CN109601471A - 一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型及其应用 - Google Patents
一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109601471A CN109601471A CN201811258037.9A CN201811258037A CN109601471A CN 109601471 A CN109601471 A CN 109601471A CN 201811258037 A CN201811258037 A CN 201811258037A CN 109601471 A CN109601471 A CN 109601471A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- smoking
- day
- mouse
- animal
- animal model
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 title claims abstract description 55
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 230000006378 damage Effects 0.000 title claims abstract description 32
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 20
- 239000003546 flue gas Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 claims abstract description 145
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims abstract description 106
- 239000000779 smoke Substances 0.000 claims abstract description 47
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 37
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims abstract description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 41
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 38
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 29
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 25
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 20
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims description 14
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims description 14
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 14
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims description 14
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims description 14
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims description 14
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 12
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims description 11
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 7
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 claims description 6
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 claims description 6
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims description 6
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 6
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 claims description 6
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 6
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 6
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 6
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 5
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 claims description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 5
- 101100347633 Drosophila melanogaster Mhc gene Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000013010 irrigating solution Substances 0.000 claims description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 claims description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 claims 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 abstract description 25
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 abstract description 25
- 206010017740 Gas poisoning Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 27
- 230000006870 function Effects 0.000 description 25
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 21
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 12
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 12
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 11
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 10
- 102100030703 Interleukin-22 Human genes 0.000 description 10
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 10
- 108010074109 interleukin-22 Proteins 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 10
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 210000003826 marginal zone b cell Anatomy 0.000 description 6
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 description 6
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 5
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 4
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 4
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 3
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 2
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 2
- 101000622137 Homo sapiens P-selectin Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- STNJBCKSHOAVAJ-UHFFFAOYSA-N Methacrolein Chemical compound CC(=C)C=O STNJBCKSHOAVAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000004493 neutrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 208000037974 severe injury Diseases 0.000 description 2
- 230000009528 severe injury Effects 0.000 description 2
- 230000005586 smoking cessation Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 102400000739 Corticotropin Human genes 0.000 description 1
- 101800000414 Corticotropin Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000687808 Homo sapiens Suppressor of cytokine signaling 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 102100024784 Suppressor of cytokine signaling 2 Human genes 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 1
- 238000005267 amalgamation Methods 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000383 hazardous chemical Substances 0.000 description 1
- 230000008821 health effect Effects 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006101 laboratory sample Substances 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011022 operating instruction Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005316 response function Methods 0.000 description 1
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/02—Breeding vertebrates
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型及其应用，该动物模型的构建方法包括如下步骤：将实验小鼠置于吸烟气体染毒仪中，设定小鼠染毒的卷烟烟气浓度为60％，1次/日，吸烟10～40min/次/日，连续吸烟30天，得到评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型。该动物模型的建立有助于认识并系统评价吸烟对动物机体免疫系统的影响与作用特点，也可为烟草降害的判断提供实验数据，进而研制出低毒性卷烟，为无法戒烟者提供减害产品。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型及其应用。
背景技术
吸烟是世界各国家存在的群体现象，近年来有关吸烟对健康影响的研究越来越受到人们的重视。机体免疫系统具有重要的生理功能，是机体健康的捍卫者。鉴于此，人们希望了解有关吸烟对免疫系统是否有影响以及如何影响的机制。国外较早研究烟草对机体免疫影响的研究始于上世纪七十年代末，主要观察了吸烟者呼吸道周围局部免疫如补体蛋白、血清反应蛋白、免疫复合物以及溶菌酶的变化，特别是对肺部肿瘤患者与正常志愿者间一些免疫相关的物质进行了临床的检测；并对一些戒烟的志愿者的免疫机能的可能影响以及戒烟后的恢复进行了研究。
随着免疫学理论和技术的发展，烟草特别是烟草提取成分(粒相)对免疫细胞如吞噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞的影响进行了一些实验研究，显示烟草对吞噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞可能的影响作用。2001年，波兰免疫学者Moszczyński研究116名男性吸烟者细胞免疫和体液免疫状态的变化进行了较系统的监测。选取116名男性为观察对象，分为3组：第1组为轻度吸烟者，年龄21～37岁，烟龄<10年；第2组为重度吸烟者，年龄29～50岁，烟龄>10年；两组吸烟者每日吸烟数均为15～25支。第3组为对照组，年龄24～47岁，从不吸烟。对所有观察者进行体检，排除各种急慢性疾患，取清晨空腹静脉血进行免疫学检查。结果发现，第1组外周血淋巴细胞绝对计数高于第2组和对照组；第2组血清免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM)浓度与对照组相比显著下降，溶菌酶活性与对照和第1组相比也显著下降(P<0.05，P<0.01)；NK细胞(CD16+)的绝对计数，第1组升高而第2组显著下降；与对照组相比，细胞毒性T细胞(CD8+)，第1组升高了15％，第2组升高了23％。研究表明，吸烟可影响人体免疫系统，特别是长期吸烟者可抑制机体免疫功能，提示，吸烟的时间和剂量是影响免疫系统功能的关键因素。
国内学者研究了不同时间吸烟对实验动物淋巴细胞的影响。将大鼠置于吸烟室中3个月、9个月后，检测吸烟组及对照组大鼠淋巴细胞体液和细胞免疫功能，发现吸烟9个月后大鼠对绵羊红细胞的抗体形成细胞反应及抗CD3抗体诱导的增殖反应均较对照组明显降低，而吸烟3个月大鼠上述功能无显著差异。但该研究对吸烟的量没有详细的探讨，对不同吸烟剂量和时间与免疫功能的效应间缺乏系统的评价。
然而，近些年来，关于尼古丁对机体的作用在以往大量负面报道的基础上，逐步开始有了一些相反作用的报道，如抑制中枢神经元凋亡进程、压制细菌毒素引起的机体炎症反应、对缺氧状态下的细胞保护作用、促进血管再生及损伤修复及诱导干扰素(IFN)生成增加粘膜局部抵抗力等。尤其值得注意的是尼古丁在调节机体炎症反应过程时表现出与其它致炎因子不同的特性，提示尼古丁对于气道炎症的发生可能并非只是以往认为的负面效应。研究表明，尼古丁可抑制巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞对细菌内毒素(LPS)的刺激反应，减少白介素的释放，同时诱导IFN-γ的生成。研究也显示尼古丁可有效压制肠道炎症动物模型IL-8、IL-4的表达释放水平，减轻病理损伤程度。因此，吸烟对机体健康的影响仍然有待于进一步的实验研究与评估，也需要动物模型来综合评价吸烟对动物机体免疫系统的影响。但机体的免疫系统组成及功能复杂，目前尚没有有效的动物模型来综合评价吸烟对动物机体免疫系统及功能的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型及其应用，该动物模型可用于综合评价吸烟对动物机体免疫系统及功能的影响。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：
由于吸烟首先影响的是肺脏器官，且机体免疫细胞分布于机体的每个器官和组织包括肺脏器官中，因此，本发明采用吸烟后小鼠肺部病理疾病活动指数(Disease activityindex，DAI)评分的方法研究吸烟的剂量、时间与效应的关系，提出了一套系统的疾病活动指数评分体系。基于该评价体系，本发明设定出一种合理的模拟吸烟条件，即60％吸烟烟雾浓度、1次/日、10～40min/次/日、连续吸烟30天，进而得到适用于评价吸烟对肌体免疫系统及功能的影响的模拟吸烟条件。
本发明提供的吸烟后小鼠肺部病理进行疾病活动指数(DAI)评分体系如下：
肺泡完整性评分值A1(0-3分)：肺泡完整(-)记0分，轻度损伤(+)记1分，中度损伤(++)2分，重度损伤(+++)3分；
肺上皮细胞水肿评分值A2(0-3分)：无水肿(-)记0分，轻度水肿(+)记1分，中度水肿(++)记2分，重度水肿(+++)记3分；
炎症细胞浸润评分值A3(0-3分)：无浸润(-)记0分，少量浸润(+)记1分，中度浸润(++)记2分，大量浸润(+++)记3分；
支气管上皮完整性评分值A4(0-3分)：完整(-)记0分，轻度缺损(+)记1分，中度缺损(++)记2分，重度缺损(+++)记3分；
支气管水肿评分值A5(0-3分)：无水肿(-)记0分，轻度水肿(+)记1分，中度水肿(++)记2分，重度水肿(+++)记3分。
以肺泡完整性评分值A1+肺上皮细胞水肿评分值A2+炎症细胞浸润评分值A3+支气管上皮完整性评分值A4+支气管水肿评分值A5之和为肺部DAI值。
本发明经实验研究验证，当0分≤DAI值<8.5分，分值过低，不能很好反映出吸烟损伤。
当8.5分≤DAI值≤12.5分，为较好的评价吸烟对小鼠肺脏器官出现病理效应疾病活动的区间，可反映肺脏器官局部免疫病理的变化及全身免疫系统和功能的改变。
当12.5分<DAI值≤15分，该区间内会引起肺部COPD等严重并发症，与生理条件相差较大，不能完整地反应吸烟对肺部的影响。
经过大量实验验证及创造性分析，本发明将吸烟条件设定为卷烟烟气浓度为60％，1次/日，吸烟10～40min/次/日，连续吸烟30天，实验小鼠的DAI值介于8.5-12.5分之间，在上述吸烟的剂量、时间与效应条件下，肺脏器官病理疾病活动指数(DAI)评分出现的病理效应可反映肺脏器官局部免疫病理的变化，并探讨全身免疫系统和功能的改变关系，为较佳的吸烟模拟条件，可用于建立适用于评价吸烟对动物机体免疫系统及功能影响的动物模型。
本发明提供的一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型，该动物模型的构建方法包括如下步骤：将实验小鼠置于吸烟气体染毒仪附带的密封染毒舱室中，设定染毒舱室空间内卷烟烟气体积浓度为60％，1次/日，吸烟10～40min/次/日，连续吸烟30天，得到评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型。
优选的，所述评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型的构建方法中，分别设定鼠染毒的卷烟烟气浓度为60％，1次/日，吸烟10min/次/日，连续吸烟30天；卷烟烟气浓度为60％，1次/日，吸烟20min/次/日，连续吸烟30天；卷烟烟气浓度为60％，1次/日，吸烟40min/次/日，连续吸烟30天，得到3组动物模型。
更优选的，所述评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型的构建方法中，设定卷烟烟气浓度为60％，1次/日，吸烟20min/次/日，连续吸烟30天，得到动物模型。
另外，本发明提供所述动物模型在评价卷烟烟气对动物免疫系统损伤中的应用。通过该动物模型提供的一种合理的模拟吸烟条件即60％吸烟烟雾浓度、1次/日、10～40min/次/日、连续吸烟30天，应用于评价不同组成的卷烟燃烧后动物在该卷烟烟气条件下吸烟对其机体免疫系统及功能的影响。
本发明提供所述动物模型在研制低毒性卷烟中的应用。通过该动物模型提供的一种合理的模拟吸烟条件，即60％吸烟烟雾浓度、1次/日、10～40min/次/日、连续吸烟30天，应用于评价不同组成的卷烟燃烧后动物在该卷烟烟气条件下吸烟对机体免疫系统及功能的影响；以动物在该卷烟烟气条件下吸烟对机体免疫系统及功能的结果调整卷烟的组方，进而研制低毒性卷烟。
本发明还提供一种卷烟烟气对动物机体免疫系统功能影响的评价方法，其包括如下步骤：
1)将实验动物置于密封空间中，设定小鼠染毒的卷烟烟气浓度为60％、10～40min/次/日、1次/日，连续吸烟30天；
2)通过对步骤1)处理后的实验动物进行机体免疫系统损伤检测，评价卷烟燃烧后的烟气对动物机体免疫系统的影响。
进一步，步骤2)中，所述对步骤1)处理后的实验动物进行机体免疫系统损伤检测包括：检测实验动物吸烟前后肺脏局部肺泡灌洗液中细胞量及分泌细胞因子量变化；检测实验动物吸烟前后肺脏组织细胞因子变化；检测实验动物吸烟前后肺脏免疫相关基因及分子的表达变化；检测实验动物吸烟前后免疫系统中CD4+T细胞、CD8+T细胞数量和比例的变化及T淋巴细胞中CD69、CD25、MHC II的表达情况；检测实验动物吸烟前后脾脏中B细胞各亚群比例变化及血清中IgM、IgG、IgA、IgD、IgE的表达情况评估吸烟对动物获得性免疫功能的影响。
再，所述检测实验动物肺泡灌洗液中细胞量及分泌细胞因子量变化中所述细胞量为巨噬细胞含量、NK细胞含量、中性粒细胞含量，所述分泌细胞因子量为炎症因子表达量，所述炎症因子包括IL-1、IL-6、TNF、hs-CRP、溶菌酶。
本发明所述免疫相关基因及分子包括巨噬细胞表达的CD40、CD80、CD86、Ia及炎症细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α。所述B细胞亚群包括FoB(滤泡B细胞)和MZB(边缘区B细胞)。
本发明以动物机体天然免疫为研究内容的主线，结合机体特异性免疫，通过整体动物的研究方法，考察出烟草烟气对动物机体免疫系统影响的剂量和时间，并在上述模拟吸烟条件下建立动物模型，从而方便、准确地从免疫细胞、免疫分子水平得到不同烟草烟气对机体免疫系统的影响，评价出卷烟烟气对动物机体免疫系统功能影响，得到烟草对机体免疫系统的损伤情况。
本发明的有益效果：
本发明建立了卷烟烟气对免疫系统功能毒性作用的实验动物模型，该动物模型从肺脏局部、免疫器官及整体免疫方面较系统、全面地反映吸烟对动物免疫系统的影响。该动物模型的建立有助于认识并系统评价吸烟对动物机体免疫系统的影响与作用特点，也可为烟草降害的判断提供实验数据，进而研制出低毒性卷烟，为无法戒烟者提供减害产品。
附图说明
图1为本发明实施例1小鼠吸烟30天后肺部典型病理表现照片。
图2为本发明实施例2烟气染毒后，小鼠支气管灌洗液中固有免疫细胞Ly6G变化典型图。
图3为本发明实施例2烟气染毒后，小鼠支气管灌洗液中固有免疫细胞CD3变化典型图。
图4为本发明实施例2为吸烟对小鼠肺泡灌洗液上清中炎症因子和溶菌酶产生的影响。
图5为本发明实施例4吸烟小鼠肺部表达谱的Heatmap分析。
图6为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞细胞表面分子CD40表达的影响。
图7为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞细胞表面分子CD80表达的影响。
图8为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞细胞表面分子CD86表达的影响。
图9为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞细胞表面分子la表达的影响。
图10为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞细胞炎性因子产生的影响。
图11为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞CD40针对LPS的反应性的影响。
图12为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞CD80针对LPS的反应性的影响。
图13为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞CD60针对LPS的反应性的影响。
图14为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞la针对LPS的反应性的影响。
图15为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞针对LPS的反应性产生炎性因子的影响。
图16为本发明实施例6吸烟对小鼠胸腺淋巴细胞比例的影响。
图17为本发明实施例6吸烟对脾脏淋巴细胞比例的影响。
图18为本发明实施例6小鼠吸烟后T细胞对conA刺激后CD25、CD69及Ia分子的表达。
图19为本发明实施例6小鼠吸烟30天后对脾脏T细胞增殖能力与细胞因子分泌能力的影响。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
实施例1小鼠吸烟浓度、时间的生物学效应模式与免疫损伤实验模型的建立
如何评价吸烟的生物学效应是关乎后续开展的吸烟对机体免疫系统即功能影响的首先面临的问题。由于吸烟首先影响的是肺脏器官，且机体免疫系统分布于机体的每个器官和组织包括肺脏中，因此，本实施例采用对吸烟后小鼠肺部病理疾病活动指数(DAI)评分的方法研究吸烟的剂量和时间与效应的关系，用于免疫系统及功能的影响评价。
吸烟后小鼠肺部病理进行疾病活动指数(DAI)评分方法及标准如下：
肺泡完整性评分值A1(0-3分)：肺泡完整(-)记0分，轻度损伤(+)记1分，中度损伤(++)2分，重度损伤(+++)3分；
肺上皮细胞水肿评分值A2(0-3分)：无水肿(-)记0分，轻度水肿(+)记1分，中度水肿(++)记2分，重度水肿(+++)记3分；
炎症细胞浸润评分值A3(0-3分)：无浸润(-)记0分，少量浸润(+)记1分，中度浸润(++)记2分，大量浸润(+++)记3分；
支气管上皮完整性评分值A4(0-3分)：完整(-)记0分，轻度缺损(+)记1分，中度缺损(++)记2分，重度缺损(+++)记3分；
支气管水肿评分值A5(0-3分)：无水肿(-)记0分，轻度水肿(+)记1分，中度水肿(++)记2分，重度水肿(+++)记3分。
以肺泡完整性评分值A1+肺上皮细胞水肿评分值A2+炎症细胞浸润评分值A3+支气管上皮完整性评分值A4+支气管水肿评分值A5之和为肺部DAI值。
本发明经实验研究验证，当0分≤DAI值<8.5分，分值过低，不能很好反映出吸烟损伤。
当8.5分≤DAI值≤12.5分，为较好的评价吸烟对小鼠肺脏器官出现病理效应疾病活动的区间，可反映肺脏器官局部免疫病理的变化及全身免疫系统和功能的改变。
当12.5分<DAI值≤15分，该区间内会引起肺部COPD等严重并发症，与生理条件相差较大，不能完整地反应吸烟对肺部的影响。
将实验小鼠(C57BL/6小鼠)随机分组(分5组，每组20只)，将动物置于动物吸烟气体染毒仪(HRH-CSED-K)中，设定小鼠染毒烟雾浓度为20％、40％、60％、80％，分别吸烟10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日，连续吸烟30天；正常对照组不吸烟。1个月后中止吸烟，进行相应的实验。
本实施例中烟雾来源于江西中烟工业有限责任公司提供的对照卷烟(生产批号为20150225-0)，经过智能吸烟机(HRH-SM120)将烟雾输入动物吸烟气体染毒仪(HRH-CSED-K)的密封染毒舱室中，并设定染毒舱室空间内所需的卷烟烟气浓度。
对不同吸烟条件下小鼠肺部病理切片进行了DAI评分，评分结果参见表1。
由表1可知，第15-18组、第19-21组、第22-23组、第25组的DAI评分在8.5分≤DAI值≤12.5分范围内，但是相对应第19-21组，第15组的每天每次吸烟时间过长，第16-18组、第22-23组的连续吸烟天数过长，第25组的烟雾浓度过高，因此，综合考虑实验时间及成本与DAI分数，较佳的吸烟评价模拟条件是：60％吸烟浓度、1次/日、10-40min/次/日、连续吸烟30天；最佳评价条件是60％吸烟浓度、1次/日、20min/次/日、连续吸烟30天。
表1小鼠肺部病理进行疾病活动指数(DAI)评分表
图1为第19-21组小鼠吸烟30天后肺部典型病理表现照片及对照组小鼠肺部照片，发现未吸烟的对照组肺泡结构明显，结构清晰，肺泡腔中及间质无出血水肿情况(参见图1A)；吸烟10min/日组与吸烟20min/日组小鼠的部分肺泡可见水肿，少部分区域出现免疫细胞浸润(参见图1B、图1C)；吸烟40min/日组小鼠可见显著的肺泡充血，可见灶性淤血或出血(参见图1D)。因此，以60％对照卷烟的烟雾浓度连续30天吸烟可导致肺脏的炎症病理，以40min/次/日尤为明显。
实施例2利用动物模型评价吸烟对小鼠肺部区域性免疫功能的影响
本实施例中烟雾的来源于江西中烟工业有限责任公司提供的对照卷烟(生产批号为20150225-0)，经过智能吸烟机(HRH-SM120)将烟雾输入动物吸烟气体染毒仪(HRH-CSED-K)的密封染毒舱室中，并设定染毒舱室空间内所需的卷烟烟气浓度
将动物置于动物吸烟气体染毒仪(HRH-CSED-K)中，设定小鼠染毒烟雾浓度为60％，吸烟1次/日，分别吸烟10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日；正常对照组不吸烟。1个月后中止吸烟，进行相应的实验。本实施例检测了该模式烟雾下吸烟对小鼠肺泡灌洗液中细胞含量的变化及细胞因子表达的情况。
首先，对小鼠支气管进行灌洗，利用流式细胞仪(FACS)对支气管进行灌洗液(BALF)中免疫细胞亚群进行了测定，肺泡灌洗液中细胞量测定结果参见表2，小鼠支气管灌洗液中固有免疫细胞变化典型图参见图2-图3。
由表2可知，小鼠在60％烟雾下吸烟20min/次/日、30天后，小鼠肺泡灌洗液中细胞含量均增加(P<0.05)，但吸烟10min/日30天组的肺泡灌洗液细胞含量与对照细胞相比增加不明显，而在吸烟40min/次/日的卷烟烟气吸烟30天后，与对照细胞相比，肺泡灌洗液细胞含量显著增加(P<0.01)。
同时，由表2及图2-3可知，FACS检测免疫细胞亚群比例发现，吸烟后小鼠BALF中巨噬细胞(CD11b+Ly6G-)、NK细胞(NK1.1+CD3-)差异并不明显，但中性粒细胞(CD11b+Ly6G+)、和NKT(NK1.1+CD3+)细胞的比例均有所上调，吸烟20min组小鼠上调最为显著，40min组小鼠发生下调。
表2.不同模式吸烟对小鼠肺泡灌洗液中细胞量的影响
| 组别 | 巨噬细胞(％) | 中性粒细胞(％) | NK细胞(％) | NKT细胞(％) |
| 0min | 3.3±0.3 | 46.1±3.1 | 6.0±0.8 | 27.9±5.2 |
| 10min | 2.9±0.2* | 58.2±4.8** | 8.5±1.1** | 48.4±6.3** |
| 20min | 0.7±0.2** | 83.3±4.9** | 4.8±1.3 | 73.4±8.4** |
| 40min | 1.9±0.2** | 57.7±4.2** | 6.5±1.2 | 39.9±5.7** |
与0min组比较，*p<0.05，**p<0.01；n＝5。
本实施例还检测了吸烟对小鼠肺泡灌洗液上清中炎症因子及溶菌酶表达情况的影响，上清中IL-1、IL-6、TNF、hs-CRP、溶菌酶含量采用检测试剂盒检测。检测方法包括：将100微升待测上清加入包被好IL-1等抗体的孔板中；分别加入第一抗体工作液200微升，反应板充分混匀后室温下放置2小时，洗涤反应板3次，在吸水纸上控干；每孔加酶标抗体工作液200微升，室温下孵育2小时；用洗涤液将反应板充分洗涤3次，在吸水纸上控干；每孔加底物工作液100微升，室温处反应30分钟，每孔加入50微升终止液混匀30分钟内在96孔板微量分光光度仪上，在490nm波长处测OD值，以690nm的波长矫正，制作标准曲线测定待测样品的含量。
检测结果参见图4，由图4可知，在吸烟10min/次/日、30天后，小鼠肺泡灌洗液上清中IL-1、IL-6、TNF、hs-CRP、溶菌酶含量均增加(P<0.05)；在吸烟20min/次/日、30天后，小鼠肺泡灌洗液中细胞表达IL-1、IL-6、TNF、溶菌酶(LYZ)含量均增加(P<0.01)；而在吸烟40min/次/日、30天后，小鼠肺泡灌洗液中细胞表达IL-1、IL-6、TNF、hs-CRP含量也增加(P<0.05)，但溶菌酶含量降低，提示烟雾浓度为60％、吸烟1次/日、40min/次/日、连续吸烟30天可抑制溶菌酶的产生。
实施例3利用动物模型评价吸烟对小鼠体重、免疫器官的影响
本实施例评价了小鼠染毒烟雾浓度为60％条件下，吸烟时间分为10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日，吸烟1个月后小鼠体重及免疫器官的影响。正常对照组不吸烟。1个月后中止吸烟，进行相应的实验秤取小鼠体重的变化；处死小鼠后去脾脏、胸腺。分析天平称重，计算免疫器官系数。
小鼠吸烟后，各组小鼠免疫器官胸腺、脾脏重量及其系数结果如表3-5所示。由表3-5可见，在烟雾浓度60％条件下，吸烟20min/次/日、40min/次/日，吸烟30天后均可导致小鼠体重的减轻；与未吸烟组比较，实验组小鼠胸腺、脾脏系数均明显降低，表明在烟雾浓度60％条件下，吸烟20min/次/日、40min/次/日吸烟30天后对小鼠免疫器官产生了效应。
表3.小鼠吸烟10min/次/日1个月后免疫器官重量及系数结果
| 染毒浓度 | 0％ | 20％ | 40％ | 60％ | 80％ |
| 体重(g) | 25.6±3.3 | 25.1±3.2 | 24.7±3.4 | 24.1±4.2 | 24.5±5.1 |
| 脾系数[％] | 0.41±0.03 | 0.40±0.02 | 0.39±0.02 | 0.385±0.02 | 0.38±0.02* |
| 胸腺系数[％] | 0.25±0.02 | 0.25±0.02 | 0.23±0.02 | 0.23±0.04 | 0.22±0.05 |
与0min组比较，*p<0.05，**p<0.01；n＝10
表4.小鼠吸烟20min/次/日1个月后免疫器官重量及系数结果
| 染毒浓度 | 0％ | 20％ | 40％ | 60％ | 80％ |
| 体重(g) | 25.5±3.7 | 24.9±3.6 | 23.7±3.4 | 22.9±4.6 | 21.8±5.4** |
| 脾系数[％] | 0.42±0.02 | 0.40±0.04 | 0.39±0.03* | 0.35±0.03** | 0.32±0.02** |
| 胸腺系数[％] | 0.25±0.01 | 0.24±0.02 | 0.23±0.03 | 0.19±0.03* | 0.17±0.04** |
与0min组比较，**p<0.01；n＝10
表5.小鼠吸烟40min/次/日1个月后免疫器官重量及系数结果
| 染毒浓度 | 0％ | 20％ | 40％ | 60％ | 80％ |
| 体重(g) | 25.4±3.5 | 24.9±3.7 | 23.7±4.4 | 20.1±4.6** | 19.5±5.4** |
| 脾系数[％] | 0.41±0.03 | 0.37±0.02* | 0.33±0.02* | 0.31±0.01** | 0.27±0.02** |
| 胸腺系数[％] | 0.25±0.03 | 0.24±0.04 | 0.22±0.06* | 0.16±0.04** | 0.16±0.05** |
与0min组比较，**p<0.01；n＝10
实施例4利用动物模型评价吸烟对小鼠肺脏免疫相关基因表达的影响
随机选取以60％对照卷烟的烟雾浓度连续30天的10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日组各一小鼠的右侧肺叶，采用mirVanaTMmiRNAIsolation Kit(Cat#AM1560,Ambion,Austin,TX,US)，根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的total RNA抽提，抽提所得total RNA经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)电泳质检合格后备用。之后实验样品RNA采用Agilent表达谱芯片配套的试剂盒，按照标准操作流程的标记部分对样品中的mRNA分子进行荧光标记。按照Agilent miRNA芯片配套提供的标准操作流程和配套试剂盒，mRNA Complete Labeling and Hyb Ki的杂交部分，进行样品的杂交实验。在滚动杂交炉中，Hybridization Oven，55℃，20rpm，滚动杂交20小时。杂交完成后在洗缸staining dishes中洗片，洗片所用的试剂为Gene ExpressionWash Buffer Kit。芯片结果采用Agilent Microarray Scanner进行扫描，用FeatureExtraction software 10.7读取数据，软件设置Scan resolution＝5μm,PMT 100％，5％最后采用Gene Spring Software 11.0进行归一化处理，所用的算法为Quantile，使用Illumina高通量测序平台检测其基因表达差异，将测序结果进行比对，筛选Log2(countingnumber)>3的结果进行分析，heatmap分析结果如图5所示。
由图5结果显示，IL-6与溶菌酶(LYZ)在吸烟10min/日与20min/日、30天后中出现上调，在40min/日组出现显著的下调，免疫抑制因子SOCS2在所有吸烟组中出现下调。上述结果表明，小剂量吸入香烟后会导致肺部区域免疫相关基因的活化，介导肺部炎症反应性的增强；而大剂量吸入香烟烟气后可介导肺部炎症损害，并导致肺部区域免疫相关基因表达的显著抑制。
实施例5利用动物模型评价吸烟对小鼠巨噬细胞细胞功能的影响
机体免疫系统中的巨噬细胞作为专职的抗原提呈细胞，具有吞噬和杀伤病原体细胞等可以物质的能力，在介导天然免疫应答的过程中起着重要的作用。为了探究烟草烟气对小鼠巨噬细胞的免疫功能的影响，本实施例研究小鼠以60％的吸烟烟雾浓度、吸烟时间分为10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日、共计30天后，机体腹腔巨噬细胞的功能变化。
取上述吸烟及对照组小鼠，收集腹腔巨噬细胞至15ml离心管中，1000转离心10分钟，弃上清；加入10ml Tris-NH4CL室温破红约10分钟，1000转离心10分钟，弃上清；PBS洗涤一遍，加入1x流式Buffer(PBS+2％BSA)500微升重悬，分管；每管分别加入0.3微升CD40-FITC、CD80-PE、CD86-PERCP、Ia-APC流式抗体，轻轻混匀，避光孵育15-30分钟；PBS洗涤两遍，1000转离心10分钟，弃上清；每管加入200微升流式Buffer重悬，通过FACS检测巨噬细胞表面各类免疫分子的表达，检测结果分别参见图6-图9。由图6-图9可知，吸烟可导致巨噬细胞CD40、CD80、CD86及Ia的上调表达，吸烟20min/次/日组小鼠上调尤为明显，40min/次/日组发生下调。
本发明检测了小鼠以60％的吸烟烟雾浓度、吸烟时间分为10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日、共计30天后，收集机体腹腔巨噬细胞培养上清，将100微升待测上清加入包被好IL-1、IL-6、TNF-α抗体的孔板中；分别加入第一抗体工作液200微升，反应板充分混匀后室温下放置2小时，洗涤反应板3次，在吸水纸上控干；每孔加酶标抗体工作液200微升，室温下孵育2小时；用洗涤液将反应板充分洗涤3次，在吸水纸上控干；每孔加底物工作液100微升，室温处反应30分钟，每孔加入50微升终止液混匀30分钟内在96孔板微量分光光度仪上，在490nm波长处测OD值，以690nm的波长矫正。IL-1、IL-6、TNF-α等炎性因子的表达结果参见图10。由图10可知，显示吸烟20min/次/日组小鼠上调尤为明显，40min/次/日组发生下调。上述结果提示，吸烟可活化小鼠巨噬细胞，激活天然免疫应答。但吸烟40min/次/日则可造成小鼠巨噬细胞活化抑制，导致天然免疫应答被抑制。
进一步采用内毒素(LPS)再刺激各组小鼠腹腔巨噬细胞，以检测巨噬细胞对危险刺激的反应性，结果分别参见图11-图14。由图11-图14发现，相比对照组，各组巨噬细胞CD40、CD80、CD86、Ia表面分子均发生不同程度下调，40minn/次/日组下调最为显著。
进一步采用内毒素(LPS)再刺激各组小鼠腹腔巨噬细胞，以检测巨噬细胞对危险刺激的反应性及其产生免疫物质的影响，结果参见图15。由图15发现，相比对照组，各组巨噬细胞IL-1、TNF-α、IL-6等炎性因子的表达也发生了不同程度的下调，同样以吸烟40min/次/日组下调最为显著。提示吸烟40min/次/日组可显著抑制巨噬细胞对抗原的反应性。
实施例6利用动物模型评价吸烟对小鼠获得性免疫功能的影响
烟草烟气对获得性免疫系统的作用机制尚不明确，可能有以下几种作用途径：首先，对细胞免疫的影响。①烟草中的尼古丁在被肺部吸收后，随着血液进入血脑，刺激交感肾上腺系统，能显著加快促肾上腺皮质激素的分泌，并瞬时快速诱导某些蛋白的表达，从而增加血浆中儿茶酚胺以及肾上腺皮质激素的浓度，而儿茶酚胺、肾上腺皮质激素都对细胞免疫有一定的抑制作用。②T淋巴细胞的增殖和生长都需要白介素2(IL-2)，而IL-2只有与膜白介素2受体(mIL-2R)结合才能发挥免疫调节作用。烟雾中的众多有害物质，如苯并芘、丙烯醛等会刺激免疫活性细胞，引起血清中可溶性白介素2受体(sIL-2R)浓度升高，sIL-2R是一种免疫抑制物质，会与mIL-2R竞争结合IL-2，抑制IL-2的免疫调节作用。
其次，对体液免疫的影响。目前国内外针对吸烟对体液免疫的作用机制研究较少，大部分学者都从吸烟影响B淋巴细胞的生长、增殖等角度探讨吸烟对免疫球蛋白的影响，但具体的影响机制不明。同时，烟草中的有些危害物质会对B淋巴细胞的DNA造成损害，从而影响B细胞的增殖；有学者认为高浓度烟雾会抑制细胞信号转导系统的功能，从而干扰B淋巴细胞的增殖。
本实施例从居住特异性(获得性)免疫功能的细胞即T淋巴细胞、B淋巴细胞的主要免疫器官脾脏及淋巴结入手，分析吸烟对其重量、T淋巴细胞、B淋巴细胞的组成及功能探讨吸烟的可能作用。
本实施例探讨了60％烟雾下小鼠10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日吸烟30天后脾脏组织的变化。取吸烟30天的各组小鼠的脾脏，称重后，研磨制备成为单个细胞悬液。应用流式细胞仪计数并分析CD4+T细胞、CD8+T细胞数量和比例的改变。小鼠胸腺中T淋巴细胞含量结果参见表6，小鼠脾脏中T淋巴细胞含量结果参见表7，图16-图17为吸烟对小鼠脾脏淋巴结胸腺及淋巴细胞比例的影响结果。
由表6-7及图16-图17可知，在吸烟后小鼠胸腺中及脾脏中CD8+T细胞比例在吸烟20min/次/日组小鼠时发生显著上调，而在40min/次/日剂量组时有所下降。
表6.吸烟对小鼠胸腺中T淋巴细胞比例的影响
| 染毒浓度 | 0min/次/日 | 10min/次/日 | 20min/次/日 | 40min/次/日 |
| CD4+(％) | 9.8±1.8 | 13.4±4.2** | 14.2±3.1** | 8.1±1.5 |
| CD8+(％) | 2.1±0.3 | 2.2±0.4 | 4.8±0.8** | 1.6±0.6 |
表7.吸烟对小鼠脾脏中T淋巴细胞比例的影响
| 染毒浓度 | 0min/次/日 | 10min/次/日 | 20min/次/日 | 40min/次/日 |
| CD4+(％) | 12.5±3.4 | 14.4±2.1* | 16.7±3.2** | 16.6±1.4** |
| CD8+(％) | 7.3±0.4 | 11.3±0.6** | 10.4±0.3** | 10.6±0.3** |
B2即通常指的B细胞，为CD5-B细胞，主要识别蛋白质抗原。在Th细胞的辅助下，B2细胞才能被完全激活并介导对T细胞依赖抗原的免疫应答，产生特异性抗体。B2细胞介导的免疫应答特点为：可发生体细胞突变，有亲和力成熟，产生高亲和力抗体，可产生免疫记忆细胞。B2细胞按照分布位置不同分为FoB(滤泡B细胞)和MZB(边缘区B细胞)，表型分别为B220+CD23hiCD21low和B220+CD23lowCD21hi。
本实施例检测了60％烟雾下小鼠10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日吸烟30天后脾脏组织中B2细胞各亚群含量，检测方法如下：处死小鼠后，无菌取脾，200目钢网研磨，3000转离心5min，弃上清，以15mlTris-NH4CL室温破红10min，3000转离心5min；PBS洗一遍后加入1x流式Buffer(PBS+2％BSA)500微升重悬，分管；每管分别加入0.3微升CD23-FITC、、CD23-PE、B220-PERCP流式抗体，轻轻混匀，避光孵育15-30分钟；PBS洗涤两遍，3000转离心10分钟，弃上清；每管加入200微升流式Buffer重悬，通过FACS检测B2细胞亚群，结果参见表8。
由表8可知，吸烟20min/次/日时，脾脏中FoB与MZB比例均增加，但40min/次/日时，这一现象存在被逆转趋势。
表8.小鼠吸烟后脾脏中B2细胞各亚群变化
| 染毒浓度 | 0min/次/日 | 10min/次/日 | 20min/次/日 | 40min/次/日 |
| FoB(％) | 59.8±1.3 | 60.4±1.6 | 67.3±1.5* | 62.3±1.4 |
| MZB(％) | 10.3±1.4 | 11.5±0.9 | 18.4±1.3* | 12.4±0.6 |
T淋巴细胞在活化过程中会表达一些特殊的分子，如CD69(较早期)、CD71(早期)、CD25(晚期)、HLA-DR(较晚期)以及黏附分子CD62L和CD44等。本实施例采用磁珠分选染毒小鼠脾脏CD4+CD62+naive T细胞，conA刺激，并流式检测CD69、CD25以及MHC II的表达情况，以评估染毒后小鼠T细胞活化能力变化，具体操作如下：
磁珠分选CD4+CD62+naive T细胞：无菌取小鼠脾脏，200目钢网研磨，吸入15ml离心管，1200rmp离心5min。弃除上清，加入8-10ml/管Tris-NH4Cl，破红，1200rmp离心5min，弃上清获取单个核细胞悬液，计数后取1×108个细胞用于分选。离心后用分选缓冲液重悬至200μl，加入20μl磁珠混匀，4℃继续避光孵育15min，加10ml分选缓冲液后离心弃上清并用500μl分选缓冲液重悬。离心期间安装MACS LD分选柱，2ml分选缓冲液润柱3次，将重悬细胞混匀加至LD柱，液体留空后加分选缓冲液1ml×3次洗柱，无菌离心管收集流出的未标记细胞悬液即为CD4+T细胞，将收集到的CD4+T细胞离心后用分选缓冲液重悬至400μl，加结合磁珠的CD62L分选抗体20μl，4℃避光孵育10min，10ml分选缓冲液重悬并离心，弃上清后用分选缓冲液500μl重悬。安装MS柱并用500μl缓冲液润柱3次，将500μl细胞悬液混匀后加至MS柱，待悬液流空加500μl×3次洗柱，洗柱完成后加1ml分选缓冲液至MS柱，将MS柱取下放至新的无菌离心管，取配套栓塞用力挤压液体，栓塞挤压后冲出分选柱部分细胞悬液即为CD4+CD62L+naive T细胞；
体外培养并以conA刺激培养24小时后收集至1ml离心管中，3000转离心5分钟，弃上清；PBS洗涤一遍，加入1x流式Buffer(PBS+2％BSA)100微升重悬；每管加入0.3微升CD69-FITC、CD25-PE以及MHC II-APC流式抗体，轻轻混匀，避光孵育15-30分钟；PBS洗涤两遍，3000转离心5分钟，弃上清；每管加入200微升流式Buffer重悬，立即上样检测，以评估染毒后小鼠T细胞活化能力变化。
小鼠吸烟后T细胞对conA刺激后CD25、CD69及Ia分子的表达结果参见图18，结果显示，染毒小鼠脾脏T细胞的活化能力与染毒剂量成剂量递增关系，20min/次/日时到达顶峰，40min/次/日时这一趋势消失。
使用磁珠分选法调取CD3+T细胞(H-2b)，采用ConA刺激，5％CO2培养箱孵育50小时后吸取上清液100ul，用于检测IL-2、IFN-gmma的表达水平；加入CCK8试剂继续培养20小时后，检测T细胞的增殖，结果参见图19。具体操作如下：
使用磁珠分选法调取CD3+T细胞(H-2b)：采用美天妮CD3分选磁珠。处死小鼠，无菌取脾脏，200目钢网研磨。吸入15ml离心管，1200rmp离心5min。弃除上清，加入8-10ml/管Tris-NH4Cl,破红，1200rmp离心5min，弃上清。加入120微升/管PBSE，混匀。加入10微升/管磁珠，混匀后4℃15min,中间混一次。加入15毫升/管PBSE，混匀，1500rmp离心10min后弃上清，2ml PBSE重悬。取无菌阳选柱，2mlPBSE洗3次。重悬好的细胞过柱子，再过2mlPBSE，洗两遍。取下柱子，加入2ml PBSE，迅速打出磁铁吸附的细胞，冲洗两次。收集细胞至离心管，1200rmp离心5min后弃上清，采用ConA刺激，5％CO2培养箱孵育50小时后吸取上清液100ul，用于检测IL-2、IFN-gmma的表达水平(将100微升待测培养上清加入包被好IL-2、IFN-gmma抗体的孔板中；分别加入第一抗体工作液200微升，反应板充分混匀后室温下放置2小时，洗涤反应板3次，印干；每孔加酶标抗体工作液200微升，室温下孵育2小时；用洗涤液将反应板充分洗涤3次，印干；每孔加底物工作液100微升，室温处反应30分钟；每孔加入50微升终止液混匀；30分钟内在96孔板微量分光光度仪上，在490nm波长处测OD值)；加入CCK8试剂继续培养20小时后，检测T细胞的增殖(细胞增殖实验采用CCK8检测，按照操作说明取对数生长期的细胞，以每孔100μL体积，5×103个/孔细胞铺于96孔板，每组设置6个复孔，96孔板四周的孔分别加入等量PBS，防止边缘效应。细胞培养72小时后，加入10μL CCK8试剂，37℃，孵育2小时，于450nm波长处测定OD值，结果参见图19。
由图19结果发现，10min/次/日与20min/次/日吸烟30天后对脾脏的质量、脾脏T细胞产生IL-2、IFN-γ的水平均无显著影响，40min/次/日吸烟30天后对脾脏质量、脾脏T细胞产生IL-2、IFN-γ有降低，同时对T细胞的增殖有一定的抑制作用(P<0.05。上述结果提示，10min/日、20min/日吸烟30天后对脾脏免疫功能无显著影响。
体液免疫中，主要是通过B淋巴细胞合成并分泌的免疫球蛋白发挥作用，包括IgM、IgG、IgA、IgD、IgE五类。IgM是免疫应答出现较早抗体，IgG是免疫应答中最主要的免疫球蛋白，而IgA可在黏膜表面发挥作用，选择这3个指标，能较完整且较准确地观察体液免疫的功能和状态。
本实施例检测了60％烟雾下小鼠10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日吸烟30天后小鼠血清中免疫球蛋白水平，具体操作方法为：在使用之前，所有的试剂盒组分都恢复到18-26摄氏度，试剂应通过轻轻涡旋、旋转混合均匀。取出已包被的反应板，并在记录表上标记好每个样本位置。根据检测需要取出所需要的数量反应条，将未使用的反应条放回密封袋于2-8摄氏度保存。将100微升待测BALF加入包被好IgA、IgM、IgG抗体的孔板中；分别加入第一抗体工作液200微升，反应板充分混匀后室温下放置2小时，洗涤反应板3次，印干；每孔加酶标抗体工作液200微升，室温下孵育2小时；用洗涤液将反应板充分洗涤3次，印干；每孔加底物工作液100微升，室温处反应30分钟；每孔加入50微升终止液混匀；30分钟内在96孔板微量分光光度仪上，在490nm波长处测OD值，结果参见表9。
由表9结果显示，与对照组相比，实验组血清中IgM、IgG、IgA均增高，且以20min/次/日组最为明显，但40min/次/日组则略有下降，其可能是免疫系统受损的结果。
表9.小鼠吸烟30天小鼠血清中免疫球蛋白水平
| 染毒浓度 | 0min/次/日 | 10min/次/日 | 20min/次/日 | 40min/次/日 |
| IgA(μg/ml) | 2.16±0.31 | 3.23±0.62 | 4.38±0.54 | 3.33±0.45 |
| IgG(μg/ml) | 14.20±1.36 | 14.83±0.86 | 17.95±0.77 | 14.37±1.52 |
| IgM(μg/ml) | 1.35±0.23 | 1.45±0.29 | 1.41±0.63 | 1.17±0.63 |
Claims (10)
1.一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型，该动物模型的构建方法包括如下步骤：将实验小鼠置于密封室中，设定密封室内小鼠呼吸的卷烟烟气体积浓度为60％，1次/日，吸烟10～40min/次/日，连续吸烟30天，得到评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型。
2.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，所述评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型的构建方法中，分别设定小鼠染毒的卷烟烟气浓度为60％，1次/日，吸烟10min/次/日，连续吸烟30天；卷烟烟气浓度为60％，1次/日，吸烟20min/次/日，连续吸烟30天；卷烟烟气浓度为60％，1次/日，吸烟40min/次/日，连续吸烟30天，得到3组动物模型。
3.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，所述评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型的构建方法中，设定小鼠染毒的卷烟烟气浓度为60％，1次/日，吸烟20min/次/日，连续吸烟30天，得到动物模型。
4.如权利要求1-3任一项所述的动物模型在评价卷烟烟气对动物免疫系统损伤中的应用。
5.如权利要求1-3任一项所述的动物模型在研制低毒性卷烟中的应用。
6.一种卷烟烟气对动物机体免疫损伤的评价方法，其特征在于，包括如下步骤：通过对权利要求1-3任一项所述的动物模型进行机体免疫系统损伤检测，评价卷烟燃烧后的烟气对动物机体免疫系统的影响。
7.根据权利要求6所述的评价方法，其特征在于，所述对动物模型进行机体免疫系统损伤检测包括：检测实验动物肺脏局部肺泡灌洗液中细胞量及分泌细胞因子量变化；检测实验动物肺脏免疫相关基因及分子的表达变化；检测实验动物吸烟前后免疫系统中CD4+T细胞、CD8+T细胞数量和比例的变化及T淋巴细胞中CD69、CD25、MHC II的表达情况；检测实验动物吸烟前后B细胞各亚群比例变化及吸烟前后血清中IgM、IgG、IgA、IgD、IgE的产生情况。
8.根据权利要求7所述的评价方法，其特征在于，所述细胞量包括巨噬细胞含量、NK细胞含量、中性粒细胞含量，所述分泌细胞因子量为炎症因子表达量，所述炎症因子包括IL-1、IL-6、TNF、hs-CRP、溶菌酶。
9.根据权利要求7所述的评价方法，其特征在于，所述免疫相关基因及分子包括巨噬细胞表达的CD40、CD80、CD86、Ia及炎症细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α。
10.根据权利要求7所述的评价方法，其特征在于，所述B细胞亚群包括FoB和MZB。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811258037.9A CN109601471B (zh) | 2018-10-26 | 2018-10-26 | 一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型的构建方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811258037.9A CN109601471B (zh) | 2018-10-26 | 2018-10-26 | 一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型的构建方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109601471A true CN109601471A (zh) | 2019-04-12 |
| CN109601471B CN109601471B (zh) | 2021-07-27 |
Family
ID=66002814
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811258037.9A Expired - Fee Related CN109601471B (zh) | 2018-10-26 | 2018-10-26 | 一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型的构建方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109601471B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110656154A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-01-07 | 江西中烟工业有限责任公司 | 一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法 |
| CN110702891A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-01-17 | 江西中烟工业有限责任公司 | 一种天然本草提取物对长期吸烟危害的减害作用的测试方法 |
| CN110729022A (zh) * | 2019-10-24 | 2020-01-24 | 江西中烟工业有限责任公司 | 一种被动吸烟大鼠早期肝损伤模型建立方法及相关基因筛选方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080072338A1 (en) * | 2004-09-28 | 2008-03-20 | Fuji Biomedix Co., Ltd | Animal for Drug Efficacy Evaluation, Method for Developing Chronic Obstructive Pulmonary Disease in Animal for Drug Efficacy Evaluation, and Method for Evaluating Drug Efficacy Using the Animal |
| US20090007281A1 (en) * | 2006-01-13 | 2009-01-01 | Battelle Memorial Institute | Animal Model for Assessing Copd-Related Diseases |
| CN102735804A (zh) * | 2012-07-23 | 2012-10-17 | 浙江中烟工业有限责任公司 | 仅鼻拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法 |
| CN102788874A (zh) * | 2011-05-16 | 2012-11-21 | 湖北中烟工业有限责任公司 | 一种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法 |
| CN107607699A (zh) * | 2017-09-06 | 2018-01-19 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种评价烟草主流烟气诱发炎症反应用动物体外气管模型建立方法、评价方法 |
-
2018
- 2018-10-26 CN CN201811258037.9A patent/CN109601471B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080072338A1 (en) * | 2004-09-28 | 2008-03-20 | Fuji Biomedix Co., Ltd | Animal for Drug Efficacy Evaluation, Method for Developing Chronic Obstructive Pulmonary Disease in Animal for Drug Efficacy Evaluation, and Method for Evaluating Drug Efficacy Using the Animal |
| US20090007281A1 (en) * | 2006-01-13 | 2009-01-01 | Battelle Memorial Institute | Animal Model for Assessing Copd-Related Diseases |
| CN102788874A (zh) * | 2011-05-16 | 2012-11-21 | 湖北中烟工业有限责任公司 | 一种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法 |
| CN102735804A (zh) * | 2012-07-23 | 2012-10-17 | 浙江中烟工业有限责任公司 | 仅鼻拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法 |
| CN107607699A (zh) * | 2017-09-06 | 2018-01-19 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种评价烟草主流烟气诱发炎症反应用动物体外气管模型建立方法、评价方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| ZHI-HUA CHEN 等: "Egr-1 Regulates Autophagy in Cigarette Smoke-Induced Chronic Obstructive Pulmonary Disease", 《PLOS ONE》 * |
| 买尔江•艾合买提 等: "香烟减毒添加剂对吸烟小鼠免疫功能及气管和肺结构的影响", 《新疆医科大学报》 * |
| 宁欣: "吸烟对大鼠免疫系统功能的影响", 《中国医学导报》 * |
| 张颜波: "《诊断学应试向导》", 30 November 2014, 同济大学出版社 * |
| 王秦川 等: "ICR小鼠吸烟诱导肺部炎症模型的建立及其特征", 《浙江大学学报（医学版）》 * |
| 郭辉: "获得添加植物提取物香烟S19对吸烟大鼠免疫指标及抗氧化指标的影响", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110729022A (zh) * | 2019-10-24 | 2020-01-24 | 江西中烟工业有限责任公司 | 一种被动吸烟大鼠早期肝损伤模型建立方法及相关基因筛选方法 |
| CN110729022B (zh) * | 2019-10-24 | 2023-06-23 | 江西中烟工业有限责任公司 | 一种被动吸烟大鼠早期肝损伤模型建立方法及相关基因筛选方法 |
| CN110702891A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-01-17 | 江西中烟工业有限责任公司 | 一种天然本草提取物对长期吸烟危害的减害作用的测试方法 |
| CN110656154A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-01-07 | 江西中烟工业有限责任公司 | 一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法 |
| CN110656154B (zh) * | 2019-11-28 | 2022-11-25 | 江西中烟工业有限责任公司 | 一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109601471B (zh) | 2021-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rouxel et al. | Cytotoxic and regulatory roles of mucosal-associated invariant T cells in type 1 diabetes | |
| Stelmaszczyk-Emmel et al. | Frequency and activation of CD4+ CD25high FoxP3+ regulatory T cells in peripheral blood from children with atopic allergy | |
| Geboes et al. | Proinflammatory role of the Th17 cytokine interleukin‐22 in collagen‐induced arthritis in C57BL/6 mice | |
| Elias et al. | Proteomic analysis of filaggrin deficiency identifies molecular signatures characteristic of atopic eczema | |
| Van Hamburg et al. | IL-17/Th17 mediated synovial inflammation is IL-22 independent | |
| CN109601471A (zh) | 一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型及其应用 | |
| Renand et al. | Immune alterations in patients with type 1 autoimmune hepatitis persist upon standard immunosuppressive treatment | |
| Bilenki et al. | Natural killer T cells contribute to airway eosinophilic inflammation induced by ragweed through enhanced IL‐4 and eotaxin production | |
| Dua et al. | Myeloid and plasmacytoid dendritic cells in induced sputum after allergen inhalation in subjects with asthma | |
| Goubet et al. | Escherichia coli–specific CXCL13-producing TFH are associated with clinical efficacy of neoadjuvant PD-1 blockade against muscle-invasive bladder cancer | |
| Adom et al. | Biomarkers for allogeneic HCT outcomes | |
| Macedo et al. | Impact of induction therapy on circulating T follicular helper cells and subsequent donor-specific antibody formation after kidney transplant | |
| Sicherer et al. | Advances in allergic skin disease, anaphylaxis, and hypersensitivity reactions to foods, drugs, and insects in 2009 | |
| Hui et al. | T cell‐mediated induction of thymic stromal lymphopoietin in differentiated human primary bronchial epithelial cells | |
| Zhou et al. | Expression of CD4+ CD25+ CD127Low regulatory T cells and cytokines in peripheral blood of patients with primary liver carcinoma | |
| Hinrichs et al. | Transcriptome analysis of CCR9+ T helper cells from primary sjögren’s syndrome patients identifies CCL5 as a novel effector molecule | |
| Amin et al. | Amphiregulin in intestinal acute graft-versus-host disease: a possible diagnostic and prognostic aid | |
| Vilani-Moreno et al. | Increased serum levels of interleukin-6 in erythema nodosum leprosum suggest its use as a biomarker | |
| CN109601472A (zh) | 一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤动物模型的构建方法 | |
| Cagnoni et al. | Bronchopulmonary lymph nodes and large airway cell trafficking in patients with fatal asthma | |
| Tibúrcio et al. | Frequency of CXCR3+ CD8+ T-lymphocyte subsets in peripheral blood is associated with the risk of paradoxical tuberculosis-associated immune reconstitution inflammatory syndrome development in advanced HIV disease | |
| CN103525762B (zh) | 一种制备专一性t细胞的配方、方法及其配方制备方法 | |
| CN115469104A (zh) | Hmgb1在胶质母细胞瘤tmz化疗预后预测中的应用 | |
| Marttila et al. | Expression of p53 is associated with microbial acetaldehyde production in oralsquamous cell carcinoma | |
| Greco et al. | IL-6 and TNF are Potential Inflammatory Biomarkers in Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210727 |