CN110656154A - 一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法，包括尿液酶解、过柱和萃取、洗脱、浓缩、Ames试验微量波动法和结果判定共六个步骤，其中尿液酶解采用乙酸钠‑乙酸缓冲液调节控制pH环境，过柱时依次用甲醇和水预处理，并在去离子水冲洗后用甲醇洗脱，经浓缩后采用Ames试验微量波动法检测并判定结果，该方法可以显著降低传统Ames试验所需的尿液检测量，并提高检测灵敏度，尤其适用于大鼠烟气暴露模型的生物学检测。

Description

一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法。
背景技术
卷烟烟气是含有6000多种化合物的复杂气溶胶，其中有69种被IARC确定为人类致癌物。卷烟烟气中的多环芳烃、各种烷化剂、苯系物、芳香胺等致突变物质，这些物质进入人体或实验动物体内后，经体内代谢，多以原型、代谢产物或是结合物等形式从肾脏排出，因此采用短期的致突变试验检测尿液的诱变作用具有重要的意义。
人群烟气暴露存在很大的差异性，因此以Sprague Dawley大鼠作为试验对象，检测烟气暴露不同周期后大鼠尿液的致突变性，可直接反应烟气吸入暴露的致突变作用。但由于目前的现有技术中，尿液致突变试验的尿液前处理方法，尿液需要量在50~100 mL以上或更多的，因此，现有方法仅适用于人体尿液的致突变检测，而大鼠尿液量极少，采用现有方法无法有效评价其致突变性。
Ames等人曾采用鼠伤寒沙门氏菌在微粒体酶系统存在时，以传统平板掺入法检测尿液的致突变性，由于该方法每平皿的受试物限制为0.1 mL，而且尿液中的组氨酸也可干扰实验结果，因此该传统方法只能检测高浓度的致突变物，对致突变物质的浓度较低的尿液无法适用。
发明内容
本发明的目的在于建立一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法，采用酶解、过柱、萃取、浓缩等方法来处理尿液，使尿液检测量至少降低10倍，并且研究建立了尿液酶解浓缩后的Ames试验微量波动法，提高了检测的灵敏度，可作为烟气暴露的生物学检测指标。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法，包括以下步骤：
S1.尿液酶解
将预先收集的尿样解冻至室温，取5 mL于玻璃瓶中，依次加入8~15mL 乙酸钠-乙酸缓冲液和50 µL β-葡萄糖醛酸酶，混合均匀后放入恒温水浴槽中，在37 ℃下避光酶解14~20h；
S2.过柱和萃取
称取XAD-2吸附剂1.05±0.05 g，置入层析柱内，首先用甲醇5~10mL浸润萃取，近流完时，加入5~10mL水来进行预处理，近流完时，加入酶解的尿样；
S3.洗脱
加入去离子水5~8 mL冲洗层析柱，洗去尿液中存在的组氨酸，弃去冲洗液，随后加入10~15mL甲醇于层析柱，洗脱XAD-2吸附剂上的尿液物质；
S4.浓缩
洗脱液放入氮吹仪，直至吹干，加入100 μL的二甲基亚砜（DMSO）萃取残留物；
S5.Ames试验微量波动法
鼠伤寒沙门氏菌TA98过夜培养后，将菌液稀释至1~2×108个/mL。将0.1 mL菌液、8.85mL选择指示生长培养基、0.1 mL尿液DMSO萃取液、0.25 mL的3.2mg%组氨酸、0.25 mL的0.8mg%生物素、1.15mL的10%S9混匀，以0.2 mL/孔加入96孔细胞培养板，48孔/板，37℃培养48h，溶剂对照为DMSO，阳性对照为环磷酰胺；
S6.结果判定
培养48 h后，培养液变为黄色孔为阳性孔，蓝紫色孔为阴性孔，介于黄和蓝紫色之间的判定为阴性，计数每板的阳性孔数，以卡方检验对结果进行差异显著性比较。
优选的是，所述S1步骤中，所述乙酸钠-乙酸缓冲液的pH为5±0.1。
优选的是，所述S1步骤中，所述酶解时间为16h。
优选的是，所述S5步骤中，所述选择指示生长培养基是5 μL/mL溴甲酚紫的Davis-Mingoli缓冲液。
本发明所述卡方检验方位为：卡方检验的公式是
Figure DEST_PATH_IMAGE001
，公式中n为反应板孔数，t为试验板阳性反应孔数，c为阴性对照阳性反应孔数，试验板与对照板经2×2列联表的卡方检验后，如果p<0.05，则表示试验样品为致突变阳性。不同暴露组间阳性情况则采用R×C列联表的卡方检验，p<0.05时，表示组间有明显差异。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
本发明检测方法包括尿液酶解、过柱和萃取、洗脱、浓缩、Ames试验微量波动法和结果判定共六个步骤，其中尿液酶解采用乙酸钠-乙酸缓冲液调节控制pH环境，过柱时依次用甲醇和水预处理，并在去离子水冲洗后用甲醇洗脱，经浓缩后采用Ames试验微量波动法检测并判定结果，该方法可以显著降低传统Ames试验所需的尿液检测量至少10倍，并提高了检测灵敏度，尤其适用于大鼠烟气暴露模型的生物学检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
大鼠1#和2#烟气暴露1个月后，收集第30天的24 h尿液，
S1.尿液酶解
取5 mL，并依次加入10 mL乙酸钠-乙酸缓冲液（pH=5±0.1）和50 µL β-葡萄糖醛酸酶，混合均匀后放入恒温水浴槽中，在37 ℃下避光酶解16 h。
S2.过柱和萃取
含XAD-2吸附剂（1.05±0.05 g）的层析柱内依次经甲醇5mL和5mL水预处理后，加入酶解的尿样。
S3.洗脱
去离子水5 mL冲洗，洗去尿液中存在的组氨酸，弃去冲洗液，随后加入10 mL甲醇洗脱XAD-2吸附剂上的尿液物质。
S4.浓缩
将洗脱液放入氮吹仪，直至吹干，加入100 μL的二甲基亚砜（DMSO）萃取残留物。
S5.Ames试验微量波动法
鼠伤寒沙门氏菌TA98过夜培养后，将菌液稀释至1~2×108个/mL。将0.1 mL的TA98菌液、8.85 mL选择指示生长培养基（5 μL/mL溴甲酚紫的Davis-Mingoli缓冲液）、0.1 mL尿液DMSO萃取液、0.25 mL的3.2mg%组氨酸、0.25 mL的0.8 mg%生物素、1.15mL的10%S9混匀，以0.2 mL/孔加入96孔细胞培养板，48孔/板，37℃培养48 h，其中溶剂对照为DMSO，阳性对照为环磷酰胺。
S6 .结果判定
培养48 h后，培养液变为黄色孔为阳性孔，蓝紫色孔为阴性孔，介于黄和蓝紫色之间的也判定为阴性。计数每板的阳性孔数，以卡方检验对结果进行差异显著性比较。结果见表1。
表1 暴露烟气1个月后尿液的微量波动试验结果
样品序号 阳性孔数 阴性孔数 <i>X</i><sup>2</sup> P
DMSO 9 39
尿液1<sup>#</sup> 11 37 0.253 0.615
尿液2<sup>#</sup> 18 30 3.904 0.048*
CP 35 13 33.185 0.000
从表1可以看出，1#大鼠的尿液对TA98无致突变作用，2#大鼠的尿液对TA98有致突变作用。
实施例2
按照实施例1所述方法，对尿液DMSO萃取液进行致突变检测，区别在于将尿液DMSO萃取液分别稀释至原浓度的0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍和0.5倍，进行致突变检测，计算每个浓度的阳性孔数，以浓度为横坐标，阳性孔数为纵坐标作图，结果发现，本发明所述方法有良好的剂量效应关系，线性范围较宽，单位剂量致突变率更低，试验的灵敏度较高。
对比例1
取实施例1所述的1#和2#烟气暴露1个月后大鼠的第30天的24 h尿液，经过以下处理。
S1.尿液酶解
取5 mL，并依次加入20 mL醋酸溶液（pH=5±0.1）和50 µL β-葡萄糖醛酸酶，混合均匀后放入恒温水浴槽中，在37 ℃下避光酶解24 h。
S1-S6步骤操作同实施例1。结果1#大鼠阳性孔数为7个，2#大鼠阳性孔数为8个，评判结论为1#和2#大鼠的尿液均未有致突变作用。
按照实施例2所述方法稀释对比例1制备的尿液DMSO萃取液，进行致突变检测，计算每个浓度的阳性孔数，以浓度为横坐标，阳性孔数为纵坐标作图，结果发现，对比例1所述方法没有剂量效应关系，试验的灵敏度低。
对比例2
取实施例所述的1#和2#烟气暴露1个月后大鼠的第30天的24 h尿液，经过以下处理。
S1-S2步骤操作同实施例1。
S3.洗脱
去离子水5 mL冲洗，洗去尿液中存在的组氨酸，弃去冲洗液，随后加入10 mL丙酮洗脱XAD-2吸附剂上的尿液物质。
S4-S6步骤操作同实施例1，结果1#大鼠阳性孔数为6个，2#大鼠阳性孔数为5个，评判结论为1#和2#大鼠的尿液均未有致突变作用。
按照实施例2所述方法稀释对比例2制备的尿液DMSO萃取液，进行致突变检测，计算每个浓度的阳性孔数，以浓度为横坐标，阳性孔数为纵坐标作图，结果发现，对比例2所述方法没有剂量效应关系，试验的灵敏度低。
对比例3
取实施例所述的1#和2#烟气暴露1个月后大鼠的第30天的24 h尿液，经过以下处理。
S1-S2步骤操作同实施例1。
S3.洗脱
去离子水5 mL冲洗，洗去尿液中存在的组氨酸，弃去冲洗液，随后加入10 mL70%的乙醇洗脱XAD-2吸附剂上的尿液物质。
S4-S6步骤操作同实施例，结果1#大鼠阳性孔数为6个，2#大鼠阳性孔数为5个，评判结论为1#和2#大鼠的尿液均未有致突变作用。
按照实施例2所述方法稀释对比例3制备的尿液DMSO萃取液，进行致突变检测，计算每个浓度的阳性孔数，以浓度为横坐标，阳性孔数为纵坐标作图，结果发现，对比例3所述方法没有剂量效应关系，试验的灵敏度低。

Claims (4)

1.一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.尿液酶解
将预先收集的尿样解冻至室温，取5 mL于玻璃瓶中，依次加入8~15mL 乙酸钠-乙酸缓冲液和50 µL β-葡萄糖醛酸酶，混合均匀后放入恒温水浴槽中，在37 ℃下避光酶解14~20h；
S2.过柱和萃取
称取XAD-2吸附剂1.05±0.05 g，置入层析柱内，首先用甲醇5~10mL浸润萃取，近流完时，加入5~10mL水来进行预处理，近流完时，加入酶解的尿样；
S3.洗脱
加入去离子水5~8 mL冲洗层析柱，洗去尿液中存在的组氨酸，弃去冲洗液，随后加入10~15mL甲醇于层析柱，洗脱XAD-2吸附剂上的尿液物质；
S4.浓缩
洗脱液放入氮吹仪，直至吹干，加入100 μL的二甲基亚砜（DMSO）萃取残留物；
S5.Ames试验微量波动法
鼠伤寒沙门氏菌TA98过夜培养后，将菌液稀释至1~2×108个/mL,将0.1 mL菌液、8.85mL选择指示生长培养基、0.1 mL尿液DMSO萃取液、0.25 mL的3.2mg%组氨酸、0.25 mL的0.8mg%生物素、1.15mL的10%S9混匀，以0.2 mL/孔加入96孔细胞培养板，48孔/板，37℃培养48h，溶剂对照为DMSO，阳性对照为环磷酰胺；
S6.结果判定
培养48 h后，培养液变为黄色孔为阳性孔，蓝紫色孔为阴性孔，介于黄和蓝紫色之间的判定为阴性，计数每板的阳性孔数，以卡方检验对结果进行差异显著性比较。
2.根据权利要求1所述的大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法，其特征在于，所述S1步骤中，所述乙酸钠-乙酸缓冲液的pH为5±0.1。
3.根据权利要求1所述的大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法，其特征在于，所述S1步骤中，所述酶解时间为16h。
4.根据权利要求1所述的大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法，其特征在于，所述S5步骤中，所述选择指示生长培养基是5 μL/mL溴甲酚紫的Davis-Mingoli缓冲液。
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