CN105158398A - 评价丙烯酰胺短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法及应用 - Google Patents

评价丙烯酰胺短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105158398A
CN105158398A CN201510627363.2A CN201510627363A CN105158398A CN 105158398 A CN105158398 A CN 105158398A CN 201510627363 A CN201510627363 A CN 201510627363A CN 105158398 A CN105158398 A CN 105158398A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acrylamide
urine
gama
aama
mass spectrometry
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510627363.2A
Other languages
English (en)
Inventor
章宇
王桥
程军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN201510627363.2A priority Critical patent/CN105158398A/zh
Publication of CN105158398A publication Critical patent/CN105158398A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明公开了一种评价丙烯酰胺短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法，包括以下步骤：1)、对待测尿液进行前处理；2)、将经前处理后的尿液进行色谱检测；3)、采用标准曲线法对检测结果进行定量分析。本发明采用了同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法(UHPLC-MS/MS)，对丙烯酰胺的四种巯基尿酸加合物进行定量，分析时间大大缩短，同时使得四种巯基尿酸代谢物得到较好的分离，实现了对四种加合物的同步检测，这能够更加全面的对丙烯酰胺的内暴露量进行评估。

Description

评价丙烯酰胺短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法及应用
技术领域
本发明涉及一种评价膳食丙烯酰胺短期体内暴露的巯基尿酸加合物同步检测方法及其应用，属于食品安全领域。
背景技术
丙烯酰胺(Acrylamide)是一种无色无味的白色晶体小分子物质，是一种重要的化工原料，用于合成聚合物和凝胶剂。国际癌症研究机构(IARC)将丙烯酰胺列为2A类致癌物(对人类很可能有致癌性)，其具有神经毒性、生殖毒性、基因毒性等。2002年，瑞典国家食品管理局和斯德哥尔摩大学的研究人员共同宣称在油炸食品和焙烤食品中发现了高含量的丙烯酰胺(SwedishNationalFoodAdministration,Informationaboutacrylamideinfood,2002,4)。随后的研究证明热加工食品中丙烯酰胺的形成源自美拉德反应(Maillardreaction)。高碳水化合物含量的食品，如薯类油炸食品、面包类焙烤食品、汉堡类快餐食品以及饼干类休闲食品等，是人体摄入丙烯酰胺的直接来源也是主要来源。
目前，食品中丙烯酰胺的分析主要以色谱分离以及质谱分析技术为检测手段，液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术应用尤其广泛。为排除复杂食品基质中杂质的干扰，通过脱脂、提取、萃取、旋蒸、重溶和过滤等前处理步骤提取食品中的丙烯酰胺(一种提取食品中丙烯酰胺的预处理方法，CN103499478A，2014；一种烘烤食品中丙烯酰胺检测样品的提取方法，CN103389235A，2013)。Rosén和首次报道了采用同位素稀释的LC-MS技术检测热加工食品中丙烯酰胺的含量，确定了多重反应监测(MRM)的定量模式下丙烯酰胺的母离子、定性离子和定量离子(Rosén,J.,K.E.Analysisofacrylamideincookedfoodsbyliquidchromatographytandemmassspectrometry.Analyst2002,127:880-882)。此后，大量的研究报道在此基础上优化了基于质谱技术的丙烯酰胺检测方法。随着超高效液相色谱的广泛应用，基于超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)的检测丙烯酰胺的方法也迅速被开发(同时检测食品中的丙烯酰胺和杂环胺的方法，CN103149316A，2013)。除此之外，还有基于丙烯酰胺偶联蛋白质后具有抗原性的免疫学检测方法而开发的快速检测试剂(一种丙烯酰胺快速检测卡，CN202330398U，2012)和经过对热加工食品的前处理，采用荧光手段对丙烯酰胺的检测方法(一种食品中丙烯酰胺的检测方法，CN101303304，2008)。该两种方法由于受抗体特异性及荧光检测灵敏度方面的局限性，并未得到广泛适用。
对于丙烯酰胺的风险评估研究，现有研究主要是采用外暴露的评估方式，即通过测定各类食物中丙烯酰胺的含量进行膳食丙烯酰胺的摄入水平调查，但这种评估方式不能准确反映丙烯酰胺进入人体内的真正暴露水平。为能准确评估膳食丙烯酰胺对人体的暴露风险，须采用体内暴露的评估方式，即通过丙烯酰胺体内代谢生物标志物的测定对丙烯酰胺进行风险评估。与膳食丙烯酰胺外暴露相比，基于生物标志物的内暴露水平研究可以更准确地评估丙烯酰胺的日常摄入量并为流行病学的研究提供更可靠的依据。
目前基于毒代动力学水平的丙烯酰胺体内代谢已经在动物和人群实验中有一定的研究。丙烯酰胺进入体内，在细胞色素P4502E1酶的作用下，一部分迅速转化成环氧活性的物质环氧丙酰胺。环氧丙酰胺在环氧化物水解酶的作用下，一部分转化成无毒的2,3-二羟基丙酰胺。同时，丙烯酰胺和环氧丙酰胺在体内都能够与谷胱甘肽(GSH)、血红蛋白以及DNA进行结合，形成相应的加合物，如图1所示。丙烯酰胺和环氧丙酰胺与GSH结合进而转化成巯基尿酸加合物，包括N-乙酰-S-(2-氨基甲酰乙基)-L-半胱氨酸(AAMA)、N-乙酰-S-(2-氨基甲酰乙基)-L-半胱氨酰亚砜(AAMA亚砜)、N(R,S)-乙酰-S-(2-氨基甲酰-2-羟乙基)-L-半胱氨酸(GAMA)以及N-乙酰-S-(1-氨基甲酰-2-羟乙基)-L-半胱氨酸(异GAMA)，并通过尿液排出体外。另外，丙烯酰胺和环氧丙酰胺都可以与血红蛋白形成共价化合物，即丙烯酰胺-Hb和环氧丙酰胺-Hb加合物。这两种加合物被认为是评估丙烯酰胺体内暴露剂量的两个重要的生物标志物。环氧丙酰胺和丙烯酰胺还能与DNA进行结合形成DNA加合物，但是环氧丙酰胺与DNA的结合率远高于丙烯酰胺与DNA发生结合作用的效率。目前已经有四种环氧丙酰胺DNA加合物被确认，即N1-(2-羧基-2-羟乙基)-2’-脱氧腺苷(N1-GA-dA)、N3-(2-氨基甲酰-2-羟乙基)-腺嘌呤(N3-GA-Ade)、N7-(2-氨基甲酰-2-羟乙基)-鸟嘌呤(N7-GA-Gua)以及N6-(2-羧基-2-羟乙基)-2’-脱氧腺苷(N6-GA-dA)。
膳食丙烯酰胺体内短期暴露水平通过丙烯酰胺和环氧丙酰胺的巯基尿酸加合物含量水平反映。对于丙烯酰胺巯基尿酸加合物的检测方法主要有气相色谱-质谱联用法(GC-MS)(W.,A.,Dekant,W.Gaschromatography-negativeionchemicalionizationmassspectrometryasapowerfultoolforthedetectionofmercapturicacidsandDNAandproteinadductsasbiomarkersofexposuretohalogenatedolefins.JournalofChromatographyA1999,847:35-46)、高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)(Perbellini,L.,Maestri,L.,Veronese,N.,etal.AnalysisofurinaryN-acetyl-S-(N-methylcarbamoyl)cysteine,themercapturicacidderivedfromN,N-dimethylformamide.JournalofChromatographyB2001,759:349-354)、高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)(Maestri,L.,Ghittori,S.,Imbriani,M.Determinationofurinarymercapturicacidsofstyreneinmanbyhigh-performanceliquidchromatographywithfluorescencedetection.JournalofChromatographyB1996,687:387-394)等。由于丙烯酰胺的巯基尿酸加合物在尿液中的含量在数ng到数百ng之间，LC-MS/MS具有高度的灵敏性以及特异性，被认为是首选的定量方法，预期能够实现对尿液中低含量丙烯酰胺巯基尿酸加合物的定量研究，然而目前LC-MS/MS法在丙烯酰胺巯基尿酸加合物的定量分析方面却鲜有报道。
目前现有的LC-MS/MS法为：采用LC-MS/MS法同时测定AAMA和GAMA两种加合物，并采用D3-AAMA和D3-GAMA作为各自的同位素内标(Bjellaas,T.,L.H.,Haugen,M.,etal.Urinaryacrylamidemetabolitesasbiomarkersforshort-termdietaryexposuretoacrylamide.FoodandChemicalToxicology2007,45:1020-1026)。由于测定方法的自身条件的限制，因此该方法不能同时测定另两种加合物：异GAMA和AAMA亚砜。
尿液中四种巯基尿酸加合物(AAMA、GAMA、异GAMA和AAMA亚砜)为主要生物标志物。目前的定量分析方法并未实现对四种巯基尿酸加合物进行同步定量分析。同时，上述提到的HPLC等方法分析的时间较长，且检测灵敏度十分有限，不利于对大批量生物样本的检测和低含量样本的检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种评价膳食丙烯酰胺短期体内暴露的巯基尿酸加合物同步检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种评价丙烯酰胺短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法，包括以下步骤：
1)、对待测尿液进行前处理；
2)、将经前处理后的尿液进行色谱检测；
色谱条件以及质谱条件如下：
(一)色谱条件：
流速：0.2mL/min；柱温：40℃；
梯度洗脱程序如下：
A为0～1％(体积％)甲酸水，B为乙腈，其体积配比为90:10～98:2；
所述色谱柱种类及规格为ACQUTITYBEHAMIDE(2.1×100mmi.d.,1.7μm)、ACQUTITYBEHShieldRP(2.1×150mmi.d.,1.7μm)或ACQUTITYHSST3(2.1×150mmi.d.,1.8μm)；
所述进样体积为1～10μL；
备注说明：上述梯度洗脱程序最佳如表3所述；
(二)质谱条件：
仪器：三重四级杆串联质谱仪；质谱定量方法：多重反应监测(MRM)；离子源：电喷雾(ESI)负离子扫描方式；鞘气温度：375℃；鞘气流速8L/min；喷嘴电压：500V；雾化器压力：45psi；干燥气温度：300℃；干燥器流速：5L/min；载气：氮气；碰撞气：氮气；
D3-AAMA、D3-GAMA、D3-异GAMA这3种代谢物的质谱参数如下：
注：a为定量离子通道，b为定性离子通道
所述质谱条件中毛细管电压为3000～4000V；
备注说明：上述D3-AAMA、D3-GAMA、D3-异GAMA这3种代谢物的质谱参数最佳如表4所述；
3)、采用标准曲线法对检测结果进行定量分析。
作为本发明的评价丙烯酰胺短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法的改进：
所述步骤1)为：
一、当为啮齿类动物(例如为大鼠)的尿液时，前处理方法为：
取5～50μL的鼠尿，加入10μL混合同位素内标(D3-AAMA、D3-GAMA、D3-异GAMA，上述三种同位素内标浓度均为10μg/mL；以稀释液作为溶剂)，用稀释液稀释20～200倍，涡旋混匀，经0.22μm微孔滤膜过滤；
所述稀释液为：0.1～0.5％(体积％)甲酸水溶液；
二、当为高级哺乳动物(例如为人)的尿液时，前处理方法为：
人体尿液，取1～4mL，加入20μL混合同位素内标(D3-AAMA、D3-GAMA、D3-异GAMA、D3-AAMA亚砜，浓度均为10μg/mL，以稀释液作为溶剂)，依次加入10μL甲酸或50μL盐酸溶液(4mol/L)和2mL的甲酸铵(50mmol/L,pH2.5)，涡旋后离心；
取上述离心所得的上清液上样至固相萃取柱，
所述固相萃取柱种类和规格为IsoluteENV+SPEcartridge(100mg,3mL,Biotage,Sweden)或IsoluteENV+SPEcartridge(100mg,10mL,Separtis,Grenzach-Wyhlen)；
所述过柱淋洗液为1～4mL0.1％(体积％)或3mmol/L酸溶液；
具体如下：
取上述离心所得的上清液上样至固相萃取柱(预先用3mL甲醇活化，1.5mL水和1.5mL过柱淋洗液平衡的固相萃取柱)，待流干后用1～4ml过柱淋洗液进行淋洗，去除杂质并弃去淋洗液；最后用2mL体积浓度1％的酸甲醇(即，酸的体积浓度为1％，该酸同过柱淋洗液所用酸)进行洗脱，收集洗脱液；洗脱液在40℃下氮气吹干，用初始流动相溶液(如表1所示)定容至1mL，涡旋溶解1min，经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。
备注：采用不同固相萃取柱所用酸不同；采用IsoluteENV+SPEcartridge(100mg,3mL,Biotage,Sweden)固相萃取小柱，过柱淋洗液中所用酸为甲酸，淋洗液为2mL；采用IsoluteENV+SPEcartridge(100mg,10mL,Separtis,Grenzach-Wyhlen)固相萃取小柱，过柱淋洗液中所用酸为盐酸，淋洗液为4mL。以上两种为不同SPE柱的最佳方案。
作为本发明的评价丙烯酰胺短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法的进一步改进：
当为高级哺乳动物(例如为人)的尿液时，质谱检测中还包括D3-AAMA亚砜，其质谱参数如下：
备注说明：上述D3-AAMA亚砜对应的质谱参数最佳如表7所述。
本发明的技术方案如下：
本发明包括鼠尿和人尿的前处理方法、检测方法的色谱条件以及质谱条件。所述鼠尿的前处理方法涉及被稀释鼠尿体积、稀释液和稀释倍数；所述人尿的前处理方法涉及加入溶剂、固相萃取柱种类及规格和过柱淋洗液体积；所述检测的色谱条件涉及色谱柱种类及规格、流动相种类及配比、进样体积和梯度洗脱程序；所述检测的质谱条件涉及毛细管电压、Fragmentor电压和碰撞电压。
所述被稀释鼠尿体积为5～50μL；
所述鼠尿稀释液为0.1～0.5％甲酸水溶液；
所述鼠尿稀释倍数为20～200倍；
所述人尿的取样体积为1～4mL；
所述人尿前处理方法加入的溶液为10μL甲酸或50μL盐酸溶液(4mol/L)；
所述固相萃取柱种类和规格为IsoluteENV+SPEcartridge(100mg,3mL,Biotage,Sweden)或IsoluteENV+SPEcartridge(100mg,10mL,Separtis,Grenzach-Wyhlen)；
所述过柱淋洗液为1～4mL0.1％甲酸水溶液或3mmol/L盐酸溶液；
所述色谱柱种类及规格为ACQUTITYBEHAMIDE(2.1×100mmi.d.,1.7μm)、ACQUTITYBEHShieldRP(2.1×150mmi.d.,1.7μm)或ACQUTITYHSST3(2.1×150mmi.d.,1.8μm)；
所述流动相为0～1％甲酸水和乙腈，其配比为90:10～98:2；
所述进样体积为1～10μL；
所述梯度洗脱程序见表1；
所述质谱条件中毛细管电压为3000～4000V；
所述Fragmentor电压和碰撞电压见表2。
一种评价膳食丙烯酰胺短期体内暴露的巯基尿酸加合物同步检测方法，包括以下步骤：
(三)样品预处理：
大鼠尿液预处理方法：解冻大鼠尿液，取一定量(5～50μL)鼠尿，加入10μL混合同位素内标(D3-AAMA、D3-GAMA、D3-异GAMA、D3-AAMA亚砜，上述四种同位素内标浓度均为10μg/mL；以稀释液作为溶剂)，用稀释液稀释一定倍数(20～200倍)，定容至1mL，涡旋2min混匀，经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。
备注说明：例如，若稀释倍数为20，那么应取50μL鼠尿，再加入10μL浓度为10μg/mL的混合同位素内标，用稀释液稀释至1mL；若稀释倍数为200，那么应取5μL鼠尿，再加入10μL浓度为10μg/mL的混合同位素内标，用稀释液稀释至1mL。
所述稀释液为：0.1～0.5％(体积％)甲酸水溶液；即，1升甲酸水溶液中含有1～5毫升的甲酸。
备注说明：
新鲜鼠尿无需解冻可以直接进行上述预处理。
新鲜采集的大鼠尿液于-20℃下保存，可保存超过180天。然后按照上述方法解冻后进行预处理。
备注说明：
1、AAMA、GAMA、D3-AAMA和D3-GAMA可参照以下方法进行制备：
1).Fennell,T.R.,Sumner,S.C.,Snyder,R.W.,Burgess,J.,&Friedman,M.A.Kineticsofeliminationofurinarymetabolitesofacrylamideinhumans.ToxicologicalSciences,2006,93(2),256-267.
2).KoppEK,SieberM,KellertM,etal.RapidandsensitiveHILIC-ESI-MS/MSquantitationofpolarmetabolitesofacrylamideinhumanurineusingcolumnswitchingwithanonlinetrapcolumn.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2008,56(21):9828-9834.
2、异GAMA、AAMA亚砜、D3-异GAMA、D3-AAMA亚砜可按照以下方法进行制备：KoppEK,SieberM,KellertM,etal.RapidandsensitiveHILIC-ESI-MS/MSquantitationofpolarmetabolitesofacrylamideinhumanurineusingcolumnswitchingwithanonlinetrapcolumn.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2008,56(21):9828-9834.
人体尿液预处理方法：解冻人体尿液，取1～4mL，加入20μL混合同位素内标(D3-AAMA、D3-GAMA、D3-异GAMA、D3-AAMA亚砜，浓度均为10μg/mL，以稀释液作为溶剂)，依次加入10μL甲酸或50μL盐酸溶液(4mol/L)和2mL的甲酸铵(50mmol/L,pH2.5)，涡旋30s后在10000r/min下离心5min。然后取上清液上样至固相萃取柱(该固相萃取柱预先用3mL甲醇活化，再依次用1.5mL水和1.5mL0.1％甲酸水溶液平衡)，待流干后用2mL0.1％甲酸水溶液作为淋洗液进行淋洗，去除杂质并弃去淋洗液；最后用2mL1％的甲酸甲醇(即，甲酸的体积浓度为1％)进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在40℃下氮气吹干，用初始流动相溶液(如表1所示)定容至1mL，涡旋溶解1min，经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。
所述固相萃取柱种类和规格为IsoluteENV+SPEcartridge(100mg,3mL,Biotage,Sweden)或IsoluteENV+SPEcartridge(100mg,10mL,Separtis,Grenzach-Wyhlen)；
所述过柱淋洗液为1～4mL0.1％(体积％)甲酸水溶液或3mmol/L盐酸溶液。
备注说明：在本发明中，啮齿类动物的尿液前处理方式参照“大鼠尿液预处理方法”，高级哺乳动物的尿液前处理方式参照“人体尿液预处理方法”。
(四)色谱条件：
流速：0.2mL/min；柱温：40℃。
表1流动相的梯度洗脱程序
Table1.Gradientelutionprogramofmobilephase
备注说明：
A为0～1％(体积％)甲酸水，B为乙腈，其配比为90:10～98:2；
所述色谱柱种类及规格为ACQUTITYBEHAMIDE(2.1×100mmi.d.,1.7μm)、ACQUTITYBEHShieldRP(2.1×150mmi.d.,1.7μm)或ACQUTITYHSST3(2.1×150mmi.d.,1.8μm)；
所述进样体积为1～10μL。
(五)质谱条件：
仪器：三重四级杆串联质谱仪；质谱定量方法：多重反应监测(MRM)；离子源：电喷雾(ESI)负离子扫描方式；鞘气温度：375℃；鞘气流速8L/min；喷嘴电压：500V；雾化器压力：45psi；干燥气温度：300℃；干燥器流速：5L/min；载气：氮气；碰撞气：氮气。总离子流及各离子通道图如图2所示。
表2四种代谢物的质谱参数
Table2Massspectrumparametersoffourmetabolites
注：a为定量离子通道，b为定性离子通道
备注说明：
所述质谱条件中毛细管电压为3000～4000V；
本方法采用质谱分析时，AAMA、GAMA、异GAMA、AAMA亚砜是四种待分析的加合物，D3-AAMA、D3-GAMA、D3-异GAMA、D3-AAMA亚砜分别是它们的同位素内标(用于四种加合物的内标法定量)，表2共显示了16个质谱检测通道，即每种化合物有2个通道，第一个为定量离子通道，第二个为定性离子通道(辅助定量和确认)。例如对于AAMA来说，233.2是AAMA的分子离子峰，104.3和161.2均为AAMA的特征性碎片离子峰。233.2>104.3被选为定量离子通道，233.2>161.2被选为定性离子通道，依此类推。而Fragmentor和碰撞电压这两个参数是决定质谱定量和定性离子响应值高低的主要参数。
本发明与现有技术的区别主要在于：
第一，实现了GAMA、异GAMA和AAMA亚砜这三种同分异构体的色谱分离：
同分异构体由于分子量相同，所以在色谱分离时有很大难度，本发明对所使用的色谱柱、色谱条件和质谱条件进行优化，从而实现了上述三种化合物的分离。
从含量上来看，AAMA和GAMA在这四种加合物中含量较多。由于现有技术无法实现这样的分离，因此只能选用AAMA和GAMA作为短期暴露生物标志物进行定量分析，但是明显不够全面。
第二，在实现了三种同分异构体色谱分离的基础上，实现了全部四种巯基尿酸加合物的色谱分离和同步定量分析，全面地揭示了膳食丙烯酰胺经体内短期暴露后各巯基尿酸加合物的水平。
本发明的发明点主要在于：
1、本发明优化了色谱柱、色谱条件和质谱条件的情况下实现GAMA、异GAMA和AAMA亚砜这三种同分异构体的色谱分离；
2、实现了全部四种巯基尿酸加合物的色谱分离和同步定量分析；
3、本发明对鼠尿和人尿采用了不同的预处理方法。其中鼠尿预处理的优势是本发明优化了稀释倍数，采用直接稀释法，避免了复杂预处理步骤和费时费力的消耗。人尿预处理的优势是通过优化固相萃取柱规格、上样量、过柱淋洗液这三个条件，采用固相萃取纯化的方法进行。由于鼠尿基质成分简单，四种加合物的含量较高，且用稀释液稀释的倍数在20倍以上，因此采用直接稀释的办法已足以避免尿液中的杂质对四种加合物的干扰；而人尿基质成分复杂，四种加合物的含量较低，需要通过固相萃取的办法对四种加合物进行富集并除去杂质，因此固相萃取的步骤及三个参数对于人尿预处理的步骤优化尤为重要。
本发明采用了同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法(UHPLC-MS/MS)，对丙烯酰胺的四种巯基尿酸加合物进行定量，分析时间大大缩短，同时使得四种巯基尿酸代谢物得到较好的分离，实现了对四种加合物的同步检测，这能够更加全面的对丙烯酰胺的内暴露量进行评估。
本发明方法检测精确度可以达到10ng/mL的水平，属于高灵敏度，具有检测精度高的优势。另外，本方法借助于超高效液相色谱，所使用的超高效液相色谱柱可承载的柱压比普通液相柱可承载的柱压高出许多倍，使得检测效率大大提高，且本方法分析四种加合物每次进样后的分析时间只需8分钟(根据那个梯度洗脱程序表1，最长也只需10分钟/样)。因此，本发明具有方法简洁、检测精确度等优点。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为丙烯酰胺的体内代谢途径图(现有技术)；
图2为四种巯基尿酸加合物及其对应的同位素的离子扫描图；
注：(A)为四种代谢物的总离子流图谱，(B)～(I)分别为AAMA、GAMA、异GAMA、AAMA亚砜、D3-AAMA、D3-GAMA、D3-异GAMA和D3-AAMA亚砜的子离子扫描图；
图3是人体和大鼠尿液样品中丙烯酰胺巯基尿酸加合物的UHPLC-MS/MS图谱；
注：(A)为人体尿液中4种丙烯酰胺巯基尿酸加合物(AAMA、AAMA亚砜、GAMA、异GAMA)的检测图谱；(B)为大鼠尿液中3种丙烯酰胺巯基尿酸加合物(不含AAMA亚砜)的检测图谱。
具体实施方式
实施例1、评价膳食丙烯酰胺短期体内暴露的巯基尿酸加合物同步检测方法，检测对象为大鼠尿液，依次进行以下步骤：
1)、样品预处理：
大鼠尿液预处理方法：解冻SpragueDawley大鼠尿液，取10μL鼠尿，加入10μL混合同位素内标(D3-AAMA、D3-GAMA、D3-异GAMA，浓度均为10μg/mL，以稀释液作为溶剂)，用稀释液稀释100倍，定容至1mL，涡旋2min混匀，经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。
所述稀释液为：0.1％(体积％)甲酸水溶液；
2)、色谱条件：
流速：0.2mL/min；柱温：40℃。
表3、最优化的流动相的梯度洗脱程序
备注说明：
A为0.1％(体积％)甲酸水，B为乙腈；
所述进样体积为2μL；
所述色谱柱为ACQUTITYHSST3(2.1×150mmi.d.,1.8μm)。
其出峰结果可参考图3(B)的总离子流图(TIC)。通过谱图可以看出，四个化合物已在基线水平上得到了完全分离，并有较好峰形，适于质谱定量分析。
3)、质谱条件：
仪器：三重四级杆串联质谱仪；质谱定量方法：多重反应监测(MRM)；离子源：电喷雾(ESI)负离子扫描方式；鞘气温度：375℃；鞘气流速：8L/min；喷嘴电压：500V；雾化器压力：45psi；毛细管电压：3500V；干燥气温度：300℃；干燥器流速：5L/min；载气：氮气；碰撞气：氮气。
表4、3种代谢物的质谱参数
Table4Massspectrumparametersoffourmetabolites
注：a为定量离子通道，b为定性离子通道
4)、结果：
采用标准曲线法对检测结果进行定量分析。配置含100ng同位素内标的溶度为10ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的系列标准溶液进行分析。以标准物浓度对同位素浓度的比值作为横坐标(X)，以标准物浓度峰面积对同位素内标峰面积的比值作为纵坐标(Y)，得到相应线性回归方程，得出检出结果。
质谱谱图结果参照图3(B)。本实施例通过检测SD大鼠尿液样品，最低检测限(LOD)分别为0.1ng/mL(AAMA)、0.2ng/mL(GAMA)、0.2ng/mL(异GAMA)；最低定量限(LOQ)分别为0.4ng/mL(AAMA)、0.6ng/mL(GAMA)、0.6ng/mL(异GAMA)，在色谱质谱联用方法中已经达到了较高的精密度。在5只雄性SD大鼠尿液检测中值为34.5ng/mL(AAMA,23.2-78.3ng/mL)、13.1ng/mL(GAMA,6.5-18.0ng/mL)、6.9ng/mL(异GAMA,5.3-12.3ng/mL)。
验证试验1、
采用文献Boettcher,M.I.,Schettgen,T.,Kutting,B.,Pischetsrieder,M.,Angerer,J.Mercapturicacidsofacrylamideandglycidamideasbiomarkersoftheinternalexposuretoacrylamideinthegeneralpopulation.MutationResearch2005,580:167-176所报道的方法。
尿液在室温下解冻，涡旋混匀后4mL样液转移到10mL离心管中，甲酸铵缓冲液(4mL,50mmol/L,pH2.5)、100μLHCl(4mol/L)和20μL混标溶液(20mg/L甲醇溶液)加入到样液。涡旋，在3000×g下离心10min，然后7.5mL上清液加入到预先用2mL甲醇，1mL水和1.5mLHCl(pH2.5)活化平衡的IsoluteENV+SPEcartridge(100mg,10mL,Separtis,Grenzach-Wyhlen)。小柱用2mLHCl(pH2.5)、0.8mL含有10％(v/v)HCl(pH2.5)和1mL去离子水淋洗。用1.6mL含1％(v/v)甲酸甲醇洗脱，氮气吹干。用1mL(0.1mol/L)甲酸水溶液定容，样品待LC-MS/MS定量分析。
本方法采用SPE法对尿液进行预处理后采用LC-MS/MS的方法对膳食丙烯酰胺短期体内暴露的巯基尿酸加合物进行同步检测，为检测丙烯酰胺巯基尿酸加合物的经典方法。此方法可同步检测AAMA和GAMA两种代谢物，在实际尿样检测中，AAMA的含量为3～338ng/mL,GAMA的含量为从未检出到45ng/mL。相比于本发明，此验证方法对代谢物的检测不全面，且采用LC-MS/MS方法效率低耗时长，另灵敏度和精密度均不如本发明。此方法作为丙烯酰胺巯基尿酸加合物检测经典方法发表于2005年，虽时间较久，但具有一定代表性，故在此作为验证试验。
实施例2、评价膳食丙烯酰胺短期体内暴露的巯基尿酸加合物同步检测方法，检测对象为大鼠尿液，依次进行以下步骤：
1)、样品预处理：
大鼠尿液预处理方法：解冻大鼠尿液，取一定量5μL鼠尿，加入10μL混合同位素内标(D3-AAMA、D3-GAMA、D3-异GAMA，浓度均为10μg/mL，以稀释液作为溶剂)，用稀释液稀释200倍，定容至1mL，涡旋2min混匀，经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。
所述稀释液为：0.5％(体积％)甲酸水溶液；
2)、色谱条件：
流速：0.2mL/min；柱温：40℃。
表5流动相的梯度洗脱程序
备注说明：
A为0.5％(体积％)甲酸水，B为乙腈；
所述进样体积为10μL；
所述色谱柱为ACQUTITYBEHShieldRP(2.1×150mmi.d.,1.7μm)。
3)、质谱条件：
仪器：三重四级杆串联质谱仪；质谱定量方法：多重反应监测(MRM)；离子源：电喷雾(ESI)负离子扫描方式；鞘气温度：375℃；鞘气流速8L/min；喷嘴电压：500V；雾化器压力：45psi；毛细管电压：4000V；干燥气温度：300℃；干燥器流速：5L/min；载气：氮气；碰撞气：氮气。
表6四种代谢物的质谱参数
Table6Massspectrumparametersoffourmetabolites
注：a为定量离子通道，b为定性离子通道
4)、结果：
采用标准曲线法对检测结果进行定量分析。配置含100ng同位素内标的溶度为10ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的系列标准溶液进行分析。以标准物浓度对同位素浓度的比值作为横坐标(X)，以标准物浓度峰面积对同位素内标峰面积的比值作为纵坐标(Y)，得到相应线性回归方程，得出检出结果。
质谱谱图结果请参照附图3(B)。本方法LOD分别为0.2ng/mL(AAMA)、0.2ng/mL(GAMA)、0.4ng/mL(异-GAMA)；LOQ分别为0.4ng/mL(AAMA)、0.6ng/mL(GAMA)、1.0ng/mL(异-GAMA)，在色谱质谱联用方法中已经达到了较高的精密度。在5只雄性SD大鼠尿液检测中值为31.4ng/mL(AAMA,21.5-72.1ng/mL)、15.2ng/mL(GAMA,8.6-19.7ng/mL)、8.1ng/mL(异-GAMA,5.9-16.4ng/mL)。
实施例3、评价膳食丙烯酰胺短期体内暴露的巯基尿酸加合物同步检测方法，检测对象为人体尿液，依次进行以下步骤：
1)、样品预处理：
解冻人体尿液，取1mL，加入20μL混合同位素内标(D3-AAMA、D3-GAMA、D3-异GAMA、D3-AAMA亚砜，浓度均为10μg/mL，以稀释液作为溶剂)，依次加入10μL甲酸和2mL的甲酸铵(50mmol/L,pH2.5)，涡旋30s后在10000r/min下离心5min。然后上清液上样至预先用3mL甲醇活化，1.5mL水和1.5mL0.1％甲酸水平衡的固相萃取柱，待流干用2mL淋洗液进行淋洗，去除杂质并弃去淋洗液；最后用2mL1％的甲酸甲醇溶液(即甲酸的体积浓度为1％)进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在40℃下氮气吹干，用初始流动相溶液(如表3所述)定容至1mL，涡旋溶解1min，经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。
所述稀释液为：0.1％(体积％)甲酸水溶液。
所述固相萃取柱种类和规格为IsoluteENV+SPEcartridge(100mg,3mL,Biotage,Sweden)；
所述过柱淋洗液为2mL0.1％(体积％)甲酸水。
备注：采用不同固相萃取柱所用酸不同。采用IsoluteENV+SPEcartridge(100mg,3mL,Biotage,Sweden)固相萃取小柱，所用酸为甲酸，淋洗液为2mL；采用IsoluteENV+SPEcartridge(100mg,10mL,Separtis,Grenzach-Wyhlen)固相萃取小柱，所用酸为盐酸，淋洗液为4mL。以上两种为不同SPE柱的最佳方案。
2)、色谱条件：
参照实施例1。
3)、质谱条件：
在实施例1给出的3种代谢物的质谱参数的基础上，还补充了AAMA-亚砜这种代谢物的质谱参数。
即，具体如下：
表7、4种代谢物的质谱参数
Table4Massspectrumparametersoffourmetabolites
注：a为定量离子通道，b为定性离子通道
4)、结果：
采用标准曲线法对检测结果进行定量分析。配置含100ng同位素内标的溶度为10ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的系列标准溶液进行分析。以标准物浓度对同位素浓度的比值作为横坐标(X)，以标准物浓度峰面积对同位素内标峰面积的比值作为纵坐标(Y)，得到相应线性回归方程，得出检出结果。
质谱谱图结果请参照附图3(A)。本方法LOD分别为0.2ng/mL(AAMA)、0.3ng/mL(AAMA亚砜)、0.3ng/mL(GAMA)、0.3ng/mL(异GAMA)；LOQ分别为0.7ng/mL(AAMA)、1.0ng/mL(AAMA亚砜)、1.0ng/mL(GAMA)、1.0ng/mL(异GAMA)，在色谱质谱联用方法中已经达到了较高的精密度。在5名非吸烟男性人群中检测中值为57.8ng/mL(AAMA,30.4-80.1ng/mL)、12.3ng/mL(GAMA,6.3-16.3ng/mL)、7.5ng/mL(异-GAMA,4.0-12.9ng/mL)、28.4ng/mL(AAMA-亚砜,21.2-34.0ng/mL)。由于没有考虑样本差异因素，人群尿液检测数据不具备对比性，只为验证方法重复性和准确性。
验证试验2、
目前对人尿样品检测精度最高的方法为Kopp,E.K.,etal.RapidandsensitiveHILIC-ESI-MS/MSquantitationofpolarmetabolitesofacrylamideinhumanurineusingcolumnswitchingwithanonlinetrapcolumn.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2008,56(21):9828-9834.
尿样解冻，涡旋后，用等体积的乙腈稀释尿样。在4℃，1400×g条件下离心10min以出去蛋白，随后加入混合内标溶液(D3-AAMA、D3-GAMA、D3-AAMA亚砜，3000μg/mL),使稀释液浓度在30μg/L。随后自动进样器吸取100μL的稀释尿液，泵1以1mL/min的速度将尿液样品通过含有10％乙酸铵缓冲液(20mmol/L,pH6.9)和90％乙腈的流动相输送到捕获管柱上，进行载样与淋洗；然后将阀切换到洗脱位置，泵2以84％和16％的乙腈和乙酸铵缓冲液为洗脱液，以0.4mL/min的流速将目标物洗脱下来，随后进行色谱分析。
此方法采用等体积稀释人尿样品的方法，采用HILIC色谱柱，online捕获柱处理，实现了对尿液中AAMA、AAMA-亚砜以及GAMA的在线净化处理。其方法的LOD分别为0.5ng/mL(AAMA)、2.0ng/mL(AAMA亚砜)、1.0ng/mL(GAMA)。在54名非吸烟人群中检测结果中值为24ng/mL(AAMA,7.8-79.8ng/mL)、16.7ng/mL(AAMA亚砜,6.8-70.1ng/mL)、3.82ng/mL(GAMA,1.0-23.6ng/mL)。
本发明方法与验证试验方法相比较，检测精度都非常高，本发明方法精度稍高于验证方法。在检测物质上，本发明更全面，可同时检测四种代谢产物，而验证方法只能检测到3种。另外，在所举检测结果中，由于性别、年龄、人种、膳食结构等关系，两方面数据不具备相比较条件，故只供参考。
实施例4、评价膳食丙烯酰胺短期体内暴露的巯基尿酸加合物同步检测方法，检测对象为人体尿液，依次进行以下步骤：
1)、样品预处理：
解冻人体尿液，取2mL，加入20μL混合同位素内标(D3-AAMA、D3-GAMA、D3-异GAMA、D3-AAMA亚砜，浓度均为10μg/mL)，依次加入50μL盐酸溶液(4mol/L)和2mL的甲酸铵(50mmol/L,pH2.5)，涡旋30s后在10000r/min下离心5min。然后上清液上样预先用3mL甲醇活化，1.5mL水和1.5mL0.1％甲酸水平衡的固相萃取柱，待流干用淋洗液进行淋洗，去除杂质并弃去淋洗液；最后用2mL1％的甲酸甲醇溶液(即甲酸的体积浓度为1％)进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在40℃下氮气吹干，用初始流动相溶液定容至1mL，涡旋溶解1min，经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。
所述固相萃取柱种类和规格为IsoluteENV+SPEcartridge(100mg,10mL,Separtis,Grenzach-Wyhlen)；
所述过柱淋洗液为4mL3mmol/L盐酸溶液。
2)、色谱条件：
同实施例2的表5。
3)、质谱条件：
同实施例2。
在实施例2给出的3种代谢物的质谱参数的基础上，还补充了AAMA-亚砜这种代谢物的质谱参数。
即，具体如下：
表8四种代谢物的质谱参数
Table6Massspectrumparametersoffourmetabolites
注：a为定量离子通道，b为定性离子通道
4)、结果：
采用标准曲线法对检测结果进行定量分析。配置含100ng同位素内标的溶度为10ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的系列标准溶液进行分析。以标准物浓度对同位素浓度的比值作为横坐标(X)，以标准物浓度峰面积对同位素内标峰面积的比值作为纵坐标(Y)，得到相应线性回归方程，得出检出结果。
质谱谱图结果请参照附图3(A)。本方法LOD分别为0.5ng/mL(AAMA)、1.0ng/mL(AAMA亚砜)、0.7ng/mL(GAMA)、1.0ng/mL(异GAMA)；LOQ分别为1.0ng/mL(AAMA)、1.5ng/mL(AAMA亚砜)、1.0ng/mL(GAMA)、1.5ng/mL(异GAMA)，在色谱质谱联用方法中已经达到了较高的精密度。在5名非吸烟男性人群中检测中值为59.3ng/mL(AAMA,25.3-75.6ng/mL)、18.3ng/mL(GAMA,9.8-31.2ng/mL)、7.2ng/mL(异GAMA,3.9-17.3ng/mL)、25.2ng/mL(AAMA亚砜,20.0-31.6ng/mL)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.评价丙烯酰胺短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法，其特征是包括以下步骤：
1)、对待测尿液进行前处理；
2)、将经前处理后的尿液进行色谱检测；
色谱条件以及质谱条件如下：
(一)色谱条件：
流速：0.2mL/min；柱温：40℃；
梯度洗脱程序如下：
A为0～1％(体积％)甲酸水，B为乙腈，其体积比为90:10～98:2；
所述色谱柱种类及规格为ACQUTITYBEHAMIDE、ACQUTITYBEHShieldRP或ACQUTITYHSST3；
所述进样体积为1～10μL；
(二)质谱条件：
仪器：三重四级杆串联质谱仪；质谱定量方法：多重反应监测；离子源：电喷雾负离子扫描方式；鞘气温度：375℃；鞘气流速8L/min；喷嘴电压：500V；雾化器压力：45psi；干燥气温度：300℃；干燥器流速：5L/min；载气：氮气；碰撞气：氮气；
D3-AAMA、D3-GAMA、D3-异GAMA这3种代谢物的质谱参数如下：
注：a为定量离子通道，b为定性离子通道；
所述质谱条件中毛细管电压为3000～4000V；
3)、采用标准曲线法对检测结果进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的评价丙烯酰胺短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法，其特征是：
所述步骤1)为：
一、当为啮齿类动物的尿液时，前处理方法为：
取5～50μL的鼠尿，加入10μL混合同位素内标(D3-AAMA、D3-GAMA、D3-异GAMA，上述三种同位素内标浓度均为10μg/mL；以稀释液作为溶剂)，用稀释液稀释20～200倍，涡旋混匀，经0.22μm微孔滤膜过滤；
所述稀释液为：0.1～0.5％甲酸水溶液；
二、当为高级哺乳动物的尿液时，前处理方法为：
人体尿液，取1～4mL，加入20μL混合同位素内标(D3-AAMA、D3-GAMA、D3-异GAMA、D3-AAMA亚砜，浓度均为10μg/mL，以稀释液作为溶剂)，依次加入10μL甲酸或50μL盐酸溶液(4mol/L)和2mL的甲酸铵(50mmol/L)，涡旋后离心；
取上述离心所得的上清液上样至固相萃取柱，
所述固相萃取柱种类和规格为IsoluteENV+SPEcartridge或IsoluteENV+SPEcartridge。
3.根据权利要求2所述的评价丙烯酰胺短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法，其特征是：
当为高级哺乳动物的尿液时，质谱检测中还包括D3-AAMA亚砜，其质谱参数如下：
4.根据权利要求2或3所述的评价丙烯酰胺短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法，其特征是：当为高级哺乳动物的尿液时，前处理方法中的取上述离心所得的上清液上样至固相萃取柱具体为：
取上述离心所得的上清液上样至固相萃取柱，待流干后用1～4ml过柱淋洗液进行淋洗，去除杂质并弃去淋洗液；最后用2mL体积浓度1％的酸甲醇进行洗脱，收集洗脱液；洗脱液在40℃下氮气吹干，用初始流动相溶液定容至1mL，涡旋溶解1min，经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。
CN201510627363.2A 2015-09-28 2015-09-28 评价丙烯酰胺短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法及应用 Pending CN105158398A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510627363.2A CN105158398A (zh) 2015-09-28 2015-09-28 评价丙烯酰胺短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510627363.2A CN105158398A (zh) 2015-09-28 2015-09-28 评价丙烯酰胺短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105158398A true CN105158398A (zh) 2015-12-16

Family

ID=54799322

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510627363.2A Pending CN105158398A (zh) 2015-09-28 2015-09-28 评价丙烯酰胺短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105158398A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107064342A (zh) * 2017-03-25 2017-08-18 浙江大学 评价丙烯酰胺体内暴露的血红蛋白加合物检测方法及应用
CN110208406A (zh) * 2019-05-31 2019-09-06 浙江大学 评价3-氯-1,2-丙二醇及其酯短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法及应用
CN110656154A (zh) * 2019-11-28 2020-01-07 江西中烟工业有限责任公司 一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
程军: "膳食丙烯酰胺巯基尿酸加合物的同步检测及体内化学防护研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107064342A (zh) * 2017-03-25 2017-08-18 浙江大学 评价丙烯酰胺体内暴露的血红蛋白加合物检测方法及应用
CN107064342B (zh) * 2017-03-25 2019-04-30 浙江大学 评价丙烯酰胺体内暴露的血红蛋白加合物检测方法及应用
CN110208406A (zh) * 2019-05-31 2019-09-06 浙江大学 评价3-氯-1,2-丙二醇及其酯短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法及应用
CN110656154A (zh) * 2019-11-28 2020-01-07 江西中烟工业有限责任公司 一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法
CN110656154B (zh) * 2019-11-28 2022-11-25 江西中烟工业有限责任公司 一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Paglia et al. Ion mobility mass spectrometry in the omics era: Challenges and opportunities for metabolomics and lipidomics
Lagerstedt et al. Measurement of plasma free metanephrine and normetanephrine by liquid chromatography–tandem mass spectrometry for diagnosis of pheochromocytoma
Ma et al. Effect of arsenosugar ingestion on urinary arsenic speciation
Guillarme et al. Coupling ultra-high-pressure liquid chromatography with mass spectrometry
Streit et al. Validation of a rapid and sensitive liquid chromatography–tandem mass spectrometry method for free and total mycophenolic acid
Midttun et al. Determination of vitamins A, D and E in a small volume of human plasma by a high‐throughput method based on liquid chromatography/tandem mass spectrometry
Chekmeneva et al. Optimization and application of direct infusion nanoelectrospray HRMS method for large-scale urinary metabolic phenotyping in molecular epidemiology
Yang et al. Stereoselective analysis of carvedilol in human plasma using HPLC/MS/MS after chiral derivatization
Saric et al. Systematic evaluation of extraction methods for multiplatform-based metabotyping: application to the Fasciola hepatica metabolome
Ryan et al. Protein identification in imaging mass spectrometry through spatially targeted liquid micro‐extractions
Takyi-Williams et al. Ambient ionization MS for bioanalysis: recent developments and challenges
CN103592389A (zh) 一种基于妊娠糖尿病人血清lc/ms代谢组学分析方法
Jones et al. Development and validation of a LC-MS/MS assay for quantitation of plasma citrulline for application to animal models of the acute radiation syndrome across multiple species
Prieto-Blanco et al. Determination of carbonyl compounds in particulate matter PM2. 5 by in-tube solid-phase microextraction coupled to capillary liquid chromatography/mass spectrometry
CN104040338A (zh) 通过质谱测定法检测反式三碘甲状腺原氨酸的方法
CN105158398A (zh) 评价丙烯酰胺短期暴露的巯基尿酸加合物检测方法及应用
Liu et al. Online multi-channel microfluidic chip-mass spectrometry and its application for quantifying noncovalent protein–protein interactions
Kadioglu et al. Spectrofluorimetric determination of amlodipine in human plasma without derivatization
JP2004535588A (ja) リン定量化のための方法
CN102980968A (zh) 一种尿液中肌酐的液相色谱串联质谱测定方法
Van Der Gugten et al. Quantitation of aldosterone in serum or plasma using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)
Piešťanský et al. Comparison of hydrodynamically closed two‐dimensional capillary electrophoresis coupled with ultraviolet detection and hydrodynamically open capillary electrophoresis hyphenated with mass spectrometry in the bioanalysis of varenicline
CN103175921B (zh) 液相色谱串联质谱分析尿液中苯和甲苯四种代谢产物的方法
Frenich et al. Quantitative determination of endocrine‐disrupting polychlorinated biphenyls and organochlorinated pesticides in human serum using gas chromatography with electron‐capture detection and tandem mass spectrometry
Yang et al. Evolving platforms for clinical mass spectrometry

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20151216

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication