CN102258527B - Toll样受体4激动剂CRX-675抗肺纤维化的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Toll样受体4激动剂CRX-675抗肺纤维化的用途。发明人通过系统的研究发现对于C57BL/6小鼠经气管内注射博莱霉素(3U/Kg)造成肺纤维化模型，在造模后7天开始，腹腔注射CRX-675(10mg/kg/day)至第21天；通过病理组织学及生化检测等方法发现激活TLR4信号通路能显著降低博莱霉素灌注小鼠的死亡率；激活TLR4信号通路显著降低博莱霉素诱导的肺部炎症和损伤，减小博莱霉素所致肺纤维化，包括降低肺部胶原沉积、羟脯氨酸含量和α-SMA的表达，改善肺纤维化小鼠的肺功能。

Description

Toll样受体4激动剂CRX-675抗肺纤维化的用途

技术领域

本发明设计Toll样受体4激动剂CRX-675在治疗肺纤维化中的新用途，属于医药技术领域。

背景技术

纤维化是许多慢性疾病致残和致死的主要原因，严重威胁着人们的健康和生命。据美国有关统计资料证明，接近45％的疾病致死病人可以归因于组织纤维增生疾病。近年来肺纤维化(Pulmonary fibrosis)发病率和致死率呈不断上升趋势。例如特发性肺纤维化临床诊断明确后的3年生存率不足50％，5年死亡率达65％。许多慢性肺疾病，包括哮喘、慢性支气管炎、支气管扩张、慢阻肺、肺结核、肺癌、间质性肺病等，都伴有纤维化病理改变。肺纤维化可引起肺泡持续性损伤、细胞外基质反复破坏、修复、重建并过度沉积，导致正常肺组织结构改变、功能丧失。对于特发性肺纤维化、呼吸窘迫综合征、嗜酸性肉芽肿等多种肺疾病而言，肺组织纤维增生和纤维化程度决定了该疾病的临床后果。这些疾病发展到晚期，严重妨碍病人正常工作和生活质量，甚至导致病人因呼吸衰竭或心力衰竭而死亡。肺纤维化的确切发病机制至今尚未完全阐明。除了吡非尼酮在日本已获准用于治疗间质性肺纤维化(但并未被美国FDA批准)外，目前还没有其它有效的药物和治疗方法。因此，深入研究肺纤维化的发生机制，并在此基础上发现新药靶、开发治疗肺纤维化防治药物迫在眉睫。

模式识别受体Toll样受体(Toll-Like Receptors，TLRs)是先天免疫系统沟通获得免疫系统的重要桥梁。虽然目前未见TLRs与肺纤维化发生、发展的直接证据，但最近的研究发现TLRs与多种纤维化疾病的发生有密切的联系，例如本实验室前期研究发现，无论是敲除TLR2还是治疗性给予中和性TLR2抗体均可显著抑制肺脏抑制性免疫微环境的形成，降低博来霉素所致肺损伤、纤维化和动物死亡；TLR2^-/-小鼠降低冠脉结扎引起心室重构。TLR4^-/-小鼠降低四氯化碳所致肝纤维化、降低腹主动脉狭窄引起的心肌重构。我们的研究表明，在二氧化硅或BLM所引起的急性肺损伤和肺纤维化过程中TLR4均起重要调节作用。

CRX-675(氨烷基葡糖胺4磷酯)是TLR4激动剂家族成员之一，既可影响机体防御病原体的第一防线固有免疫，也可调节过敏原引起的活动性免疫反应。已有研究表明，可减轻过敏反应，抑制感染，特别是影响呼吸道的感染。

发明内容

针对肺纤维化危害严重及缺少临床有效药物和治疗方法的现状，本发明提供了一种新的技术方案，即利用Toll样受体4激动剂CRX-675用于治疗肺纤维化。

本发明通过系统的研究发现对于C57BL/6小鼠经气管内注射博莱霉素(3U/Kg)造成肺纤维化模型，在造模后7天开始，腹腔注射CRX-675(10mg/kg/day)至第21天。通过病理组织学及生化检测等方法分别分析和评价博莱霉素灌注小鼠肺部炎症、损伤和纤维化的改变，发现激活TLR4信号通路能显著降低博莱霉素灌注小鼠的死亡率；激活TLR4信号通路显著降低博莱霉素诱导的肺部炎症和损伤，减小博莱霉素所致肺纤维化，包括降低肺部胶原沉积、羟脯氨酸含量和α-SMA的表达，改善肺纤维化小鼠的肺功能。

实验结果表明，TLR4激动剂CRX-675能抑制博莱霉素所致肺纤维化，改善肺纤维化小鼠的肺功能，大大降低其死亡率。

附图说明

Sham：假手术组

BLM：模型组

CRX-675：CRX-675治疗组

图1.CRX-675显著减少BLM所致动物死亡(小鼠生存率)。

图2.CRX-675显著减轻BLM致肺部炎症。

A，肺HE染色；B，肺部炎症指数。

图3.CRX-675显著降低BLM致肺部胶原沉积。

A，肺Masson染色；B，胶原沉积。

图4.CRX-675显著降低BLM致肺部组织中羟脯氨酸的含量。

图5.CRX-675显著降低BLM致肺部α-SMA的蛋白表达。

图6.CRX-675显著提高BLM致肺功能降低(n＝5)。

A，小鼠总肺活量(TLC)；

B，小鼠深吸气量(IC)；

C，小鼠肺活量(VC)；

D，小鼠肺顺应性(Cchord)；

E，小鼠更能残气量(FRC)；

F，小鼠最大肺活量(FVC)；

G，小鼠吸气时间(Ti)；

H，小鼠呼气时间(Te)；

I，小鼠用力呼气量50ms(FEV50))；

J，小鼠用力呼气量100ms(FEV100)。

具体实施方式

以下将结合实施例对发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。

实施例1

【材料和方法】

实验动物及主要试剂

C57BL/6J小鼠动物购自中国医学科学院实验动物研究所(雄性，6-8周，16-18g)。所有动物饲养于中国医学科学院药物研究所实验动物中心，恒温恒湿，自由饮食。

博莱霉素(Bleomycin，BLM)购自日本化药株式会社；anti-IgG抗体购自Biolegend；CRX-675购自Invivogen公司；羟脯氨酸测定试剂盒购自江苏南京建成生物有限公司；α-SMA抗体购自Boster公司；Western Blot实验中所使用的DAB显色剂购自北京普利来生物技术有限公司；苏木素染色液，伊红试剂以及Masson三色染色试剂盒均购自福州迈新生物科技开发有限公司。

肺纤维化动物模型(BLM致肺纤维化动物模型)

雄性C57BL/6J(6-8周龄)小鼠，隔夜禁食，戊巴比妥钠(45mg/kg，i.p.)麻醉。气管内注射BLM(3U/kg)，假手术组(Sham)气管内注射等体积的生理盐水。造模后每日记录体重及动物的死亡情况，至第28天结束实验。肺纤维化动物实验分组设计

共分为3组，即假手术组(Sham)、模型组(BLM)及CRX-675治疗组(CRX-675)。BLM造模后7天开始腹腔注射CRX-675(10mg/kg/day)至BLM造模后第21天。假手术组和模型组给予等量的生理盐水。

病理切片和结果分析

取动物右侧下叶肺组织，4％多聚甲醛固定后石蜡包埋，并在最大横截面积切片。分别通过苏木素/伊红(HE)和Masson染色观察炎症和纤维化状况。应用SpotAdvanced 3.0获得高清晰的病理图片，HE染色观察病理基本改变，并进行炎症评分。通过Image-Pro Plus 5.1分析Masson染色后胶原的着色面积和肺组织面积。使用Image-Pro Plus 5.1测量出每个视野Masson染色后的胶原的着色面积、视野下肺组织面积。以着色面积、着色面积与视野肺组织面积比表示该胶原的相对含量。博莱霉素所致肺纤维化实验中每组分析10个标本，每个标本随机取6个视野，取均值代表一个动物胶原组织在肺组织内的相对含量和表达强度；矽肺纤维化实验中每组分析12个标本，每个标本随机取10个视野，取均值代表一个动物胶原组织在肺组织内的相对含量和表达强度。通过非参数方差分析比较各组胶原面积。

羟脯氨酸测定

BLM所致肺纤维化实验中，检测动物左肺最大肺叶羟脯氨酸的含量，评价肺纤维化的情况。方法参照南京建成生物工程技术有限公司碱水解法测定组织羟脯氨酸含量试剂盒说明书。

Western Blot检测α-SMA的表达

提取实验组中小鼠肺脏组织总蛋白，应用Bradford法进行蛋白定量后，进行在12％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶上进行电泳。应用Western Blot免疫印迹法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，5％脱脂牛奶封闭，二步法检测α-SMA的表达，Gel-Pro 3.1软件进行数据分析。

肺功能检测

实验结束当日，戊巴比妥钠(45mg/kg，i.p.)麻醉，气管切口，置入肺功能检测系统，给予150次/min频率的被迫呼吸，测定吸气时间(Ti)、呼气时间(Te)、功能残气量(FRC)、深吸气量(IC)、肺活量(VC)、总肺活量(TLC)、肺顺应性(Cchord)、最大肺活量(FVC)、用力呼气量50ms(FEV50)和用力呼气量100ms(FEV100)，每组检测5只动物。

统计分析

实验结果用X±SE，经参数或者非参数方差检验，经比较P＜0.05有统计学差异，P＜0.01有明显的统计学差异。病理学分级资料的统计使用卡方检验，经比较P＜0.05认为有统计学差异，P＜0.01认为有明显的统计学差异。

【结果】

CRX-675显著减少BLM所致动物死亡

在所有肺纤维化动物模型中，BLM所致肺纤维化的发病机制与人特发性肺纤维化最为类似。因此，我们选择BLM诱导的小鼠肺纤维化模型。气管注射BLM可造成动物急性肺损伤甚至引起死亡，随着急性炎症的消退逐渐形成明显的肺纤维化。比较气管注射博莱霉素之后28天的时间段内各组小鼠的生存率。实验结果显示，造模28后，sham组动物无死亡，BLM可引起野生型小鼠40％动物死亡，TLR4激动剂CRX-675显著减少BLM所致动物死亡(图1)。

CRX-675显著减轻BLM致肺部炎症

研究发现，引起肺间质性疾病的原因高达150种以上，包括感染、毒物、药物、自身免疫性疾病、严重创(外)伤和辐射等，但是不同原因引起的肺间质性疾病都以肺组织炎症和组织纤维增生为共同病理特征。实验结果显示，BLM能够导致小鼠肺组织大量炎性细胞，包括淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和中性粒细胞在肺组织内的浸润。而TLR4激动剂CRX-675能够显著降低其炎症程度，显著减少淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞在肺组织浸润(图2，表1)。

表1CRX-675降低BLM诱导肺纤维化小鼠肺泡灌洗液中炎症细胞数量

CRX-675显著降低BLM致肺部胶原沉积

胶原是细胞外最重要的水不溶性纤维蛋白，是构成细胞外基质的骨架。胶原在细胞外基质中形成半晶体的纤维，给细胞提供抗张力和弹性，并在细胞的迁移和发育中起作用。临床上多发的各种器官纤维化的主要病因在于胶原纤维的过度生成和降解严重不足，从而导致细胞外基质过度沉积。实验结果显示，正常肺组织中仅有少量的胶原，而BLM诱导的肺纤维化小鼠肺部胶原大量沉积，TLR4激动剂CRX-675能够显著减小这一趋势(图3)。

CRX-675显著降低BLM致肺部组织中羟脯氨酸的含量

羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4％，在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在。而胶原蛋白大多分布在皮肤、腱、软骨和血管等处。因此，羟脯氨酸的量能反映结缔组织疾病中胶原的表达情况。实验结果显示，BLM诱导的肺纤维化小鼠肺部羟脯氨酸表达明显增加，TLR4激动剂CRX-675显著降低BLM所致的肺组织羟脯氨酸含量升高(图4)。

CRX-675显著降低BLM致肺部α-SMA的蛋白表达

正常肺组织中α-SMA仅在较大血管、支气管壁的平滑肌细胞的胞浆中表达，纤维化形成时，α-SMA可在肌成纤维细胞中出现，成为成纤维细胞分化的标志。实验结果显示，BLM能导致小鼠肺部α-SMA的蛋白表达明显增加，TLR4激动剂CRX-675能够显著减小这一趋势(图5)。

CRX-675显著提高BLM致肺功能降低

肺功能检查是呼吸系统疾病的必要检查之一，能客观地观测呼吸系统，识别可能被忽略的肺功能损害，对于早期检出肺、气道病变，评估疾病的病情严重程度及预后都有十分重要的作用。包括肺容量、通气、换气、弥散功能、血气分析和呼吸动力学等。实验结果显示，BLM能导致小鼠肺功能显著降低，包括Ti、Te、IC、VC、TLC、Cchord、FRC、FVC、FEV50和FEV100，TLR4激动剂CRX-675能够显著提高BLM致肺功能降低(图6)。

【结论】

本发明采用TLR4激动剂CRX-675激活TLR4信号传到通道，可显著抑制博莱霉素所致肺纤维化，减少肺部炎症，改善博莱霉素所致纤维化小鼠肺功能，显著降低肺纤维化小鼠死亡率。

Claims (1)

1.Toll样受体4激动剂CRX-675在制备治疗肺纤维化药物中的应用。