CN113599514A - 一种用于比格犬哮喘模型造模的组合物和哮喘模型造模方法 - Google Patents
一种用于比格犬哮喘模型造模的组合物和哮喘模型造模方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于豚草抗原及屋尘螨抗原构建比格犬哮喘动物模型的方法。本发明提供了一种含有豚草粉抗原提取液和屋尘螨抗原提取液的用于比格犬哮喘模型造模的组合物。并基于该组合物构建了雾化结合注射的比格犬哮喘模型构建方法。本发明的造模方法相对容易操作、造模成功率高。更重要的是本方法构建的动物模型,其哮喘症状明显且可长期维持,具有非常好的优势和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于疾病动物模型技术领域,具体涉及用于比格犬哮喘模型造模的组合物和哮喘模型造模方法。
背景技术
哮喘是一种常见的、慢性呼吸系统疾病,在不同的国家中占的比例从1%~18%不等。过敏原暴露诱发的气道高反应性和慢性气道炎症是其重要的生理和病理特征,因此,通过使用过敏原(如卵白蛋白、屋尘螨、豚草花粉)对动物进行致敏和激发是目前最常用的哮喘造模方法。目前已有多种用于哮喘研究的临床前动物模型,其中以使用小鼠、豚鼠建立的小动物模型成本低、,广泛应用于哮喘发病机制和治疗药物研究;也有使用比格犬、猴等建立的大动物模型,其中比格犬体型适中,繁育较快,性情温顺,是最常用的大型实验动物,目前已有使用豚草花粉抗原致敏和激发建立的比格犬哮喘模型,可诱导比格犬形成气道炎症浸润和气道高反应性等典型特征。
但是,现有的动物哮喘模型症状维持时间短,有自愈趋势,难以观察长期治疗效应;并且由于动物体型较小,难以用于呼吸介入等非药物性治疗哮喘技术的临床前研究。研究报道(http://dx.doi.org/10.1080/08958370304474)称现有的比格犬哮喘模型则存在造模成功率低(50-60%),造模周期长(需8个月时间),气道高反应性改变幅度低(3mg/ml组胺刺激下气道阻力仅增加约1倍)的缺点,相应也导致该动物模型的成本过高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提高比格犬哮喘模型的造模成功率。。本发明的造模方法相对容易操作、造模成功率高。构建的动物模型,其哮喘症状明显且可长期维持。
本发明的目的是提供一种用于比格犬哮喘模型造模的组合物。
本发明的另一目的是提供一种用于比格犬哮喘模型造模的试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种构建比格犬哮喘模型的方法。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种用于比格犬哮喘模型造模的组合物,含有豚草花粉抗原提取液和尘螨抗原提取液,其中豚草花粉抗原提取液的总蛋白浓度不低于0.1mg/mL,尘螨抗原提取液的总蛋白浓度不低于0.05mg/mL。
优选地,所述豚草花粉抗原提取液的总蛋白浓度不低于0.5mg/mL,尘螨抗原提取液的总蛋白浓度不低于0.1mg/mL。
具体地,作为优选的可选择实施方案,所述的豚草花粉抗原提取液的总蛋白浓度为0.5~10mg/mL,尘螨抗原提取液的总蛋白浓度为0.1~5mg/mL。
更优选地,所述的豚草花粉抗原提取液的总蛋白浓度为0.5~5mg/mL,尘螨抗原提取液的总蛋白浓度为0.1~1.5mg/mL。
一种用于构建比格犬哮喘模型的试剂盒,包含:
(1)注射用抗原液:包含豚草花粉抗原提取液、尘螨抗原提取液和明矾佐剂,其中豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.25~3mg/mL,尘螨抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.08~0.12mg/mL,明矾佐剂占注射用抗原液的体积比为30%~50%;
(2)豚草花粉雾化液:包含豚草花粉抗原提取液,其总蛋白工作浓度为0.25~5mg/mL;
(3)混合雾化液:包含豚草花粉抗原提取液和尘螨抗原提取液,其中豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.25~5mg/mL;尘螨抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.08~0.15mg/mL。
作为具体的实施方案,优选地,所述的注射用抗原液包括腹腔注射用抗原液和皮下注射用抗原液两种:
其中,腹腔注射用抗原液中:豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为2~3mg/mL,尘螨抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.08~0.2mg/mL,明矾佐剂占腹腔注射用抗原液的体积比为30%~50%;
皮下注射用抗原液中,豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.4~0.6mg/mL,尘螨抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.08~0.2mg/mL,明矾佐剂占皮下注射用抗原液的体积比为30%~50%。
另外优选地,所述豚草花粉雾化液中,豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为2~3mg/mL。
优选地,所述混合雾化液中,豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为2~3mg/mL;尘螨抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.08~0.15mg/mL。
具体更优选地,所述用于构建比格犬哮喘模型的试剂盒,包括:
(1)腹腔注射用抗原液:包含豚草花粉抗原提取液、尘螨抗原提取液和明矾佐剂,其中豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为2~3mg/mL,尘螨抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.08~0.2mg/mL,明矾佐剂占注射用抗原液的体积比为30%~50%;
(2)皮下注射用抗原液:包含豚草花粉抗原提取液、尘螨抗原提取液和明矾佐剂,其中豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.4~0.6mg/mL,尘螨抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.08~0.2mg/mL,明矾佐剂占注射用抗原液的体积比为30%~50%;
(3)豚草花粉雾化液:包含豚草花粉抗原提取液和生理盐水,所述豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为2~3mg/mL。
(4)混合雾化液:包含豚草花粉抗原提取液、尘螨抗原提取液和生理盐水,所述豚草花粉抗原提取液的总蛋白浓度为2~3mg/mL;尘螨抗原提取液的总蛋白浓度为0.08~0.15mg/mL。
最优选地,所述用于构建比格犬哮喘模型的试剂盒,包括:
(1)腹腔注射用抗原液:由总蛋白浓度为5mg/mL的豚草花粉抗原提取液、明矾佐剂及总蛋白浓度为1.2mg/mL的尘螨抗原提取液组成;且三者的体积比为6:5:1;
(2)皮下注射用抗原液:由总蛋白浓度为1mg/mL的豚草花粉抗原提取液、明矾佐剂及总蛋白浓度为1.2mg/mL的尘螨抗原提取液组成;且三者的体积比为6:5:1;
(3)混合雾化液:由总蛋白浓度为5mg/mL的豚草花粉抗原提取液、总蛋白浓度为1mg/mL的尘螨抗原提取液及生理盐水组成;且三者的体积比为3.75:0.9:2.85;
(4)豚草花粉雾化液:由总蛋白浓度为5mg/mL的豚草花粉抗原提取液和生理盐水组成,且两者的体积比为1:1。
另外,本发明还提供了一种构建比格犬哮喘模型的方法,包括如下步骤:
(1)在比格犬出生后24小时内,腹腔注射上述的腹腔注射用抗原液;
(2)在比格犬出生后1、4、8周时,各皮下注射一次上述的皮下注射用抗原液;
(3)同时,在比格犬出生后1~12周期间,利用上述的述的豚草花粉雾化液让比格犬吸入,每周2~7次;
且同时,在第1、2、3、4、8、12周期间,利用上述的所述的混合雾化液替代豚草花粉雾化液让比格犬雾化吸入一次;
(4)在比格犬出生后13~36周期间,利用上述的豚草花粉雾化液后让比格犬吸入,每周一次。
其中,具体地,步骤(1)所述腹腔注射用抗原液注射剂量为150μL~250μL;步骤(2)所述的皮下注射用抗原液的注射剂量为80μL~250μL。
其中,具体地,步骤(3)和步骤(4)中,豚草花粉雾化液每次吸入剂量为6~8mL,混合雾化液每次吸入剂量为6~8mL。
本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种用于比格犬哮喘模型造模的组合物,并提供了利用其构建的造模方法,容易操作。。而且哮喘模型造模成功率高、哮喘症状明显,且可长期维持。
附图说明
图1为比格犬雾化吸入抗原液的场景。
图2为比格犬第36周为气道阻力最大值变化倍数-乙酰甲胆碱曲线。
图3为比格犬停止激发12周的气道阻力最大值变化倍数-乙酰甲胆碱曲线。
图4为每日雾化组比格犬病理切片图,可见气管粘膜下明显炎症细胞浸润
图5为隔日雾化组比格犬病理切片图,可见气管粘膜杯状细胞增生。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1用于构建哮喘模型的试剂盒
1、豚草花粉抗原提取液的制备:
将1g豚草花粉与10mL Tris-NaCl溶液置于50ml离心管中,4℃环境下使用摇床慢速震荡48小时。震荡完成后,在4℃1500G离心60分钟,收集上清液。使用Bradford蛋白浓度测量试剂盒测量上清液蛋白浓度后,稀释至总蛋白浓度为5mg/mL,分装为1mL/支,-80℃下保存。
2、尘螨抗原提取液的制备:
将1g尘螨与20mL PBS溶液置于50ml离心管中,4℃环境下使用摇床慢速震荡8小时。震荡完成后,在4℃6000rpm离心30分钟,收集上清液并使用0.22μm滤器过滤。使用Bradford蛋白浓度测量试剂盒测量上清液蛋白浓度后,稀释至总蛋白浓度为1.2mg/mL,分装为1mL/支,-80℃下保存。
3、用于构建哮喘模型的试剂盒,包含腹腔注射用抗原液、皮下注射用抗原液、混合雾化液和豚草花粉雾化液:
(1)腹腔注射用抗原液的制备:将5mg/mL豚草花粉抗原提取液600μL、500μL明矾佐剂及1.2mg/mL尘螨抗原提取液100μL置于EP管中,充分混匀后置于摇床在40℃环境下震荡30分钟。
(2)皮下注射用抗原液的制备:将稀释为1mg/mL豚草花粉抗原提取液300μl、250μl明矾佐剂及1.2mg/mL尘螨抗原提取液50μl置于EP管中,充分混匀后置于摇床在40℃环境下震荡30分钟。
(3)混合雾化液的制备:5mg/mL豚草花粉抗原提取液3.75mL、1mg/mL尘螨抗原提取液0.9mL及生理盐水2.85mL置于离心管,充分混匀。
(4)豚草花粉雾化液的制备:5mg/mL豚草花粉抗原提取液3.75mL、生理盐水3.75mL置于离心管,充分混匀。
实施例2哮喘模型构建
1、实验分组
选取健康新生比格犬6只,随机分为正常对照组、每日雾化组及隔日雾化组(n=2)。
2、哮喘模型构建时间为48周,具体操作如下:
正常对照组比格犬在这48周内不做任何处理。每日雾化组及隔日雾化组处理如下:
(1)每日雾化组及隔日雾化组的比格犬在出生后24小时内,各腹腔注射200μL实施例1的腹腔注射用抗原液;
(2)在出生后的第1、4、8周时,各皮下注射100μL实施例1的皮下注射用抗原液,进行致敏;
(3)同时,每日雾化组比格犬在出生后第1-12周期间,每天1次使用实施例1的豚草花粉雾化液进行激发,每次雾化吸入半小时;
而隔日雾化组的比格犬在出生后第1-12周期间,每周2次使用实施例1的雾化用豚草花粉雾化液进行激发,每次雾化吸入半小时;
而且,每日雾化组和隔日雾化组的比格犬均在第1、2、3、4、8、12周期间,利用实施例1的混合雾化液替代豚草花粉雾化液一次,让比格犬雾化吸入;
(4)12周后,即在比格犬出生后13~36周期间,每周用豚草花粉雾化液激发每日雾化组和隔日雾化组的比格犬一次,持续至36周龄。
上述方法中,雾化激化时将清醒比格犬放入1m*1m*1m的雾化箱中,箱顶设置雾化输入口,四周设置多个通气孔(图1)。使用雾化机将抗原液雾化后,从雾化输入口充入箱中,箱中的比格犬自主吸入雾化物从而实现抗原吸入激发。
每日雾化组及隔日雾化组完成36周的激发后,停止雾化激发12周。
实施例3气道炎症检测、气道反应性检测和肺脏病理切片检测。
在激发36周及停止激发后12周分别采集正常对照组、每日雾化组及隔日雾化组的比格犬支气管肺泡灌洗液,分离细胞制备细胞涂片,进行HE染色,显微镜下对BALF灌洗液的白细胞进行分类计数,计算巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞比例。
第36周,所有比格犬各进行1次乙酰甲胆碱(Mch)激发试验以检测气道反应性。首先以肌肉注射3%戊巴比妥钠0.5mL/kg+速眠新0.02mL/kg麻醉比格犬。仰卧位固定动物后行气管插管及食道插管,并连接气体流速传感器、差压传感器和biopac生理记录仪,激发试验期间,比格犬经气管插管依次雾化吸入PBS、0.1mg/mL、0.3mg/mL、1mg/mL、3mg/mL Mch各10个呼吸,每个激发浓度完成吸入后立即记录5min内的呼吸流速和跨肺压(食道压近似代替跨肺压),最后使用生理记录仪自带软件功能计算气道阻力,并以5min内的最大气道阻力值表征该激发浓度对应的气道反应强度。
完成上述所有检测后,对所有犬只行安乐死,取出肺脏进行病理切片检测。
结果:正常对照组,每日雾化组及隔日雾化组比格犬第36周支气管肺泡灌洗液细胞分类计数结果如表1所示,正常对照组,每日雾化组及隔日雾化组比格犬停止激发12周后支气管肺泡灌洗液细胞分类计数结果如表2所示。支气管肺泡灌洗液细胞分类计数结果表明,造模后比格犬气道为中性粒细胞及嗜酸性粒细胞性炎症,表明此造模方法所得哮喘模型为混合型哮喘。
表1第36周支气管肺泡灌洗液细胞分类计数结果
NEU% | MAC% | EOS% | LYM% | |
正常对照1 | 41 | 58 | 0.25 | 0.75 |
正常对照2 | 42.75 | 54.5 | 0.25 | 2.5 |
隔日雾化1 | 58 | 35.5 | 3.75 | 2.75 |
隔日雾化2 | 75 | 19 | 3 | 3 |
每日雾化1 | 61 | 29 | 1.5 | 8.5 |
每日雾化2 | 67.5 | 28 | 3 | 1.5 |
表2停止激发12周后支气管肺泡灌洗液细胞分类计数结果
NEU% | MAC% | EOS% | LYM% | |
正常对照1 | 43.25 | 56 | 0 | 0.75 |
正常对照2 | 42.75 | 54 | 0.25 | 3 |
隔日雾化1 | 55 | 38.5 | 4 | 2.5 |
隔日雾化2 | 42.5 | 36.75 | 8.25 | 12.5 |
每日雾化1 | 59.5 | 20 | 15.25 | 5.25 |
每日雾化2 | 49 | 39.5 | 7.25 | 4.25 |
通过肺功能检测可知(图2、图3),相较于正常对照组,每日雾化组及隔日雾化组的哮喘造模比格犬整体气道阻力明显上升的同时,在小剂量Mch刺激下也表现出非常明显气道阻力增加趋势,仅需0.1mg/ml Mch刺激即可使气道阻力上升200%以上,气道反应性明显升高。
肺组织病理切片结果表明,每日雾化组及隔日雾化组的比格犬气道组织存在明显炎症细胞浸润现象(图4),与肺泡灌洗液结果相吻合,同时气管上皮可见杯状细胞增生(图5)。
上述结果表明激发36周完成后,每日雾化组及隔日雾化组的比格犬即表现出明显哮喘指征,同时停止激发3个月,哮喘相关指标仍可保持,并有进一步加重的趋势。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于比格犬哮喘模型造模的组合物,其特征在于,含有豚草花粉抗原提取液和尘螨抗原提取液,其中豚草花粉抗原提取液的总蛋白浓度不低于0.1mg/mL,尘螨抗原提取液的总蛋白浓度不低于0.05mg/mL。
2.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述豚草花粉抗原提取液的总蛋白浓度不低于0.5mg/mL,尘螨抗原提取液的总蛋白浓度不低于0.1mg/mL。
3.一种用于构建比格犬哮喘模型的试剂盒,其特征在于,包含:
(1)注射用抗原液:包含豚草花粉抗原提取液、尘螨抗原提取液和明矾佐剂,其中豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.25~3mg/mL,尘螨抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.08~0.12mg/mL,明矾佐剂占注射用抗原液的体积比为30%~50%;
(2)豚草花粉雾化液:包含豚草花粉抗原提取液,其总蛋白工作浓度为0.25~5mg/mL;
(3)混合雾化液:包含豚草花粉抗原提取液和尘螨抗原提取液,其中豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.25~5mg/mL;尘螨抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.08~0.15mg/mL。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述的注射用抗原液包括腹腔注射用抗原液和皮下注射用抗原液两种,
其中,腹腔注射用抗原液中:豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为2~3mg/mL,尘螨抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.08~0.2mg/mL,明矾佐剂占腹腔注射用抗原液的体积比为30%~50%;
皮下注射用抗原液中,豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.4~0.6mg/mL,尘螨抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.08~0.2mg/mL,明矾佐剂占皮下注射用抗原液的体积比为30%~50%。
5.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述豚草花粉雾化液中,豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为2~3mg/mL。
6.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,混合雾化液中,豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为2~3mg/mL;尘螨抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.08~0.15mg/mL。
7.如权利要求3~6任一所述的试剂盒,其特征在于,包括:
(1)腹腔注射用抗原液:包含豚草花粉抗原提取液、尘螨抗原提取液和明矾佐剂,其中豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为2~3mg/mL,尘螨抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.08~0.2mg/mL,明矾佐剂占注射用抗原液的体积比为30%~50%;
(2)皮下注射用抗原液:包含豚草花粉抗原提取液、尘螨抗原提取液和明矾佐剂,其中豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.4~0.6mg/mL,尘螨抗原提取液的总蛋白工作浓度为0.08~0.2mg/mL,明矾佐剂占注射用抗原液的体积比为30%~50%;
(3)豚草花粉雾化液:包含豚草花粉抗原提取液和生理盐水,所述豚草花粉抗原提取液的总蛋白工作浓度为2~3mg/mL。
(4)混合雾化液:包含豚草花粉抗原提取液、尘螨抗原提取液和生理盐水,所述豚草花粉抗原提取液的总蛋白浓度为2~3mg/mL;尘螨抗原提取液的总蛋白浓度为0.08~0.15mg/mL。
8.一种构建比格犬哮喘模型的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)在比格犬出生后24小时内,腹腔注射权利要求4~5中任一所述的腹腔注射用抗原液;
(2)在比格犬出生后1、4、8周时,各皮下注射一次权利要求4~5中任一所述的皮下注射用抗原液;
(3)同时,在比格犬出生后1~12周期间,利用权利要求3~7中任一所述的豚草花粉雾化液让比格犬雾化吸入,每周2~7次;
且同时,在第1、2、3、4、8、12周期间,利用权利要求3~7中任一所述的混合雾化液替代豚草花粉雾化液一次;
(4)在比格犬出生后13~36周期间,利用权利要求3~7中任一所述的豚草花粉雾化液后让比格犬雾化吸入,每周一次。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述腹腔注射用抗原液注射剂量为150μL~250μL;步骤(2)所述的皮下注射用抗原液的注射剂量为80~120μL。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,步骤(3)和步骤(4)中,豚草花粉雾化液每次吸入剂量为6~8mL,混合雾化液每次吸入剂量为6~8mL。
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