为管家基因的β肌动蛋白的检测。作为有义引物使用序列表序列序号3中记载的引物，作为反义引物使用序列表序列序号4中记载的引物。通过该引物扩增的产物为275bp。PCR通过PJ 9600(Perkin-Elmer公司制)进行。PCR循环在94℃进行2分钟热变性后，将在94℃进行30秒热变性，在59℃进行30秒退火，在72℃进行60秒延伸反应的循环进行24次。反应后，进行2％琼脂糖胶电泳和溴化乙锭染色，在UV照射下观察凝胶。在所有的样品中都检测到了HGF的mRNA。作为对照，可观察到PGE1诱导的mRNA，但是没有观察到7-12SFd-F和LM肝素对mRNA的诱导。由此可知，在通常的HGF的mRNA被转录的状态中，通过添加7-12SFd-F和LM肝素不能促进HGF的mRNA的转录，因此可知，7-12SFd-F和LM肝素不会引起过剩的HGF产生诱导。
实施例15
用NHDF细胞(人正常皮肤成纤维细胞：Bio Whittaker社制)代替实施例13中使用的HS68细胞，其他与实施例13同样进行，研究7-12SFd-F在NHDF细胞中对HGF的产生诱导活性。其结果如表72～74所示。
在不添加TPA时，细胞中的HGF量以7-12SFd-F浓度依存方式降低，培养基中的HGF量和总HGF量以7-12SFd-F浓度依存方式增加，而且，总HGF量与不添加7-12SFd-F的对照组相比有明显的增加。由此可知，即使在象无TPA处理那样的HGF的mRNA少的情况下，也可从细胞表面的HGF的游离和HGF的合成两方面促进。另外，添加TPA时，细胞中的HGF量以7-12SFd-F浓度依存方式降低，培养基中的HGF量和总HGF量以7-12SFd-F浓度依存方式增加，且总HGF量与不添加7-12SFd-F的对照组相比有明显增加。另外，象这样在mRNA增加时，与不添加TPA时mRNA很少的情况相比，HGF的增加非常显著。由此可知，7-12SFd-F在mRNA是少量的情况下，在某种程度上促进HGF的游离和产生，而且，在mRNA的转录被促进，需要大量的HGF时，可显著促进HGF的游离和产生。表72 NHDF/7-12SFd-F培养基中HGF的量(ng/孔)
7-12SFd-F    无TPA      10nMTPA
(μg/ml)
   0         N.D.       0.39
   1         0.05       0.68
   10        0.18       1.22
   100       0.385      1.625N.D.表示检出界限以下。表73 NHDF/7-12SFd-F细胞中HGF的量(ng/孔)
7-12SFd-F    无TPA    10nMTPA
(μg/ml)
   0         0.185     0.24
   1         0.145     0.19
   10        0.075     0.12
   100       0.025     0.055表74 NHDF/7-12SFd-F总HGF的量(ng/孔)
7-12SFd-F   无TPA     10nMTPA
(μg/ml)
   0                   0.63
   1        0.195      0.87
   10       0.255      1.335
   100      0.41       1.68
实施例16
将在含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养的NHDF细胞(人正常皮肤成纤维细胞)悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，达到2.5×105细胞/ml，每孔2ml将其加入6孔细胞培养板，在5％二氧化碳存在下，在37℃培养24小时。之后，用含有1％胎牛血清的DMEM培养基交换，加入10nM的十四烷酰佛波醇13-醋酸酯(TPA：Gibco BRL社制)和参考例2-(3)制备的7-12SFd-F，使最终浓度达到100μg/ml。另外，作为区别，不添加TPA，只添加7-12SFd-F，同样进行。进一步进行培养，在第4、6、8、10小时萃取出全部RNA。在萃取全部RNA时使用Rneasy Mini试剂盒(QIAGEN社制)。RT-PCR除了将PCR循环进行28次以外与实施例14完全相同进行。反应后，进行2％琼脂糖胶电泳和溴化乙锭染色，在UV照射下观察凝胶。
其结果，在不添加TPA时，HGF的mRNA的转录量非常少，但通过添加7-12SFd-F，添加后4小时，可观察到少量的mRNA转录的上升。另一方面，通过添加TPA，HGF的mRNA量不管在什么时间都显著上升。添加TPA和7-12SFd-F时，与只添加TPA的情况相比，HGF的mRNA量在添加后4小时被增加，但在6小时时，与添加7-12SFd-F无差别。即，在需要HGF的mRNA的转录被活化的初期，7-12SFd-F可显著促进其转录，但是之后，其促进效果消失。由此可知，7-12SFd-F在需要HGF的瞬间诱导HGF的产生，之后，不会过剩诱导HGF的产生。
实施例17
将在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养的HL60细胞(人前骨髓性白血病细胞)悬浮于含有1％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，达到5×105细胞/ml，将其加入48孔细胞培养板，每孔500μl。之后，加入10nM的TPA，进一步添加试样，培养24小时。另外，不添加TPA，只添加试样作为区分同样进行。回收培养基，使用Quantikine人肝细胞增殖因子(HGF)ELISA试剂盒，测定培养基中HGF的量。进一步，将细胞用PBS洗净后，将其溶解于500μl的细胞溶解缓冲液(50mM HEPES pH7.4、10mM EDTA、0.1％TritonX100、1mM PMSF、1μ/ml胃蛋白酶抑制剂A、1μg/ml亮肽素)。为了使其完全溶解可用超声波处理，之后离心分离制备上清液(细胞萃取液)，用与测定培养基中HGF浓度的同样方法测定细胞内的HGF量。添加参考例2-(3)制备的7-12SFd-F，使其最终浓度达到1、10、100μg/ml。作为反面对照，添加与试样等量的蒸馏水。所有试验都进行3次取其平均值。其结果如表75～77所示。
在不添加TPA的情况下，细胞中的HGF量不随7-12SFd-F的浓度变化。培养基中的HGF量，在1001μg/ml可观察到增加，但是随7-12SFd-F的浓度没有显著的变化。另外，添加TPA时，虽然细胞中的HGF量不随7-12SFd-F的浓度变化，但是总体在较低的值。另一方面，培养基中的HGF量和总HGF量以7-12SFd-F的浓度依存方式显著增加。另外，总HGF量与不添加7-12SFd-F的对照组相比有明显的增加。另外，HGF的增加，在这样的mRNA增加的情况下与无TPA处理的mRNA很少的情况相比，有非常显著的增加。由此可知，7-12SFd-F促进mRNA的转录，在需要大量的HGF时，可显著促进HGF的游离和产生。表75 HL60/7-12SFd-F培养基中HGF的量(ng/孔)
7-12SFd-F   无TPA     10nMTPA
(μg/ml)
  0         76.74     261.60
  1         67.10     295.94
  10        78.54     464.55
  100      162.85     843.84表76 HL60/7-12SFd-F细胞中HGF的量(ng/孔)
7-12SFd-F   无TPA      10nMTPA
(μg/ml)
  0         294.12     83.37
  1         276.67     89.39
  10        236.30     67.09
  100       257.04     85.77表77 HL60/7-12SFd-F总HGF的量(ng/孔)
7-12SFd-F   无TPA     10nMTPA
(μg/ml)
   0        370.85     344.97
   1        343.77     385.32
   10       314.84     531.64
   100      420.26     929.60
实施例18
将在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养的HL60细胞(人前骨髓性白血病细胞)悬浮于含有1％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，达到5×105细胞/ml，将其加入6孔细胞培养板，每孔2ml.之后，加入10nMTPA和参考例2-(3)制备的7-12SFd-F，使最终浓度达到100μg/ml。另外，作为区别，不添加TPA，只添加7-12SFd-F，同样进行。进一步进行培养，在第4、6、8、10小时萃取出全部RNA。在萃取全部RNA时使用Rneasy Mini试剂盒(QIAGEN)社制。RT-PCR除了将PCR循环进行32次以外与实施例14完全相同进行。反应后，进行2％琼脂糖胶电泳和溴化乙锭染色，在UV照射下观察凝胶。
其结果，在不添加TPA时，HGF的mRNA的转录量非常少，但通过添加7-12SFd-F，添加后4小时，可观察到少量的HGF的mRNA转录的上升。另一方面，通过添加TPA，HGF的mRNA量不管在什么时间都显著上升。添加TPA和7-12SFd-F时，与只添加TPA的情况相比，HGF的mRNA量在添加后4小时被增加，但在6小时时，与添加7-12SFd-F无差别。即，在需要HGF的mRNA的转录被活化的初期，7-12SFd-F可显著促进其转录，但是之后，其促进效果消失。由此可知，7-12SFd-F在需要HGF的瞬间诱导HGF的产生，之后，不会过剩诱导HGF的产生。
实施例19
(1) 将市售的茼蒿冷冻干燥得到茼蒿的冷冻干燥物。将该茼蒿冷冻干燥物粉碎，所得茼蒿粉末10g悬浮于100ml氯仿中，将过滤回收不溶组分的操作重复3次。之后，悬浮于100ml乙醇中过滤，回收不溶组分的操作重复3次。从该不溶物中完全除去乙醇，将其悬浮于100ml蒸馏水中。将该悬浮液在60℃保温1小时后，过滤。向滤液中添加2.5倍量的乙醇，在-20℃冷却后，在低温离心分离得到沉淀。将该沉淀溶解于蒸馏水中，冷冻干燥，得到含有粉末状糖的组分、茼蒿萃取物。
(2)按照实施例1-(1)的同样方法，测定实施例19-(1)制备的茼蒿萃取物的HGF产生诱导活性。添加试样使其最终浓度达到1、10、100μg/ml。作为反面对照，添加于试样等量的蒸馏水。HGF的产生量是将反面对照作为100％。其结果如表78所示。所有实验都进行2次取其平均值。如表78所示，茼蒿萃取物诱导HGF的产生。
               表78茼蒿萃取物(μg/ml)     HGF的产生量(％)
    1                  125
    10                 148
    100                314(条件是，对照组的HGF产生量为8.21ng/ml。)
实施例20
按照实施例1-(1)的同样方法，测定参考例13-(5)制备的艾蒿上清组分的HGF产生诱导活性。条件是，以培养基1000分之1的量添加艾蒿上清组分。其结果如表79所示。其结果表明，艾蒿萃取物，即使用乙醇进行沉淀而不沉淀的组分也具有HGF产生诱导活性。由此可认为，用乙醇进行沉淀而不沉淀的低分子量组分也具有活性。
                      表79
    艾蒿上清组分              HGF的产生量
       添加量                    (％)
         0                       100
     1000分之1                   463(条件是，对照组的HGF产生量为4.31ng/ml。)
实施例21
(1)将干燥艾蒿叶(出售商：阪本汉方堂)50g放入匀化器(日本精机社制)，加入500ml丙酮，在8000rpm匀化10分钟，用滤纸过滤，得到残渣。重复以上操作2次，将所得100g的艾蒿叶残渣放入匀化器，加入500ml丙酮，在8000rpm匀化10分钟，用滤纸过滤，得到残渣。重复该操作4次，得到用丙酮洗净的残渣。将丙酮洗净的残渣与用丙酮洗净相同用90％的乙醇洗涤4次，80％乙醇洗涤4次，得到乙醇洗净的残渣。从最开始重复该操作1次，合并得到200g艾蒿叶的乙醇洗净残渣。
(2)向乙醇洗净的残渣中加入10升100mM的氯化钠和含有10％乙醇的30mM磷酸缓冲液(pH8.0)，在室温搅拌19小时，用滤纸过滤，得到粗萃取物(滤液)。将所得粗萃取物用装备有排除分子量1万的空心纤维的超滤装置浓缩至2升后，加入20升含有10％的乙醇的100mM氯化钠的同时进行超滤。之后，浓缩至668ml，加入1g活性炭，在室温搅拌30分钟后，在10000rpm离心分离40分钟，除去活性炭。将上清液中残留的微量活性炭用No.5c过滤器除去。从活性炭处理液取出66.8ml，用蒸馏水充分透析后，冷冻干燥，得到670mg干燥物。将该干燥物命名为艾蒿高分子组分(YPS)。将残留的601.2ml活性炭处理液放入超滤装置，用含有10％乙醇和50mM氯化钠10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)进行溶剂置换，得到溶剂置换的艾蒿高分子组分。
(3)将溶剂置换的艾蒿高分子组分加到被含有10％乙醇和50mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)平衡化的DEAE-Cellulofine A-800柱(φ4.05×37.8cm)上，用同样的缓冲液1200ml将柱子洗净后，用0.1M(1000ml)到2M(1000ml)的氯化钠进行梯度洗脱。洗脱液以每瓶30ml分馏。洗脱出的组分中，分别将馏分No.13～33命名为艾蒿高分子组分-I(YPS-I)，馏分No.69～78命名为艾蒿高分子组分-II(YPS-II)，馏分No.79～137命名为艾蒿高分子组分-III(YPS-III)。将YPS-I、YPS-II、YPS-III分别用蒸馏水充分透析，冷冻干燥，分别得到冻干物530mg、420mg、380mg。
(4)YPS-III进一步分馏，将YPS-III(200mg)溶解于50ml含有4M氯化钠的5mM咪唑-盐酸缓冲液(pH8.0)中，将其添加到用同样的缓冲液平衡化的苯基-Cellulofine柱(φ3.1×14.3cm)上，用同样的缓冲液200ml将柱子洗净后，分别用200ml含有1M氯化钠的5mM咪唑-盐酸缓冲液(pH8.0)，200ml蒸馏水，200ml乙醇进行洗脱。
洗脱液以每瓶10ml分馏。洗脱出的组分中，分别将馏分No.1～32命名为艾蒿高分子组分-III-1(YPS-III-1)，馏分No.33～53命名为艾蒿高分子组分-III-2(YPS-III-2)，馏分No.54～66命名为艾蒿高分子组分-III-3(YPS-III-3)。将YPS-III-1、YPS-III-2、YPS-III-3分别用蒸馏水充分透析，冷冻干燥，分别得到冻干物20.11mg、32.59mg、113.75mg。
(5)按照实施例1-(1)酶同样方法，测定实施例21-(2)，21-(3)制备的艾蒿萃取物的分馏物，YPS(试样①)、YPS-I(试样②)、YPS-II(试样③)、YPS-III(试样④)的HGF产生诱导活性。结果如表80所示。其结果，这些艾蒿萃取物的分馏物都显示HGF产生诱导活性。
                表80
试样          浓度       HGF的产生量
             (μg/ml)       (％)试样①           0           100
                1           214
                10          267
                100         215试样②           0           100
                1           121
                10          113
                100         260试样③           0           100
                10          129
                100         243试样④           0           100
                1           232
                10          323
                100         272(条件是，对照组的HGF产生量为8.43ng/ml。)
(6)按照实施例1-(1)的同样方法，测定实施例21-(4)制备的艾蒿萃取物的分馏物，YPS-III-1(试样①)、YPS-III-2(试样②)、YPS-III-3(试样③)的HGF产生诱导活性。结果如表81所示。其结果，这些艾蒿萃取物的分馏物都显示HGF产生诱导活性。
              表81添加量          HGF的产生量(％)(μg/ml)    试样①    试样②    试样③0          100       100       1001          188       290       24710         181       304       217100        348       295       243(条件是，对照组的HGF产生量为8.26ng/ml。)
实施例22
将参考例1-(1)记载的ガゴメ昆布由来的岩藻依聚糖30g在12L蒸馏水中室温搅拌30分钟进行溶解。将该悬浮液在10000×g离心分离40分钟，收集上清液。将其用薄膜过滤器(0.22μm)(Miuipore社制)无菌过滤，得到21.4g冷冻干燥物。为Takara岩藻依聚糖Bf(以下称为岩藻依聚糖Bf)。
用实施例1-(1)的同样方法，测定岩藻依聚糖Bf(试样①)的HGF产生诱导活性。其结果如表82所示。将实验进行两次取其平均值。其结果岩藻依聚糖Bf显示HGF产生诱导活性。
             表82添加量                HGF的产生量(％)(μg/ml)                  试样①0                       1001                       20910                      333100                     377(条件是，对照组的HGF产生量为9.17ng/ml。)
实施例23
(1)将ガゴメ昆布500g切细，用10升80％乙醇洗净后，在50升含有1mM氯化钾的10％乙醇中在25℃搅拌3天，用网眼直径32μm的不锈钢金属网过滤，得到滤液45升。将该滤液34升在80℃加热3小时后，冷却至50℃。将其用排除分子量1万的超滤OMEGA盒(Filtron社制)在保持液温50℃的同时浓缩。进一步用加温至50℃的蒸馏水5L进行脱盐，加入同样的蒸馏水200ml将回路洗涤2次，回收，得到浓缩液1.5升。将其冷冻干燥，得到8.2g F-富含岩藻依聚糖。
(2)用实施例1-(1)的同样方法，测定实施例23-(1)制备的F-rich岩藻依聚糖(试样①)的HGF产生诱导活性。其结果如表83所示。其结果F-富含岩藻依聚糖显示HGF产生诱导活性。
       表83添加量          HGF的产生量(％)(μg/ml)           试样①0               1001               11710              186100             244(条件是，对照组的HGF产生量为9.60ng/ml。)
实施例24
将在含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养的NHDF细胞(人正常皮肤成纤维细胞)悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，达到1×105细胞/ml，将其加入48孔细胞培养板，每孔500μl，培养24小时。之后，用含有1％胎牛血清的DMEM培养基交换，加入10μg/ml或100μg/ml的米诺地尔(和光纯药工业社制)和试样。另外，另外，作为区分，不添加米诺地尔，只添加试样，同样进行。回收培养基，使用Quantikine人肝细胞增殖因子(HGF)ELISA试剂盒，测定培养基中的HGF量。作为试样分别添加实施例22制备的岩藻依聚糖Bf，实施例23制备的F-富含岩藻依聚糖，参考例2-(3)制备的7-12SFd-F，使其最终浓度分别达到1、10、100μg/ml。另外，对于岩藻依聚糖Bf也进行添加最终浓度为0.1μg/ml的试验。作为反面对照，添加与试样等量的蒸馏水。试验全部进行3次，取其平均值。结果如表84～86所示。
不添加米诺地尔时，培养基中的HGF量以岩藻依聚糖Bf、F-富含岩藻依聚糖、7-12SFd-F的浓度依存方式增加，比无添加的对照组有明显的增加。由此可知，即使在象无米诺地尔处理的HGF的mRNA少的情况下，也可从细胞表面的HGF游离和HGF的合成两方面促进。另外，添加米诺地尔时，培养基中的HGF量以岩藻依聚糖Bf、F-富含岩藻依聚糖、7-12SFd-F的浓度依存方式增加，比无添加的对照组有明显的增加。另外，象这样mRNA增加的情况与无米诺地尔处理的mRNA少的情况相比，HGF的增加是非常显著的。由此可知，岩藻依聚糖Bf、F-富含岩藻依聚糖、7-12SFd-F在mRNA是少量的情况下只少量促进HGF的游离和产生，另外，在mRNA大量存在时，即大量需要HGF时，显著促进HGF的游离和产生。表84 NHDF/岩藻依聚糖Bf培养基中HGF的浓度(pg/ml)岩藻依聚糖Bf     无米诺地   米诺地尔     米诺地尔(μg/ml)        尔         10μg/ml     100μg/ml
0            N.D.       126.04       148.83
0.1          300.20     307.00       478.90
1            428.83     448.17       624.60
10           791.93     799.90       794.20
100          729.33     709.97       860.23N.D.表示检出界线以下。表85 NHDF/F-富含岩藻依聚糖培养基中HGF浓度(pg/ml)F-富含岩藻依聚糖  无米诺地尔   米诺地尔   米诺地尔   米诺地尔
(μG/ml)                   1μg/ml    10μg/ml    100μg/Ml
   0             N.D.        N.D.       N.D.        N.D.
   1            132.75       N.T.       N.T.       203.03
   10           316.90      239.90     310.20      434.10
   100          369.33      327.70     372.70      537.87N.D.表示检出界线以下。另外，N.T.表示未评价。表86 NHDF/7-12SFd-F培养基中的HGF浓度(pg/ml)7-12SFd-F    无米诺地尔    米诺地尔    米诺地尔(μg/ml)                   10μg/ml    100μg/ml0             N.D.        N.D.        137.201            228.73      164.00       378.3010           345.93      376.07       450.83100          439.67      483.20       820.10N.D.表示检出界线以下。
实施例25
对小鼠(CDF1系雌性7周龄，体重约20kg)，使用半乳糖胺(20mg/小鼠)和LPS(脂多糖：0.3μg/小鼠)同时腹腔内给药，制做暴发性肝炎致死模型，研究参考例1-(1)记载的岩藻依聚糖的延长生命效果。将岩藻依聚糖用蒸馏水调整为10％，以10ml/kg体重(岩藻依聚糖为1g/kg)的用量，在使用半乳糖胺和LPS同时给药前1小时和给药后1小时进行2次强制给药。对于对照组使用同样的蒸馏水给药。
试验开始后72小时后的生存率是，对照组中8例中活1例，岩藻依聚糖给药组中8例中活7例，可确认通过使用岩藻依聚糖给药，有显著的延长寿命效果。另外，可确认生存例中对血清生化值也有改善效果。其结果如表87所示。
                     表87组         GPT(U/l)      GOT(U/l)      总胆红素
                                       (mg/dl)对照          385           613            1.0岩藻依聚糖    94±22        233±53       0.3±0.02给药组
实施例26
(1)将ガゴメ昆布500g切细，用10升80％乙醇洗净后，在50升含有1mM氯化钾的10％乙醇中在内径40cm的容器中在25℃搅拌2天，以每分钟120转的速度搅拌，萃取出岩藻依聚糖，萃取物用网眼直径32μm的不锈钢金属网过滤，制备得到岩藻依聚糖溶液。
将1g棕榈油(花王社制：化妆品用)溶解于1升乙醇中，将该制备的棕榈油溶液1升在搅拌的同时加入到该岩藻依聚糖溶液46升中，再添加1升甘油，制备化妆水。
(2)向实施例26-(1)制备的岩藻依聚糖溶液中，加入明胶和香料达到最终浓度0.02％，得到使用明胶的化妆水。另外，同样地添加骨胶原，得到使用骨胶原的化妆水。
保藏的生物材料
(1)保藏机关名称·地址通商产业省工业技术院生命工业技术研究所日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮政编号305)
      (2)保藏的微生物
      (i)交替单胞菌属(Alteromonas sp.)SN-1009
         原保藏日：1996年2月13日
         转移至国际保藏请求日：1996年11月15日
         登记编号：FERM BP-5747
     (ii)黄杆菌属(Flavobacterium sp.)  SA-0082
         原保藏日：1995年3月29日
         转移至国际保藏请求日：1996年2月15日
         登记编号：FERM BP-5402
产业上的可利用性
本发明提供了含有显示生长因子产生诱导活性得的物质作为有效成分的对于需要生长因子产生的疾病有效的药物。该药物在生物体内有HGF产生诱导活性，h-IGF产生诱导活性，NGF·神经营养性因子产生诱导活性，作为肝炎、糖尿病、癌症、神经性疾病等需要这些生长因子产生的疾病的治疗剂或预防剂是有效的。
另外，使用选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、硫酸化多糖，例如岩藻依聚糖、葡聚糖硫酸钠、大量含有硫酸软骨素的鲨鱼软骨萃取物，其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、及它们的盐的物质可制造饮食品，形成的生长因子产生诱导用食品、饮料通过日常饮食品摄取，可改善需要生长因子产生的疾病的症状。并可提供具有同样的生理功能的饲料。
因此，含有选自具有HGF产生诱导作用的，在本发明中使用的酸性多糖、硫酸化多糖、例如岩藻依聚糖，其降解物、酸性寡糖、酸性单糖及它们的盐的物质作为有效成分的功能性饮食品，功能性饲料，由于其生长因子产生诱导作用，是在维持生物体的内环境稳定中有用的功能性饮食品或饲料。
本发明还提供了HGF产生用生物化妆品，它在肌肤的健康管理等中极其有用。另外，还提供了癌转移抑制剂。
另外，还提供了生长因子产生诱导剂，该诱导剂在生长因子的功能研究、与生长因子相关疾病用药物筛选中是有用的。
                      序列表<110>宝酒造株式会社<120>治疗剂<130>00-028-PCT<150>JP 11-108067<151>1999-4-15<150>JP 11-108499<151>1999-4-15<150>JP 11-114542<151>1999-4-22<150>JP 11-129163<151>1999-5-10<150>JP 11-142343<151>1999-5-21<150>JP 11-154662<151>1999-6-2<150>JP 11-200982<151>1999-7-14<150>JP 11-275231<151>1999-9-28<150>JP 11-375606<151>1999-12-28<150>JP 2000-99941<151>2000-3-31<160>4<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1gtgaatactg cagaccaatg tgc                                 23<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2cacagacttc gtagcgtacc tctgg                               25<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3caagagatgg ccacggctgc t                                   21<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4tccttctgca tcctgtcggc aa                                  22

Claims (32)

1.需要生长因子产生诱导的疾病的治疗剂或预防剂，其特征在于含有选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、及它们的盐的物质(条件是，肝素，硫酸乙酰肝素除外)作为有效成分。
2.权利要求1中记载的治疗剂或预防剂，其中，酸性多糖是硫酸化多糖。
3.权利要求2中记载的治疗剂或预防剂，其中，硫酸化多糖是藻类由来的硫酸化多糖、动物由来的硫酸化多糖、植物由来的硫酸化多糖、微生物由来的硫酸化多糖或鱼类由来的硫酸化多糖。
4.权利要求2中记载的治疗剂或预防剂，其中，硫酸化多糖是合成硫酸化多糖。
5.权利要求2中记载的治疗剂或预防剂，其中，硫酸化多糖是岩藻依聚糖。
6.权利要求1中记载的治疗剂或预防剂，其中，酸性单糖是硫酸化葡萄糖，硫酸化半乳糖，硫酸化木糖，硫酸化2-脱氧葡萄糖，硫酸化太洛糖和硫酸化甘露糖。
7.权利要求1中记载的治疗剂或预防剂，其中，酸性寡糖是选自硫酸化麦芽糖，硫酸化乳糖，硫酸化蔗糖，硫酸化海藻糖，硫酸化乳果糖，硫酸化蜜二糖，硫酸化纤维二糖，硫酸化异麦芽糖，硫酸化松二糖，硫酸化パラチノ一ス，硫酸化麦芽三糖，硫酸化麦芽六糖，硫酸化麦芽七糖，硫酸化十二烷基麦芽六糖，下述式(I)所示化合物和下述式(II)所示化合物的硫酸化寡糖，
Figure A0080905100031
式中、R表示OH或OSO3H；
Figure A0080905100032
式中、R表示OH或OSO3H。
8.权利要求1～7任1项中记载的治疗剂或预防剂，其中，生长因子是肝细胞增殖因子、胰岛素样增殖因子或神经生长因子。
9.权利要求1～8任1项中记载的治疗剂或预防剂，其特征在于进一步含有可协同增加酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的生长因子产生诱导作用的物质。
10.权利要求9中记载的治疗剂或预防剂，其中，可协同增加酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的生长因子产生诱导作用的物质是选自细胞因子类，前列腺素类和含有环戊烯环的化合物的物质。
11.含有选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、及它们的盐的物质形成的生长因子产生诱导用食品、饮料或饲料。
12.权利要求11中记载的食品、饮料或饲料，其中，酸性多糖是硫酸化多糖。
13.权利要求12中记载的食品、饮料或饲料，其中，硫酸化多糖是藻类由来的硫酸化多糖、动物由来的硫酸化多糖、植物由来的硫酸化多糖、微生物由来的硫酸化多糖或鱼类由来的硫酸化多糖。
14.权利要求12中记载的食品、饮料或饲料，其中，硫酸化多糖是合成硫酸化多糖。
15.权利要求12中记载的食品、饮料或饲料，其中，硫酸化多糖是岩藻依聚糖。
16.权利要求11中记载的食品、饮料或饲料，其中，酸性单糖是硫酸化葡萄糖，硫酸化半乳糖，硫酸化木糖，硫酸化2-脱氧葡萄糖，硫酸化太洛糖和硫酸化甘露糖。
17.权利要求11中记载的食品、饮料或饲料，其中，酸性寡糖是选自硫酸化麦芽糖，硫酸化乳糖，硫酸化蔗糖，硫酸化海藻糖，硫酸化乳果糖，硫酸化蜜二糖，硫酸化纤维二糖，硫酸化异麦芽糖，硫酸化松二糖，硫酸化パラチノ一ス，硫酸化麦芽三糖，硫酸化麦芽六糖，硫酸化麦芽七糖，硫酸化十二烷基麦芽六糖，下述式(I)所示化合物和下述式(II)所示化合物的硫酸化寡糖，
式中、R表示OH或OSO3H；
Figure A0080905100052
式中、R表示OH或OSO3H。
18.权利要求11～17任1项中记载的食品、饮料或饲料，其是肝细胞增殖因子产生诱导用、胰岛素样增殖因子产生诱导用或神经生长因子产生诱导用。
19.权利要求11～18任1项中记载的食品、饮料或饲料，其特征在于进一步含有可协同增加酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的生长因子产生诱导作用的物质。
20.权利要求19中记载的食品、饮料或饲料，其中，可协同增加酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的生长因子产生诱导作用的物质是选自细胞因子类，前列腺素类和含有环戊烯环的化合物的物质。
21.含有选自具有生长因子产生诱导作用的酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、及它们的盐的物质制成的生长因子产生诱导用化妆品。
22.权利要求21中记载的化妆品，其中，酸性多糖是硫酸化多糖。
23.权利要求22中记载的化妆品，其中，硫酸化多糖是藻类由来的硫酸化多糖、动物由来的硫酸化多糖、植物由来的硫酸化多糖、微生物由来的硫酸化多糖或鱼类由来的硫酸化多糖。
24.权利要求22中记载的化妆品，其中，硫酸化多糖是合成硫酸化多糖。
25.权利要求22中记载的化妆品，其中，硫酸化多糖是岩藻依聚糖。
26.权利要求21中记载的化妆品，其中，酸性单糖是硫酸化葡萄糖，硫酸化半乳糖，硫酸化木糖，硫酸化2-脱氧葡萄糖，硫酸化太洛糖和硫酸化甘露糖。
27.权利要求21中记载的化妆品，其中，酸性寡糖是选自硫酸化麦芽糖，硫酸化乳糖，硫酸化蔗糖，硫酸化海藻糖，硫酸化乳果糖，硫酸化蜜二糖，硫酸化纤维二糖，硫酸化异麦芽糖，硫酸化松二糖，硫酸化パラチノ一ス，硫酸化麦芽三糖，硫酸化麦芽六糖，硫酸化麦芽七糖，硫酸化十二烷基麦芽六糖，下述式(I)所示化合物和下述式(II)所示化合物的硫酸化寡糖，
Figure A0080905100071
式中、R表示OH或OSO3H；
式中、R表示OH或OSO3H。
28.权利要求21～27任1项中记载的化妆品，其为肝细胞增殖因子产生诱导用、胰岛素样增殖因子产生诱导用或神经生长因子产生诱导用化妆品。
29.权利要求21～28任1项中记载的化妆品，其特征在于进一步含有可协同增加酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的生长因子产生诱导作用的物质。
30.权利要求29中记载的化妆品，其中，可协同增加酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、或它们的盐的生长因子产生诱导作用的物质是选自细胞因子类，前列腺素类和含有环戊烯环的化合物的物质。
31.权利要求21～30任1项中记载的化妆品，其是洗剂类、乳液类、膏霜类、面膜类，浴用剂，洗面剂，浴用皂或浴用洗剂。
32.生长因子产生调节剂，其特征在于含有选自酸性多糖、其降解物、酸性寡糖、酸性单糖、酸性糖醇、及它们的盐的物质作为有效成分。
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