JP6730937B2 - 免疫療法のための抗原負荷キトサンナノ粒子 - Google Patents

Description

本発明は、キトサンおよび抗原を含むナノ粒子であって、キトサンが約９０％の脱アセチル化度および分子量５ｋＤａ〜８０ｋＤａを有するナノ粒子、そのようなナノ粒子を含有する微粒子、ならびにそのような粒子の調製方法を対象とする。粒子はワクチン接種に使用可能である。

２０年以上前に、キトサンを含むキチン誘導体は免疫刺激活性を有することが見出された。この免疫刺激活性は、キチン誘導体と、天然多糖の免疫アジュバントクラスであるグルカンの間の構造的類似性と共に、数人の科学者がキトサンのアジュバント能力を研究するきっかけとなった。キトサンおよびその誘導体を対象とした研究は、他のアジュバントと共に用いた場合の免疫応答に対する影響に重点を置いていた。
キトサンはその粘膜付着特性のため、粘膜ワクチン接種のアジュバントとして探究されている。キトサンによるワクチン増強のメカニズムは、粘膜付着により鼻腔内でワクチンが保持されること、および内皮細胞間結合が開いてワクチンが傍細胞輸送されることの両方によると考えられている（Ilium et al. 2001 Adv Drug Dev 51(1-3):81-96）。
キトサンのアジュバント特性も、感染症に対する皮下ワクチン製剤および癌ワクチンで探究されている（In vivo evaluation of chitosan as an adjuvant in subcutaneous vaccine formulations, R. Scherliess et al., Vaccine 2013; Chitin, Chitosan, and Glycated Chitosan Regulate Immune Responses: The Novel Adjuvants for Cancer Vaccine, X. Li et al., Clin and Dev Immunol, 2013）。
粒子状ワクチンもまたアジュバント特性を有すると文献に記載されている（例えばPathogen recognition and development of particulate vaccines: Does size matter?, S. Xiang, Methods, 2006）。
米国特許出願公開第２００４／００３７８４０号（新規の治療ワクチン製剤）は、ポリペプチド抗原に対する免疫応答がそのようなポリペプチド抗原と混合したキトサンにより誘導され得ることを開示し、およびこのために好ましい製剤としての微粒子を開示している。最も好ましいのは、微粒子が０．７３〜０．８２μｍの間の平均粒子径を有すること、ならびにキトサンが、平均分子量約９５，０００〜約３，０００，０００および少なくとも９８％の脱アセチル化度（ＤＤ）を有することである。

従来技術において製剤が報告されているにもかかわらず、さらなる製剤、特に、既存の製剤と比較して有効性の改善をもたらす製剤に対する継続的な需要がある。したがって、そのような製剤を提供することが本発明の目的であった。

驚くべきことに、キトサンナノ粒子を含有する抗原により誘導される免疫応答は、そのようなナノ粒子のキトサンが約９０％の脱アセチル化度（ＤＤ）および分子量５キロダルトン（ｋＤａ）〜８０キロダルトン（ｋＤａ）を有する場合に劇的に増加することが、本発明により見出された。そのような知見は、従来技術の教示とは明らかに異なる。従来技術の教示は、粒子中のキトサンのＤＤ値は好ましくはできるだけ高くあるべき（少なくとも９８％）こと、キトサンは好ましくは、効果の増大をもたらすことが判明した本発明のナノ粒子の平均分子量よりはるかに高い範囲の平均分子量を有するべきであることを教示している。したがって、本発明の１つの目的は、キトサンおよび抗原を含むナノ粒子であって、キトサンが約９０％の脱アセチル化度および分子量５ｋＤａ〜８０ｋＤａを有することを特徴とするナノ粒子を対象とする。

骨髄抗原提示細胞による、ＦＩＴＣ添加ＮＰまたはＦＩＴＣ添加なしの対照ＮＰのサイズ依存性取り込み（ｎ＝４、（３連で））を示す図である。全てのテストしたＮＰサイズの平均±ＳＤを、０．１ｍｇ／ｍｌのキトサンおよびシリカについて示す。 骨髄抗原提示細胞による、ＦＩＴＣ添加ＮＰまたはＦＩＴＣ添加なしの対照ＮＰのサイズ依存性取り込み（ｎ＝４、（３連で））を示す図である。全てのテストしたＮＰサイズの平均±ＳＤを、０．１ｍｇ／ｍｌのキトサンおよびシリカについて示す。 別々に脱アセチル化したキトサンＮＰの比較を示す図である。ＯＴＩ ｔ細胞の抗原依存性ＣＤ６９発現およびＩＬ−２産生の平均＋／−ＳＤ。キトサンのＮＰサイズは２５０±３０ｎｍである。ＯＴＩ ｔ細胞は、非結合対照（オボアルブミンパネル）として、または示されたポリマータイプのＮＰ内負荷されたものとして、示されたオボアルブミン濃度で２４時間インキュベートした。ＣＤ６９発現はＦＡＣＳにより、ＩＬ−２はＥＬＩＳＡにより検出した。 １００Ｌ／分でＣｙｃｌｏｈａｌｅｒから分散された、ＮＧＩにおける乾燥粉末微粒子製剤由来のオボアルブミン（ＯＶＡ）の沈着（ｎ＝３、エラーバーは標準偏差を示す）を示す図である。ＦＰＦは７５．３７％であり、空気力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）は１．１０２μｍである。これは、肺に分布することができる粒子の高い割合を示している。 ＳＤ前の元のＮＰ（黒い線）サイズ平均１９０．５ｎｍ ＰＤＩ ０．１８２；ＳＤ後（グレーの線）サイズ平均２０９．５ｎｍ ＰＤＩ ０．１４５（ＳＤ：噴霧乾燥、ＮＰ：ナノ粒子）を示す図である。

本明細書で使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」は１つまたは複数を意味するものとする。本明細書で使用されるとき、単語「含む」と併せて使用される場合、単語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは１つを超えるを意味する。本明細書で使用されるとき「別の」は、少なくとも２番目以降を意味する。さらに、文脈によって特に要求されない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。
用語「ナノ粒子」は本明細書で使用されるとき、１μｍ未満の平均サイズを有する粒子を指す。ナノ粒子は、球体などの定形を好ましくは有するが、不定形も有してもよい。

用語「微粒子」は本明細書で使用されるとき、１μｍを超える平均サイズを有する粒子を指す。微粒子は球体などの定形、または不定形を有してもよい。一実施形態において、微粒子はナノ粒子、およびナノ粒子の十分な接着をもたらして各使用に必要とされる十分な物理的安定性を有する微粒子を形成することができる賦形剤から構成される。適切な賦形剤は例えば、例えば糖または糖アルコールなどの付着特性を有する賦形剤であってもよい。
用語「キトサン」は本明細書で使用されるとき、ランダムに分布したβ−（１−４）結合Ｄ−グルコサミン（脱アセチル化単位）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（アセチル化単位）から成る直鎖状多糖を指す。キトサンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの多糖であるキチンの脱アセチル化により商業的に製造される。種々のキトサンは、キチンと比較した分子量、粘度および脱アセチル化度（ＤＤ）により特徴付けられ得る。
キトサン以外に、抗原とナノ粒子を形成することができるキトサンの誘導体または類似体も、本発明の目的に使用され得る。そのような類似体または誘導体は修飾されたキトサンであってもよく、修飾はキトサンの物理的、化学的または生理学的特性を変えるのに役立つ。そのような類似体は、静電的および／もしくは親水性および／もしくは疎水性相互作用による非共有付着、またはキトサンとの共有結合により形成することができる。類似体の例には、特異的もしくは非特異的標的リガンドおよび／または膜透過剤および／またはエンドソーム溶解剤および／または核局在化シグナルをキトサンに結合させることにより修飾されたキトサンが含まれるが、これらに限定されない。他の例は、誘導体化キチンもしくはキトサンまたは上述された類似体、すなわちＯ−アセチル化および／またはＮ−アセチル化および／またはＮ−トリメチル化キトサンもしくは類似体である。陰イオン分子（例えばアジュバントポリ（Ｉ：Ｃ）（ポリイノシン酸：ポリシチジル酸）が、静電相互作用により陽イオンＮ−トリメチル化キトサンに結合されてもよい。キトサンベース化合物は有利には、天然に架橋されてもよく、またはグルタルアルデヒドなどの架橋剤もしくはゲル化剤（Akbuga and Durmaz 1994 Int J of Pharm 111, 217-222; Aiedeh et al 1997 J. Microencapsul. 14, 567-576; Jameela, S.R. et al 1995 Biomaterials 16, 769-775）、ホルムアルデヒドもしくはアルギン酸のゲル化（Liu, L.S. et al 1997 J. Control Rel. 43, 65-74; Alexakis, T. et al 1995. Appl. Biochem. Biotechnol. 50, 93-106; Polk A. et al 1994 J. Pharm. Sci. 83, 178-185）により架橋されてもよい。

用語「抗原」は本明細書で使用されるとき、脊椎動物、好ましくは哺乳動物において細胞性および／または液性免疫応答を引き起こすことができるタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは炭水化物の全て、または部分を指す。一実施形態において、抗原はタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは核酸である。さらなる実施形態において、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドはグリコシル化されてもよい。
用語「脱アセチル化度」（ＤＤ）は本明細書で使用されるとき、対応するキチン分子のＮ−アセチル基の最大可能数と比べた、キトサン分子における遊離アミノ基のパーセンテージを指す。キトサンは、アセチル基が遊離アミノ基（−ＮＨ₂）を残してキチンのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位から除去される、キチンのアルカリ脱アセチル化により最も一般的に調製される。キトサンの脱アセチル化度を決定する方法は当技術分野で広く知られており、ニンヒドリンテスト、線形電位差滴定法、近赤外分光法、核磁気共鳴分光法、臭化水素滴定法、赤外分光法、および一次導関数ＵＶ分光法（ｆｉｒｓｔ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ＵＶ−ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）（Khan T A, J Pharm Pharmaceut Sci 5(3): 205-212, 2002）などのさまざまな方法を含む。

質量平均分子量（Ｍｗ）は、静的光散乱（ＳＬＳ）により決定された（Scherliess, R., Buske, S., Young, K., Weber, B., Rades, T. and Hook, S., In vivo evaluation of chitosan as an adjuvant in subcutaneous vaccine formulations Vaccine 31 (2013) 4812-4819）。
ＳＬＳは、多糖のＭｗを決定するのに一般的に使用される［Wu H. Correlations between the Rayleigh ratio and the wavelength for toluene and benzene. Chemical Physics 2010; 367: 44-7］。レーザー光が試料に送られ、散乱光が決定される。散乱光の強度は、分子量（質量平均）およびポリマーの濃度に比例する。この比例は、簡略されたレイリーの式（ｅｄｕｃｅｄ Ｒａｙｌｅｉｇｈ ｅｑｕａｔｉｏｎ）により与えられる［Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏシステム：Ｍａｌｖｅｒｎアプリケーションノートでの分子量測定］（式２）

式２：レイリーの式（式中、Ｋは光学定数であり、Ｒ_θはレイリー比であり、Ｍは質量平均分子量であり、Ａ₂は第２ビリアル係数であり、Ｃは試料濃度である）。

デバイプロットにおけるレイリーの式を用いて、切片が分子量の逆数に等しく、得られる傾きが第２ビリアル係数の２倍となるＫＣ／Ｒ対Ｃの線形フィットが生成され得る。分子量を決定するために、静的光散乱測定がＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｃ．、マルバーン、ＵＫ）を用いて行われる。ＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳは、角度１７３度および光源としてＨｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ）を備える単一角度レーザー光散乱装置である。各試料測定の前に、バックグラウンド光強度が決定され、散乱基準としてレイリー比値１．３５×１０−５ ｃｍ^-1でのトルエンの後方散乱が測定される。試料は、０．０２Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．１Ｍ塩化ナトリウムにｐＨ値４．５で溶解され、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）０．１９２ｍＬ／ｇが推測される（Nguyen S, Hisiger S, Jolicoeur M, Winnik FM, Buschmann MD. Fractionationand characterization of chitosan by analytical SEC and 1H NMR after semi-preparative SEC. Carbohydrate Polymers 2009; 75: 636-45）。０．２５〜１．００ｇ／Ｌの範囲の５つの異なる試料濃度が調製され、測定される。各測定前に試料は、０．４５ｍ ＰＴＦＥフィルターを通じて正方形のガラスキュベットに濾過される。測定は２０℃の温度で行われ、データはデバイプロット法により分析される。

本明細書で使用されるとき「約」は、明示されているか否かにかかわらず、例えば、整数、分数、およびパーセンテージを含む数値を指す。用語「約」は一般的に、当業者が列挙された値と同等である（例えば、同じ機能または結果を有する）と見なすであろう数値の範囲を指す（例えば、列挙された値の＋／−１〜３％）。場合によっては、用語「約」は、最も近い有効数字に四捨五入される数値を含み得る。
有利には、ナノ粒子中に存在するキトサンは、分子量１０ｋＤａ〜８０ｋＤａ、好ましくは２０ｋＤａ〜６０ｋＤａ、より好ましくは２５ｋＤａ〜５０ｋＤａを有する。したがって、本発明の１つの実施形態は、キトサンが分子量１０ｋＤａ〜７０ｋＤａ、好ましくは２０ｋＤａ〜６０ｋＤａ、より好ましくは２５ｋＤａ〜５０ｋＤａを有することを特徴とするナノ粒子を対象とする。

治療ワクチン製剤のためのキトサン粒子を開示している米国特許出願公開第２００４／００３７８４０号から、ワクチン粒子は最も好ましくは０．７３〜０．８２μｍの間の範囲に粒子径を有するべきであることが知られている（上記参照）。対照的に、キトサンナノ粒子は、平均サイズ１００〜５００ｎｍを有する場合、強い優れた免疫学的効果を示すことが本発明により見出された。ナノ粒子が平均粒子サイズ２００ｎｍ〜４００ｎｍ、特に２００ｎｍ〜３００ｎｍを有する場合、そのような免疫学的効果は増加する。したがって、本発明の１つのさらなる実施形態は、ナノ粒子が、平均サイズ１００〜５００ｎｍ、好ましくは２００〜４００ｎｍ、より好ましい２００ｎｍ〜３００ｎｍを有することを特徴とするナノ粒子を対象とする。

用語「平均サイズ」は、本明細書で使用されるとき、水性媒体中で一緒に動くナノ粒子集団の流体力学的平均直径（「ｚ−平均」）を指す。ｚ−平均は、「調和強度平均粒子径（ｈａｒｍｏｎｉｃ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ａｖｅｒａｇｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ）」としてＩＳＯ２２４１２により定義されている。種々の手法により測定されたｚ−平均サイズを比較するために、試料は単峰性（すなわちただ１つのピーク）、球形またはほぼ球形、および単分散性（すなわち極めて狭い分布幅）でなければならない。これらの系の平均サイズは、当業者に公知の、および例えば実験部分に記載されている（下記参照）標準的なプロセスにより測定することができる。

有利には、本発明のナノ粒子は対イオンを含有する。したがって、本発明の好ましい実施形態は、対イオンを含有することを特徴とするナノ粒子を対象とする。
用語「対イオン」は本明細書で使用されるとき、そのプロトン化アミノ基により得られるキトサンの正電荷と均衡を取る、有機酸塩または鉱酸塩から得られる陰イオンまたは陰イオン基を指す。本発明に使用可能な対イオンは、２つの主なカテゴリー、すなわち（例えばＣａＣｌ₂、ＢａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂、ＣｕＣｌ₂、ＺｎＣｌ₂、ＣｏＣｌ₂を用いて使用され得る）塩化物、ＮａＳＯ₄、ピロリン酸塩、トリポリリン酸塩、テトラポリリン酸塩、オクタポリリン酸塩、ヘキサメタリン酸塩および［Ｆｅ（ＣＮ）₆］^-4／［Ｆｅ（ＣＮ）₆］^-3などの低分子量対イオン、ならびにオクチル硫酸塩、ラウリル硫酸塩、ヘキサデシル硫酸塩、セチルステアリル硫酸塩、コール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースまたはポリ（アクリル酸）などの高分子量イオンに分類することができる。

本発明の好ましい実施形態においてナノ粒子は、対イオンとしてカルボキシメチルセルロース、トリポリリン酸五ナトリウム、コール酸ナトリウム、ヘパリン、低分子量ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン、カラゲナン、核酸（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）またはポリ（アクリル酸）を含有する。したがって、本発明はさらに、対イオンがカルボキシメチルセルロース、トリポリリン酸五ナトリウム、コール酸ナトリウム、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン、カラゲナン、核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡベースＲＩＧ−Ｉ様（（レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ）様）受容体アゴニスト）またはポリ（アクリル酸）であることを特徴とする、ナノ粒子を対象とする。
ナノ粒子は有利には、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を抗原として含有する。したがって、本発明の好ましい実施形態は、抗原がペプチド、タンパク質、または核酸であることを特徴とするナノ粒子を対象とする。
用語「ペプチド」は本明細書で使用されるとき、ペプチド結合により互いに結合された少なくとも２個のアミノ酸の鎖を指す。幾つかの実施形態において、ペプチドには、各々が少なくとも１つのペプチド結合によって他のアミノ酸に結合された少なくとも３〜５個のアミノ酸が含まれ得る。用語「ペプチド」には、それでもなおポリペプチド鎖に組み込むことができる「非天然」アミノ酸または他の実体が時として含まれる。用語「ペプチド」は、本明細書で使用されるとき約１０〜約１００個またはこれ以上のアミノ酸を含有する長い連続した非分岐ペプチド鎖を指す用語「ポリペプチド」を包含する。

用語「タンパク質」は本明細書で使用されるとき、ペプチド結合により互いに結合された１００個を超えるアミノ酸を含有する巨大分子を指す。タンパク質は、例えば１つもしくは複数のジスルフィド結合により連結された、または他の形で会合した１つまたは複数のポリペプチドを含有し、アミノ酸以外の部分を含んでもよく（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカン等であってもよい）、および／またはさもなければ処理もしくは修飾されていてもよい。「タンパク質」は、細胞により産生されるような完全なポリペプチド鎖（シグナル配列の有無にかかわらず）であってもよく、またはその特徴的な部分であってもよい。
ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、ｌ−アミノ酸、ｄ−アミノ酸、または両方を含有してもよく、当技術分野で公知のさまざまなアミノ酸修飾または類似体のいずれかを含有してもよい。有用な修飾には、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化等が含まれる。幾つかの実施形態において、タンパク質は天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、およびこれらの組合せを含み得る。

用語「核酸」は本明細書で使用されるとき、単一のヌクレオチド、またはあるヌクレオチドの３’位のリン酸基が別のヌクレオチドの５’末端と連結された２個以上のヌクレオチドを含む天然または合成分子を指す。核酸は長さによって制限されず、故に核酸にはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）が含まれ得る。
核酸が抗原として存在する場合、核酸は、そのプロトン化アミノ基により得られるキトサンの正電荷と（負電荷のために）均衡を取る。そのような例において核酸はそれ自体、上記のように対イオンとして作用するため、さらなる対イオンは必要でなく、または減少した量のみで必要とされる。
キトサンのアジュバント効果にもかかわらず、本発明の１つの実施形態においてナノ粒子はアジュバントをさらに含有してもよい。

用語「アジュバント」は本明細書で使用されるとき、抗原に対する免疫応答を増大させることができる任意の物質を指す。アジュバントが抗原と組み合わされると、そのような組合せは、抗原単独により誘導されるものより強い免疫応答を抗原に対して誘導する。使用可能なアジュバントの例は、ＣｐＧ、ＣＴＢ、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、Ｐｏｌｙ ＩＣ、ＲＮＡベースＲＩＧ−Ｉ受容体アゴニスト、またはサイトカインである。
ナノ粒子は、予防および治療ワクチン接種を含むワクチン接種に使用することができる。したがって、本発明はまた、ワクチン接種の使用のためのナノ粒子も対象とする。本発明の特定の実施形態は、治療ワクチンとして使用するためのナノ粒子、および予防ワクチンとして使用するためのナノ粒子である。治療ワクチン接種のためのナノ粒子の使用が特に好ましい。

本明細書で使用されるとき、用語「ワクチン」は本明細書で使用されるとき、ワクチン接種宿主が免疫応答、好ましくは防御免疫応答を起こすように誘導される成分を含有する治療的または予防的医薬製剤を指す。好ましくは、免疫応答を誘導するそのような成分は抗原である。
「ワクチン」と共に用語「治療」は本明細書で使用されるとき、ワクチンにより誘導された免疫応答が、例えば癌などの進行中の疾患をこの発症または検出後に処置、改善、緩和することを指す。用語「治療ワクチン接種」は本明細書で使用されるとき、ＡＩＤＳ、結核、自己免疫疾患（例えば多発性硬化症および関節リウマチ）、胃潰瘍または癌などの進行中の疾患を処置、改善、緩和するための治療ワクチンの使用を指す。

「ワクチン」と共に用語「予防」は本明細書で使用されるとき、微生物感染もしくはウイルス感染により誘導された疾患に対する防御をもたらすように、または微生物侵入の重症度を低減するように、感染していない被験者において免疫応答がワクチンにより誘導されることを指す。用語「予防ワクチン接種」は本明細書で使用されるとき、微生物感染もしくはウイルス感染により誘導された疾患に対する防御をもたらすように、または微生物侵入の重症度を低減するように、感染していない被験者において免疫応答を誘導するための予防ワクチンの使用を指す。
本発明の特に好ましい実施形態によれば、ナノ粒子は、治療ワクチン接種の使用のため、好ましくは癌ワクチン接種のためのものである。同様に本発明は、治療ワクチン接種、好ましくは癌ワクチン接種および自己免疫疾患に対するワクチン接種のためのナノ粒子の使用も対象とする。

癌ワクチン接種の場合、ナノ粒子は適切な腫瘍抗原を含有しなければならない。癌ワクチン接種のためのナノ粒子は、（ｉ）主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩに結合するペプチド配列を含まなければならず、（ｉｉ）腫瘍細胞により処理され、およびＭＨＣ Ｉ分子に結合するのに利用可能にならなければならず、（ｉｉｉ）ＭＨＣ Ｉ限定的にＴ細胞レパートリーにより認識されなければならず、（ｉｖ）特異的Ｔ細胞受容体を発現する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）前駆体の増殖を駆動しなければならない（Matera L, Cacer Treat Rev 36(2): 131-141, 2010）。
ＣＴＬ認識ヒト腫瘍抗原（ＣＴＬ−ｄｅｆｉｎｅｄ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ）ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原）をコードすることが報告された最初の遺伝子の分子クローニング以降、および新たな技術の開発に伴い、ヒト癌においてＴ細胞により認識される多くの他の抗原、いわゆる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が同定され、特徴付けられている（Van der Bruggen et al., J Immunol 178(5): 2617-2621, 2007; Novellino L et al., Cancer Immunol Immunother 54(3): 187-207, 2005）。ＴＡＡの他の例は、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣＡ−１２５（癌抗原１２５）、ＭＵＣ−１（ムチン１）、ＥＴＡ（上皮腫瘍抗原）およびＣＴＡＧ１Ｂ（癌／精巣抗原１ｂ）である。

本発明のナノ粒子は、粘膜経路または皮下などの非経口経路、筋肉内、腹腔内および静脈内経路によるなど、さまざまな経路により投与することができる。本明細書で使用されるとき、用語「粘膜の」は、鼻、肺、経口（舌下、頬）、胃腸、直腸、膀胱、結膜（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉａｌ）、腺、例えば乳腺、上皮粘膜などの粘膜により覆われた身体の任意の膜表面を指す。したがって、本発明の１つの実施形態は、ナノ粒子が粘膜投与または非経口注射により投与されることを特徴とする、ワクチン接種のためのナノ粒子の使用を対象とする。好ましくは、ナノ粒子は粘膜経路により投与され、鼻および肺経路が特に好ましい。したがって、１つの好ましい実施形態は、粘膜投与が肺または鼻投与であることを特徴とする、ワクチン接種のためのナノ粒子の使用を対象とする。

ナノ粒子の粘膜投与は、当技術分野で公知の液体分散液および装置を用いて行うことができる。液体ナノ粒子分散液の送達は、当技術分野で公知の装置を用いて、投与の特定の経路に適合された制御された粒子サイズ範囲で行うことができる。例えば、ナノ粒子分散液は、機械式ポンプまたはスプレーを用いて鼻粘膜に投与することができる。肺粘膜への送達は、例えば、市販の加圧式定量吸入器（ｐＭＤＩ）を用いて肺にナノ粒子分散液を噴霧して達成することができる。好ましくは、粘膜へのナノ粒子の投与に使用される液体分散液は、ナノ粒子が水溶液に分散された水性分散液である。
キトサンナノ粒子は、イオンゲル化法、乳化および架橋、エマルジョン滴の合一、エマルジョン溶媒拡散、逆ミセル形成、イオンゲル化、高分子電解質複合体形成、ラジカル重合による改変イオンゲル化、脱溶媒和などの当業者により知られているさまざまな方法により調製することができる（A. Grenha, Chitosan nanoparticles: a survey of preparation methods, J Drug Targeting, 2012）。イオンゲル化法は極めて単純で穏やかであること、ならびに化学架橋の代わりに静電相互作用による可逆的物理架橋を伴い、試薬の起こり得る毒性、および他の望ましくない影響を回避することから好ましい。有利にはナノ粒子は、抗原が不安定な、他の処理環境に敏感なペプチドまたはタンパク質抗原である場合に当てはまるように、抗原の分解を引き起こし得る有害な溶媒、特に有機溶媒を使用することなく穏やかな条件下で調製され得る。

用語「イオンゲル化」は本明細書で使用されるとき、ナノ粒子を調製するための反対に帯電した分子間の複合体形成を指す。イオンゲル化法の一実施形態において、キトサンは水性媒体に溶解される。水性媒体は好ましくは、遊離アミノ酸基（−ＮＨ₂）のこの正に帯電したプロトン化形態（−ＮＨ₃ ⁺）への変換を促すように弱酸性である。そのような溶液は次いで、例えば、キトサンを含有する水溶液を負に帯電した対イオンを含有する水溶液に加えて、負に帯電した対イオンを含有する水溶液と組み合わされ、またはその逆も同様である。好ましくは、水溶液の組合せは、定常撹拌下で１つの水溶液を他の水溶液に滴加して行われる。反対に帯電した種間の複合体形成により、キトサンはイオンゲル化し、沈殿して球状粒子を形成する。ナノ粒子は、濾過により除去し、蒸留水で洗浄し、乾燥することができる。したがって、本発明の好ましい実施形態は、ナノ粒子がイオンゲル化により調製されることを特徴とする、ナノ粒子の調製方法を対象とする。

用語「水溶液」は本明細書で使用されるとき、存在する溶媒の少なくとも一部が水から成る任意の溶液または懸濁液を指す。存在し得るさらなる溶媒成分は、例えば、エタノール、プロパノール、プロパンジオールまたはグリセロールなどのアルコールである。水溶液は好ましくは、溶媒として水またはエタノール／水混合物を含み、溶媒は特に好ましくは水から成る。特定の実施形態において水溶液は、酸性物質、塩基性物質または緩衝物質などのｐＨ調整剤を含む。好ましい実施形態において水溶液は、酢酸／酢酸塩緩衝液などの弱酸性ｐＨを提供する薬剤を含有する。
ナノ粒子を調製する適切な方法は、ステップ（ａ）キトサンおよび抗原を含む水溶液を調製するステップと、（ｂ）対イオンを含む水溶液を調製するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）において調製された水溶液およびステップ（ｂ）により調製された水溶液を混合するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた混合物を撹拌して、キトサンナノ粒子を含有する水性分散液を生成するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において得られたナノ粒子を回収するステップとを含む。

したがって、本発明はまた、
（ａ）キトサンおよび抗原を含む水溶液を調製するステップと、
（ｂ）対イオンを含む水溶液を調製するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）において調製された水溶液およびステップ（ｂ）により調製された水溶液を混合するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた混合物を撹拌して、キトサンナノ粒子を含有する水性分散液を生成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において得られたナノ粒子を回収するステップと
を含む、ナノ粒子の調製方法も対象とする。

本方法の代替の実施形態によれば、抗原は、キトサンを含む水溶液（ステップ（ａ））の代わりに、対イオンを含む水溶液（ステップ （ｂ））に存在する。本方法のさらなる代替の実施形態によれば、抗原は、水溶液、すなわちキトサンを含む水溶液（ステップ（ａ））および対イオンを含む水溶液（ステップ（ｂ））の両方に存在する。
好ましくは、本方法のステップ（ｃ）における水溶液の混合は、ステップ（ｂ）において調製された水溶液をステップ（ａ）により調製された水溶液に加えることによって行われる。したがって、本発明はまた、ステップ（ｃ）が、ステップ（ｂ）において調製された水溶液をステップ（ａ）により調製された水溶液に加えることによって行われる、ナノ粒子の調製の方法も対象とする。

上記のように本発明のナノ粒子は、粘膜投与、特に肺および鼻投与が好ましい投与経路であるワクチン接種に有利には使用することができる。そのようなナノ粒子は小さな粒子サイズのため、適切な方法で直接投与することができず、液体媒体、特に水性媒体に分散されることを必要とし、これは、保管中のナノ粒子の安定性に有害な影響を及ぼし得る。例えば、適切な粒子サイズを提供する液体媒体なしでの極めて小さなナノ粒子の直接肺投与は呼気をもたらすため、肺粘膜の免疫応答が誘導されない。直接投与に使用可能な粒子サイズを有するナノ粒子を含有する乾燥粒子製剤が非常に望ましい。粘膜に投与された後、および粘膜と接触すると、粒子は有利にはナノ粒子を、例えば崩壊により放出する。
したがって、本発明のナノ粒子を含む粒子を提供することが本発明のさらなる目的である。そのような粒子は、本発明のナノ粒子、およびマトリックス剤を含む微粒子により提供される。

用語「マトリックス剤」は本明細書で使用されるとき、歯槽粘膜および鼻粘膜などの粘膜に存在するときに少なくとも一部が水および水性媒体に可溶性であり、ナノ粒子の互いに対するマトリックスおよび／または付着性を提供してより大きな粒子を形成することができる薬剤または化学化合物を指す。マトリックス剤で形成された微粒子において、ナノ粒子は凝集体として整列されてもよく、ならびに／またはマトリックス剤により完全におよび／もしくは部分的に囲まれてもよい。微粒子が水または水性媒体と接触すると、マトリックス材料はそのような媒体中で一部または全体が溶解し、微粒子の崩壊およびこれに含有されたナノ粒子の放出をもたらす。
好ましいマトリックス剤は、単糖、二糖、糖アルコールまたは多糖である。したがって、本発明の１つの実施形態は、マトリックス剤が単糖、二糖、糖アルコールまたは多糖であることを特徴とする微粒子を対象とする。

特に好ましいマトリックス剤は、単糖グルコース、二糖トレハロース、スクロースおよびラクトース、糖アルコールマンニトールおよびソルビトール、ならびにデンプン多糖およびデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎｅ）である。したがって、本発明はさらに、マトリックス剤である単糖が、グルコースであり、マトリックス剤である二糖が、トレハロース、スクロースまたはラクトースであり、マトリックス剤である糖アルコールが、マンニトールまたはソルビトールであり、およびマトリックス剤である多糖が、デンプンまたはデキストランであることを特徴とする、ナノ粒子を含む微粒子をさらに対象とする。
肺投与において、活性粒子のサイズは、吸収部位を決定する上で非常に重要である。粒子が肺深くへ運ばれることを達成するには、粒子は粒子サイズを有していなければならず、１０μｍ未満の空気力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）を例えば有するべきである。１０μｍを超えるＭＭＡＤを有する粒子は、喉の壁に影響を及ぼす可能性が高く、一般的には肺に到達しない。一般的には、ＭＭＡＤが１０μｍより高い粒子は中咽頭に、５〜１０μｍの間にある粒子は中枢気道に、０．５〜５μｍにある粒子は小気道および肺胞に沈着すると考えることができる。したがって、呼吸器処置（吸入）に関して、０．５〜５μｍの間のＭＭＡＤを有する粒子を使用することが好ましい。

用語「空気力学的質量中央径」（ＭＭＡＤと略される）は本明細書で使用されるとき、分散粒子の空気力学的サイズの尺度である。ＭＭＡＤ分布は、エアロゾルが吸入中に沈着する様態を定義し、粒子として、一般的には空気中で同じ沈降速度を有する単位密度粒子の中央径である。ＭＭＡＤは、粒子の粒子形状、密度および物理的サイズを包含し、アンダーソンカスケードインパクション（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｃａｓｃａｄｅ ｉｍｐａｃｔｉｏｎ）または次世代インパクター（ＮＧＩ）により決定されたエアロゾル化粉末の空気力学的粒子サイズ分布の中間点または中央値を指す。本発明者らの試験では、定量装置、乾燥粉末装置、および類似の吸入器装置をテストするための高性能で精密な粒子分類カスケードインパクターであるモデル１７０次世代Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｍｐａｃｔｏｒ（ＮＧＩ）が使用された。ＭＳＰ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、製薬会社１５社のコンソーシアム（次世代インパクターコンソーシアム）と協力してこのインパクターを開発した。設計プロセスへの実質的なユーザーの関与は、空気力学的設計方針とユーザーフレンドリーな操作の組合せをもたらした。取り外し可能な一連の回収カップは、吸入器テスト間の時間を最小にする。他の時間節約的特徴には、最終フィルターがなく、入口のＯリングがないことが含まれる。ＮＧＩは、次世代インパクターコンソーシアムの１５の製薬会社によりテストされている。

本発明の１つの実施形態は、ＭＭＡＤ ０．５μｍ〜８μｍ、好ましくは０．５μｍ〜５μｍ、より好ましくは１μｍ〜５μｍ、最も好ましくは２μｍ〜５μｍを有する微粒子を指す。したがって、本発明はまた、空気力学的質量中央径０．５μｍ〜５μｍ、好ましくは１μｍ〜５μｍ、より好ましくは２μｍ〜５μｍを有することを特徴とする、微粒子も対象とする。
微粒子はワクチン接種に使用することができる。したがって、本発明の１つの実施形態は、ワクチン接種で使用するためのナノ粒子を対象とする。
本発明の好ましい実施形態によれば、微粒子は治療ワクチン接種における使用のため、好ましくは癌ワクチン接種のためのものである。同様に本発明は、治療ワクチン接種、好ましくは癌ワクチン接種のための微粒子の使用も対象とする。

ナノ粒子に関する上記のようなさらなるさまざまな投与経路以外に、微粒子は、好ましくは粘膜投与、より好ましくは肺または鼻投与により投与され、肺投与が最も好ましい。したがって、１つの好ましい実施形態は、粘膜投与が肺または鼻投与であることを特徴とする治療ワクチン接種のための微粒子の使用を対象とする。
粘膜投与に関して、微粒子は、加圧式定量吸入器（ｐＭＤＩ）または乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ’ｓ）などの例えば市販の装置を用いて投与することができる。肺粘膜に投与される場合、乾燥粉末吸入器が好ましい。市販のＤＰＩ’ｓは、例えば、Ｐｕｆｆｈａｌｅｒ（Ａｋｔｉｖ−Ｄｒｙ ＬＬＣ）、ＴｗｉｎＣａｐｓ（Ｈｏｖｉｏｎｅ ＬＬＣ）、Ｔｏｒｕｓ ＤＰＩ（Ｍａｎｔａ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＬＬＣ）、Ｃｏｎｉｘ Ｏｎｅ（３Ｍ）およびＤｉｒｅｃｔＨａｌｅｒ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ（Ｄｉｒｅｃｔ−Ｈａｌｅｒ Ａ／Ｓ）、Ｃｙｃｌｏｈａｌｅｒ（ＰＢ Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ）である。

微粒子は、噴霧乾燥法を用いて調製することができる。用語「噴霧乾燥」は本明細書で使用されるとき、噴霧乾燥器を用いて溶液または懸濁液からμｍサイズの粒子を含む乾燥粉末を生成する方法を指す。噴霧乾燥は、原則として溶媒抽出プロセスである。得られる生成物の成分は、液体に溶解／分散され、次いで、例えば蠕動ポンプを用いて噴霧乾燥器のアトマイザーに送液される。液体の霧化に使用することができる適切なアトマイザーは、ノズルまたは回転ディスクを含む。ノズルでは、霧化は圧縮ガスの作用により生じるが、回転ディスクを使用する場合、霧化はディスクの急速回転により生じる。両方の場合において、霧化は乾燥チャンバー中への液体の小滴への崩壊をもたらし、乾燥チャンバーで溶媒がエアロゾル液滴から抽出され、例えば排気管を通って溶媒トラップに排出される。

液滴サイズ１０〜５００μｍが噴霧乾燥により生成され得る。溶媒（水または有機溶媒）が乾燥すると、ナノ粒子含有液滴は乾燥してμｍサイズの粒子になり、粉末様粒子を形成する。
幾つかの市販の噴霧乾燥機が本発明の微粒子を調製するのに使用されてもよく、例えば、適切な機械はＢｕｃｈｉおよびＮｉｒｏにより製造されている。適切な噴霧乾燥器の例には、Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ ２９０、もしくはＭＯＢＩＬＥ ＭＩＮＯＲ（商標）などのＢｕｃｈｉ製の実験室スケール噴霧乾燥器、またはＮｉｒｏ製のＰｈａｒｍａ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ ＰｈａｒｍａＳＤ（登録商標）、またはＰｒｏｃｅｐｔ ＮＶ製の４Ｍ８−ＴｒｉＸが含まれる。

典型的な噴霧乾燥機において、乾燥される懸濁液は、撹拌リザーバからポンプで霧化チャンバーに汲み上げられ、ノズルから微細液滴（好ましくは液滴は直径１〜２０μｍの範囲にある）として加熱空気、例えば、５０〜１５０℃の範囲の入口温度（抗原の望ましくない酸化のリスクがある場合、空気の代わりに窒素が使用されてもよい）の流れに噴霧される。加熱空気の温度は、液体を蒸発させ、微粒子を自由流動粉末に乾燥させるのに十分でなければならないが、活性物質を分解するほど高くてはならない。微粒子は、サイクロンまたはフィルターまたはサイクロンおよびフィルターの組合せで回収することができる。
微粒子の調製に使用することができる適切な噴霧乾燥法はよく知られており、例えば、K. Masters in "Spray-drying Handbook", John Wiley & Sons, New York, 1984により記載されている。好ましい実施形態において、液体の霧化はノズルを用いて行われる。

本発明の適切な実施形態によれば、本発明のナノ粒子、およびマトリックス剤を含有する液体は噴霧乾燥される。したがって、本発明の１つの目的は、ナノ粒子およびマトリックス剤を含有する液体が噴霧乾燥されることを特徴とする、微粒子の調製方法を対象とする。液体は好ましくは、マトリックス剤が溶解され、ナノ粒子が分散されている水溶液である。

好ましくは、本方法は、（ａ）抗原負荷ナノ粒子、および水性分散液中に溶解されたマトリックス成形剤を含む水性分散液を調製するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において調製された水性分散液を噴霧乾燥して抗原負荷ナノ粒子含有微粒子を生成するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）において得られた微粒子を回収するステップとを含む。したがって、本発明は、
（ａ）抗原負荷ナノ粒子、および水性分散液中に溶解されたマトリックス成形剤を含む水性分散液を調製するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において調製された水性分散液を噴霧乾燥して抗原負荷ナノ粒子含有微粒子を生成するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において得られた微粒子を回収するステップと
を含むことを特徴とする方法も対象とする。
「ナノ粒子」と共に用語「抗原負荷」は、本発明により記載されおよび／または特許請求された抗原を含むナノ粒子を指す。
微粒子が乾燥粉末吸入器を用いて投与されることを意図する場合、粉末の流れを改善するために粒子状賦形剤材料が微粒子に混合されてもよい。賦形剤材料のそのような粒子は、例えば９０μｍを超える空気力学的質量中央径を有する粗粒子（そのような粗粒子は担体粒子と呼ばれる）であってもよく、または微小粒子であってもよい。
例は、これに限定されることなく本発明を説明するものである。

ナノ粒子の粒子サイズ分析
粒子サイズおよびゼータ電位測定は、動的光散乱（ＤＬＳ）を適用するＺｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて行う。データ分析には、「汎用」分析モードを以下のパラメータに基づき使用する。
粘度：１．０１ｍＰａｓ（２２℃で）
屈折率：１．３２８
各試料は１２０秒以内で２２℃に平衡化し、分析を３連で行う。
ゼータ電位測定は特定の細胞を用いて行う。測定は、１０〜１００ランにより同様に３連で行う（自動調節）。データ分析はスモルコフスキーモデルに基づく。

微粒子の粒子サイズ分析
噴霧乾燥生成物の粒子サイズ分布は、ＨＥＬＯＳレーザー回折器（Ｓｙｍｐａｔｅｃ ＧｍｂＨ、クラウスタール、ツェラーフェルト、ドイツ）を用いて行う。噴霧乾燥粉末を３バールにより分散させ、ＨＥＬＯＳ Ｒｏｄｕｓモジュールを用いて測定する。
カプセルベース吸入器、「Ｃｙｃｌｏｈａｌｅｒ」を空気力学的特徴付けに使用する。測定はＨＥＬＯＳ吸入器モジュールを用いて行う。１００ｌ／分の空気流速（＝吸入器全体にわたって４ｋＰａ差圧低下）を用いて吸入器から粉末を放出する。粒子サイズ分布をレーザー回折により決定する。１０ｍｇの噴霧乾燥粉末を充填したＨＰＭＣカプセル（サイズ３）を吸入器を用いて分散させる。×５０、粉末画分＜５．２５μｍ、および相対的デアグロメレーションを決定する。

ナノ粒子の調製（概要）
ナノ粒子はイオンゲル化により製造する。ナノ粒子は、キトサンの正に帯電した１級アミノ基とセルロース誘導体の負に帯電したカルボキシ基との静電相互作用によるイオン架橋により自発的に形成される。
キトサン溶液の調製には、正確な量のキトサン（Ｃｈｉｔｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｅｐｐｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｉｔｏｓａｎ）、例えば０．１％を酸性酸溶液、例えば２％に溶解する。カルボキシメチルセルロース溶液を、正確な量のＴｙｌｏｓｅ Ｃ３０（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、例えば０．１％を精製水に溶解して調製し、マグネチックスターラー上で撹拌しながらキトサン相にゆっくり加える。得られたナノ粒子（キトサン／酸性酸／Ｔｙｌｏｓｅ比０．１／２および０．１％）は、２３０ｎｍの平均サイズ、０．１４０の多分散指数（ＰＤＩ）を有する（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓにより測定）。ナノ粒子を遠心分離によりサンプリングし、および１％酢酸に再懸濁する。異なる対イオン（例えばヘパリン、ヒアルロン酸およびポリアクリレートでの例）を含有する製剤をそれ相応に調製し、対イオンを精製水に溶解する。

最終ナノ粒子懸濁液の組成は以下の通りである：

オボアルブミン負荷ナノ粒子は以下のように生成する。０．１％（ｗ／Ｖ）キトサン（Ｈｅｐｐｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｉｔｏｓａｎ ＧｍｂＨ、ドイツ）を、１ｍｇ／ｍｌオボアルブミン（ＯＶＡ；Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と共に、２％（Ｖ／Ｖ）酢酸に溶解する。
イオンゲル化用薬剤として０．１％（ｗ／Ｖ）の負に帯電したセルロース誘導体（Ｔｙｌｏｓｅ Ｃ３０、Ｈｏｅｃｈｓｔ、ドイツ）を同じ容量の再蒸留水に別個に溶解し、撹拌しながらキトサン相にゆっくり加える。あるいは、オボアルブミン負荷ナノ粒子を以下のように生成する。０．１％（ｗ／Ｖ）キトサン（Ｈｅｐｐｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｉｔｏｓａｎ ＧｍｂＨ、ドイツ）を、（ＯＶＡ；Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）２％（Ｖ／Ｖ）酢酸に溶解する。

イオンゲル化用薬剤として０．１％（ｗ／Ｖ）の負に帯電したセルロース誘導体（Ｔｙｌｏｓｅ Ｃ３０、Ｈｏｅｃｈｓｔ、ドイツ）を、１ｍｇ／ｍｌオボアルブミンと共に、同じ容量の再蒸留水に別個に溶解し、撹拌しながらキトサン相にゆっくり加える。オボアルブミンは、上記のプロセス後にＴｙｌｏｓｅ相に溶解することもできる。キトサン対Ｔｙｌｏｓｅの最適比は１：１と決定する。Ｔｙｌｏｓｅ溶液は、所望の粒子サイズを達成するためにキトサン溶液に加える必要がある。

抗原提示細胞（マクロファージおよび樹状細胞）による取り込みへの粒子サイズの影響
この試験で使用するマクロファージおよび樹状細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスの骨髄から単離する（単離プロトコルについては、Schroder M. et al., Mol Immunol. 2011, 48(9-10): 1139-48参照）。簡単には、骨髄細胞をマウスの後肢から単離し、未処理ペトリ皿中０．８×１０６（１０⁶）細胞／ｍｌの細胞濃度で加湿インキュベーター（５％ ＣＯ２および３７℃）において、１０％ＦＣＳ、１００ ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μＭ β−メルカプトエタノール、およびマクロファージまたは樹状細胞分化に関して、それぞれ１００ｎＭ Ｍ−ＣＳＦまたは１００ｎＭ ＧＭ−ＣＳＦのどちらかを補充したＲＰＭＩ培地で培養する。分化プロセスに関して、細胞株Ｒ１の上清を使用してＧＭ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦ含有上清のどちらかを生成し、実験で使用する前にＥＬＩＳＡで濃度を測定する。４日後、細胞を追加のペトリ皿に１：２に分け、新しく追加した培養培地および増殖因子でさらに３日間培養する。さらに３日後、接着細胞をインビトロ実験、ＦＡＣＳ分析、および顕微鏡実験に使用する。ＮＰ取り込み試験には、５×１０⁴マクロファージを１００μｌの容量の９６ウェル細胞培養処理スライド（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１００ ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）に播種する。次いで１００μｇ／ｍｌまたは１０００μｇ／ｍｌキトサン−ＮＰまたはシリカ−ＮＰを、１００μｌ細胞培養培地に異なる時点で蛍光ありまたは蛍光なしで加える。インキュベーション段階後、細胞を擦り取り、ＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリー用に調製する。

実験結果を図１および２に示す：骨髄抗原提示細胞による、ＦＩＴＣ添加ＮＰまたはＦＩＴＣ添加なしの対照ＮＰのサイズ依存性取り込み（ｎ＝４、（３連で））。全てのテストしたＮＰサイズの平均±ＳＤを、０．１ｍｇ／ｍｌのキトサンおよびシリカについて示す。
抗原提示細胞による取り込みに好ましい粒子サイズを決定するために、キトサン以外に、シリカおよびＰＬＧＡナノ粒子（全てＦＩＴＣ標識した）を試験した。シリカＮＰの結果も本明細書に示す。その理由は、これらの粒子をマイクロメートル規模でも製造することが技術的に容易なためである（キトサン粒子とは反対に）。キトサンＮＰ（およびシリカ）の結果は、５００ｎｍを超える粒子サイズでは取り込み速度が低下することを示している。抗原提示細胞による好ましい取り込みのための粒子サイズのスイートスポットは、２００〜３００ｎｍであるように思われる。

免疫学的検査法
細胞培養、上記参照
ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）の単離
ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞をＯＴＩマウスの脾臓から単離し、ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）により精製する。細胞をカウント後、細胞をマクロファージまたは樹状細胞とのインビトロ共培養に直接使用する。

フローサイトメトリー
抗体染色は、フローサイトメトリー緩衝液中でＦｃ受容体遮断の存在下で行う（マウスＣＤ１６−ＣＤ３２に対するモノクローナル抗体２．４Ｇ２（１０μｇ／ｍｌ）；実験室調製）。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩまたはＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ｓｏｆｗａｒｅ）（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を収集およびデータ分析に使用する。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を死細胞の排除に使用する。
フローサイトメトリーに使用する抗体は、以下の通りであった（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）：アロフィコシアニンまたはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗ＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）。

インビトロ実験
キトサン−Ｏｖａ−ＮＰ５×１０⁴のインビトロ評価には、１００μｌの容量の細胞培養処理９６ウェルプレート（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１００ ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中のマクロファージまたは樹状細胞を使用する。次いで、１×１０⁵の新しく単離したＣＤ８＋ＯＴＩ Ｔ細胞を含む５０μｌ培地および同じ濃度のキトサン−Ｏｖａ−ＮＰ、または負荷されていない遊離オボアルブミンを含む５０μｌ培地を加える。２４時間後、その後のＥＬＩＳＡ測定用に−２０℃で保管した上清を単離し、残りの細胞をフローサイトメトリー分析に使用する。
サイトカイン測定
ＩＬ−２を検出するためのマウス特異的ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、インビトロで生成した上清に使用し、ビーズベースＴｈ１／Ｔｈ２ １０ｐｌｅｘ（ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、血液試料の血清中のＴ細胞特異的サイトカインを決定するのに使用する。

実験結果を図３に示す：別々に脱アセチル化したキトサンＮＰの比較。ＯＴＩ ｔ細胞の抗原依存性ＣＤ６９発現およびＩＬ−２産生の平均＋／−ＳＤ。キトサンのＮＰサイズは２５０±３０ｎｍである。ＯＴＩ ｔ細胞は、非結合対照（オボアルブミンパネル）として、または示されたポリマータイプのＮＰ内負荷されたものとして、示されたオボアルブミン濃度で２４時間インキュベートした。ＣＤ６９発現はＦＡＣＳにより、ＩＬ−２はＥＬＩＳＡにより検出した。
異なる脱アセチル化度（ＤＤ）のキトサンからできたナノ粒子（約２６０ｎｍ）を、オボアルブミンをモデル抗原として用いて一般的な免疫学的設定（ＣＤ６９、ＩＬ−２）におけるインビトロでの性能について調べる。７５または９５％のＤＤを有するキトサンナノ粒子は、可溶性オボアルブミンを比較するとＩＬ−２の場合で１０倍の免疫学的効果の増加を示す。この改善は、ナノ粒子およびキトサンのアジュバント特性の組合せから生じる予測範囲内である。驚くべきことに、９０％のＤＤを有するキトサンナノ粒子は、７５または９５％のＤＤを有する同じ粒子と比較すると免疫応答の劇的な増加を示す（ＩＬ−２に関して可溶性オボアルブミンと比較して３８倍、図３参照）。これは従来技術の知見と正反対である。データは、従来技術の製剤と比較して、本発明の粒子の優れた免疫応答および治療ワクチン接種のための有用性を示している。

微粒子の調製
乾燥粉末製剤を得るために、２％（ｗ／Ｖ）マンニトールのマトリックス（Ｐｅａｒｌｉｔｏｌ ２００ ＳＤ、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ、フランス）をナノ粒子懸濁液に加え、それぞれ８０℃および３５℃の入口および出口温度で、Ｂｕｃｈｉ Ｂ−２９０ミニスプレードライヤー（Ｂｕｃｈｉ、フラヴィル、スイス）を用いて噴霧乾燥する。

微粒子のＭＭＡＤ分析
次世代インパクター（ＮＧＩ）を用いた空気力学的特徴付け
空気力学的特徴付けには、ＨＰＭＣカプセル（サイズ３）に２０ｍｇ（±０．１ｍｇ）の噴霧乾燥粉末を充填する。カプセルはＣｙｃｌｏｈａｌｅｒにより分散させる。空気流速は、吸入器全体にわたって４ｋＰａの圧力低下に調節する。真空容量を吸入ごとに４ｌの流量に調節する。ＮＧＩの種々のステージはプロピレングリコールおよびイソプロパノールの混合物で被覆する。カプセル１個を各ランに使用する。各ラン後、ＮＧＩパーツを規定量の０．１Ｍ ＮａＯＨでクリーニングする。クリーニング液を試験管に移し、透明な溶液が得られるまで３７℃でインキュベートする。この溶液を０．１Ｍ ＨＣｌ（１：１比）で中和する。オボアルブミン含量を、ＮＧＩのステージごとにＢＣＡアッセイにより決定する。使用した流速に基づき、微粉画分（ＦＰＦ）、空気力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）、および幾何標準偏差（ＧＳＤ）を、ＣＩＴＤＡＳソフトウェアを用いて流速に対して計算する。結果を図４に示す：１００Ｌ／分でＣｙｃｌｏｈａｌｅｒから分散された、ＮＧＩにおける乾燥粉末微粒子製剤由来のオボアルブミン（ＯＶＡ）の沈着（ｎ＝３、エラーバーは標準偏差を示す）。ＦＰＦは７５．３７％であり、空気力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）は１．１０２μｍである。これは、肺に分布することができる粒子の高い割合を示している。

水性媒体中で分散したときの、噴霧乾燥微粒子が、放出前のサイズのＯＶＡ負荷キトサンＮＰを放出する能力について調べた。結果を図５に示す：ＳＤ前の元のＮＰ（黒い線）サイズ平均１９０．５ｎｍ ＰＤＩ ０．１８２；ＳＤ後（グレーの線）サイズ平均２０９．５ｎｍ ＰＤＩ ０．１４５（ＳＤ：噴霧乾燥、ＮＰ：ナノ粒子）。

元のＮＰおよび処理したＮＰの粒子サイズおよび多分散指数は類似している。これは、噴霧乾燥がワクチン接種のためのＮＰの好ましい標的生成物プロファイルを変えないことを示すものである。

Claims (21)

1. キトサンおよび抗原を含むナノ粒子であって、キトサンが９０％の脱アセチル化度および分子量５ｋＤａ〜８０ｋＤａを有し、
   カルボキシメチルセルロース、ピロリン酸塩、ヘパリン、ヒアルロン酸又はポリ（アクリル酸）である対イオンを含有し、
   ナノ粒子が平均サイズ２００ｎｍ〜３００ｎｍを有することを特徴とするナノ粒子。
2. キトサンが分子量１０ｋＤａ〜７０ｋＤａを有することを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子。
3. 抗原がペプチド、タンパク質、または核酸であることを特徴とする、請求項１または２に記載のナノ粒子。
4. アジュバントを含有することを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
5. ワクチン接種の使用のための、請求項１から４に記載のナノ粒子。
6. 治療ワクチン接種のための医薬組成物であって、請求項１から４のいずれか１項に記載のナノ粒子を含む、医薬組成物。
7. ナノ粒子が粘膜投与または非経口注射により投与されることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 粘膜投与が肺または鼻投与であることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
9. ナノ粒子がイオンゲル化により調製されることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載のナノ粒子の調製方法。
10. （ａ）キトサンおよび抗原を含む水溶液を調製するステップと、
    （ｂ）対イオンを含む水溶液を調製するステップと、
    （ｃ）ステップ（ａ）において調製された水溶液およびステップ（ｂ）により調製された水溶液を混合するステップと、
    （ｄ）ステップ（ｃ）において得られた混合物を撹拌して、キトサンナノ粒子を含有する水性分散液を生成するステップと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）において得られたナノ粒子を回収するステップと
    を含む、請求項９に記載の方法。
11. ステップ（ｃ）が、ステップ（ｂ）において調製された水溶液をステップ（ａ）により調製された水溶液に加えることによって行われる、請求項１０に記載の方法。
12. 請求項１から４のいずれか１項に記載のナノ粒子、およびマトリックス剤を含む微粒子。
13. マトリックス剤が単糖、二糖、糖アルコールまたは多糖であることを特徴とする、請求項１２に記載の微粒子。
14. マトリックス剤である単糖が、グルコースであり、マトリックス剤である二糖が、トレハロース、スクロースまたはラクトースであり、マトリックス剤である糖アルコールが、マンニトールまたはソルビトールであり、およびマトリックス剤である多糖が、デンプンまたはデキストランであることを特徴とする、請求項１３に記載の微粒子。
15. 微粒子が空気力学的質量中央径０．５μｍ〜５μｍを有することを特徴とする、請求項１２から１４のいずれか１項に記載の微粒子。
16. ワクチン接種の使用のための、請求項１２から１５のいずれか１項に記載の微粒子。
17. 治療ワクチン接種のための医薬組成物であって、請求項１２から１６のいずれか１項に記載の微粒子を含む、医薬組成物。
18. 微粒子が粘膜投与により投与されることを特徴とする、請求項１７に記載の医薬組成物。
19. 粘膜投与が肺または鼻投与であることを特徴とする、請求項１８に記載の医薬組成物。
20. 請求項１から４のいずれか１項に記載のナノ粒子、およびマトリックス剤を含有する液体が、噴霧乾燥されることを特徴とする、請求項１２から１６のいずれか１項に記載の微粒子の調製方法。
21. （ａ）抗原負荷ナノ粒子、および水性分散液中に溶解されたマトリックス剤を含む水性分散液を調製するステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）において調製された水性分散液を噴霧乾燥して抗原負荷ナノ粒子含有微粒子を生成するステップと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）において得られた微粒子を回収するステップと
    を含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。