CN107064342A - 评价丙烯酰胺体内暴露的血红蛋白加合物检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法,该方法包括血液(大鼠血液和人体血液)的前处理方法、检测方法的色谱条件以及质谱条件。本发明采用了同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法(UHPLC‑MS/MS),对丙烯酰胺的两种血红蛋白加合物进行定量,分析时间大大缩短,同时使得AAVal‑PTH和两种GAVal‑PTH空间异构体得到较好的分离,实现同步检测,这能够更加全面的对丙烯酰胺的内暴露量进行评估。
Description
技术领域
本发明涉及一种评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法及其应用,属于食品安全领域。
背景技术
2002年,瑞典国家食品管理局与斯德哥尔摩大学的研究人员共同宣称在油炸食品和焙烤食品中发现了高含量的丙烯酰胺(Acrylamide,AA),并在随后的研究证明热加工食品中丙烯酰胺的形成源自美拉德反应(Swedish National Food Administration,Information about acrylamide in food,2002,4),引起了国际社会的高度关注。丙烯酰胺是一种无色无味的白色晶体小分子物质,为一种重要的化工原料,工业用途广泛。人体摄入丙烯酰胺主要来自高碳水化合物含量的食品,如薯类油炸食品,焙烤类食品、消费快餐食品以及休闲类食品等。根据我国第五次膳食调查的研究表明,我国的膳食丙烯酰胺摄入主要来自烹饪蔬菜、谷物及薯类消费(Gao,J.,Zhao,Y.,Zhu,F.,Ma,Y.,Li,X.,Miao,H.,&Wu,Y.Dietary exposure of acrylamide from the fifth Chinese Total Diet Study.Foodand Chemical Toxicology 2016,87,97-102.)。
丙烯酰胺具有神经毒性、生殖毒性、基因毒性及致癌性。人体在丙烯酰胺亚慢性暴露(30μg/kg bw)条件下可能引起可逆的周围神经病变,如四肢无力、麻木、骨骼无力等,在长期暴露中会引发更严重状况。(WHO,2005)。丙烯酰胺在实验啮齿类动物中的生殖与发育毒性都得到了验证,表现为混乱交配、繁殖率下降、胎儿再吸收增加,怀孕雌鼠产崽量减少、雄鼠精子畸形和精子数量降低(Lineback&Jones,2011)。同时,也有文献报道了丙烯酰胺可能对人体存在基因毒性(Jiang et al.,2007;Parzefall,2008)。丙烯酰胺的致癌性早在1994年已经被国际癌症研究机构(IARC)列为2A类致癌物(对人类很可能有致癌性)。基于目前的现有研究,对丙烯酰胺的体内代谢动力学及毒理学的研究显得尤其重要,开发对膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法十分必要。
目前,在食品中检测分析丙烯酰胺主要以色谱联用质谱作为主要的分析检测手段。其中,以气相色谱联用质谱(GC-MS)和液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术应用尤其广泛。此外,一些为快速检测食品中丙烯酰胺的理化检验方法及试剂盒也在积极开发中。为了达到检测目的和更好的检出效果,一般需要对食品样品采取必要的样品预处理。食品属于分析检测的复杂基质,对于丙烯酰胺的检测需要通过脱脂、提取、萃取、旋蒸、重溶和过滤等前处理步骤提取食品中的丙烯酰胺(一种提取食品中丙烯酰胺的预处理方法,CN103499478A,2014;一种烘烤食品中丙烯酰胺检测样品的提取方法,CN103389235A,2013),以达到排除复杂基质中杂质的干扰。Rosén等在2002年首次采用同位素稀释的液相色谱串联质谱法对热加工食品中丙烯酰胺的含量进行了方法开发研究,采用多重反应监测(MRM)的定量模式确认了丙烯酰胺的母离子、定性离子和定量离子(Rosén,J.Analysis of acrylamide incooked foods by liquid chromatography tandem mass spectrometry.Analyst 2002,127:880-882)。此后,大量的研究采用及优化了此方法,基于质谱技术对各类食品基质中丙烯酰胺的检测方法进行了研究。与此同时,丙烯酰胺作为热加工食品产生的危害物,与其他危害物同步检测的研究也十分受到关注(同时检测食品中的丙烯酰胺和杂环胺的方法,CN103149316A,2013)。由于基于色谱串联质谱检测平台的昂贵和检测周期较长的问题,国内外对丙烯酰胺快速检测领域也进行了大量的方法开发,如基于丙烯酰胺免疫亲和原理而开发的快速检测试剂(一种丙烯酰胺快速检测卡,CN202330398U,2012)和采用荧光手段对丙烯酰胺的检测方法(一种食品中丙烯酰胺的检测方法,CN101303304,2008)。目前对丙烯酰胺快速检测方面的研究仍受到丙烯酰胺特性及技术方面的限制,所开发的快速检验方法并未得到广泛适用。
丙烯酰胺作为食品中危害物,对其体内风险评估主要是采用膳食外暴露的评估方式,即通过调查各类食品中丙烯酰胺的含量进行膳食水平评估。此种策略可操作性强,在我国公共卫生系统被广泛应用。但这种评估手段仍有一定局限性,不能直观反映丙烯酰胺进入人体内后的代谢方式和暴露水平。所以,通过采用体内代谢及暴露的评估方式需要得到重视,丙烯酰胺体内研究方法十分有必要进行研究,即通过对丙烯酰胺体内代谢生物标志物的检测对其进行风险评估。体内策略与体外相比,前者能更准确地评估丙烯酰胺的日常摄入量。同时丙烯酰胺体内研究方法的建立及评估能为目前对丙烯酰胺的监控和评估提供更可靠的依据,具有十分重要的指导意义。
丙烯酰胺作为一种毒物在上世纪80年代就有一定的研究。在啮齿类动物和人体实验中发现,丙烯酰胺在进入体内后,会首先与体内细胞色素P450 2E1酶的作用,部分丙烯酰胺会迅速转化成具有强氧化活性的环氧丙酰胺(GA),环氧丙酰胺毒性远远高于丙烯酰胺,为体内代谢主要危害物。环氧丙酰胺在环氧化物水解酶的作用下,分子结构开环形成成无毒的2,3-二羟基丙酰胺(2,3-OH),完成一级代谢。与此同时,丙烯酰胺和环氧丙酰胺在体内都能够与谷胱甘肽(GSH)、血红蛋白以及DNA进行结合,形成相应的加合物,见图1。丙烯酰胺和环氧丙酰胺与谷胱甘肽结合后,会进一步转化成巯基尿酸加合物,包括N-乙酰-S-(2-氨基甲酰乙基)-L-半胱氨酸(AAMA)、N-乙酰-S-(2-氨基甲酰乙基)-L-半胱氨酰亚砜(AAMA-亚砜)、N(R,S)-乙酰-S-(2-氨基甲酰-2-羟乙基)-L-半胱氨酸(GAMA)以及N-乙酰-S-(1-氨基甲酰-2-羟乙基)-L-半胱氨酸(异-GAMA),并通过尿液排出体外。其中AAMA-亚砜只存在于人体内,在其他动物中并未发现。丙烯酰胺和环氧丙酰胺进入体内血液后,会与血红蛋白缬氨酸的N一端形成共价化合物,即丙烯酰胺-Hb和环氧丙酰胺-Hb加合物。丙烯酰胺血红蛋白加合物会在体内累积并存在长达4个月,因此这两种加合物被认为是评估膳食丙烯酰胺体中长期暴露剂量的两个重要的生物标志物(EFSA,Scientific opinion on acrylamide infood,2015)。另外,环氧丙酰胺和丙烯酰胺都能与DNA进行结合形成加合物,但环氧丙酰胺与DNA的结合率远高于丙烯酰胺与DNA发生结合作用的效率。目前已经有四种环氧丙酰胺DNA加合物被确认,即N1-(2-羧基-2-羟乙基)-2’-脱氧腺苷(N1-GA-dA)、N3-(2-氨基甲酰-2-羟乙基)-腺嘌呤(N3-GA-Ade)、N7-(2-氨基甲酰-2-羟乙基)-鸟嘌呤(N7-GA-Gua)以及N6-(2-羧基-2-羟乙基)-2’-脱氧腺苷(N6-GA-dA),其中以N7-GA-Gua为主要加合物。
目前,国际对于丙烯酰胺体内血红蛋白加合物的研究及应用主要集中在欧洲及美国,对于其检测方法的开发瓶颈主要存在于血液前处理方面和仪器分析方面。血液前处理包括两方面,一方面为血红蛋白制备,另一方面为衍生物净化。其中,各种报道衍生方式类似,衍生剂选择不同,如会选用五氟苯基硫代异氰酸酯(PFPITC)、异硫氰酸苯酯(PITC)或异硫氰酸荧光素(FITC)等(Bergmark,E.,Calleman,C.J.,He,F.,&Costa,L.G.Determinationof hemoglobin adducts in humans occupationally exposed to acrylamide.ToxicolAppl Pharmacol1993,120(1),45-54.;Fennell,T.R.,Sumner,S.C.,Snyder,R.W.,Burgess,J.,Spicer,R.,Bridson,W.E.,&Friedman,M.A.Metabolism and hemoglobinadduct formation of acrylamide in humans.Toxicological Sciences 2005,85(1),447-459.;von Stedingk,H.,Rydberg,P.,&M.A new modified Edmanprocedure for analysis of N-terminal valine adducts in hemoglobin byLC–MS/MS.Journal of Chromatography B 2010,878(27),2483-2490.)。净化步骤普遍采用固相萃取小柱进行简便高效处理,也有报道的进行普通理化净化方法(Hagmar,L.,Wirfalt,E.,Paulsson,B.,&Tornqvist,M.Differences in hemoglobin adduct levels ofacrylamide in the general population with respect to dietary intake,smokinghabits and gender.Mutat Res 2005,580(1-2),157-165)。仪器分析方面主要有气相色谱-质谱联用法(GC-MS/MS)(Schettgen,T.,Muller,J.,Fromme,H.,&Angerer,J.Simultaneous quantification of haemoglobin adducts of ethylene oxide,propylene oxide,acrylonitrile,acrylamide and glycidamide in human blood byisotope-dilution GC/NCI-MS/MS.Journal of Chromatography B-AnalyticalTechnologies in the Biomedical and Life Sciences 2010,878(27),2467-2473.)和液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS/MS)(Obon-Santacana,M.,Lujan-Barroso,L.,Travis,R.C.,Freisling,H.,Ferrari,P.,Severi,G.,...Duell,E.J.Acrylamide and GlycidamideHemoglobin Adducts and Epithelial Ovarian Cancer:A Nested Case-Control Studyin Nonsmoking Postmenopausal Women from the EPIC Cohort.Cancer EpidemiolBiomarkers Prev 2016,25(1),127-134.)。由于膳食丙烯酰胺在人体内血液中含量非常少,其含量在数pmol/g Hb到数百pmol/g Hb之间,对检测分析方法的前处理和仪器检测要求非常高。目前普遍采用以固相萃取为代表的前处理方法和以超高效液相色谱串联质谱为仪器支持的检测手段,为评估膳食丙烯酰胺体内中长期血红蛋白加合物暴露的研究提供技术手段。
膳食丙烯酰胺体内中长期暴露主要以丙烯酰胺及其氧化代谢产物环氧丙酰胺的血红蛋白加合物为主要生物标志物(AAVal和GAVal)。由于其与血液中红细胞血红蛋白缬氨酸结合的特殊性,通常采用衍生的方法将其结合并脱去血红蛋白,通过定量分析方法间接检测衍生物实现对两种血红蛋白加合物的同步检测分析。上述所涉方法前处理操作冗长,衍生效率和净化效率较低,采用气相色谱的方法检测灵敏度十分有限,不利于对大批量生物样品的检测和膳食水平暴露低含量的样本的检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法。
为了解决上述技术问题,本发明提供一种评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法,包括以下步骤:
1)、制备血红蛋白干粉:
取0.5~1mL的红细胞加入1~9体积倍的纯水稀释红细胞(即,稀释至2~10倍),涡旋震荡后于-80±5℃速冻0.5~3h;之后,在20~55℃水浴下解冻得到溶血液;
在溶血液中加入15~30mL酸化异丙醇溶液,于3500~6000rpm离心2~15min;在离心所得上清液(暗红色)中加入10~30mL乙酸乙酯,涡旋震荡后于4±0.5℃放置0.5~4h从而沉淀蛋白;接着于3500~6000rpm离心2~15min,在离心所得的沉淀中重复上述加入乙酸乙酯后涡旋震荡、沉淀蛋白和离心1~3次;最终离心所得的沉淀用正己烷(10~30mL)洗涤后干燥,得血红蛋白粉;
2)、衍生及净化:
取20~100mg的血红蛋白粉加入0.8~3mL的甲酰胺和20~100μL的1mol/L NaOH溶液,再加入5~30μL的衍生剂,涡旋混匀;在室温下震荡12~24h进行衍生化,然后在30~60℃水浴继续衍生0.5~6h;
水浴衍生结束后,再加入0.2~2mL的20%(质量%)NaCl溶液(目的是沉淀血红蛋白)以及20μL同位素内标d8-AAVal-PTH和d8-GAVal-PTH的混合液(溶剂为甲醇),涡旋混合均匀,在转速8000~12000rpm下离心2~15min,取上清液;
将固相萃取柱活化、平衡后,取上清液上样,先用2~3mL淋洗液淋洗(目的是去除杂质),然后2~3mL甲醇洗脱,收集洗脱液;洗脱液在40℃下氮气吹干,用流动相溶液定容至1mL,涡旋溶解1min,经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析;
所述淋洗液为体积浓度5%~10%甲醇水溶液;
流动相溶液为初始流动相,即,0~1%甲酸水溶液:乙腈=40:60~60:40;
3)、色谱条件:
仪器:超高效液相色谱(UHPLC);流速:0.2mL/min;柱温:40℃;流动相A:0~1%甲酸水溶液;流动相B:乙腈;等度洗脱比例:A:B=40:60~60:40;进样体积:5~10μL;进样时间:10~15min;
所述色谱柱种类及规格为ACQUTITY HSS T3(2.1×150mm i.d.,1.8μm)或ACQUTITYBEH C18(2.1×150mm i.d.,1.7μm);
4)、质谱条件:
仪器:三重四级杆串联质谱仪;质谱定量方法:多重反应监测(MRM);离子源:电喷雾(ESI)负离子扫描方式;鞘气温度:375℃;鞘气流速8L/min;喷嘴电压:500V;雾化器压力:45psi;毛细管电压:3000~4000V;干燥气温度:300℃;干燥器流速:5L/min;载气:氮气;碰撞气:氮气;总离子流及各离子通道图如图2所示;
表1两种代谢物及其同位素的质谱参数
Table1 Mass spectrum parameters of two metabolites and their isotopeconpounds
注:a为定量离子通道,b为定性离子通道
备注说明,本方法采用质谱分析时,AAVal-PTH和GAVal-PTH为两种待分析的加合物,d8-AAVal-PTH和d8-GAVal-PTH为它们的同位素内标(用于两种加合物的内标法定量),表1共显示了8个质谱检测通道,即每种化合物有2个通道,第一个为定量离子通道,第二个为定性离子通道(辅助定量和确认)。例如对于AAVal-PTH来说,394.1是AAVal-PTH的分子离子峰,303.0和274.9均为AAVal-PTH的特征性碎片离子峰。394.1>303.0被选为定量离子通道,394.1>274.9被选为定性离子通道,依此类推。而Fragmentor和碰撞电压这两个参数是决定质谱定量和定性离子响应值高低的主要参数;
5)、结果:
利用上述液相-质谱联用方法,通过标准曲线法对样品进行定量分析。
备注说明:
本发明利用上述液相-质谱联用方法,通过标准曲线法对样品进行定量分析,对大鼠和人群血液样品的检出限可达到1.4~3.5pmol/g Hb,定量限可达4.8~10.7pmol/g Hb,可达到样品的最低含量限度。通过4天3水平6平行(即在4天中,对血液样品加入在样品含量范围中的高、中、低三个浓度的混合标准品溶液,每个浓度下做6个水平样品,进行方法的可靠性验证)进行方法学验证,相对标准偏差(RSD)都小于11.17%,符合方法学要求,具有高精密度和灵敏度。
当检测对象为大鼠血液,
对于AAVal-PTH,线性方程为y=0.002515x-0.012177,相关系数R2=0.9999;
对于GAVal-PTH,线性方程为y=0.001583x+0.002810,相关系数R2=0.9999。
检测对象为人体血液,
对于AAVal-PTH,线性方程为y=0.075514x+0.022087,相关系数R2=0.9924;
对于GAVal-PTH,线性方程为y=0.046010x+0.012801,相关系数R2=0.9834。
作为本发明的评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法的改进:所述步骤1)中红细胞的制备方法为:将装在抗凝管中的全血在3500±rpm下离心5±0.5min,将上清液(血浆)和中间层(白膜)移出,在下层(留在下层的为红细胞部分)中加入PBS溶液或生理盐水进行清洗、离心,得到红细胞。
作为本发明的评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法的进一步改进:所述步骤2)中的衍生剂为五氟苯基异硫氰酸酯(Pentafluorophenylisothiocyanate)。
作为本发明的评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法的进一步改进:所述步骤2)中:
当待测样品是人血时,混合同位素内标为d8-AAVal-PTH和d8-GAVal-PTH,浓度均为1μg/mL;
当待测样品是鼠血,混合同位素内标为d8-AAVal-PTH和d8-GAVal-PTH,浓度均为10μg/mL。
混合同位素内标溶剂为甲醇。
作为本发明的评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法的进一步改进:所述步骤2)中:
所述固相萃取柱为SupelcleanTM LC-18cartridge(3cc,500mg;Supelco,Bellefonte,USA)、HLB cartridge(3cc,60mg,Waters,Milford,MA)、ExtrelutTM NTcartridge(3cc,1g;Merck,Darmstadt,Germany)。
本发明包括血液(大鼠血液和人体血液)的前处理方法、检测方法的色谱条件以及质谱条件。其中前处理包括血红蛋白粉的制备、衍生和过柱净化。所述血红蛋白粉的制备涉及红细胞用量及稀释倍数、速冻时间及解冻水浴温度、离心转速及时间、有机溶剂用量;所述衍生条件涉及血红蛋白粉用量、加入溶剂及体积、衍生反应时间及温度;所述过柱净化涉及沉淀蛋白溶剂、固相萃取柱种类及规格和过柱淋洗液体积;所述检测的色谱条件涉及色谱柱种类及规格、流动相种类及配比、进样体积和梯度洗脱程序;所述检测的质谱条件涉及毛细管电压、Fragmentor电压和碰撞电压。
所述解冻的红细胞体积为0.5~1mL;
所述红细胞稀释倍数为2~10倍;
所述在-80℃速冻时间为0.5~3h;
所述解冻水浴温度为20~55℃;
所述酸化异丙醇(50mmol/L盐酸)体积为15~30mL;
酸化异丙醇溶液(50mmmol/L盐酸)配制方法为:浓盐酸摩尔浓度为12mol/L,加入浓盐酸0.83mL到200mL异丙醇溶剂中,搅拌均匀。
所述离心转速为3500~6000rpm;
所述离心时间为2~15min;
所述4℃静置沉淀蛋白时间为0.5~4h;
所述用乙酸乙酯体积为10~30mL;
所述用正己烷体积为10~30mL;
所述血红蛋白粉用量为20~100mg;
所述甲酰胺体积为0.8~3mL;
所述NaOH溶液(1mol/L)体积为20~100μL;
所述五氟苯基硫代异氰酸酯(PFPITC)体积为5~30μL;
所述衍生反应时间为12~24h;
所述衍生水浴温度为30~60℃;
所述衍生水浴反应时间为0.5~6h;
所述20%NaCl溶液体积为0.2~2mL;
所述固相萃取柱种类和规格为SupelcleanTM LC-18cartridge(3cc,500mg;Supelco,Bellefonte,USA)、HLB cartridge(3cc,60mg,Waters,Milford,MA)和ExtrelutTM NTcartridge(3cc,1g;Merck,Darmstadt,Germany);
所述淋洗液为5%~10%甲醇水溶液(v/v);
所述淋洗液体积为2~3mL;
所述色谱柱种类及规格为ACQUTITYHSS T3(2.1×150mm i.d.,1.8μm)和ACQUTITYBEH C18(2.1×150mm i.d.,1.7μm);
所述流动相为0~0.5%甲酸水溶液(v/v)和乙腈,其配比为40:60~60:40;
所述进样体积为5~10μL;
所述质谱条件中毛细管电压为3000~4000V;
所述Fragmentor电压和碰撞电压见表1。
本发明的方案具体为:一种评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法,包括以下步骤:
(一)制备血红蛋白干粉
将装在抗凝管中的全血样品在3500rpm下离心5min,将上清液(血浆)和中间层(白膜)移出,将留在下层的红细胞部分加入PBS溶液或生理盐水,用滴管吹打均匀后吸去上清液,在3000rpm离心5min,重复清洗3次,得到红细胞。
取一定量的红细胞(0.5~1mL),转移至离心管中,加入纯水稀释红细胞一定倍数(2~10倍),涡旋震荡10min,放入-80℃冰箱速冻一段时间(0.5~3h)。之后,在一定温度下(20~55℃)水浴下解冻得到溶血液。在溶血液中加入一定量的酸化异丙醇溶液(15~30mL),在一定转速(3500~6000rpm)下离心一定时间(2~15min)。将暗红色的上清液转移至另外离心管中,加入一定量的乙酸乙酯(10~30mL),涡旋震荡10min,在4℃冰箱放置一段时间(0.5~4h)沉淀蛋白,然后在一定转速(3500~6000rpm)下离心一定时间(2~15min),弃去上清液。在沉淀中加入一定量乙酸乙酯(10~30mL)按照前面所述步骤重复洗涤沉淀2次,再加入一定量正己烷(10~30mL)洗涤沉淀一次,放在通风厨静置过夜,待干燥后研磨成粉,得到血红蛋白粉,在-20℃保存。
(二)衍生及净化
取一定量的血红蛋白粉(20~100mg),加入一定量的甲酰胺(0.8~3mL)和一定量的1mol/L NaOH溶液(20~100μL),再加入一定量的衍生剂五氟苯基硫代异氰酸酯(5~30μL),涡旋混匀。在室温下震荡一定时间(12~24h)进行衍生化,然后在一定温度水浴(30~60℃)继续衍生一定时间(0.5~6h)。水浴衍生后,在溶液中加入一定量20%NaCl溶液(0.2~2mL),沉淀血红蛋白。对于人血样品,再加入20μL混合同位素内标(d8-AAVal-PTH和d8-GAVal-PTH,浓度均为1μg/mL);对于鼠血样品,再加入20μL混合同位素内标(d8-AAVal-PTH和d8-GAVal-PTH,浓度均为10μg/mL),涡旋混合均匀,在转速10000rpm下离心一定时间(2~15min),取上清液备用。
固相萃取柱事先用3mL甲醇活化,再用3mL纯水平衡,待溶液流干后,将上清液上样至固相萃取柱,流干后用一定体积(2~3mL)淋洗液(5%~10%甲醇水溶液)进行淋洗,去除杂质并弃去淋洗液。最后用一定体积(2~3mL)甲醇洗脱,收集洗脱液。洗脱液在40℃下氮气吹干,用初始流动相溶液定容至1mL,涡旋溶解1min,经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。
备注说明:
1.本处理方法适用于大鼠血液和人体血液的样品制备;
2.所述固相萃取柱种类和规格为SupelcleanTM LC-18cartridge(3cc,500mg;Supelco,Bellefonte,USA)、HLB cartridge(3cc,60mg,Waters,Milford,MA)和ExtrelutTM NTcartridge(3cc,1g;Merck,Darmstadt,Germany);
3.大鼠血液样品和人群血液样品由于其丙烯酰胺血红蛋白加合物的含量不同,所以其加入内标的剂量不同;
4.AAVal-PTH、GAVal-PTH、d8-AAVal-PTH和d8-GAVal-PTH的制备方法可参照已经公开发表以下文献;
*Paulsson,B.,Athanassiadis,I.,Rydberg,P.,&M.(2003).Hemoglobin adducts from glycidamide:acetonization of hydrophilic groups forreproducible gas chromatography/tandem mass spectrometric analysis.RapidCommunications in Mass Spectrometry Rcm,17(16),1859–1865.
(三)色谱条件:
仪器:超高效液相色谱(UHPLC);流速:0.2mL/min;柱温:40℃;流动相A:0~1%甲酸水溶液;流动相B:乙腈;等度洗脱比例:A:B=40:60~60:40;进样体积:5~10μL;进样时间:10~15min。
所述色谱柱种类及规格为ACQUTITYHSS T3(2.1×150mm i.d.,1.8μm)或ACQUTITYBEH C18(2.1×150mm i.d.,1.7μm)。
(四)质谱条件:
仪器:三重四级杆串联质谱仪;质谱定量方法:多重反应监测(MRM);离子源:电喷雾(ESI)负离子扫描方式;鞘气温度:375℃;鞘气流速8L/min;喷嘴电压:500V;雾化器压力:45psi;毛细管电压:3000~4000V;干燥气温度:300℃;干燥器流速:5L/min;载气:氮气;碰撞气:氮气。总离子流及各离子通道图如图2所示。两种代谢物及其同位素的质谱参数见表1。
本发明与现有技术的区别主要在于:
第一,本发明通过制备血液血红蛋白粉,选用特异的衍生剂衍生结合目标物,采用SPE柱方式净化样品等前处理方法,使大鼠血液和人体血液中含量非常少的丙烯酰胺血红蛋白加合物便于检测,并能达到较低的检出限;
第二,本发明通过优化超高效液相色谱条件,成功在基线水平分离了AAVal-PTH和GAVal-PTH的手性结构。GAVal-PTH具有左旋(L)和右旋(D)两种构型,本发明首次确定了这两种空间异构体,并发现右旋(D)和左旋(L)比例关系维持在45:55。
第三,本发明采用同位素稀释法超高效液相色谱串联质谱法(UHPLC-MS/MS),对丙烯酰胺血红蛋白进行检测方法的开发。提高了色谱分离效率,减少了分析时间,样品处理简单,可达到较高灵敏度和较低定量限。
本发明具有如下技术优势:
1、本发明开发了适用于大鼠血液和人体血液检测丙烯酰胺血红蛋白加合物的前处理步骤。
本发明优化了血红蛋白粉的制备过程,使大鼠和人体的血液最大限度释放血红蛋白,并通过有机溶剂的清洗得到纯度较高的血红蛋白干粉。采用的衍生剂将血红蛋白肽链末端的丙烯酰胺加合物结合,并脱去蛋白,排除了待测溶液中蛋白质的干扰,降低了质谱检测的基质效应。所采用的SPE方式净化样品,一方面避免了样品中杂质的干扰,一方面使溶解血红蛋白的溶剂甲酰胺(沸点较高,不利于氮吹干后定容)与目标物分离,降低了溶剂干扰,对于仪器检测有重要意义。
2、本发明实现了两种丙烯酰胺血红蛋白加合物的色谱分离,同时在基线水平分离了GAVal-PTH的手性异构体,并对其进行了确认。
本发明通过优化色谱柱、流动线、洗脱条件等色谱条件,达到了对两种丙烯酰胺血红蛋白加合物的较好分离。其中GAVal-PTH具有手性结构,在本发明的色谱条件下成功将其分离。通过对其出峰顺序、生物质含量不同等,确定前峰为右旋(D型),后峰为左旋(L型),其比例关系稳定在45:55。此发明对于进一步研究体内丙烯酰胺血红蛋白加合物具有生物学意义。
3、实现了全部两种丙烯酰胺血红蛋白加合物的色谱分离和同步定量分析。本发明对于全面评估膳食丙烯酰胺经体内中期暴露后各血红蛋白加合物的水平检测有重要意义。
本发明采用了同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法(UHPLC-MS/MS),对丙烯酰胺的两种血红蛋白加合物进行定量,分析时间大大缩短,同时使得AAVal-PTH和两种GAVal-PTH空间异构体得到较好的分离,实现同步检测,这能够更加全面的对丙烯酰胺的内暴露量进行评估。本发明方法检测定量限可以达到10pmol/g Hb的水平,属于高灵敏度,具有检测灵敏度高的优势;而上述现有技术的检测定量限为15pmol/g Hb。另外,本方法借助于超高效液相色谱,所使用的超高效液相色谱柱可承载的柱压比普通液相柱可承载的柱压高出许多倍,使得检测效率大大提高。本方法分析时间只需10~15分钟。因此,本发明具有方法简洁、检测精确度等优点。
附图说明
图1为丙烯酰胺的体内代谢途径图;
图2为两种代谢物及其对应的同位素的离子扫描图;
注:(A)为AAVal-PTH的子离子扫描图,(B)为d8-AAVal-PTH的子离子扫描图,(C)为GAVal-PTH的子离子扫描图,(D)为d8-GAVal-PTH的子离子扫描图;
图3是人体和大鼠血液样品中丙烯酰胺血红蛋白加合物的UHPLC-MS/MS图谱;
注:(A)为人体和大鼠血液样品中丙烯酰胺血红蛋白加合物的总离子流图,(B)~(E)分别为AAVal-PTH、d8-AAVal-PTH、GAVal-PTH和d8-GAVal-PTH的离子通道检测谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1、一种评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法,检测对象为大鼠血液,依次进行以下步骤:
1)、制备血红蛋白干粉
将装在抗凝管中的全血样品5mL在3500rpm下离心5min,将上清液(血浆)和中间层(白膜)移出,将留在下层的红细胞部分加入PBS溶液或生理盐水3mL,用滴管吹打均匀后吸去上清液,在3000rpm离心5min,重复清洗3次,得到红细胞2mL。
取红细胞1mL,转移至离心管中,加入纯水(5ml)稀释红细胞6倍,涡旋震荡10min,放入-80℃冰箱速冻2h。之后,在37℃水浴下解冻得到溶血液。在溶血液中加入20mL的酸化异丙醇溶液,在5000rpm转速下离心10min。将暗红色的上清液转移至另外离心管中,加入20mL的乙酸乙酯,涡旋震荡10min,在4℃冰箱放置2h沉淀蛋白,然后4500rpm转速条件下离心10min,弃去上清液。在沉淀中加入15mL乙酸乙酯,按照以上所述步骤重复洗涤沉淀2次,再加入20mL正己烷洗涤沉淀一次,放在通风厨静置过夜,待干燥后研磨成粉,得到血红蛋白粉约150~200mg,在-20℃保存。
2)、衍生及净化:
取50mg的血红蛋白粉,加入1.5mL的甲酰胺和40μL的1mol/L NaOH溶液,再加入10μL衍生剂五氟苯基硫代异氰酸酯,涡旋混匀。在室温下震荡16h进行衍生化,然后在45℃水浴下继续衍生2h。水浴衍生结束后,在溶液中加入0.5mL 20%(质量%)NaCl溶液,沉淀血红蛋白。加入20μL混合同位素内标(d8-AAVal-PTH和d8-GAVal-PTH,浓度均为10μg/mL,溶剂为甲醇),涡旋混合均匀,在转速10000rpm下离心15min,取上清液备用。
固相萃取柱选用SupelcleanTM LC-18cartridge(3cc,500mg;Supelco,Bellefonte,USA)。事先用3mL甲醇活化,再用3mL纯水平衡,待溶液流干后,将上清液上样至固相萃取柱,流干后用2mL 10%甲醇水溶液进行淋洗,去除杂质并弃去淋洗液。最后用2mL甲醇洗脱,收集洗脱液。洗脱液在40℃下氮气吹干,用初始流动相溶液(如步骤3)中所示)定容至1mL,涡旋溶解1min,经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。
初始流动相溶液为:0.1%甲酸水溶液:乙腈=50:50(体积比)。
3)、色谱条件:
仪器:超高效液相色谱(UHPLC);色谱柱:ACQUTITYHSS T3(2.1×150mmi.d.,1.8μm);流速:0.2mL/min;柱温:40℃;流动相A:0.1%甲酸水溶液;流动相B:乙腈;等度洗脱比例:A:B=50:50;进样体积:5μL;进样时间:12min。
4)、质谱条件:
仪器:三重四级杆串联质谱仪;质谱定量方法:多重反应监测(MRM);离子源:电喷雾(ESI)负离子扫描方式;鞘气温度:375℃;鞘气流速8L/min;喷嘴电压:500V;雾化器压力:45psi;毛细管电压:3500V;干燥气温度:300℃;干燥器流速:5L/min;载气:氮气;碰撞气:氮气。总离子流及各离子通道图如图3所示。
两种代谢物及其同位素的质谱参数如表2。
表2两种代谢物及其同位素的质谱参数
Table2 Mass spectrum parameters of two metabolites and their isotopeconpounds
注:a为定量离子通道,b为定性离子通道
5)、结果:
采用标准曲线法对样本进行定量分析。以初始流动相为溶剂,配置含200ng同位素内标的溶度为0.125,0.625,1.25,2.5,6.25和12.5nmol/g Hb的系列标准溶液(AAVal-PTH和GAVal-PTH)进行分析。以标准物浓度对同位素浓度的比值作为横坐标(X),以标准物浓度峰面积对同位素内标峰面积的比值作为纵坐标(Y),得到相应线性回归方程,得出检测结果。
对于AAVal-PTH,线性方程为y=0.002515x-0.012177,相关系数R2=0.9999;
对于GAVal-PTH,线性方程为y=0.001583x+0.002810,相关系数R2=0.9999。
检出谱图参照图3。本实施例以Sprague Dawley大鼠的毒理学实验血液作为样本,最低检出限(LOD)分别为1.51pmol/g Hb(AAVal-PTH)和3.13pmol/g Hb(GAVal-PTH);最低定量限(LOQ)分别为4.78pmol/g Hb(AAVal-PTH)和6.56(GAVal-PTH)。
此方法达到了较高的精密度。选用10只SD大鼠(雌、雄各5只)的血液样本检测,其丙烯酰胺血红蛋白加合物的含量分别为7.16~12.09pmol/g Hb(AAVal-PTH)和25.70~24.43pmol/g Hb(GAVal-PTH)。
具体为:10只成年SD大鼠采用基础饲料喂养,15天后进行宰杀,获得血液样品。鼠血按照实施例1所述方法进行处理及色谱质谱分析,最终可得到2种代谢物及其同位素的各离子通道谱图,参见图3。对各通道的出峰面积进行积分,可得到各化合物对应的峰面积。同位素的峰面积所对应的浓度为已知,通过标准曲线校正计算(上述线性回归方程),可得到目标代谢物峰面积所对应的浓度,再进行单位换算,获得结果。
验证实验1、
采用文献Fennell,T.R.,Sumner,S.C.,Snyder,R.W.,Burgess,J.,Spicer,R.,Bridson,W.E.,&Friedman,M.A.(2005).Metabolism and hemoglobin adduct formationof acrylamide in humans.Toxicological Sciences,85(1),447-459.所报道的方法。
血红蛋白的清洗及分离与本发明的实施例1相同,采用方法为经典方法(Mowreret al.,1986)。其衍生剂选用异硫氰酸苯脂(Phenylisothiocyanate,PTH),将丙烯酰胺及其一级代谢产物环氧丙酰胺从血红蛋白末端脱去进行Edman降解。衍生产物选用HLB固相萃取柱(3cc,60mg)净化处理,SPE柱预先用甲醇和纯水进行活化和平衡,用甲醇进行洗脱,吹干后定容在100μL的50:50(v/v)甲醇/0.1%甲酸水溶液中。待测样液采用HPLC-API-MS系统进行仪器定量分析。
本此方法为采用SPE净化预处理的LC-MS对膳食丙烯酰胺血红蛋白加合物定量分析同步检测的经典方法。采用此方法对Fischer 344大鼠的血液样品检测中,AAVal-PTH的含量为0.16±0.01pmo/g Hb,GAVal-PTH的含量为0.12±0.02pmol/g Hb。
相比于本发明,此验证方法选用的衍生剂对丙烯酰胺血红蛋白加合物的结合效率不高,选用的固相萃取柱对目标物保留效果较差,采用HPLC-API-MS/MS系统作为检测仪器,检测耗时长且API离子源对目标物的离子化效果不佳,综上所述,此验证方法不如本发明所述方法。该验证方法作为膳食丙烯酰胺血红蛋白加合物的检测经典发表于2005年,虽然时间较久,但为该研究的高引方法,较为经典,故再此作为验证实验。
实施例2、评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法,检测对象为大鼠血液,依次进行以下步骤:
1)、制备血红蛋白干粉:
制备红细胞方法参照实施例1。
取制备好的红细胞0.8mL,转移至离心管中,加入纯水稀释红细胞5倍,涡旋震荡10min,放入-80℃冰箱速冻1.5h。之后,在37℃水浴下解冻得到溶血液。在溶血液中加入16mL的酸化异丙醇溶液,在4500rpm转速下离心5min。将暗红色的上清液转移至另外离心管中,加入16mL的乙酸乙酯,涡旋震荡8min,在4℃冰箱放置3.5h沉淀蛋白,然后4500rpm转速条件下离心8min,弃去上清液。在沉淀中加入16mL乙酸乙酯,按照以上所述步骤重复洗涤沉淀2次,再加入16mL正己烷洗涤沉淀一次,放在通风厨静置过夜,待干燥后研磨成粉,得到血红蛋白粉,在-20℃保存。
2)、衍生及净化:
取100mg的血红蛋白粉,加入3mL的甲酰胺和80μL的1mol/L NaOH溶液,再加入20μL衍生剂五氟苯基硫代异氰酸酯,涡旋混匀。在室温下震荡24h进行衍生化,然后在45℃水浴下继续衍生4h。水浴衍生结束后,在溶液中加入1mL 20%NaCl溶液,沉淀血红蛋白。加入20μL混合同位素内标(d8-AAVal-PTH和d8-GAVal-PTH,浓度均为10μg/mL),涡旋混合均匀,在转速10000rpm下离心10min,取上清液备用。
固相萃取柱选用HLB cartridge(3cc,60mg,Waters,Milford,MA)。事先用3mL甲醇活化,再用3mL纯水平衡,待溶液流干后,将上清液上样至固相萃取柱,流干后用3mL0.1%甲酸水溶液进行淋洗,去除杂质并弃去淋洗液。最后用3mL甲醇洗脱,收集洗脱液。洗脱液在40℃下氮气吹干,用初始流动相溶液(如步骤3)中所示)定容至1mL,涡旋溶解1min,经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。
3)、色谱条件:
仪器:超高效液相色谱(UHPLC);色谱柱:ACQUTITYBEH C18(2.1×150mmi.d.,1.7μm);流速:0.2mL/min;柱温:40℃;流动相A:0.1%甲酸水溶液;流动相B:乙腈;等度洗脱比例:A:B=45:55;进样体积:10μL;进样时间:10min。
4)、质谱条件:
仪器:三重四级杆串联质谱仪;质谱定量方法:多重反应监测(MRM);离子源:电喷雾(ESI)负离子扫描方式;鞘气温度:375℃;鞘气流速8L/min;喷嘴电压:500V;雾化器压力:45psi;毛细管电压:4000V;干燥气温度:300℃;干燥器流速:5L/min;载气:氮气;碰撞气:氮气。总离子流及各离子通道图如图2所示。
两种代谢物及其同位素的质谱参数同实施例1。
5)、结果:
采用标准曲线法对样本进行定量分析。配置含200ng同位素内标的溶度为0.125,0.625,1.25,2.5,6.25和12.5nmol/g Hb的系列标准溶液进行分析。以标准物浓度对同位素浓度的比值作为横坐标(X),以标准物浓度峰面积对同位素内标峰面积的比值作为纵坐标(Y),得到相应线性回归方程,得出检测结果。
线性回归方程同实施例1。
检出谱图参照图3。本实施例以Sprague Dawley大鼠的毒理学实验血液作为样本,最低检出限(LOD)分别为1.68pmol/g Hb(AAVal-PTH)和5.05pmol/g Hb(GAVal-PTH);最低定量限(LOQ)分别为5.37pmol/g Hb(AAVal-PTH)和7.55(GAVal-PTH)。此方法达到了较高的精密度。选用10只SD大鼠(雌、雄各5只)的血液样本检测,其丙烯酰胺血红蛋白加合物的含量分别为6.98~11.29pmol/g Hb(AAVal-PTH)和23.97~25.38pmol/g Hb(GAVal-PTH)。
实施例3、评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法,检测对象为人体血液,依次进行以下步骤:
1)制备血红蛋白干粉
收集人群血液在抗凝管中,制备红细胞预处理及制备血红蛋白干粉处理方法等同于实施例1的步骤1)。
2)衍生及净化
此实施例为人血样本,加入20μL混合同位素内标,d8-AAVal-PTH和d8-GAVal-PTH的浓度均为1μg/mL,其余等同于实施例1的步骤2)。
3)色谱条件
等同于实施例1的步骤3)。
4)质谱条件
等同于实施例1的步骤4)。
5)结果
采用标准曲线法对样本进行定量分析。配置含20ng同位素内标的溶度为12.5,25,62.5,125和250pmol/g Hb的系列标准溶液进行分析。以标准物浓度对同位素浓度的比值作为横坐标(X),以标准物浓度峰面积对同位素内标峰面积的比值作为纵坐标(Y),得到相应线性回归方程,得出检测结果。
对于AAVal-PTH,线性方程为y=0.075514x+0.022087,相关系数R2=0.9924;
对于GAVal-PTH,线性方程为y=0.046010x+0.012801,相关系数R2=0.9834。
检出谱图参照图3。本实施例以膳食人群的血液作为样本,最低检出限(LOD)分别为1.43pmol/g Hb(AAVal-PTH)和3.46pmol/g Hb(GAVal-PTH);最低定量限(LOQ)分别为5.12pmol/g Hb(AAVal-PTH)和10.69(GAVal-PTH)。此方法达到了较高的精密度。在5名男性非吸烟人群中进行检测,其丙烯酰胺血红蛋白加合物的含量分别为12.09~25.48pmol/gHb(AAVal-PTH)和12.29~32.60pmol/g Hb(GAVal-PTH)。
验证实验2、
采用文献Hartmann,E.C.,Boettcher,M.I.,Schettgen,T.,Fromme,H.,Drexler,H.,&Angerer,J.(2008).Hemoglobin adducts and mercapturic acid excretion ofacrylamide and glycidamide in one study population.Journal of Agriculturaland Food Chemistry,56(15),6061-6068.所报道的方法。
该方法采用GC-NCI-MS/MS作为分析检测平台。样品全血通过离心获得红细胞,利用生理盐水清洗红细胞3次。随后在红细胞中加入蒸馏水在-18℃中获得溶血液,多次加入乙酸乙酯清洗沉淀,干燥过夜后得到血红蛋白。将血红蛋白溶于甲酰胺,加入同位素内标溶液,加入氢氧化钠(NaOH)碱化溶液环境,随后加入衍生剂五氟苯基硫代异氰酸酯(PFPITC)使其发生Edman降解,过夜。然后在衍生液中加入饱和氯化钠溶液(NaCl)提高提取效率,加入乙醚提取丙烯酰胺与血红蛋白的衍生加合物,蒸发至干后将目标物溶解在甲苯中。用碳酸钠(Na2CO3)水溶液清洗甲苯相,随后将甲苯蒸发,加入1%的硫酸丙酮溶液使环氧丙酰胺加合物过夜丙酮化。之后将酸溶液中和,加入甲苯清洗溶液,蒸发至干,待测物重溶于甲苯后上机分析。
本方法色谱仪器选用气相色谱(GC),质谱离子源选用化学离子源(NCI),对人群样本血液中的的丙烯酰胺血红蛋白加合物的检测实现了同步定量分析,达到了较高的灵敏度,可达到最低检出限为4pmol/g Hb(AAVal、GAVal)。在91名非吸烟的欧洲人群样本中,AAVal含量中值为30pmol/g Hb(15~71pmol/g Hb),GAVal含量中值为34pmol/g Hb(14~66pmol/g Hb)。本发明相比于该方法,检测精确度都非常高,本发明方法精确度稍高于验证方法。本发明优势在于简单便捷的血液预处理以及样品前处理,大大缩短了样品分析时间;采用超高效液相色谱,提高了分析效率;利用电喷雾离子源(ESI),对目标加合物提高了离子化效率和仪器响应效果。该方法发表于2008年,为欧洲对丙烯酰胺体内中长期血液代谢评价的主要方法,故在此作为验证方法。
实施例4、评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法,检测对象为人体血液,依次进行以下步骤:
1)制备血红蛋白干粉
收集人群血液在抗凝管中,制备红细胞预处理及制备血红蛋白干粉处理方法等同于实施例2的步骤1)。
2)衍生及净化
此实施例为人血样本,加入20μL混合同位素内标,d8-AAVal-PTH和d8-GAVal-PTH的浓度均为1μg/mL,其余等同于实施例2的步骤2)。
3)色谱条件
等同于实施例2的步骤3)。
4)质谱条件
等同于实施例2的步骤4)。
5)结果
采用标准曲线法对样本进行定量分析。配置含20ng同位素内标的溶度为12.5,25,62.5,125和250pmol/g Hb的系列标准溶液进行分析。以标准物浓度对同位素浓度的比值作为横坐标(X),以标准物浓度峰面积对同位素内标峰面积的比值作为纵坐标(Y),得到相应线性回归方程,得出检测结果。
线性回归方程同实施例3。
检出谱图参照图3。本实施例以膳食人群的血液作为样本,最低检出限(LOD)分别为2.13pmol/g Hb(AAVal-PTH)和4.76pmol/g Hb(GAVal-PTH);最低定量限(LOQ)分别为6.87pmol/g Hb(AAVal-PTH)和16.82(GAVal-PTH)。此方法达到了较高的精密度。在5名男性非吸烟人群中进行检测,其丙烯酰胺血红蛋白加合物的含量分别为15.93~23.95pmol/gHb(AAVal-PTH)和15.86~30.78pmol/g Hb(GAVal-PTH)。
对比实验一、
采用SD大鼠血液作为对比例待测样本,按照实施例1所述处理、检测和定量步骤进行测定目标物含量。选用异硫氰酸苯酯(PITC)取代五氟苯基硫代异氰酸苯酯(PFPITC)作为衍生剂,作为条件对比。6只SD大鼠的丙烯酰胺加合物的含量分别为4.4~6.1pmol/g Hb(AAVal-PTH)和4.1~11.2pmol/g Hb(GAVal-PTH)。该方法的检出限为3.5~5.4pmol/g Hb;定量限为5.6~9.7pmol/g Hb。从大鼠数据上来看,该方法测得数据与实施例1测得数据较为接近。两种衍生剂结构类似,区别在于PFPITC比PITC多5个氟原子,具有更大的空间位阻,对血红蛋白末端的丙烯酰胺加合物有更高效的选择结合性。从检测限和定量限来说,其方法的检出限和定量限也高于本发明,且检出限和定量限太接近样本所含剂量,故此对比例所采用衍生剂不如本发明。
对比实验二、
当色谱条件中,液相色谱改为气相色谱;色谱柱为Fused-silica capillarycolumn(30m,0.32mm i.d.1.0um;DB-5MS;J&W Scientific);进样温度升温程序为:100-300℃,150℃/min,恒温300℃18min;载气为氦气;柱温程序为:1min 100℃,20℃/min到240℃,10℃/min到300℃并保持7min。其余条件保持不变。
采用人体血液作为检测目标,按照实施例3进行处理,并采用以上色谱条件作为检测条件,按照实施例3的质谱条件和定量步骤。5名非吸烟人群进行检测,其丙烯酰胺血红蛋白加合物的含量分别为21~33pmol/g Hb(AAVal-PTH)和20~32pmol/g Hb(GAVal-PTH)。此方法的检出限为5.8~9.4pmol/g Hb;定量限为12.7~19.8pmol/g Hb。从人群数据上来看,该方法所测数据相比本发明测得数据偏高,其方法的检出限和定量限也高于本发明,故此对比例所采用条件不如本发明。
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1.评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法,其特征是包括以下步骤:
1)、制备血红蛋白干粉:
取0.5~1mL的红细胞加入1~9体积倍的纯水稀释红细胞,涡旋震荡后于-80±5℃速冻0.5~3h;之后,在20~55℃水浴下解冻得到溶血液;
在溶血液中加入15~30mL酸化异丙醇溶液,于3500~6000rpm离心2~15min;在离心所得上清液中加入10~30mL乙酸乙酯,涡旋震荡后于4±0.5℃放置0.5~4h从而沉淀蛋白;接着于3500~6000rpm离心2~15min,在离心所得的沉淀中重复上述加入乙酸乙酯后涡旋震荡、沉淀蛋白和离心1~3次;最终离心所得的沉淀用正己烷洗涤后干燥,得血红蛋白粉;
2)、衍生及净化:
取20~100mg的血红蛋白粉加入0.8~3mL的甲酰胺和20~100μL的1mol/L NaOH溶液,再加入5~30μL的衍生剂,涡旋混匀;在室温下震荡12~24h进行衍生化,然后在30~60℃水浴继续衍生0.5~6h;
水浴衍生结束后,再加入0.2~2mL的20%NaCl溶液以及20μL同位素内标d8-AAVal-PTH和d8-GAVal-PTH的混合液,涡旋混合均匀,在转速8000~12000rpm下离心2~15min,取上清液;
将固相萃取柱活化、平衡后,取上清液上样,先用2~3mL淋洗液淋洗,然后2~3mL甲醇洗脱,收集洗脱液;洗脱液在40℃下氮气吹干,用流动相溶液定容至1mL,涡旋溶解1min,经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析;
所述淋洗液为体积浓度5%~10%甲醇水溶液;
3)、色谱条件:
仪器:超高效液相色谱;流速:0.2mL/min;柱温:40℃;流动相A:0~1%甲酸水溶液;流动相B:乙腈;等度洗脱比例:A:B=40:60~60:40;进样体积:5~10μL;进样时间:10~15min;
所述色谱柱种类及规格为ACQUTITYHSS T3或ACQUTITYBEH C18;
4)、质谱条件:
仪器:三重四级杆串联质谱仪;质谱定量方法:多重反应监测;离子源:电喷雾负离子扫描方式;鞘气温度:375℃;鞘气流速8L/min;喷嘴电压:500V;雾化器压力:45psi;毛细管电压:3000~4000V;干燥气温度:300℃;干燥器流速:5L/min;载气:氮气;碰撞气:氮气;
两种代谢物及其同位素的质谱参数
Table1 Mass spectrum parameters of two metabolites and their isotopeconpounds
注:a为定量离子通道,b为定性离子通道
5)、结果:
利用上述液相-质谱联用方法,通过标准曲线法对样品进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法,其特征是:所述步骤1)中红细胞的制备方法为:将装在抗凝管中的全血在3500±rpm下离心5±0.5min,将上清液和中间层移出,在下层中加入PBS溶液或生理盐水进行清洗、离心,得到红细胞。
3.根据权利要求1所述的评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法,其特征是:所述步骤2)中的衍生剂为五氟苯基异硫氰酸酯。
4.根据权利要求3所述的评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法,其特征是所述步骤2)中:
当待测样品是人血时,混合同位素内标为d8-AAVal-PTH和d8-GAVal-PTH,浓度均为1μg/mL;
当待测样品是鼠血,混合同位素内标为d8-AAVal-PTH和d8-GAVal-PTH,浓度均为10μg/mL。
5.根据权利要求4所述的评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法,其特征是所述步骤2)中:
所述固相萃取柱为SupelcleanTM LC-18cartridge、HLB cartridge、ExtrelutTMNT cartridge。
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