CN1800408B - 一种核酸转运载体和核酸转运系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种核酸转运载体和以该转运载体为基础的核酸转运系统及其制备方法。本发明提供的核酸转运载体由壳聚糖构成；本发明提供的核酸转运系统为壳聚糖与被转运核酸的聚合物。本发明核酸转运载体和以其为基础构建的核酸转运系统具有良好的靶向性、稳定性和生物相容性，同时还具有核酸信息携带量大、宿主免疫原性低、无毒副作用、材料易得、成本低廉等特点，特别适宜用于寡核苷酸和RNA的转运。

Description

一种核酸转运载体和核酸转运系统及其应用

技术领域

本发明涉及核酸转运系统及其应用领域，尤其是载体材料在基因工程技术和生物医药等领域的应用。

背景技术

核酸转运系统是实现核酸转运和核酸治疗的关键，适宜的核酸载体可将目的核酸安全、高效、可控、简便地转运至细胞或细菌，实现其生物学作用。而与核酸载体相关的免疫反应，细胞毒性与安全性问题是核酸应用领域急待解决的问题之一。介导核酸转运的载体一般有病毒载体和非病毒载体两种，其中病毒载体占主要地位。但由于病毒载体系统具有无法避免地缺点，如病毒本身地免疫反应和自身毒性等，越来越多的研究者开始重视非病毒载体系统。而非病毒型核酸载体也并非没有缺点。例如正电荷脂质体血浆清除率偏快，核酸信息携带量偏少，且具有一定的免疫原性和毒性。随着科技发展，微粒、纳米粒或聚合物出现在非病毒载体领域。其具有核酸信息携带量大、靶向性强、稳定性好、易于控制等特点。但仍存在问题，例如：无机纳米粒不能在体内降解；某些有机聚合物具有免疫原性等。且大部分聚合物在转运基因时可表现出较好效果，一旦用于寡核苷酸和RNA的转运，仍存在不能有效保护核酸和效率低下等缺点。因此，人们仍在继续对新型核酸转运系统的研究。

发明内容

本发明的任务是提供一种新的核酸转运系统，其具有良好的靶向性、稳定性和生物相容性，同时还具有核酸信息携带量大、宿主免疫原性低、无毒副作用、材料易得、成本低廉等特点，特别适宜用于寡核苷酸和RNA的转运。本发明还同时提供了该核酸转运系统的制备方法。

本发明提供的核酸转运载体由壳聚糖构成。本发明的实质贡献在于壳聚糖作为核酸转运载体之应用为。壳聚糖与被转运核酸的聚合物构成本发明核酸转运系统。

本发明核酸转运系统的制备方法，包括以下步骤：

a.将壳聚糖溶于浓度为1％至5％的盐酸、谷氨酸、醋酸或柠檬酸中，制备浓度为0.5％壳聚糖稀酸溶液，再用氢氧化钠调pH到5.5，然后用1％醋酸溶液将其稀释至0.02％，再调一次pH至5.5，过虑除菌得0.02％壳聚糖稀酸溶液；

b.将被转运核酸溶于水溶液或10至50mM硫酸钠溶液制备浓度为200μg/ml的核酸溶液；

c.将以上步骤制得的0.02％壳聚糖稀酸溶液和浓度为200μg/ml的核酸溶液以体积比0.125∶1至10∶1的比例混合，优选为1∶1的体积比混合，在合适条件下使壳聚糖与核酸发生聚合反应，得到含有壳聚糖-核酸聚合物的溶液。

进一步将以上所得的含有壳聚糖-核酸聚合物溶液经离心或真空冷冻干燥后可得到壳聚糖-核酸聚合物。

壳聚糖稀酸溶液与核酸溶液的混合方式是：将核酸溶液逐滴加入壳聚糖溶液中，或者将壳聚糖溶液和核酸溶液分别同时置55℃水浴30分钟，将核酸溶液迅速吸出加入壳聚糖溶液；使壳聚糖与核酸发生聚合反应的合适条件是：置壳聚糖稀酸溶液与核酸溶液的混合溶液于摇床上以500rpm摇1小时，或者将壳聚糖稀酸溶液与核酸溶液的混合溶液涡流振荡1分钟。

壳聚糖是由葡萄糖胺单体及N-乙酰基葡萄糖胺单体按不同比例聚合形成的多糖，由于葡萄糖胺单体上有游离的氨基，故带有正电荷，其pKa值为6.5。当PH在6以下时，壳聚糖才能溶解，其一级氨基会质子化。带有正电荷的壳聚糖和带有负电荷的核酸会形成聚合物，且带有正电荷，易与带负电荷的细胞结合〔参见L.Illum，I.Jabbal-Gill，M.Hinchcliffe，A.N.Fisher，S.S.Davis，Chitosan as a novel nasal delivery system for vaccines，Advanced DrugDelivery Reviews 51(2001)81-96)。根据方法不同，通过复凝聚法形成的壳聚糖-核酸聚合物直径分别在在1微米至1.5微米之间或100-500纳米之间。壳聚糖和核酸结合后可以保护核酸免受酶的降解，增加核酸的稳定性。

本发明利用壳聚糖作为载体制备核酸转运系统。利用复凝聚法、离子胶凝法或共价交联法等方法，壳聚糖和核酸在一定条件下形成壳聚糖-核酸聚合物。

本发明提供两种壳聚糖-核酸聚合物的制备方法。

第一种包括以下步骤：

a.将壳聚糖溶于1％醋酸溶液得到0.5％壳聚糖溶液，搅拌24小时使其完全溶解；

b.加入等体积1％的氨水，使溶解的壳聚糖沉淀，过滤，真空冷冻干燥得到壳聚糖沉淀物；

c.将干燥后所得壳聚糖重复步骤a得0.5％壳聚糖溶液；

d.用氢氧化钠调PH到5.5，然后用1％醋酸溶液将其稀释至0.02％，再调一次PH至5.5，过虑除菌；

e.将被转运的核酸溶于10mM硫酸钠溶液中使其终浓度为200μg/ml；

f.将等体积核酸溶液逐滴加入壳聚糖溶液中，置混和溶液于摇床上以500rpm摇1小时；

g.将混和溶液12000rpm离心10分钟以收集微粒得壳聚糖与被转运核酸的聚合物。

第二种包括以下步骤：

a.将壳聚糖溶于1％醋酸溶液得到1％的壳聚糖溶液，搅拌24小时使其完全溶解

b.加入等体积1％的氨水，使溶解的壳聚糖沉淀，过滤，真空冷冻干燥得到壳聚糖沉淀物

c.将干燥后所得壳聚糖重复步骤a得0.5％壳聚糖溶液

d.用氢氧化钠调PH到5.5，然后用1％醋酸溶液将其稀释至0.02％，再调一次PH至5.5，过虑除菌

e.将需转运的核酸溶于10mM硫酸钠溶液，终浓度为200μg/ml

f.等体积的壳聚糖溶液和核酸溶液同时置55℃水浴30分钟

g.将核酸溶液迅速吸出加入壳聚糖溶液，涡流振荡1分钟，得到壳聚糖-核酸聚合物溶液

以壳聚糖作为核酸转运载体，可把目的核酸带入各种细胞或细菌，实现其生物学功能。壳聚糖-核酸聚合物作为核酸转运系统，其应用包括：

(1)壳聚糖-寡核苷酸聚合物抗细菌作用：选择对细菌的生长和毒力具有重要作用的基因，人工合成若干与该基因反义配对的寡核苷酸，制备壳聚糖-寡核苷酸聚合物，与细菌共培养，细菌的生长受到明显抑制，毒力下降。结果表明壳聚糖-寡核苷酸聚合物能有效帮助寡核苷酸进入细菌，并实现寡核苷酸的生物学功能。

(2)壳聚糖-iRNA聚合物提高iRNA免疫活性：iRNA是一类来自免疫器官并能传递免疫功能的RNA，但进入人体后极易受人体内RNase降解而失去活性，因此其免疫活性仍有争议。制备壳聚糖-iRNA聚合物致敏动物，发现动物的免疫功能增强。结果表明壳聚糖-iRNA聚合物能够有效保护iRNA免受RNase降解，增强其免疫活性。

(3)壳聚糖-发夹状RNA聚合物的抗病毒效应：21-23nt的发夹状RNA可以引发转录后的基因沉默，但需要合适的载体将其导入细胞。以壳聚糖为转运载体制备壳聚糖-发夹状RNA聚合物，与被病毒感染的细胞共培养，发现病毒的靶基因沉默，相应的蛋白质水平明显降低。说明壳聚糖-发夹状RNA聚合物能将发夹状RNA有效导入细胞，并具有良好的靶向性。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明所用原材料为壳聚糖，是一种天然的生物材料，无毒性，无副作用，是一种绿色环保型核酸载体，使用者易于接受。

2、本方法制备壳聚糖-核酸聚合物，相比其他聚合物的制备方法，具有时间更短，方法更为简便(比如与多酰胺基树枝状分子等阳离子聚合物相比)，粒径均匀，分散性好〔见图1〕等优点。

3、以壳聚糖制备聚合物，易于修饰壳聚糖的某些基团，进一步提高聚合物的稳定性及转运效率。

4、与传统核酸载体比较，壳聚糖聚合物的核酸携带大，效率高，无免疫原性，无细胞毒性，且具有生物可降解性等优点〔参见S.Hirano，H.Seino，Y.Akiyama，I.Nonaka，Biocompatibility of chitosan by oral and intravenous administration，Polym.Eng.Sci.(1998)897-901〕。

5、该发明制备工艺简单，设备要求不高，反应时间短，条件温和，易于操作。而且材料易得，成本低廉(壳聚糖广泛存在于蟹虾等水产品中)。

附图说明

图1为在原子力显微镜下显示的壳聚糖-质粒DNA聚合物的形态，由图可见壳聚糖-质粒DNA聚合物呈球形，直径在100-200nm之间，在溶液中均匀分布。

图2为聚合物粒径分布图。该图是用ZetaPALS无机/有机多功能Zeta电位/粒度分析仪测定的壳聚糖-RNA聚合物的粒径大小，由图可见壳聚糖-iRNA聚合物的平均粒径132.6nm。

图3为聚合物表面电位分布图。该图是用ZetaPALS无机/有机多功能Zeta电位/粒度分析仪测定的壳聚糖-RNA聚合物的表面电位，由图可见壳聚糖-iRNA聚合物的平均表面电位+12.8mv。

图4为壳聚糖-质粒DNA聚合物酶保护试验结果：

第1条带：未和壳聚糖结合的寡核苷酸；

第2条带：寡核苷酸在0.1μg DNase I作用15分钟后，有明显降解；

第3条带：寡核苷酸与1μg DNase I反应15min后被完全降解；

第4条带：壳聚糖-寡核苷酸聚合物；

第5条带：聚合物与0.1μg DNase I反应15min后，聚合物中的寡核苷酸未发生明显降解；

第6条带：聚合物与1μg DNase I反应15min后，聚合物中的寡核苷酸部分被降解聚合物与1μg DNase I反应15min后，聚合物中的寡核苷酸部分被降解

结果显示：壳聚糖起到了保护寡核苷酸不受DNase I降解的作用。显示本发明核酸载体有效保护核酸免受酶的降解。

图5为壳聚糖-寡核苷酸聚合物对结核杆菌菌落数的影响(cfu为菌落形成单位)，即结核杆菌在本发明提供的壳聚糖-寡核苷酸聚合物存在下的细菌存活率，表明壳聚糖-寡核苷酸聚合物能有效帮助反义寡核苷酸进入结核杆菌，抑制基因的表达，从而细菌的生长受到抑制。

具体实施方式

实施例一

壳聚糖-寡核苷酸聚合物的制备

(一)壳聚糖溶液的制备

1、称量壳聚糖溶于1％的醋酸溶液，得到壳聚糖含量1％的溶液，搅拌24小时使其完全溶解。

2、在所得溶液中加入等体积1％氨水，使溶解的壳聚糖沉淀出来，过滤；沉淀置-80℃预冷过夜，然后真空冷冻干燥沉淀；再溶于1％的醋酸溶液(这一步可选，有条件最好做，主要是去除壳聚糖里面的蛋白等杂质)。

3、用氢氧化钠调PH至5.5。

4、用1％醋酸溶液稀释至浓度为0.02％，然后再次调PH至5.5。

5、在无菌室中过滤除菌，置于4℃冷藏。

(二)寡核苷酸溶液的制备：将寡核苷酸200μg/ml溶液和等体积10mM的硫酸钠溶液混合，使溶液的寡核苷酸终浓度为100μg/ml，硫酸钠的终浓度为5mM。

(三)制备壳聚糖-寡核苷酸聚合物

1、壳聚糖和寡核苷酸溶液各200μl，置55℃水浴30分钟。

2、用无菌TIP头将寡核苷酸溶液迅速吸出加入壳聚糖溶液中，涡流振荡1分钟，得到壳聚糖-寡核苷酸聚合物溶液，经真空冷冻干燥后得到壳聚糖-核酸聚合物。

实施例二

壳聚糖-RNA聚合物的制备

(一)壳聚糖溶液的制备

1、称量壳聚糖溶于1％的醋酸溶液，得到壳聚糖含量1％的溶液，搅拌24小时使其完全溶解。

2、在所得溶液中加入等体积1％氨水，使溶解的壳聚糖沉淀出来，过滤；沉淀置-80℃预冷过夜，然后真空冷冻干燥沉淀；再溶于1％的醋酸溶液(这一步可选，有条件最好做，主要是去除壳聚糖里面的蛋白等杂质)。

3、用氢氧化钠调PH至5.5。

4、用1％醋酸溶液稀释至浓度为0.25％，然后再次调PH至5.5。

5、在无菌室中过滤除菌，置于4℃冷藏。

(二)RNA溶液的制备：将RNA溶于20％硫酸钠溶液中，RNA终浓度为200μg/ml

(三)制备壳聚糖-RNA聚合物：将等体积RNA溶液逐滴加入壳聚糖溶液中，然后置混和溶液于摇床上以500rpm摇1小时，最后将混和溶液12000rpm离心10分钟以收集微粒得到壳聚糖-RNA聚合物。

实施例三

壳聚糖-寡核苷酸聚合物在抑制结核杆菌方面的应用。

1、ino1基因是对结核杆菌生长和毒力具有重要作用的基因，选择结核杆菌ino1基因为想要抑制的基因。

2、在Genebank上查得ino1基因的全序列。根据OLIGO-5 SECONDARY STRUCTURE ANALYSIS软件设计出4段反义寡核苷酸。序列如下：5’-CGACGGGCTCCGCGTCGGAG-3’，5’-TCGGTGAACTTCTTGGCCCA-3’，5’-CTTGGAGATCTTCTTGGACT-3’，5’-TTGGCGATCTTGGCCGCCCG-3’。

3、将壳聚糖和反义寡核苷酸按方法一制成壳聚糖-寡核苷酸聚合物。

4、将聚合物用PBS溶解为0.5mg/ml后加入培养有结核杆菌的培养液中，共同培养2-4周。

5、取少量菌液经过足够稀释，涂于培养皿中得固体培养基上，2周后计数菌落数。结果参见图5。结果表明壳聚糖-寡核苷酸聚合物能有效帮助反义寡核苷酸进入结核杆菌，抑制基因的表达，从而细菌的生长受到抑制。

实施例四

壳聚糖-iRNA聚合物提高iRNA免疫活性实验

(一)体内白细胞粘附抑制(LAI)试验

1、选择抗乙肝免疫核糖核酸，配制成所需浓度的溶液。

2、和壳聚糖溶液按前述方法二制成壳聚糖-iRNA聚合物溶液。

3、小白鼠30只，体重28～34g，雌性，随机分4组，腋下和腹股沟皮下多点注射药物，每3天1次，共7次，30天后重复注射5次。

生理盐水组：生理盐水1ml；

壳聚糖组：0.02％壳聚糖0.5ml+蒸馏水0.5ml；

iRNA组：iRNA溶液1ml(50μg)；

壳聚糖-iRNA聚合物组：聚合物1ml(含iRNA组50μg)。

4、末次注射48小时后，颈椎脱臼处死小鼠，制备脾细胞悬液。

5、分别测量各组白细胞粘附抑制率LAI。

结果参见表1。

表1、经壳聚糖-iRNA聚合物致敏的小鼠的白细胞粘附指数比较

                体内给药小鼠LAI值(％，X±S)

F＝24.17，P＝0.00

                       四组小鼠LAI值两两比较P值

表1为经壳聚糖-iRNA聚合物致敏的小鼠的白细胞粘附指数的比较。由表可见壳聚糖-iRNA聚合物试验组的白细胞粘附抑制率高于其他三组，与其他各组差别均有显著性。表明壳聚糖-iRNA聚合物能够有效保护iRNA免受RNase降解，增强其免疫活性。

(二)利用乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒进行脾细胞识别HBsAg ELISA试验取96孔板，按下述加样，各组设5复孔：

上述四组小鼠脾细胞悬液        50μl

乙肝疫苗                      50μl

10％小牛血清RPMI-1640液       100μl

②5％CO₂、37℃培养2h，离心微孔板(1000g、15min)，轻轻弃去上清，加入含10％小牛血清的RPMI-1640液50μl；

③设阳性对照孔(阳性血清50μl)和阴性对照孔(阴性血清50μl)，均设5复孔；

④各孔内加入酶标记抗体50μl，轻拍混匀；

⑤37℃孵育25min，室温平衡5min；

⑥用洗涤液洗涤后，离心后弃上清，重复5次，洗涤完后扣干(每次保持30-60s浸泡时间)；

⑦向各孔内加入底物A、B各50μl，轻拍混匀，37℃暗置15min；

⑧每孔加入终止液50μl，混匀；

⑨酶标仪波长双波长450/630nm测定各孔的OD值(A值)，按试剂盒标准判断结果。

结果参见表2

表2、小鼠脾细胞识别HBsAgELISA结果

表2为小鼠脾细胞识别HBsAgELISA结果，表明壳聚糖-iRNA聚合物组小鼠脾细胞吸附HBsAg能力明显高于其他两组，这一结果进一步说明了小鼠脾细胞已致敏，具有识别特异性抗原的能力，当二者相遇时，脾细胞识别吸附HBsAg，特异性结合，壳聚糖-iRNA聚合物致敏作用最强。

(三)体外白细胞粘附抑制试验

1、取健康小鼠1只，制备脾细胞悬液，96孔板中加样：

实验孔，共3组：

壳聚糖-iRNA聚合物组：健康小鼠脾细胞悬液  100μl

乙肝疫苗            50μl

壳聚糖-iRNA聚合物   50μl

iRNA溶液组：健康小鼠脾细胞悬液  100μl

乙肝疫苗            50μl

iRNA                50μl

0.02％壳聚糖组：健康小鼠脾细胞悬液100μl

乙肝疫苗            50μl

0.02％壳聚糖        50μl

对照孔：

各孔不加乙肝疫苗，健康小鼠脾细胞悬液100μl，用含10％小牛血清的RPMI-1640补足总体积至200μl。

2、分别测量各组白细胞粘附抑制率LAI。

结果显示体外白细胞粘附抑制指数壳聚糖-iRNA纳米粒的LAI为31.00％，iRNA纳米粒的LAI为26.55％，壳聚糖的LAI为7.12％，壳聚糖-iRNA纳米粒白细胞粘附抑制率高于其他组。

实施例五

壳聚糖-发夹状RNA聚合物抗病毒效应研究

1、人乳头瘤病毒(HPV)和宫颈癌的发生密切相关，且以HPV-16、18的E6和E7蛋白和肿瘤细胞的永生化相关性最强。因此在HPV-16的序列中选取前端为G的序列GAATAAATATGCTGTATGT作为靶基因。

2、用MEGAscript^TMRNAi试剂盒体外转录合成发夹状RNA，序列如下：5’-GAATCGATATGCTGTATGTTTCGACATACAGCATATCGATTCTTTT-3’。

3、另外设计单正义链：GAATCGATATGCTGTATGTTTCGTTTT和单反义链ACATACAGCATATCGATTCTTTT作为对照。

4、配制壳聚糖溶液，按方法一制备壳聚糖-发夹状RNA聚合物及壳聚糖-寡核苷酸聚合物。

5、将聚合物加入培养有人宫颈癌细胞株CaSKi的培养液中，72小时候收集细胞。

6、通过半定量RT-PCR和蛋白印迹法分别检测壳聚糖-发夹状RNA聚合物对HPV-16mRNA及蛋白表达的影响。结果见表3。

表3：转染质粒对HPV-E6 mRNA及蛋白表达的影响

注：^*与各组相比P＜0.05，^**与各组相比P＜0.01

表3为壳聚糖-发夹状RNA聚合物对HPV-16mRNA及蛋白表达的影响。由表可见发夹状序列组HPV-16mRNA及蛋白的水平明显低于其他组，其差异具有统计学意义。表明壳聚糖-发夹状RNA聚合物能将发夹状RNA有效导入细胞，并具有良好的靶向性。

本发明所用到的核酸序列如下：

①5’-CGACGGGCTCCGCGTCGGAG-3’针对部分结核杆菌ino1基因的反义寡核苷酸序列1

②5’-TCGGTGAACTTCTTGGCCCA-3’针对部分结核杆菌ino1基因的反义寡核苷酸序列2

③5’-CTTGGAGATCTTCTTGGACT-3’针对部分结核杆菌ino1基因的反义寡核苷酸序列3

④5’-TTGGCGATCTTGGCCGCCCG-3’针对部分结核杆菌ino1基因的反义寡核苷酸序列4

⑤5’-GAATCGATATGCTGTATGTTTCGTTTT-3’针对部分人乳头瘤病毒(HPV)-16的单正义链⑥5’-ACATACAGCATATCGATTCTTTT-3’针对部分人乳头瘤病毒(HPV)-16的单反义链

⑦5’-GAATCGATATGCTGTATGTTTCGACATACAGCATATCGATTCTTTT-3’针对部分人乳头瘤病毒(HPV)-16的发夹状RNA

以上序列前6条均为人工合成，第7条为体外转录形成。

以下为上述核酸序列之序列表。

                       序列表

<110>华中科技大学同济医学院

<120>一种核酸转运载体和核酸转运系统及其应用

<130>1

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>Mycobacterium tuberculosis

<400>1

cgacgggctc cgcgtcggag                                         20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>Mycobacterium tuberculosis

<400>2

tcggtgaact tcttggccca                                         20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>Mycobacterium tuberculosis

<400>3

cttggagatc ttcttggact                                         20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>Mycobacterium tuberculosis

<400>4

ttggcgatct tggccgcccg                                         20

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>Human papillomavirus

<400>5

gaatcgatat gctgtatgtt tcgtttt                                 27

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>Human papillomavirus

<400>6

acatacagca tatcgattct ttt                                     23

<210>7

<211>46

<212>DNA

<213>Human papillomavirus

<400>7

gaatcgatat gctgtatgtt tcgacataca gcatatcgat tctttt            46

Claims (7)

1.一种由壳聚糖与被转运核酸聚合而成的核酸转运系统的制备方法，包括以下步骤：

a.将壳聚糖溶于浓度为1％至5％的盐酸、谷氨酸、醋酸或柠檬酸中，制备浓度为0.5％壳聚糖稀酸溶液；

b.再用氢氧化钠调pH到5.5，然后用1％醋酸溶液将其稀释至0.02％，再调一次pH至5.5，过滤除菌得0.02％壳聚糖稀酸溶液；

c.将被转运核酸溶于水溶液或10至50mM硫酸钠溶液制备浓度为200μg/ml的核酸溶液；

d.将以上步骤制得的0.02％壳聚糖稀酸溶液和浓度为200μg/ml的核酸溶液以体积比0.125∶1至10∶1的比例混合，置壳聚糖稀酸溶液与核酸溶液的混合溶液于摇床上以500rpm摇1小时，或者将壳聚糖稀酸溶液与核酸溶液的混合溶液涡流振荡1分钟，使壳聚糖与核酸发生聚合反应，得到含有壳聚糖-核酸聚合物的溶液。

2.根据权利要求1所述的由壳聚糖与被转运核酸聚合而成的核酸转运系统的制备方法，其特征在于，将步骤d所得的含有壳聚糖-核酸聚合物的溶液经离心或真空冷冻干燥后得到壳聚糖-核酸聚合物。

3.根据权利要求1所述的由壳聚糖与被转运核酸聚合而成的核酸转运系统的制备方法，其特征在于壳聚糖溶液和核酸溶液是以1∶1的体积比混合。

4.根据权利要求1所述的由壳聚糖与被转运核酸聚合而成的核酸转运系统的制备方法，其特征在于，步骤d中壳聚糖稀酸溶液与核酸溶液的混合方式是：将核酸溶液逐滴加入壳聚糖溶液中。

5.根据权利要求1所述的由壳聚糖与被转运核酸聚合而成的核酸转运系统的制备方法，其特征在于，步骤d中壳聚糖稀酸溶液与核酸溶液的混合方式是：将壳聚糖溶液和核酸溶液分别同时置55℃水浴30分钟，将核酸溶液迅速吸出加入壳聚糖溶液。

6.一种由壳聚糖与被转运核酸聚合而成的核酸转运系统的制备方法，包括以下步骤：

a.将壳聚糖溶于1％醋酸溶液得到0.5％壳聚糖溶液，搅拌24小时使其完全溶解；

b.加入等体积1％的氨水，使溶解的壳聚糖沉淀，过滤，真空冷冻干燥得到壳聚糖沉淀物；

c.将干燥后所得壳聚糖重复步骤a得到0.5％壳聚糖溶液；

d.氢氧化钠调PH到5.5，然后用1％醋酸溶液将0.5％壳聚糖溶液稀释为0.02％壳聚糖溶液，再调一次PH至5.5，过滤除菌；

e.将被转运的核酸溶于10mM硫酸钠溶液中使其终浓度为200μg/ml；

f.将等体积核酸溶液逐滴加入壳聚糖溶液中，置混合溶液于摇床上以500rpm摇1小时；

g.将混合溶液12000rpm离心10分钟以收集微粒得到壳聚糖与被转运核酸的聚合物。

7.一种由壳聚糖与被转运核酸聚合而成的核酸转运系统的制备方法，包括以下步骤：

a.将壳聚糖溶于1％醋酸溶液得到1％的壳聚糖溶液，搅拌24小时使其完全溶解；

b.加入等体积1％的氨水，使溶解的壳聚糖沉淀，过滤，真空冷冻干燥得到壳聚糖沉淀；

c.将干燥后所得壳聚糖重复步骤a得0.5％壳聚糖溶液；

d.用氢氧化钠调PH到5.5，然后用1％醋酸溶液将0.5％壳聚糖溶液稀释为0.02％壳聚糖溶液，再调一次PH至5.5，过滤除菌；

e.将需转运的核酸溶于10mM硫酸钠溶液，终浓度为200μg/ml；，

f.等体积的壳聚糖溶液和核酸溶液同时置55℃水浴30分钟；

g.将核酸溶液迅速吸出加入壳聚糖溶液，涡流振荡1分钟得到壳聚糖与被转运核酸的聚合物。

Images