CN109350737A - 一种嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型的建立和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型的建立和检测方法。该方法包括如下步骤：(1)将小鼠通过OVA致敏以及激发，建立嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型；(2)将步骤(1)中获得的小鼠置于Buxco无创肺功能检测系统的密闭体描舱内自由活动；其中，Buxco无创肺功能检测系统连接有雾化控制器和信号转换器；(3)使用乙酰甲胆碱雾化激发小鼠，并通过Finepointe软件的气道反应性模式测定小鼠雾化激发前后Penh值的变化来评价小鼠的气道反应性。本发明建立了咳嗽明显、无气道高反应、气道嗜酸性粒细胞炎症、激素治疗有效且符合伦理的小鼠EB模型，有利于小鼠EB模型的推广和应用。
Description
技术领域
本发明属于医学研究领域，特别涉及一种嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型的建立和检测方法。
背景技术
目前嗜酸粒细胞性支气管炎(EB)研究大多集中于临床，但鉴于人体研究的局限性，有关EB的探索在很大程度上需要通过动物实验进行，而目前EB动物模型暂缺，因此成功建立EB动物模型具有重要意义。目前国际上尚未建立确切的EB动物模型，仅有日本学者Ogawa提出了多粘菌素B滴鼻造模建立EB豚鼠模型的方法，但由于各种限制(如造模方法不符合人类EB的流行病学情况、饲养成本高、生物制剂少等)，未见其他学者采用该模型进行EB的研究。
小鼠与人类共享99％基因，且相关检测试剂多样且基因操作成熟，饲养及药物消耗成本较低，适宜大批量实验并进行深入研究。我们前期研究通过小剂量(10μg)鸡卵蛋白(OVA)滴鼻激发，成功复制了无气道高反应(AHR)及气道嗜酸性粒细胞炎症的小鼠EB模型(有创气道反应性测量)，但是该模型存在以下不足：①咳嗽是EB的重要临床特征，部分哮喘病人也表现为咳嗽，但该研究对小鼠咳嗽方面没能进行研究；②未观察激素对于咳嗽的治疗效果；③该种方法(即有创气道反应性测量)检测完毕后小鼠会立即死亡，不符合伦理要求，也无法批量制作合格的模型，费时费力，同时也无法将该模型应用于药物安全学等要求动物必须存活的实验中，导致目前该模型的应用较为局限，难以推广。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型的建立和检测方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种嗜酸粒细胞性支气管炎(EB)小鼠模型的建立和检测方法，包括如下步骤：
(1)将小鼠通过鸡卵蛋白(Ovalbumin，OVA)致敏以及激发，建立EB(嗜酸粒细胞性支气管炎)小鼠模型；
(2)将步骤(1)中获得的小鼠置于Buxco无创肺功能检测系统的密闭体描舱内自由活动，其中，Buxco无创肺功能检测系统连接有雾化控制器和信号转换器；
(3)使用乙酰甲胆碱(Mch)雾化激发小鼠，并通过Finepointe软件的气道反应性模式测定小鼠雾化激发前后Penh值(气道阻力预测值)的变化来评价小鼠的气道反应性。
步骤(1)中所述的小鼠为Balb/c小鼠；优选为雌性Balb/c小鼠，其年龄为7～8周龄，体重为18～20g，动物级别为SPF级。
所述的Balb/c小鼠的年龄优选为7周龄。
步骤(1)中所述的致敏优选为通过如下步骤实现：小鼠在第0天(当天)、第7天和第14天腹腔注射含有10μg OVA和1.3mg佐剂氢氧化铝的OVA溶液使小鼠致敏。
所述的OVA溶液优选为通过如下方法配制得到：
(I)将OVA粉末溶解到生理盐水中，得到混合液A；其中，混合液A的浓度为2mg/ml；
(II)将混合液A与生理盐水按体积比1:19混合均匀，得到混合液B；
(III)将混合液B与佐剂氢氧化铝凝胶按体积比1：1混合均匀，得到混合液C；其中，佐剂氢氧化铝凝胶的浓度为13mg/ml；
(IV)将混合液C在4℃条件下放置1h，得到OVA溶液。
步骤(1)中所述的激发优选为通过如下步骤实现：将小鼠麻醉后用含有10μg OVA的OVA溶液滴鼻激发。
所述的麻醉为采用戊巴比妥钠进行麻醉，其用量为50mg/kg。
所述的OVA溶液优选为通过如下方法配制得到：将OVA粉末溶解到生理盐水中，得到OVA溶液；其中，OVA粉末的用量按每mg(毫克)OVA粉末配比5ml生理盐水计算。
步骤(1)中所述的EB(嗜酸粒细胞性支气管炎)小鼠通过激素治疗后症状缓解。
所述的激素包括地塞米松等。
所述的地塞米松优选为地塞米松注射液，其注射量为5mg/kg，注射方式为腹腔注射。
所述的嗜酸粒细胞性支气管炎(EB)小鼠模型的建立和检测方法，在步骤(3)之前还包括咳嗽敏感性检测的步骤，具体为：使用辣椒素激发液雾化激发小鼠咳嗽，实时监听小鼠咳嗽声音，通过声音分析软件记录声波，并通过Finepointe软件将舱内气流变化转化为呼吸波形进行记录并自动实时分析、计数，以检测小鼠的咳嗽敏感性。
所述的辣椒素激发液的浓度为100μmol/L，雾化剂量为1.0ml/3min。
所述的辣辣椒素激发液由以下步骤配制而成：先将30.5mg的辣椒素，1ml的吐温80，1ml的无水乙醇和8ml的生理盐水混合均匀，得到原液；再取出0.5ml的原液与49.5ml的生理盐水混合均匀，得到辣辣椒素激发液。
所述的声音分析软件为cooledit软件。
步骤(3)所述的测定小鼠雾化激发前后Penh值优选为通过如下步骤实现：依次测定300μl PBS以及倍增浓度的Mch(乙酰甲胆碱)雾化激发后的Penh值变化，每次雾化1min，记录3min。
步骤(3)所述的使用乙酰甲胆碱(Mch)雾化激发优选为依次使用浓度为3.125mg/ml、6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml和50mg/ml的乙酰甲胆碱雾化激发，每次雾化1min，记录3min，乙酰甲胆碱经雾化后进入体描舱内，由小鼠通过自主呼吸吸入。
步骤(3)所述的气道反应性的检测为通过Finepointe软件的AHR(无气道高反应)模式进行检测；该软件可以对小鼠肺阻力进行实时显示、实时监测和实时分析。
所述的嗜酸粒细胞性支气管炎(EB)小鼠模型的建立和检测方法，在步骤(3)之后还包括如下步骤：处死小鼠，留取肺泡灌洗液及肺组织，观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸细胞百分比及肺组织病理变化。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明首次采用无创肺功能检测法，避开了有创肺功能不能重复测量且检测完毕后小鼠会死亡的缺陷；同时该方法在小鼠肺功能的快速、重复检测时，以及在一些必须要求动物为清醒状态的实验(如药物安全学)等，都有其存在的价值。
(2)本发明建立了咳嗽明显、无气道高反应(AHR)、气道嗜酸性粒细胞炎症、激素治疗有效且符合伦理的小鼠EB模型，该方法不仅成功在小鼠上复制了EB的四大临床特征(即咳嗽明显、无气道高反应、气道嗜酸性粒细胞炎症、激素治疗有效四大特点)，使之成为一种完善的疾病动物模型，并且大大降低了工作强度，节省工作时间，提高工作效率，有利于小鼠EB模型的推广和应用。
附图说明
图1是小鼠咳嗽检测系统的展示图；其中，图A为小鼠咳嗽检测系统，8为偏流仪，9为干燥剂，10为雾化控制器，11为雾化头，12为音箱，13为呼吸波形，14为体描舱，15为信号转换器；图B为体描舱放大图；图C为呼吸波形放大图，1为咳嗽波形，2为喷嚏波形，3为平静呼吸波形，4为急促呼吸波形，5为屏气波形，6为深呼吸波形，7为甩头波形。
图2是小鼠无创肺功能检测系统的展示图；其中，图A为小鼠无创肺功能检测软件，16为无创软件(Finepoint软件)；图B为小鼠无创肺功能检测系统连接方式，17为信号转换器，18为偏流仪，19为雾化控制器，20为雾化头，21为气溶胶分布室，22为干燥剂，23为体描舱。
图3是造模后四组小鼠的咳嗽敏感性变化图；其中，AS、EB组较NS组咳嗽次数明显升高(*表示p＜0.01)，且显著高于DXM组(##表示p＜0.01)。
图4是造模后四组小鼠的气道反应性变化图；其中，在Mch(50mg/ml)，AS组Penh明显高于其余3组(*表示p＜0.05)。
图5是造模后四组小鼠BALF中的嗜酸粒细胞(Eos)变化图；其中，AS组及EB组BALF中Eos％显著高于NS及DXM组(#表示p＜0.05)。
图6是造模后四组小鼠的肺组织病理表现图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的各原料以及试剂，除特别指出的以外，均可由市售获得。
实施例1
1.实验动物及分组
SPF级BALB/c小鼠，雌性，7周龄，体重18～20g，购于南方医科大学实验动物中心；小鼠均饲养于呼吸疾病国家重点实验室SPF级动物房内，昼夜明暗交替时间12h/12h，可以自由进食去OVA(鸡卵蛋白，美国Sigma公司)的饲料和三蒸水。24只小鼠随机分为4组(每组6只)：盐水组(NS组)、哮喘组(AS组)、嗜酸粒细胞性支气管炎组(EB组)、地塞米松治疗组(DXM组)。
(1)致敏：AS组、EB组、DXM组在第0天、第7天、第14天腹腔注射OVA溶液0.2ml/只(含OVA 10μg+佐剂氢氧化铝0.1ml)致敏，NS组腹腔注射同等剂量的生理盐水，腹腔注射时应注意不要将药物注入血管从而影响实验结果；其中：
致敏阶段OVA溶液配方：5mg OVA加入2.5ml生理盐水中，充分溶解后，取出0.1ml加入1.9ml生理盐水混合均匀得到混合液，再将混合液与佐剂氢氧化铝凝胶(13mg/ml，美国Sigma公司)按体积比1：1混合得到的溶液，混合均匀后，4℃放置1h使用；
(2)激发：在实验第21天、22天、23天连续3天，各组小鼠进行戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉后滴鼻激发，滴鼻激发时AS组予OVA激发液50μl(含OVA 200μg)滴鼻激发，同时EB组及DXM组予激发液OVA 50μl(含OVA 10μg)滴鼻激发，NS组滴入同等剂量的生理盐水。首先对小鼠进行戊巴比妥钠50mg/kg腹腔麻醉。待小鼠麻醉后，每只小鼠单侧鼻孔滴25μl，同时要注意速度及频率，且密切观察各小鼠呼吸频率、体温及周身循环状态，避免小鼠窒息死亡；地塞米松组(DXM组)小鼠在实验第21、22、23天进行麻醉滴鼻激发前及小鼠气道反应性检测前1小时，予地塞米松注射液(广州白云山天心制药有限公司)5mg/kg腹腔注射进行药物治疗。其中：
滴鼻阶段OVA溶液(AS组)由以下组分配制而成：OVA 20mg和质量百分数0.9％的氯化钠(生理盐水)溶液5ml；
滴鼻阶段OVA溶液(EB组、DXM组)由以下组分配制而成：OVA 2mg，质量百分数0.9％的氯化钠溶液10ml。
2、检测方法
(1)咳嗽敏感性检测：末次激发后24小时，将清醒小鼠置于Buxco无创体描舱中自由活动，向雾化头中加入100μmol/L辣椒素激发液(辣椒素激发液由以下组分配制而成：辣椒素30.5mg，吐温80 1ml，无水乙醇1ml，质量百分数0.9％的氯化钠溶液8ml)1ml雾化3min，雾化结束后继续观察3min，共记录6min内小鼠咳嗽次数。声波通过cooledit声音分析软件记录，声音通过音箱外放可实时监听。体描舱连接信号转化器，腔内气流变化通过Finepointe咳嗽软件转化为呼吸波形进行记录并自动实时分析。
小鼠咳嗽检测系统如图1所示，其中，小鼠咳嗽检测系统由体描舱、信号转换器、偏流仪、雾化控制器、干燥剂、音箱和雾化头组成。通过Fionepoint软件自动声音监测及呼吸波形分析结合人工质控方式，分辨出7种小鼠呼吸波形：(1)咳嗽，(2)喷嚏，(3)平静呼吸，(4)急促呼吸，(5)屏气，(6)深呼吸，(7)甩头。根据波形的不同，由软件自动计数小鼠咳嗽次数。
(2)小鼠无创气道反应性检测：在咳嗽敏感性检测6小时后，采用Buxco公司无创肺功能检测系统检测小鼠的气道反应性。首先打开Finepoint软件，选择小鼠气道反应性检测(通过Finepointe软件的AHR模式进行检测)，然后连接体描舱、信号转换器、偏流仪、雾化控制器、雾化头、干燥剂及各管道使其成为密闭的循环通路后进行定标，定好标后将小鼠放入体描舱中，观察软件中小鼠的实时呼吸波形，待呼吸波形稳定后行进小鼠气道反应性检测。
小鼠无创肺功能检测系统如图2所示。小鼠无创肺功能检测系统由雾化头、气溶胶分布室、干燥剂、雾化控制器、体描舱、信号转换器和偏流仪组成；其中，气溶胶分布室一端与雾化控制器连接，另一端通过管道与体描舱连接；雾化头连接在气溶胶分布室正上方；体描舱与信号转化器连接；干燥剂一端与雾化控制器连接，另一端与气溶胶分布室连接；偏流仪与体描舱连接，形成一个闭合通道，回收通过体描舱的气溶胶，并使得整个管道处于流通状态。
利用小鼠无创肺功能检测系统先观察小鼠的基础肺阻力(无创肺功能中，用气道阻力预测值Penh来反映肺阻力变化)，观察时间为2min；随后按照设定程序依次测定300μlPBS缓冲液以及倍增浓度的Mch(乙酰甲胆碱，美国Sigma公司)雾化激发后的Penh变化，每次雾化1min，记录3min。Mch的激发浓度由低到高，依次为3.125、6.25、12.5、25、50(mg/ml)，Mch经雾化头雾化后通过雾化控制器控制，气溶胶随管道均匀进入体描舱内，由动物通过自主呼吸吸入。激发后通过气道阻力预测值Penh为指标来评价动物的气道反应性。该检测方法可同时检测6只小鼠的气道反应性。
通过将小鼠放入到体描舱中，雾化不同浓度的乙酰甲胆碱，经Finepoint软件自动检测得到不同浓度乙酰甲胆碱刺激下的肺阻力变化(肺阻力通过气道阻力预测值Penh反映)。该软件可以对小鼠肺阻力进行实时显示、实时监测、实时分析。
(3)支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞分类：气道反应性检测完毕后，立即换用肺泡灌洗液插管进行支气管肺泡灌洗，PBS缓冲液0.8ml×3次，每次灌洗后反复缓慢抽吸3次，记录每次的回收量(回收率应≥80％)。全部的支气管肺泡灌洗液4℃离心1500rpm×10min，上清液-80℃保存；细胞沉淀重悬后制备涂片，10％甲醛固定液固定，苏木素&伊红(HE)染色，光学显微镜下进行细胞学分类计数，每张涂片计数200个细胞，求出各分类计数细胞所占百分比，随机选择视野进行显微摄影。
(4)肺组织病理标本的制备：开胸取肺组织，置于10％甲醛固定液中固定24h以上。常规取材、脱水、石蜡包埋、制备石蜡切片、HE染色，中性树胶封片。于20×光学显微镜下观察组织形态、气道上皮损伤、气管及血管周围嗜酸性细胞浸润情况，主要观察气道周围炎症细胞尤其是EOS的浸润程度。
3、统计学方法
采用SPSS25.0软件进行统计分析。实验数据以means±sem表示，两组样本均数进行t检验，多组样本均数进行单因素方差分析，方差齐时采用最小显著差异法(LSD)；方差不齐时采用Kruskal-Wallis法，P<0.05表示差别有统计学意义。
4、结果：
(1)造模后小鼠咳嗽敏感性变化(结果见图3)，造模后咳嗽次数AS组(11.3±1.6次)、EB组(10.2±2.2次)较NS组(2.2±0.6次)明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01)；与AS组及EB组相比，DXM组咳嗽次数(2.7±1.0次)明显减少，差异有统计学意义(P＜0.01)。
(2)造模后小鼠气道反应性变化(结果见图4)，AS组小鼠雾化Mch(50mg/ml)后Penh显著高于DXM组、EB组及NS组，差异有统计学意义(P＜0.05)；EB组、NS组及DXM组3组间Penh在Mch(3.125～50mg/ml)各浓度激发后均无显著性差异(P＞0.05)。
(3)造模后小鼠肺泡灌洗液中嗜酸粒细胞(Eos)比较(结果见图5)，造模后小鼠BALF(支气管肺泡灌洗液)中，AS组Eos％(39.5±1.8)％、EB组Eos％(37.2±1.7)％显著高于NS组(0％)及DXM组Eos％(2.8±0.6)％，差异有统计学意义(p<0.05)。
(4)造模后小鼠肺组织病理表现(结果见图6)：AS组、EB组与NS组肺组织病理比较，根据Uderwood评分表及Myou S等评价方法，NS组小鼠气管结构清晰，气道上皮纤毛排列整齐，无水肿及上皮损伤情况，气管周围无炎症细胞浸润；AS组可见支气管周围有中至重度炎症细胞浸润，伴区域性肺水肿及中度气道上皮脱落，气管周围可见明显嗜酸性粒细胞浸润；EB组肺组织病理改变较哮喘组较轻，支气管周围轻度炎症细胞浸润，伴轻度气道上皮脱落，气管周围亦可见明显嗜酸粒细胞浸润。DXM组与AS、EB组小鼠肺组织病理比较：地塞米松治疗后肺组织病理显示气管周围轻度炎症细胞浸润，上皮细胞轻度脱落，未见水肿改变，较AS组与EB组肺组织病理显著改善，且气管周围嗜酸粒细胞浸润明显减少。
5.结论：
(1)造模后，EB小鼠咳嗽敏感性明显增加；地塞米松治疗可以显著降低EB小鼠的咳嗽次数。
(2)造模后的EB小鼠模型无气道高反应性。
(3)造模后，EB小鼠肺泡灌洗液(BALF)中，嗜酸粒细胞百分比明显增加；而激素治疗可以明显降低EB小鼠BALF的嗜酸粒细胞百分比。
(4)EB模型小鼠肺组织病理切片可见气管周围炎症细胞浸润，伴气道上皮脱落及气道嗜酸性粒细胞浸润；而激素治疗后肺组织病理较前明显缓解。
综上所述，10μg OVA滴鼻激发可以建立具有咳嗽明显、无气道高反应、气道嗜酸性粒细胞炎症、激素治疗有效的完善小鼠EB模型。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型的建立和检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将小鼠通过OVA致敏以及激发，建立嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型；
(2)将步骤(1)中获得的小鼠置于Buxco无创肺功能检测系统的密闭体描舱内自由活动；其中，Buxco无创肺功能检测系统连接有雾化控制器和信号转换器；
(3)使用乙酰甲胆碱雾化激发小鼠，并通过Finepointe软件的气道反应性模式测定小鼠雾化激发前后Penh值的变化来评价小鼠的气道反应性。
2.根据权利要求1中所述的嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型的建立和检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的激发通过如下步骤实现：将小鼠麻醉后用含有10μg OVA的OVA溶液滴鼻激发；
所述的OVA溶液通过如下方法配制得到：将OVA粉末溶解到生理盐水中，得到OVA溶液；其中，OVA粉末的用量按每毫克OVA粉末配比5ml生理盐水计算。
3.根据权利要求1中所述的嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型的建立和检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的致敏通过如下步骤实现：小鼠在第0天、第7天和第14天腹腔注射含有10μg OVA和1.3mg佐剂氢氧化铝的OVA溶液使小鼠致敏；
所述的OVA溶液通过如下方法配制得到：
(I)将OVA粉末溶解到生理盐水中，得到混合液A；其中，混合液A的浓度为2mg/ml；
(II)将混合液A与生理盐水按体积比1:19混合均匀，得到混合液B；
(III)将混合液B与佐剂氢氧化铝凝胶按体积比1：1混合均匀，得到混合液C；其中，佐剂氢氧化铝凝胶的浓度为13mg/ml；
(IV)将混合液C在4℃条件下放置1h，得到OVA溶液。
4.根据权利要求1中所述的嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型的建立和检测方法，其特征在于：
步骤(3)所述的使用乙酰甲胆碱雾化激发为依次使用浓度为3.125mg/ml、6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml和50mg/ml的乙酰甲胆碱雾化激发，每次雾化1min，记录3min，乙酰甲胆碱经雾化后进入体描舱内，由小鼠通过自主呼吸吸入。
5.根据权利要求1中所述的嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型的建立和检测方法，其特征在于，在步骤(3)之前还包括咳嗽敏感性检测的步骤，具体为：
使用辣椒素激发液雾化激发小鼠咳嗽，实时监听小鼠咳嗽声音，通过声音分析软件记录声波，并通过Finepointe软件将舱内气流变化转化为呼吸波形进行记录并自动实时分析、计数，以检测小鼠的咳嗽敏感性。
6.根据权利要求5中所述的嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型的建立和检测方法，其特征在于：
所述的辣椒素激发液的浓度为100μmol/L，雾化剂量为1.0ml/3min；
所述的声音分析软件为cooledit软件。
7.根据权利要求5中所述的嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型的建立和检测方法，其特征在于：
所述的辣辣椒素激发液由以下步骤配制而成：先将30.5mg的辣椒素，1ml的吐温80，1ml的无水乙醇和8ml的生理盐水混合均匀，得到原液；再取出0.5ml的原液与49.5ml的生理盐水混合均匀，得到辣辣椒素激发液。
8.根据权利要求1中所述的嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型的建立和检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述的嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠通过激素治疗后症状缓解。
9.根据权利要求8中所述的嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型的建立和检测方法，其特征在于：所述的激素为地塞米松。
10.根据权利要求1中所述的嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型的建立和检测方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的小鼠为雌性Balb/c小鼠，其年龄为7～8周龄，体重为18～20g，动物级别为SPF级。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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