CN106456746B - 用于免疫疗法的抗原负载壳聚糖纳米颗粒 - Google Patents

用于免疫疗法的抗原负载壳聚糖纳米颗粒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含壳聚糖和抗原的纳米颗粒，由此所述壳聚糖具有约90％的脱乙酰度和5kDa至80kDa的分子量，涉及含有此类颗粒的微粒以及涉及此类颗粒的制备方法。所述颗粒可用于接种疫苗。

Description

用于免疫疗法的抗原负载壳聚糖纳米颗粒
本发明涉及包含壳聚糖和抗原的纳米颗粒，由此壳聚糖具有约90％的脱乙酰度和5kDa至80kDa的分子量，涉及含有此类纳米颗粒的微粒以及涉及制备此类颗粒的方法。所述颗粒可用于接种疫苗。
在20多年前，发现甲壳素衍生物包括壳聚糖具有免疫刺激活性。该免疫刺激活性，与甲壳素衍生物和葡聚糖(一种免疫佐剂类的天然多糖)之间的结构相似性一起，引导多位科学家研究壳聚糖的佐剂性能。关于壳聚糖及其衍生物的研究聚焦于其在与其它佐剂结合时对于免疫应答的影响。
由于其粘膜粘附性质，壳聚糖已被作为用于粘膜接种疫苗的佐剂来探索。由壳聚糖造成的疫苗增强的机理被认为是归因于经由粘膜粘附在鼻通道中的疫苗的保留和用于疫苗的细胞旁路转运的内皮细胞连接的打开这两者(Ilium等人，2001Adv Drug Dev51(l-3):81-96)。
壳聚糖的佐剂性质也已在对抗传染疾病和用于癌症疫苗的皮下疫苗制剂方面被探索(In vivo evaluation of chitosan as an adjuvant in subcutaneous vaccineformulations,R.Scherlieβ等人,Vaccine 2013；Chitin,Chitosan,and GlycatedChitosan Regulate Immune Responses:The Novel Adjuvants for Cancer Vaccine,X.Li等人,Clin and Dev Immunol,2013)。
颗粒疫苗也已在文献中被描述为具有佐剂性质(例如Pathogen recognition anddevelopment of particulate vaccines:Does size matter？,S.Xiang,Methods,2006)。
US 2004/0037840 A1(新型治疗性疫苗制剂)公开了针对多肽抗原的免疫应答可由与此类多肽抗原混合的壳聚糖诱导，并且公开了作为用于此的优选制剂的微粒。最优选的是所述微粒具有0.73和0.82μm之间的平均粒径和壳聚糖具有约95,000至约3,000,000的平均分子量和至少98％的脱乙酰度(DD)。
尽管有描述于现有技术中的制剂，仍存在对于其它制剂，特别是与现存的制剂相比较提供改善的效力的制剂的持续需求。因此，本发明的一个目标是提供此类制剂。
令人惊讶地，本发明已发现由含有抗原的壳聚糖纳米颗粒诱导的免疫应答急剧增强，若此类纳米颗粒的壳聚糖具有约90％的脱乙酰度(DD)和5千道尔顿(kDa)至80千道尔顿(kDa)的分子量的话。该发现与现有技术教导形成清晰的对比，现有技术教导颗粒中的壳聚糖的DD值应当优选尽可能地高(至少98％)并且壳聚糖应当优选具有在一范围内的平均分子量，该分子量比本发明的纳米颗粒的那些高得多，本发明的纳米颗粒的分子量已证明提供了增强的效果。因此，本发明的一个目的是涉及包含壳聚糖和抗原的纳米颗粒，其特征在于壳聚糖具有约90％的脱乙酰度和5kDa至80kDa的分子量。
如本文所使用的，“一”("a"或"an")应当表示一或更多。如本文所使用的，当连同单词“包含”使用时，单词“一”表示一或多于一。如本文所使用的“另一”表示至少第二或更多。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语包括复数，且复数术语包括单数。
如本文所使用的，术语“纳米颗粒”是指具有小于1μm的平均尺寸的颗粒。纳米颗粒优选具有规则形状，例如球形，但也可具有不规则形状。
如本文所使用的，术语“微粒”是指具有大于1μm的平均尺寸的颗粒。微粒可具有规则形状，例如球形，或不规则形状。在一个实施方式中，微粒由纳米颗粒和赋形剂构成，所述赋形剂能够提供纳米颗粒的充分的粘合以形成具有用于它们各自用途所需的充分的物理稳定性的微粒。合适的赋形剂可为，例如，具有粘合性质的赋形剂，诸如，例如糖或糖醇。
如本文所使用的，术语“壳聚糖”是指由无规分布的β-(1-4)-连接的D-葡糖胺(脱乙酰单元)和N-乙酰基-D-葡糖胺(乙酰化单元)组成的线性多糖。壳聚糖通过甲壳素的脱乙酰化来商业生产，甲壳素为N-乙酰基-D-葡糖胺的多糖。不同的壳聚糖可通过与甲壳素相比较的分子量、粘度和脱乙酰度(DD)来表征。
除了壳聚糖之外，能够与抗原形成纳米颗粒的其衍生物或类似物也可用于本发明的目的。此类类似物或衍生物可为改性壳聚糖，其中所述改性用于改变其物理、化学或生理学性质。这种类似物可通过归因于静电和/或亲水性和/或疏水性相互作用的非共价附着或通过与壳聚糖的共价结合来形成。类似物的实例包括，但不限于，通过在其上结合特异性或非特异性靶抗原和/或膜透化剂和/或内吞体裂解剂(endosomolytic agent)和/或核定位信号来改性的壳聚糖。其它实例是衍生的甲壳素或壳聚糖或以上提及的类似物，即，O-乙酰化和/或N-乙酰化和/或N-三甲基化壳聚糖或类似物。可通过静电相互作用使阴离子性分子(例如佐剂Poly(I:C)(聚肌苷酸:聚胞苷酸))附着至阳离子性N-三甲基化壳聚糖。基于壳聚糖的化合物可有利地进行交联，要么自然交联要么借助交联剂或胶凝剂例如戊二醛(Akbuga和Durmaz 1994Int J of Pharm 111,217–222；Aiedeh等人1997J.Microencapsul.14,567–576；Jameela,S.R.等人1995Biomaterials 16,769–775)、甲醛或藻酸盐凝胶作用(Liu,L.S.等人1997J.Control Rel.43,65–74；Alexakis,T.等人1995.Appl.Biochem.Biotechnol.50,93–106；Polk A.等人1994J.Pharm.Sci.83,178–185)进行交联。
如本文所使用的，术语“抗原”是指能够在脊椎动物，优选哺乳动物中引起细胞和/或体液免疫应答的蛋白质、多肽、肽或碳水化合物的全部或部分。在一个实施方式中，所述抗原是蛋白质、多肽、肽或核酸。在另一实施方式中，所述蛋白质、多肽或肽可为糖基化的。
如本文所使用的，术语“脱乙酰度”(DD)是指壳聚糖分子中的游离氨基相对于相应的甲壳素分子的N-乙酰基的最大可能数目的百分比。壳聚糖最常通过甲壳素的碱性脱乙酰化来制备，由此乙酰基被从甲壳素的N-乙酰基-D-葡糖胺单元中脱除，留下游离氨基(-NH2)。用于测定壳聚糖的脱乙酰度的方法在本领中广泛已知并且包括各种方法，例如茚三酮试验、线性电位滴定、近红外光谱、核磁共振光谱、溴化氢滴定分析、红外光谱和一阶导数紫外分光光度法(Khan T A,J Pharm Pharmaceut Sci 5(3):205-212,2002)。
重均分子量(Mw)通过静态光散射(SLS)来测定(Scherlieβ,R.,Buske,S.,Young,K.,Weber,B.,Rades,T.和Hook,S.,In vivo evaluation of chitosan as an adjuvantin subcutaneous vaccine formulations Vaccine31(2013)4812-4819)。
SLS通常用于测定多糖的Mw[Wu H.Correlations between the Rayleigh ratioand the wavelength for toluene and benzene.Chemical Physics 2010；367:44–7]。将激光送至样品中并测定散射光。散射光的强度与聚合物的分子量(重均)和浓度成比例。该比例性由简化的Rayleigh方程给出[Molecular weight measurements with theZetasizer Nano system:Malvern application note](方程2)
Figure BDA0001171804780000041
方程2：Rayleigh方程，其中K是光学常数，Rθ是Rayleigh比率，M是重均分子量，A2是第二维里系数且C是样品浓度。
在Debye曲线中使用Rayleigh方程，可产生KC/R对C的线性拟合，其中截距等于分子量倒数且所得斜率是第二维里系数的两倍。为测定分子量，使用ZetaSizer Nano ZS(Malvern Inc.,Malvern,UK)进行静态光散射测量。ZetaSizer Nano ZS是单角激光散射装置，其具有173°的角和He–Ne激光(633nm)作为光源。在每次样品测量之前，测定背景光强并测量作为散射标准的具有1.35×10-5cm-1的Rayleigh比率值的甲苯的反向散射。将样品溶解在pH值为4.5的0.02M乙酸钠和0.1M氯化钠中并假设0.192mL/g的折射率增量(dn/dc)(Nguyen S,Hisiger S,Jolicoeur M,Winnik FM,Buschmann MD.Fractionationandcharacterization of chitosan by analytical SEC and 1H NMR after semi-preparative SEC.Carbohydrate Polymers 2009；75:636–45)。制备并测量在0.25至1.00g/L范围内的五种不同的样品浓度。在各次测量之前，将样品通过0.45m PTFE过滤器过滤到方形玻璃池中。在20℃的温度下进行测量，并经由Debye曲线方法分析数据。
如本文所使用的，“约”是指数值，包括，例如整数、分数和百分数，不管是否明确指示。术语“约”通常是指本领域普通技术人员将认为等同于所述值(即具有相同的功能或结果)的数值范围(例如所述值的+/-1-3％)。在一些情况下，术语“约”可包括四舍五入到最接近的有效数字的数值。
有利地，存在于纳米颗粒中的壳聚糖具有10kDa至80kDa、优选20kDa至60kDa、且更优选25kDa至50kDa的分子量。因此，本发明的一个实施方式涉及纳米颗粒，其特征在于壳聚糖具有10kDa至70kDa、优选20kDa至60kDa且更优选25kDa至50kDa的分子量。
从US 2004/0037840 A1(其公开了用于治疗性疫苗制剂的壳聚糖颗粒)中已知疫苗颗粒应当最优选具有在0.73和0.82μm之间的范围内的粒径(见上)。相比之下，本发明已发现若壳聚糖纳米颗粒具有100至500nm的平均尺寸，则它们展现强且优异的免疫学效果。若纳米颗粒具有200nm至400nm，特别是200nm至300nm的平均粒径，则此类免疫学效果得到增强。因此，本发明的另一实施方式涉及纳米颗粒，其特征在于该纳米颗粒具有100至500nm、优选200至400nm并更优选200nm至300nm的平均尺寸。
如本文所使用的，术语“平均尺寸”是指在水性介质中一起运动的纳米颗粒群的流体动力学平均直径(“z-平均”)。该z-平均被ISO 22412定义为‘调和强度平均的粒径’。为比较通过不同技术测量的z-平均尺寸，样品必须为单模态的(即仅一个峰)、球形或近球形形状和单分散的(即非常窄的分布宽度)。这些系统的平均尺寸可通过本领域技术人员已知的并且描述于例如实验部分(见下文)的标准方法来测量。
有利地，本发明的纳米颗粒包含抗衡离子。因此，本发明的优选实施方式涉及纳米颗粒，其特征在于它们含有抗衡离子。
如本文所使用的，术语“抗衡离子”是指衍生自有机或无机酸盐的阴离子或阴离子性基团，其抵消通过壳聚糖的质子化氨基衍生的壳聚糖的正电荷。可用于本发明的抗衡离子可分成两个主要类别：低分子量抗衡离子例如氯离子(其可通过使用例如CaCl2,BaCl2,MgCl2,CuCl2,ZnCl2,CoCl2来采用)、NaSO4、焦磷酸根、三聚磷酸根、四聚磷酸根、八聚磷酸根、六偏磷酸根和[Fe(CN)6]-4/[Fe(CN)6]-3，以及高分子量离子例如辛基硫酸根、月桂基硫酸根、十六烷基硫酸根、鲸蜡硬脂基硫酸根、胆酸钠、羧甲基纤维素或聚丙烯酸。
在本发明的优选实施方式中，所述纳米颗粒含有羧甲基纤维素、三聚磷酸五钠、胆酸钠、肝素、低分子量透明质酸、藻酸盐、果胶、角叉菜胶、核酸(例如RNA或DNA)或聚丙烯酸作为抗衡离子。因此，本发明进一步涉及纳米颗粒，其特征在于所述抗衡离子是羧甲基纤维素、三聚磷酸五钠、胆酸钠、肝素、透明质酸、藻酸盐、果胶、角叉菜胶、核酸(例如RNA、DNA或基于RNA的RIG-I样((维甲酸诱导基因I)样)受体激动剂)或聚丙烯酸。
所述纳米颗粒有利地含有肽、多肽或蛋白质作为抗原。因此，本发明优选的实施方式涉及纳米颗粒，其特征在于所述抗原是肽、蛋白质或核酸。
如本文所使用的，术语“肽”是指通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的链。在一些实施方式中，肽可包括至少3-5个氨基酸，其各自借助至少一个肽键与其它结合。术语“肽”有时包括“非天然”氨基酸或尽管如此但能够整合到多肽链中的其它实体。术语“肽”包涵术语“多肽”，如本文所使用的，术语“多肽”是指含有约10至约100个氨基酸或更多的长的、连续的并且非支化的肽链。
如本文所使用的，术语“蛋白质”是指含有通过肽键彼此连接的多于100个氨基酸的大分子。蛋白质含有一个或更多个多肽，所述多肽例如通过一个或更多个二硫键连接或通过其它手段相关联，并可包括除了氨基酸以外的部分(例如可为糖蛋白、蛋白多糖等)和/或可以别的方式处理或修饰。“蛋白质”可为如由细胞产生的完整的多肽链(具有或不具有信号序列)，或可为其特征性部分。
肽、多肽和蛋白质可含有l-氨基酸、d-氨基酸或两者，并可含有本领域已知的各种氨基酸修饰或类似物中的任何种。有用的修饰包括，例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方式中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。
如本文所使用的，术语“核酸”是指包含单一核苷酸或通过磷酸酯基在一个核苷酸的3'位连接至另一核苷酸的5'端的两个或更多个核苷酸的天然或合成分子。核酸不受长度限制，并因此核酸可包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
若核酸作为抗原存在，则其可(归因于其负电荷)抵消通过壳聚糖的质子化氨基衍生的壳聚糖的正电荷。在此类情况下，核酸自身充当如上所述的抗衡离子，使得不必需更多的抗衡离子或仅需要减少量的抗衡离子。
尽管壳聚糖具有佐剂作用，在本发明的一个实施方式中，所述纳米颗粒可进一步含有佐剂。
如本文所使用的，术语“佐剂”是指能够增强对于抗原的免疫应答的任何物质。若将佐剂与抗原组合，则此类组合诱导对于抗原的免疫应答，该免疫应答比由单独的抗原诱导的免疫应答更强。可用的佐剂的实例是CpG、CTB、c-di-AMP、Poly IC、基于RNA的RIG-I受体激动剂或细胞因子。
所述纳米颗粒可用于接种疫苗，包括预防性接种疫苗和治疗性接种疫苗。因此，本发明还涉及用于接种疫苗的用途的纳米颗粒。本发明的具体实施方式是用作治疗性疫苗的纳米颗粒以及用作预防性疫苗的纳米颗粒。纳米颗粒用于治疗性接种疫苗的用途是特别优选的。
如本文所使用的，如本文所使用的术语“疫苗”是指治疗性或预防性药物制剂，其含有针对其诱导接种疫苗的宿主以提高免疫应答、优选保护性免疫应答的组分。优选地，诱导免疫应答的此种组分是抗原。
如本文所使用的，与“疫苗”一起的术语“治疗性”是指在疾病发作或检测之后，由疫苗诱导的免疫应答治疗、改善或减轻进行中的疾病，诸如，例如癌症。如本文所使用的，术语“治疗性接种疫苗”是指使用治疗性疫苗来治疗、改善或减轻进行中的疾病，例如AIDS、结核病、自身免疫疾病(例如多发性硬化和类风湿性关节炎)、胃溃疡或癌症。
如本文所使用的，与“疫苗”一起的术语“预防性”是指在未感染的对象中由疫苗诱导免疫应答以提供对抗由微生物或病毒感染诱导的疾病的保护或降低微生物入侵的严重度。如本文所使用的，术语“预防性接种疫苗”是指使用预防性疫苗来诱导未感染对象中的免疫应答以提供对抗由微生物或病毒感染诱导的疾病的保护或降低微生物入侵的严重度。
根据本发明特别优选的实施方式，所述纳米颗粒用于治疗性接种疫苗，优选用于癌症接种疫苗。同样地，本发明还涉及纳米颗粒用于治疗性接种疫苗、优选用于癌症接种疫苗和用于自身免疫疾病的接种疫苗的用途。
在癌症接种疫苗的情况下，所述纳米颗粒必须含有适当的肿瘤抗原。用于癌症接种疫苗的纳米颗粒必须(i)包括结合主要组织相容性复合物(MHC)I类的肽序列，(ii)被肿瘤细胞处理并变得可用于结合MHC I分子，(iii)以MHC I–限制方式被T细胞库识别，和(iv)驱动表达特异性T细胞受体的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)前体的扩展(Matera L,CancerTreat Rev 36(2):131–141,2010)。
因为第一基因的分子克隆被报道为编码CTL-限定人肿瘤抗原MAGE(黑素瘤相关抗原)，并且随着新技术的发展，很多被在人癌症上的T细胞识别的其它抗原，所谓的肿瘤相关抗原(TAA)，已被鉴定和表征(Van der Bruggen等人,J Immunol 178(5):2617–2621,2007；Novellino L等人,Cancer Immunol Immunother 54(3):187–207,2005)。TAA的其它实例是CEA(癌胚抗原)、CA-125(癌抗原125)、MUC-1(粘蛋白1)、ETA(上皮肿瘤抗原)和CTAG1B(癌/睾丸抗原1b)。
本发明的纳米颗粒可通过各种途径来施用，例如经由粘膜或肠胃外途径，例如皮下、肌肉内、腹膜内和静脉内途径。如本文所使用的，术语“粘膜的”是指被粘膜覆盖的身体的任何膜表面，例如鼻、肺、口(舌下、口腔)、胃肠、直肠、泌尿、结膜、腺例如乳腺、上皮的粘膜。因此，本发明的一个实施方式涉及纳米颗粒用于接种疫苗的用途，其特征在于所述纳米颗粒通过粘膜给药或通过肠胃外注射来施用。优选地，所述纳米颗粒通过粘膜途径施用，由此特别优选鼻和肺途径。因此，一个优选的实施方式涉及纳米颗粒用于接种疫苗的用途，其特征在于所述粘膜给药是肺或鼻给药。
可使用本领域已知的液体分散体和设备进行纳米颗粒的粘膜给药。通过使用本领域已知的设备，液态纳米颗粒分散体的输送可伴随受控粒径范围来进行，所述粒径范围适于特定的给药途径。例如，可通过使用机械泵或喷雾器向鼻粘膜施用纳米颗粒分散体。可例如通过使用市售的加压定量吸入器(pMDIs)将纳米颗粒分散体雾化至肺来实现向肺粘膜的输送。优选用于向粘膜施用纳米颗粒的液体分散体是水性分散体，其中纳米颗粒分散在水溶液中。
可通过本领域技术人员已知的各种方法制备壳聚糖纳米颗粒，所述方法例如离子凝胶化法、乳化和交联、乳化液滴聚结、乳化溶剂扩散、反相胶束化、离子凝胶化、聚电解质络合、用自由基聚合的改进的离子凝胶化、去溶剂化(A.Grenha,Chitosan nanoparticles:a survey of preparation methods,J Drug Targeting,2012)。离子凝胶化法是优选的，因为其非常简单而且温和，并且因为其包括通过静电相互作用产生的可逆的物理交联，而不是化学交联，这避免了可能的试剂毒性和其它不合意的作用。有利地，可在不使用有害溶剂(特别是有机溶剂)的温和条件下制备纳米颗粒，所述有害溶剂(特别是有机溶剂)可引起抗原的降解，当若所述抗原是不稳定的且对于其它工艺环境敏感的肽或蛋白质抗原的话，情况可能是这样的。
如本文所使用的，术语“离子凝胶化”是指带相反电荷的分子之间的的络合以制备纳米颗粒。在离子凝胶化法的一个实施方式中，将壳聚糖溶解在水性介质中，该水性介质优选是弱酸性的，以促进游离氨基酸基团(-NH2)向其带正电荷的质子化形式(-NH3 +)的转化。随后将此溶液与含有带负电荷的抗衡离子的水溶液组合，例如通过将含有壳聚糖的水溶液添加至含有带负电荷的抗衡离子的水溶液中或反过来。优选地，通过在恒定搅拌下将一种水溶液逐滴添加至另一种水溶液来完成水溶液的组合。归因于带相反电荷的物质之间的络合，壳聚糖经历离子凝胶化并沉淀以形成球形颗粒。可通过过滤、用蒸馏水洗涤并干燥除去纳米颗粒。因此，本发明的优选实施方式涉及用于制备纳米颗粒的方法，其特征在于通过离子凝胶化制备所述纳米颗粒。
如本文所使用的，术语“水溶液”是指任何溶液或悬浮液，其中至少一些存在的溶剂由水组成。可存在的其它溶剂成分是醇类，诸如，例如乙醇、丙醇、丙二醇或甘油。水溶液优选包含水或乙醇/水混合物作为溶剂，该溶剂特别优选由水组成。在某些实施方式中，水溶液包含pH调节剂，例如酸、碱或缓冲剂物质。在优选的实施方式中，水溶液含有提供弱酸性pH的试剂，例如乙酸/乙酸盐缓冲剂。
用于制备纳米颗粒的适当方法包括以下步骤：(a)制备包含壳聚糖和抗原的水溶液；(b)制备包含抗衡离子的水溶液；(c)将在步骤(a)中制备的水溶液和通过步骤(b)制备的水溶液混合；(d)搅拌在步骤(c)中获得的混合物以产生含有壳聚糖纳米颗粒的含水分散体；(e)收集在步骤(d)中获得的纳米颗粒。
因此，本发明还涉及用于制备纳米颗粒的方法，其包括以下步骤：
(a)制备包含壳聚糖和抗原的水溶液；
(b)制备包含抗衡离子的水溶液；
(c)将在步骤(a)中制备的水溶液和通过步骤(b)制备的水溶液混合；
(d)搅拌在步骤(c)中获得的混合物以产生含有壳聚糖纳米颗粒的水性分散体；
(e)收集在步骤(d)中获得的纳米颗粒。
根据所述方法的替代实施方式，所述抗原存在于包含抗衡离子的水溶液(步骤(b))中，而不是包含壳聚糖的水溶液(步骤(a))中。根据所述方法的另一替代实施方式，所述抗原存在于两种水溶液中，即存在于包含壳聚糖的水溶液(步骤(a))中和存在于包含抗衡离子的水溶液(步骤(b))中。
优选地，通过将步骤(b)中制备的水溶液添加至通过步骤(a)制备的水溶液进行此方法的步骤(c)中的水溶液的混合。因此，本发明还涉及制备纳米颗粒的方法，其中通过将步骤(b)中制备的水溶液添加至通过步骤(a)制备的水溶液进行步骤(c)。
如上所述，本发明的纳米颗粒可有利地用于接种疫苗，由此粘膜给药，尤其是肺和鼻给药，是优选的给药途径。归因于它们的小粒径，此类纳米颗粒不可以适当方式直接施用，并需要被分散在液体介质中，特别是水性介质中，其可对于纳米颗粒在储存期间的稳定性具有有害作用。例如，在没有提供适当粒径的液体介质的情况下，非常小的纳米颗粒的直接肺给药导致它们的呼出，使得不会诱导肺粘膜的免疫应答。具有可用于直接给药的粒径的含有纳米颗粒的干燥颗粒制剂是非常期望的。在被施用至粘膜并与粘膜接触之后，所述颗粒有利地应当释放纳米颗粒，例如通过它们的崩解。
因此，本发明的又一目标是提供包含本发明的纳米颗粒的颗粒。此类颗粒通过包含本发明的纳米颗粒和基质剂的微粒来提供。
如本文所使用的，术语“基质剂”是指试剂或化合物，其在它们存在于粘膜上，例如肺泡粘膜和鼻粘膜上时至少部分可溶于水和水性介质，并且可将基质和/或纳米颗粒的粘附提供至彼此以形成更大的颗粒。在与基质剂形成的微粒中，纳米颗粒可排列成团聚物和/或可完全和/或部分被基质剂包围。在微粒与水或水性介质接触之后，基质材料部分或全部溶解在此类介质中，导致微粒的崩解和含在其中的纳米颗粒的释放。
优选的基质剂是单糖、二糖、糖醇或多糖。因此，本发明的一个实施方式涉及微粒，其特征在于所述基质剂是单糖、二糖、糖醇或多糖。
特别优选的基质剂是单糖葡萄糖，二糖海藻糖、蔗糖和乳糖，糖醇甘露糖醇和山梨糖醇，以及多糖淀粉和葡聚糖。因此，本发明进一步涉及包含纳米颗粒的微粒，其特征在于所述基质剂单糖是葡萄糖，基质剂二糖是海藻糖、蔗糖或乳糖，基质剂糖醇是甘露糖醇或山梨糖醇，并且基质剂多糖是淀粉或葡聚糖。
在肺给药中，活性颗粒的尺寸在确定吸收位点方面非常重要。为了实现颗粒被携带进入肺深处，该颗粒必须具有特定尺寸，例如应当具有小于10μm的质量中值空气动力学直径(MMAD)。具有大于10μm的MMAD的颗粒可能撞击喉壁并且通常不会到达肺。可通常考虑具有高于10μm的MMAD的颗粒沉积在口咽中，测量为5和10μm之间的那些沉积在中心气道中且0.5至5μm的那些沉积在小气道和肺泡中。因此，针对呼吸治疗(吸入)，优选使用具有0.5至5μm之间的MMAD的颗粒。
如本文所使用的，术语“质量中值空气动力学直径”(缩写为MMAD)是分散颗粒的空气动力学尺寸的量度。该MMAD分布定义了在吸入期间气雾剂沉积的方式，并且是与所述颗粒具有相同沉降速度(通常在空气中)的单位密度颗粒的中值直径。MMAD包涵颗粒形状、颗粒的密度和物理尺寸并且是指通过Anderson cascade impaction或Next GenerationImpactor(NGI)测定的气雾化粉末的空气动力学粒径分布的中点或中值。在我们的研究中，使用了170型Next Generation Pharmaceutical Impactor(NGI)，其是高性能、精确、颗粒分类的阶式碰撞取样器，其用于测试定量、干粉和类似的吸入器设备。MSP Corporation连同15成员的制药公司联合会(Next Generation Impactor Consortium)开发了该碰撞取样器。在设计过程中的大量的用户参与导致了空气动力学设计原理和用户友好操作的组合。一套可去除的收集杯使吸入器测试之间的时间最小化。其它节省时间的特征包括最终的过滤器和进口O形环的缺失。NGI已经过Next Generation Impactor Consortium中的15家制药公司测试。
本发明的一个实施方式是指具有0.5μm至8μm、优选0.5μm至5μm、更优选1μm至5μm并最优选2μm至5μm的MMAD的微粒。因此，本发明还涉及微粒，其特征在于它们具有0.5μm至5μm、优选1μm至5μm并更优选2μm至5μm的质量中值空气动力学直径。
所述微粒可用于接种疫苗。因此，本发明的一个实施方式涉及用于接种疫苗的纳米颗粒。
根据本发明的优选实施方式，所述微粒用于治疗性接种疫苗，优选用于癌症接种疫苗。类似地，本发明还涉及微粒用于治疗性接种疫苗，优选用于癌症接种疫苗的用途。
除了用于纳米颗粒的上述的其它各种给药途径之外，所述微粒优选通过粘膜给药，更优选通过肺或鼻给药来施用，由此最优选肺给药。因此，一个优选的实施方式涉及所述微粒用于治疗性接种疫苗的用途，其特征在于所述粘膜给药是肺或鼻给药。
针对粘膜给药，可例如通过使用市售的设备，例如加压计量吸入器(pMDIs)或干粉吸入器(DPI's)施用所述微粒。若向肺粘膜施用，则优选干粉吸入器。市售的DPI’s为例如Puffhaler(Aktiv-Dry LLC)、TwinCaps(Hovione LLC)、Torus DPI(Manta Devices LLC)、Conix One(3M)和DirectHaler Pulmonary(Direct-Haler A/S)、Cyclohaler(PB PharmaGmbH)。
可通过使用喷雾干燥技术来制备所述微粒。如本文所使用的，术语“喷雾干燥”是指通过使用喷雾干燥器由溶液或悬浮液产生包含微米尺寸颗粒的干燥粉末的方法。喷雾干燥原则上是一个溶剂提取过程。将待获得的产物的成分溶解/分散在液体中并随后例如通过使用蠕动泵将其进料至喷雾干燥器的雾化器中。可用于使液体雾化的合适的雾化器包括喷嘴或转盘。关于喷嘴，雾化由于压缩气体的作用而发生，而在使用转盘的情况下，雾化由于盘的快速旋转而发生。在两种情况下，雾化导致液体被破坏成小液滴进入干燥室中，其中溶剂被从气雾剂液滴中提取并排出，例如通过排气管至溶剂捕集器(solvent trap)中。
通过喷雾干燥可产生10至500μm的液滴尺寸。当溶剂(水或有机溶剂)干燥时，含有纳米颗粒的液滴干燥成微米尺寸的颗粒，从而形成粉末状颗粒。
可使用许多市售喷雾干燥机器来制备本发明的微粒，例如，合适的机器由Buchi和Niro制造。合适的喷雾干燥器的实例包括来自Buchi的实验室规模的喷雾干燥器，例如MiniSpray Dryer 290、或MOBILE MINORTM，或来自Niro的Pharma Spray Dryer
Figure BDA0001171804780000141
，或来自Procept NV的4M8-TriX。
在典型的喷雾干燥机器中，将待干燥的悬浮液从搅拌的储器中泵送至雾化室，在其中其从喷嘴作为微细液滴(优选该液滴直径在1至20μm范围内)喷出进入加热空气流中，例如，进口温度在50至150℃范围内(若存在不合意的抗原氧化的风险，则可使用氮气代替空气)。加热空气的温度必须足以使液体蒸发并使微粒干燥成自由流动的粉末，但是不应像使活性物质降解的温度那么高。可在旋风分离器或过滤器或旋风分离器和过滤器的组合中收集微粒。
可用于制备所述微粒的合适的喷雾干燥技术是众所周知的，并例如由K.Masters描述于"Spray-drying Handbook",John Wiley&Sons,New York,1984。在优选实施方式中，通过使用喷嘴进行液体的雾化。
根据本发明的适当的实施方式，将含有本发明的纳米颗粒和基质剂的液体喷雾干燥。因此，本发明的一个目标涉及用于制备所述微粒的方法，其特征在于将含有所述纳米颗粒和基质剂的液体喷雾干燥。所述液体优选是水溶液，其中溶解所述基质剂并分散所述纳米颗粒。
优选地，所述方法包括步骤(a)制备包含抗原负载纳米颗粒和被溶解在其中的基质构建剂的水性分散体；(b)喷雾干燥在步骤(a)中制备的水性分散体，以产生含有抗原负载纳米颗粒的微粒和(c)收集在步骤(b)中获得的微粒。因此，本发明还涉及一种方法，其特征在于其包括以下步骤：
(a)制备包含抗原负载纳米颗粒和被溶解在其中的基质构建剂的水性分散体；
(b)喷雾干燥在步骤(a)中制备的水性分散体，以产生含有抗原负载纳米颗粒的微粒和
(c)收集在步骤(b)中获得的微粒。
与“纳米颗粒”一起的术语“抗原负载”是指包含如本发明所述和/或所要求保护的抗原的纳米颗粒。
若意欲通过使用干粉吸入器施用所述微粒，则可将颗粒状赋形剂材料与所述微粒混合以改善粉末的流动。此类赋形剂材料的颗粒可为粗颗粒，例如具有大于90μm的质量中值空气动力学直径(此类粗颗粒称作载体颗粒)，或它们可为细颗粒。
实施例解释本发明，但本发明不限于此。
纳米颗粒的粒径分析
使用Zetasizer(Malvern Instruments)应用动态光散射(DLS)进行粒径和ζ电位测量。针对数据分析，基于以下参数使用‘通用’分析模式：
粘度：1.01mPas(在22℃下)
折射率：1.328
使各样品在120秒内平衡至22℃并一式三份进行分析。
使用特定电池进行ζ电位测量。使用10-100次运转(自动调节)同样一式三份进行测量。数据分析基于Smoluchowski模式。
微粒的粒径分析
使用HELOS激光衍射仪(Sympatec GmbH,Clausthal,Zellerfeld,Germany)进行喷雾干燥产品的粒径分布。使用3bar分散喷雾干燥的粉末并使用HELOS Rodus模块进行测量。
基于胶囊的吸入器’Cyclohaler’用于空气动力学表征。使用HELOS吸入器模块进行测量。使用100l/min(＝4kPa跨越吸入器的压差降)的空气流量将粉末从吸入器中释放。通过激光衍射测定粒径分布。使用吸入器分散填充有10mg喷雾干燥粉末的HPMC胶囊(3号)。测量X50，粉末部分<5.25μm以及相对解聚作用。
纳米颗粒的制备(一般描述)
通过离子凝胶化制造纳米颗粒。通过由带正电荷的壳聚糖的伯氨基与带负电荷的纤维素衍生物的羧基的静电相互作用产生的离子交联自发形成纳米颗粒。
对于壳聚糖溶液的制备，将准确量的壳聚糖(Chitoscience,Heppe MedicalChitosan)，例如0.1％，溶解于酸性酸溶液，例如2％中。通过将准确量的Tylose C30(Hoechst)，例如0.1％，溶解于纯水中制备羧甲基纤维素溶液并将其缓慢添加至壳聚糖相，同时在磁力搅拌器上搅拌。所得的纳米颗粒(具有壳聚糖/酸性酸/Tylose比率0.1/2和0.1％)具有230nm的平均尺寸和0.140的多分散指数(PDI)(通过Zetasizer Nano ZS,Malvern Instruments测量)。通过离心分离对纳米颗粒取样并将其重新悬浮在1％乙酸中。将抗衡离子溶解于纯水中，相应地制备含有不同抗衡离子的制剂(例如用肝素、透明质酸和聚丙烯酸酯的实例)。
最终纳米颗粒悬浮液的组成如下：
Figure BDA0001171804780000161
Figure BDA0001171804780000171
Figure DA00011718047850989296
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Figure BDA0001171804780000172
Figure BDA0001171804780000181
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Figure DA00011718047851112187
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Figure DA00011718047851149343
Figure BDA0001171804780000191
Figure BDA0001171804780000201
如下产生卵白蛋白负载纳米颗粒。将0.1％(w/V)壳聚糖(Heppe MedicalChitosan GmbH,Germany)与1mg/ml卵白蛋白(OVA；Sigma,USA)溶解于2％(V/V)乙酸中。
将0.1％(w/V)的带负电荷的纤维素衍生物(Tylose C30,Hoechst,Germany)作为用于离子凝胶化的试剂单独溶解在相同体积的两份蒸馏水中并将其缓慢添加至壳聚糖相，同时搅拌。替代地，如下产生卵白蛋白负载纳米颗粒。将0.1％(w/V)壳聚糖(Heppe MedicalChitosan GmbH,Germany)溶解(OVA；Sigma,USA)在2％(V/V)乙酸中。
将0.1％(w/V)的带负电荷的纤维素衍生物(Tylose C30,Hoechst,Germany)作为用于离子凝胶化的试剂与1mg/ml卵白蛋白单独溶解在相同体积的两份蒸馏水中并将其缓慢添加至壳聚糖相，同时搅拌。还可在以上提及的过程之后将卵白蛋白溶解在Tylose相中。壳聚糖与Tylose的最佳比率确定为1:1。须要将Tylose溶液添加至壳聚糖溶液以获得所需粒径。
粒径对于它们被抗原提呈细胞(巨噬细胞和树突细胞)摄取的影响
本研究中所用的巨噬细胞和树突细胞分离自C57BL/6j小鼠的骨髓(对于分离方案参见
Figure BDA0001171804780000202
M.等人,Mol Immunol.2011,48(9-10):1139-48)。简要地，骨髓细胞分离自小鼠的后腿并将其在用10％FCS、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、50μMβ-巯基乙醇和100nMM-CSF或100nM GM-CSF(分别用于巨噬细胞或树突细胞分化)补充的RPMI培养基中，在加湿培养器中(5％CO2和37℃)、在未经处理的皮氏培养皿中以0.8×106个细胞/ml的细胞浓度进行培养。对于分化过程，使用细胞系R1的上清液来产生含有GM-CSF或M-CSF的上清液，并在用于实验之前用ELISA测量其浓度。在四天后，将细胞1:2分开在额外的皮氏培养皿上并用新鲜添加的培养基和生长因子培养额外三天。在另外三天之后，将粘附细胞用于体外实验、FACS分析和微观实验。对于NP-摄取研究，将5x104个巨噬细胞以100μl的体积(DMEM、10％FCS、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素)接种在96-孔细胞培养物处理的载玻片中。随后在不同时间点在100μl细胞培养基中添加具有或不具有荧光的100μg/ml或1000μg/ml壳聚糖-NP或二氧化硅-NP。在培养期之后，刮下细胞，用PBS洗涤两遍并制备用于流式细胞术。
实验结果显示于图1和2中：通过髓系抗原提呈细胞产生的FITC-负载NP或不含FITC-负载的对照NP的尺寸依赖性摄取(n＝4，作为一式三份)。所有测试的NP-尺寸的平均值±SD都是针对0.1mg/ml的壳聚糖和二氧化硅显示。
除了壳聚糖之外，研究了二氧化硅和PLGA纳米颗粒(所有都是FITC标记的)以确定用于通过抗原提呈细胞摄取的优选粒径。此处还呈现了二氧化硅NP的结果，因为其在制造同样微米尺度的那些颗粒上是技术上可行的(与壳聚糖颗粒形成对比)。壳聚糖NP(和二氧化硅)的结果表明随着粒径在500nm以上，摄取率降低。对于有利的通过抗原提呈细胞进行的摄取的粒径最有效点(sweet spot)显示为200-300nm。
免疫测试方法
细胞培养见上
CD8+T细胞(CTLs)的分离
从OTI小鼠的脾脏分离首次用于实验的(naive)CD8+T细胞并通过autoMACS(Miltenyi Biotec)进行纯化。在将细胞计数之后，将它们直接用于与巨噬细胞或树突细胞体外共培养。
流式细胞术
在流式细胞术缓冲剂中在Fc受体阻断剂(对于小鼠CD16-CD32(10μg/ml)的单克隆抗体2.4G2；内部制备)的存在下进行抗体染色。FACSCanto II或Fortessa(BDBiosciences)和FlowJo软件(TreeStar)用于获取和数据分析。Hoechst 33258(10μg/ml；Sigma-Aldrich)用于排除死细胞。
用于流式细胞术的抗体如下(eBioscience)：
别藻蓝蛋白-或Alexa Fluor488-缀合的抗-CD69(H1.2F3)。
体外实验
对于壳聚糖-Ova-NP的体外评价，使用100μl体积(DMEM、10％FCS、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素)的在细胞培养物处理的96-孔板中的5x104个巨噬细胞或树突细胞。随后添加在50μl培养基中的1x105个新鲜分离的CD8+OTI T细胞和在50μl培养基中的相同浓度的壳聚糖-Ova-NP或游离的未负载卵白蛋白。在24h后，分离上清液(其储存在-20℃下用于随后的ELISA测量)并将剩余的细胞用于流式细胞术分析。
细胞因子测量
用于检测IL-2(eBioscience)的小鼠特异性ELISA用于体外产生的上清液，且基于珠的Th1/Th210plex(FlowCytomix,eBioscience)用于测定血样的血清中的T细胞特异性细胞因子。
实验结果显示于图3中：不同脱乙酰壳聚糖NP的比较。OTI t细胞的抗原依赖性CD69表达和IL-2产量的平均+/-SD。壳聚糖的NP尺寸为250±30nm。采用所指示的卵白蛋白浓度作为未结合的对照(卵白蛋白组)或负载在所指示的聚合物类型的NP内24h来培养OTIt细胞。通过FACS检测CD69表达，通过ELISA检测IL-2。
针对由不同脱乙酰度(DD)的壳聚糖制备的纳米颗粒(～260nm)在普通免疫设定(CD69,IL-2)中的体外性能，使用卵白蛋白作为模型抗原对它们进行研究。具有75或95％DD的壳聚糖纳米颗粒显示与可溶性卵白蛋白相比较的增强的免疫效果，在IL-2的情况中增强了10倍。这种改善在由纳米颗粒和壳聚糖的佐剂性质的组合产生的期望范围内。令人惊讶地，与具有75或95％的DD的相同颗粒相比较，具有90％的DD的壳聚糖纳米颗粒显示免疫应答的急剧增强(对于IL-2而言，与可溶性卵白蛋白相比较，增强了38倍，参见图3)，这与现有技术发现相反。该数据展现与现有技术制剂相比较的本发明颗粒的较好的免疫应答和它们对于治疗性接种疫苗的有效性。
微粒的制备
为获得干粉制剂，将2％(w/V)甘露糖醇(Pearlitol 200SD,Roquette,France)的基质添加到纳米颗粒悬浮液中，并使用Büchi B-290Mini喷雾干燥器(Büchi,Flawil,Switzerland)分别以80℃和35℃的进口温度和出口温度进行喷雾干燥。
微粒的MMAD分析
使用Next Generation Impactor(NGI)进行空气动力学表征。
对于空气动力学表征，将HPMC胶囊(3号)填充20mg(±0.1mg)的喷雾干燥粉末。通过Cyclohaler分散胶囊。调节空气流量至跨越吸入器的压降为4kPa。对于各次吸入将真空量(vacuum capacity)调节至4l流量。NGI的不同阶段涂覆有丙二醇和异丙醇的混合物。一个胶囊用于各次运行。在各次运行之后，用限定量的0.1M NaOH清洁NGI部分。将清洁流体转移至试管并在37℃下培养直至获得清澈溶液。用0.1M HCl(1:1比率)中和该溶液。通过BCA分析测定NGI的各阶段的卵白蛋白含量。基于所使用的流量，使用CITDAS软件针对流量计算细粉分数(FPF)、质量中值空气动力学直径(MMAD)和几何标准偏差(GSD)。结果显示于图4：卵白蛋白(OVA)由在100L/min的Cyclohaler分散的NGI中的干粉微粒制剂的沉淀(n＝3，误差条显示标准偏差)。FPF是75.37％且质量中值空气动力学直径(MMAD)是1.102μm。这表明高分数的颗粒能够在肺中分布。
针对喷雾干燥微粒在分散到水性介质中后释放初始尺寸的OVA-负载壳聚糖NP的能力，对它们进行研究。结果显示于图5：原始NP在SD之前(黑线)尺寸平均190.5nm PDI0.182；在SD之后(灰线)尺寸平均209.5nm PDI 0.145(SD：喷雾干燥，NP：纳米颗粒)。
原始NP和经处理的NP的颗粒尺寸和多分散指数相类似。这表明喷雾干燥不改变NP用于接种疫苗的有利的靶产物曲线。

Claims (31)

1.包含壳聚糖和抗原的纳米颗粒，其特征在于所述壳聚糖具有90%的脱乙酰度和5 kDa至80 kDa的分子量，并且所述纳米颗粒含有抗衡离子，所述抗衡离子是羧甲基纤维素、三聚磷酸五钠、胆酸钠、肝素、低分子量透明质酸、藻酸盐、果胶、角叉菜胶或聚丙烯酸。
2.根据权利要求1的纳米颗粒，其特征在于所述壳聚糖具有10 kDa至70 kDa的分子量。
3.根据权利要求2的纳米颗粒，其特征在于所述壳聚糖具有20 kDa至60 kDa的分子量。
4.根据权利要求2的纳米颗粒，其特征在于所述壳聚糖具有25 kDa至50 kDa的分子量。
5.根据权利要求1或2的纳米颗粒，其特征在于所述纳米颗粒具有100 nm至500 nm的平均尺寸。
6.根据权利要求5的纳米颗粒，其特征在于所述纳米颗粒具有200 nm至400 nm的平均尺。
7.根据权利要求5的纳米颗粒，其特征在于所述纳米颗粒具有200 nm至300 nm的平均尺寸。
8.根据权利要求1至4和6至7中的任一项的纳米颗粒，其特征在于所述抗原是肽或核酸。
9.根据权利要求1至4和6至7中的任一项的纳米颗粒，其特征在于所述抗原是蛋白质。
10.根据权利要求1至4和6至7中的任一项的纳米颗粒，其特征在于其含有佐剂。
11.根据权利要求1至4和6至7中的任一项的纳米颗粒，用于接种疫苗。
12.根据权利要求1至11中的任一项的纳米颗粒在制备用于治疗性接种疫苗的疫苗中的用途。
13.根据权利要求12的用途，其特征在于所述疫苗用于癌症接种疫苗。
14.根据权利要求12或13的用途，其特征在于通过粘膜给药或通过肠胃外注射施用所述纳米颗粒。
15.根据权利要求14的用途，其特征在于所述粘膜给药是肺或鼻给药。
16.用于制备根据权利要求1至11中的任一项的纳米颗粒的方法，其特征在于通过离子凝胶化制备所述纳米颗粒。
17.根据权利要求16的方法，其包括以下步骤：
(a)制备包含壳聚糖和抗原的水溶液；
(b)制备包含抗衡离子的水溶液；
(c)将在步骤(a)中制备的水溶液和通过步骤(b)制备的水溶液混合；
(d)搅拌在步骤(c)中获得的混合物以产生含有壳聚糖纳米颗粒的水性分散体；
(e)收集在步骤(d)中获得的所述纳米颗粒。
18.根据权利要求17的方法，其中通过将在步骤(b)中制备的水溶液添加至通过步骤(a)制备的水溶液来进行步骤(c)。
19.微粒，其包含根据权利要求1至11中的任一项的纳米颗粒和基质剂。
20.根据权利要求19的微粒，其特征在于所述基质剂是单糖、二糖、糖醇或多糖。
21.根据权利要求20的微粒，其特征在于所述基质剂单糖是葡萄糖，所述基质剂二糖是海藻糖、蔗糖或乳糖，所述基质剂糖醇是甘露糖醇或山梨糖醇，并且所述基质剂多糖是淀粉或葡聚糖。
22.根据权利要求19至21中的任一项的微粒，其特征在于所述微粒具有0.5 µm至5 µm的质量中值空气动力学直径。
23.根据权利要求22的微粒，其特征在于所述微粒具有1 µm至5 µm的质量中值空气动力学直径。
24.根据权利要求22的微粒，其特征在于所述微粒具有2 µm至5 µm的质量中值空气动力学直径。
25.根据权利要求19至21和23至24中的任一项的微粒，用于接种疫苗。
26.根据权利要求19至25中的任一项的微粒在制备用于治疗性接种疫苗的疫苗中的用途。
27.根据权利要求26的用途，其特征在于所述疫苗用于癌症接种疫苗。
28.根据权利要求26或27的用途，其特征在于通过粘膜给药施用所述微粒。
29.根据权利要求28的用途，其特征在于所述粘膜给药是肺或鼻给药。
30.用于制备根据权利要求19至25中的任一项的微粒的方法，其特征在于喷雾干燥含有根据权利要求1至11中的任一项所述的纳米颗粒和所述基质剂的液体。
31.根据权利要求30的方法，其特征在于其包括以下步骤：
(a)制备包含抗原负载纳米颗粒和被溶解在其中的所述基质剂的水性分散体；
(b)喷雾干燥在步骤(a)中制备的所述水性分散体，以产生含有抗原负载纳米颗粒的微粒；
(c)收集在步骤(b)中获得的所述微粒。
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