CN113892461A - 小麦面筋蛋白经皮致敏小鼠模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物医学领域，具体涉及本发明提供一种小麦面筋蛋白致敏的小鼠动物模型的构建方法。包括以下步骤，1、小麦面筋蛋白的溶解：采用冰水超声的方法处理小麦面筋蛋白2‑2.5h，超声功率为100W，40KHz。2、将刚离乳的Balb/c小鼠(3周龄)无植物蛋白饲料适应性喂养3周，在21、28、35、42天对小鼠经皮致敏500μl小麦面筋蛋白致敏液致敏小鼠。本发明采用小麦面筋蛋白作为致敏蛋白，冰浴条件下采用超声处理促进小麦面筋蛋白的溶解，通过皮肤吸收途径，成功构建小麦蛋白致敏小鼠模型。该模型能够有效的评价含小麦蛋白组分食物及化妆品的致敏性，为小麦蛋白的致敏机制研究提供特异性的动物模型。

Description

小麦面筋蛋白经皮致敏小鼠模型的构建方法

技术领域

本发明涉及动物医学领域，特别涉及小麦面筋蛋白经皮致敏小鼠模型的构建方法。

背景技术

过敏作为一种致敏原导致的免疫介导疾病，受到复杂的多因素影响，其全球发病率日益升高。小麦是我国北方主食，也是世界卫生组织认定的8大致敏原之一，能够引起小麦依赖运动激发过敏症、面包师哮喘、鼻炎、荨麻疹等过敏性疾病。

要研究小麦蛋白引起的过敏疾病的发病机制，寻找更有效的治疗方法，动物模型是重要的工具。而小鼠由于肺部结构、组织学和功能特征与人类相似，饲养费用低，便于发展转基因模型等特点，成为最常用的模型研究对象。一个典型的致敏小鼠模型应该能够模拟人类过敏的主要免疫学特征：血清过敏原特异性IgE显著增加，血清中组胺含量显著升高，Th2类细胞因子(如IL-4，IL-13)的表达升高，Th1类细胞因子(如IFN-γ)的表达降低等。

小麦面筋蛋白致敏小鼠模型的构建通常包括致敏和激发两部分。常用的致敏的方式有腹腔注射、灌胃致敏等，激发的方式主要为大剂量灌胃、腹腔注射等。不同的致敏和激发方式会在一定程度上影响小鼠的免疫反应。

因此，提供一种能够很好模拟小麦蛋白引起的人类过敏典型特点的小鼠模型的构建方法，具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，实验中发现：经皮致敏方式同样能够成功小鼠过敏模型，该模型与腹腔注射方式和灌胃方式构建的致敏模型相比具有类似的炎症反应和血清学变化，可以较好的模拟人类小麦过敏的典型特点特别是经皮肤接触引起的小麦致敏。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了小麦面筋蛋白经皮致敏动物模型的构建方法，取小麦面筋蛋白经皮致敏，构建动物模型。

在本发明的一些具体实施方案中，所述构建方法包括如下步骤：

步骤1：取小麦面筋蛋白溶于缓冲液中，冰水超声，获得小麦面筋蛋白溶解液；再与氢氧化铝佐剂混合乳化，制得小麦面筋蛋白致敏液；

步骤2：将刚离乳的Balb/c小鼠(3周龄)无植物蛋白饲料适应性喂养3周，于21、28、35、42天分别对小鼠经皮致敏500μl所述小麦面筋蛋白致敏液致敏小鼠；

步骤3：激发；第56天给每只小鼠灌胃含有10～15mg小麦面筋蛋白的缓冲液。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中，以mg/ml计，所述小麦面筋蛋白与所述缓冲液的重量体积比为10:1。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液的pH值为7.4。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中，所述超声的功率为100W，40KHz，所述超声的时间为2～2.5h。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述小麦面筋蛋白溶解液与氢氧化铝佐剂按照10:1混合乳化。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中，所述小麦面筋蛋白的制备方法包括如下步骤：

步骤A：以g/ml计，取面粉与水按照10:6的重量体积比和成面团；

步骤B：20±5℃下，将面团浸入500ml的0.5mol/L NaCl溶液中浸泡1h，浸泡期间搅拌不少于1次；

步骤C：搅拌面团，将包含淀粉的NaCl溶液倒出，保留面筋组分，每次加入1L0.5mol/L NaCl溶液洗涤面筋，所述洗涤的次数不少于5次；

步骤D：采用蒸馏水洗涤面筋，然后加入淀粉酶，在55℃下反应10min；所述淀粉酶的酶活为40000u/g；所述淀粉酶的加入量为0.5g/100g面粉；

步骤E：采用蒸馏水洗涤面筋至少3次，得到小麦面筋蛋白，冻干，粉碎，于4℃保存。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述小麦面筋蛋白致敏液中，所述小麦面筋蛋白的浓度为2.18～2.72mg/ml。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述经皮给药具体为：致敏前刮净小鼠腹部，用砂纸摩擦小鼠腹部皮肤，使小鼠腹部变红，但未出血，取500μL所述小麦面筋蛋白致敏液均匀涂抹于小鼠腹部，用弹性纱布包裹，放入笼中1h，然后拆除纱布，用无菌水冲洗给药区域。

在本发明的一些具体实施方案中，所述砂纸的目数为400目。

本发明提供一种小麦面筋蛋白致敏的小鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤，1、小麦面筋蛋白的溶解：采用冰水超声的方法处理小麦面筋蛋白2-2.5h，超声功率为100W，40KHz。2、将刚离乳的Balb/c小鼠(3周龄)无植物蛋白饲料适应性喂养3周，在21、28、35、42天对小鼠经皮致敏500μl小麦面筋蛋白致敏液致敏小鼠。本发明采用小麦面筋蛋白作为致敏蛋白，冰浴条件下采用超声处理促进小麦面筋蛋白的溶解，通过皮肤吸收途径，成功构建小麦蛋白致敏小鼠模型。该模型能够有效的评价含小麦蛋白组分食物及化妆品的致敏性，为小麦蛋白的致敏机制研究提供特异性的动物模型。

本模型在建立过程中，通过对小鼠经皮肤致敏小麦致敏原，灌胃小麦致敏蛋白激发，成功构建了小麦面筋蛋白经皮肤致敏的小鼠过敏模型。模型小鼠可以很好的模拟人类小麦蛋白质致敏引起的过敏疾病的典型特征。这个模型可以为我们研究人类小麦过敏的发生机制及探索新的治疗方法提供良好平台。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1a示对照组实验流程图；

图1b示模型组实验流程图；

图2示小鼠过敏临床症状评分(ctrl-对照组，td-经皮致敏，ip-腹腔注射，ig-灌胃致敏)；

图3示小鼠血清总IgE含量测定(*代表两组差异显著，p<0.05；**代表两组极显著差异，p<0.01；***代表两组极其差异显著，p<0.001)；

图4示小鼠血清小麦蛋白特异性IgE含量测定；

图5示小鼠血清组胺含量测定；

图6示小鼠血清中IL-4(Th2型细胞因子)含量测定；

图7示小鼠血清中IL-13(Th2型细胞因子)含量测定；

图8示小鼠血清中IFN-γ(Th1型细胞因子)含量测定；

图9a示对照组100倍镜下小鼠结肠切片观察；

图9b示对照组100倍镜下小鼠结肠切片观察；

图10a示经皮致敏模型组100倍镜下小鼠结肠切片观察；

图10b示经皮致敏模型组100倍镜下小鼠结肠切片观察。

具体实施方式

本发明公开了小麦面筋蛋白经皮致敏小鼠模型的构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明采用的技术方案是：

提供一种小麦面筋蛋白经皮致敏小鼠模型的构建方法，包括步骤：

(1)小麦面筋蛋白溶液制备：1ml pH 7.4的PBS缓冲液中加入10mg小麦面筋蛋白，采用冰水超声的方法处理小麦面筋蛋白2～2.5h，超声功率为100W，40KHz；

(2)致敏：将刚离乳的Balb/c小鼠(3周龄)无植物蛋白饲料适应性喂养3周，然后在21、28、35、42天经皮给药500μl致敏小鼠，经皮给药操作为每次致敏前用小鼠剃毛器刮净小鼠腹部，用400目砂纸摩擦小鼠腹部皮肤，使小鼠腹部变红，但未出血，取500μL小麦面筋蛋白致敏液均匀涂抹于小鼠腹部，用弹性纱布包裹，放入笼中1h，然后拆除纱布，用无菌水冲洗给药区域；

(3)激发：第56天给每只小鼠灌胃10-15mg小麦面筋蛋白。

同一种致敏原，经不同途径引起的致敏会导致不同程度的免疫反应。本发明的对照实例，分别为利用小麦面筋蛋白溶液通过灌胃致敏和腹腔注射致敏方式构建的小鼠模型。根据本发明致敏效果比较，发现三种致敏方式均能够引起小鼠的过敏，出现过敏表观症状、血清中IgE含量及组胺含量升高、Th2型细胞因子升高、Th2型细胞因子降低，肠道病理切片显示这三种方式致敏均能造成肠道损伤。

综上所述，本发明采用小麦面筋蛋白溶液经皮致敏可以成功构建小鼠致敏模型，可以模拟小麦蛋白经由皮肤途径诱导致敏所引起过敏典型特征。

进一步的，根据本发明的优选实施例1，步骤(2)中，用于致敏的小麦面筋蛋白致敏液配制方法是：取适量步骤(1)制得的小面面筋蛋白溶液，按10:1的比例加入氢氧化铝佐剂(即10ml蛋白质溶液加入1ml氢氧化铝佐剂)，乳化。

步骤(3)中，灌胃激发时用的小麦面筋蛋白混合液配置方法是：用200mg冻干小麦面筋蛋白与10mlpH7.4的PBS缓冲液中，充分搅拌使之混合均匀，每次灌胃前需再将其摇均匀。

所述小麦面筋蛋白由下列方法制备：

(1)称取100g面粉，加入60ml蒸馏水和成面团；

(2)浸泡：室温下，将面团浸入500ml的0.5mol/L NaCl溶液中浸泡1小时，浸泡期间搅拌数次；

(3)0.5mol/L NaCl溶液洗涤：搅拌面团，将包含淀粉的NaCl溶液倒出，保留面筋组分，每次加入1L 0.5mol/L NaCl溶液洗涤面筋5次；

(4)蒸馏水洗涤：用蒸馏水洗涤面筋，然后加入淀粉酶，在55℃下反应10min；

(5)冻干：用蒸馏水洗涤面筋3次，得到小麦面筋蛋白，冻干后，用粉碎机粉碎，保存在4℃条件下备用。

本模型在建立过程中，通过对小鼠经皮肤致敏小麦致敏原，灌胃小麦致敏蛋白激发，成功构建了小麦面筋蛋白经皮肤致敏的小鼠过敏模型。模型小鼠可以很好的模拟人类小麦蛋白质致敏引起的过敏疾病的典型特征。这个模型可以为我们研究人类小麦过敏的发生机制及探索新的治疗方法提供良好平台。

本发明提供的小麦面筋蛋白经皮致敏小鼠模型的构建方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1小麦面筋蛋白溶液制备

1.目的

本模型构建中，需要小麦面筋蛋白溶液作为致敏原，然后进行致敏环节的操作。而小麦面筋蛋白是难溶于水的，必须对其进行其他辅助操作以增加促进其更大的溶解。本部分实验主要为增加小麦面筋蛋白的溶解，以使其达到构建致敏模型所需的浓度要求。

2.材料及方法

1)主要试剂

pH 7.4的PBS缓冲液 北京索莱宝科技有限公司；

Bradford蛋白质浓度测定试剂盒 北京索莱宝科技有限公司。

2)主要仪器

制冰机 KQ2200 常熟市圣海电器有限公司；

超声波清洗器 IMS-20 昆山市超声仪器有限公司；

离心机 2-16R 上海托莫斯科学仪器有限公司；

漩涡混匀仪 MX-F 美国赛洛捷克仪器公司；

酶标仪 Multiskan FC 美国Thermo公司。

3)操作

称量200mg小麦面筋蛋白置入50ml离心管中，向管内加入20mlpH7.4的PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)，旋涡震荡混匀，然后向超声清洗器中倒入冰水，将离心管置于冰水中超声处理2～2.5h，超声功率为100W，频率40KHz，中间每隔30min取出离心管漩涡震荡10min，以使不溶性的小麦面筋蛋白尽可能溶解，获得较高浓度的蛋白质溶液，然后将小麦面筋蛋白溶液在4℃，2500r/min条件下离心20min,取上清液。

4)小麦面筋蛋白溶液蛋白质浓度检测

采用Bradford蛋白质浓度测定试剂盒检测小麦面筋蛋白溶液蛋白质浓度。采用BSA(牛血清白蛋白)作为标准蛋白，测定标准曲线，然后用考马斯亮蓝G250对小麦面筋蛋白溶液中的蛋白质进行染色，在595nm波长下测定吸光度。

3.实验结果

最终测得的小麦面筋蛋白溶液蛋白质浓度为2.18-2.72mg/ml。可以达到构建小鼠致敏模型的所需的浓度要求。

实施例2评估经皮致敏，腹腔注射致敏和灌胃致敏方式构建小鼠致敏能够的效果

1.目的

腹腔注射致敏和灌胃致敏是常用的构建小鼠过敏模型的方法，本部分研究即尝试对经皮致敏方法与腹腔致敏和灌胃致敏的方法构建的小鼠过敏模型的效果进行比较。

2.实验对象及材料

1)动物准备

刚离乳的雌性Balb/c小鼠(3周龄)40只(SPF级),体重8-12g，由维通利华公司提供，中国农业大学动物房饲养，饲喂无植物蛋白饲料(AIN93M)，自由饮食。饲养环境：温度22-25℃；湿度：40-60％。

2)材料和试剂

氢氧化铝佐剂(Imject Alum Adjuvant) 赛默飞世尔科技有限公司；

小麦粉 中粮集团有限公司；

pH 7.4的PBS缓冲液 北京索莱宝科技有限公司；

免疫球蛋白E(IgE)检测试剂盒 武汉云克隆科技股份有限公司；

组胺(HA)检测试剂盒 武汉云克隆科技股份有限公司；

HE染色试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；

4％多聚甲醛溶液 北京百瑞极生物科技有限公司；

ELISA包被液 北京索莱宝科技有限公司；

5％BSA封闭液 北京索莱宝科技有限公司；

二甲苯、乙醇、乙酸等试剂均为分析纯，购于北京化工厂。

3)主要仪器

酶标仪 Multiskan FC 美国Thermo公司；

电热鼓风干燥箱 DHG-9055A 上海一恒科学仪器有限公司；

漩涡混匀仪 MX-F 美国赛洛捷克仪器公司。

4)分组建模

将40只小鼠适应性喂养3周，然后随机分为对照组(ctrl)，经皮致敏组(td)，腹腔注射致敏组(ip)和灌胃致敏(ig)，每组10只。试验流程如图1a和图1b。

致敏：向小麦面筋蛋白溶液中按10:1的比例加入氢氧化铝佐剂(即10ml蛋白质溶液加入1ml氢氧化铝佐剂)，乳化，制得小麦蛋白致敏液，用于后续致敏实验。

经皮致敏：在21、28、35、42天经皮给药500μl小麦面筋蛋白致敏液致敏小鼠，经皮给药操作为每次致敏前用小鼠剃毛器刮净小鼠腹部，用400目砂纸摩擦小鼠腹部皮肤，使小鼠腹部变红，但未出血，取500μl小麦蛋白致敏溶液均匀涂抹于小鼠腹部，用弹性纱布包裹，放入笼中1h，然后拆除纱布，用无菌水冲洗给药区域；

腹腔注射致敏：在21、28、35、42天采用无菌注射器腹腔注射200μl小麦面筋蛋白致敏液致敏小鼠；

灌胃致敏：在21、28、35、42天采用无菌注射器与灌胃针，灌胃腹腔注射500μl小麦面筋蛋白致敏液致敏小鼠；

对照组：在21、28、35、42天，每只小鼠采用无菌注射器腹腔注射200μl pH 7.4 PBS缓冲溶液。

激发：第56天，将用200-300mg冻干小麦面筋蛋白与10ml Ph 7.4的PBS缓冲液中，充分搅拌使之混合均匀，制备混合液，给所有致敏组小鼠每只灌胃500μl混合液，每只小鼠灌胃前需再将混合液摇均匀；对照组小鼠每只灌胃500μl pH 7.4的PBS缓冲液。

5)标本采集

血清

剪除小鼠胡须，摘除一侧眼球，用1.5ml离心管收集血液，然后脱颈处死小鼠。血液室温放置2h,在3000r/min，4℃条件下离心10min，取上层血清装入另外的EP管，-80℃下保存。

结肠组织

将小鼠解剖，取2cm结肠组织，置于4％多聚甲醛固定液中固定，用于病理切片制作。

3.研究方法

1)过敏小鼠过敏表观症状观察

本实验将小鼠临床症状分为6个等级:0＝“无症状”；1＝'抓鼻子和头'；2＝“活动减少或呼吸频率增加”；3＝“气喘，呼吸困难，眼睛和/或嘴巴周围发红，脱发”；4＝“口服刺激后抽搐或不动”；5＝“死亡”。临床评分4、5分为严重过敏症状，2、3分为中度过敏症状，1分为轻度过敏症状。小鼠灌胃激发0.5h后小鼠过敏症状，并根据过敏症状进行评分。

2)用IgE检测试剂盒检测小鼠血清中总IgE及小麦蛋白特异性IgE含量

总IgE的检测可以直接用试剂盒的预包被板检测，而特异性IgE含量需要先在4℃下用包被液稀释的小麦蛋白溶液包被空白板24h，然后BSA溶液封闭4h。

实验步骤：

根据说明书进行实验前标准品、试剂及样本准备；

向包被板每孔中加样100μl,37℃下孵育1h；

将板甩干，每孔加检测溶液A 100μl,37℃下孵育1h；

洗板3次，然后每孔加检测溶液B 100μl,37℃下孵育30min；

洗板5次，然后每孔加TMB底物90μl,37℃下避光孵育10-20min；

每孔加终止液50μl，于450nm读板。

3)血清中组胺含量检测

根据试剂盒说明书进行操作，实验步骤包括：

根据说明书进行实验前标准品、试剂及样本准备；

加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。空白孔加50μl标准品稀释液，余孔加待测样品50μl，然后立即每孔加检测溶液A工作液50μl，轻轻振动，混匀，注意不要有气泡，酶标板加上覆膜，37℃温育1h；

洗板：弃去孔内液体，每孔用350μl的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体，重复洗板3次。最后一次洗涤后，吸取或倒出剩余的洗涤缓冲液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干；

每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100μl，加上覆膜，37℃温育30分钟；

弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤；

每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜，37℃避光显色。反应时间控制在10-20分钟，不要超过30分钟。当标准孔的后面3孔有明显的梯度蓝色，前3孔梯度不明显时，即可终止；

每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色，如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀；

在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的O.D.值。

4)血清中细胞因子的检测

采用磁珠芯片法对血清中的细胞因子进行检测。实验步骤如下：

样品孵育：取微珠在振荡器上1400rpm，振荡30s，使用Assay Buffer稀释微珠。取50μl准备好的标准品、样品和Blan加入96孔板中，贴上封口膜，放置在平板振荡器上850rpm振荡，室温避光孵育30min。

孵育检测抗体：弃去样品，使用洗板机洗涤3次，使用Antibody Diluent按说明书要求稀释Detection Antibody，每孔加入25μL稀释好的Detection Antibody，贴上封口膜，放置在平板摇床上850rpm，室温避光振荡孵育30min。

显色：弃去检测抗体，使用洗板机洗涤3次，使用Assay Buffer按说明书要求稀释Streptavidin-PE；每孔加入50μl稀释好的Streptavidin-PE，贴上封口膜，放置在平板摇床上850rpm，室温避光振荡孵育10min；使用洗板机洗涤3次，每孔加入125μl Assay Buffer重悬，贴上封口膜，放置在平板摇床上850rpm，室温避光振荡30秒，送入已校正的Bio-Plex机器中读值。

5)小鼠结肠组织病理学染色观察

将固定好的结肠组织流水冲洗12h，然后依次放入70％乙醇1h、80％乙醇1h、95％乙醇1h、100％乙醇(1)1h、100％乙醇(2)1h、100％乙醇(3)1h，再依次放入二甲苯(1)40min、二甲苯(2)40min、二甲苯(3)40min，样品浸65度石腊(1)1h、65度石腊(2)1h、65度石腊(3)1h,将组织放入不锈钢组织包埋模，灌注65度石蜡液。室温放置3h后，得到组织包埋蜡块，放入-20℃保存。

将组织包埋块切片，厚度4μm，65℃烤片15min，依次放入二甲苯(1)1min、二甲苯(2)10min，然后再依次放入100％乙醇10min、95％乙醇1min、80％乙醇1min、70％乙醇1min。水洗切片后放入苏木精染液3min，水洗，放入1％的盐酸酒精30s，水洗,放入1％氨水30s，水洗，伊红染液2min，水洗，依次放入70％乙醇1min、80％乙醇1min、95％乙醇1min、100％乙醇1min。吹干切片，最后在二甲苯溶液中浸泡一下，吹干，封片，读片。

5)数据统计

数据用“平均值±标准差”表示，样本之间均数差异显著性检验采用ANOVA分析，如果有显著性差异，采用LSD(方差齐)和Benferroni(方差不齐)方法进行两两比较。当方差不齐时采用秩和检验，使用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。认为P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著,P＜0.001为差异极其显著。

4.研究结果

1)小鼠过敏症状评分比较

与对照组相比三种致敏方式均能诱导大部分小鼠过敏，引起不同程度的临床症状，见图2。

2)小鼠血清中总IgE及小麦蛋白特异性IgE含量测定

正常对照组小鼠的血清中总IgE含量为11.83±0.510ng/ml，与经皮致敏组的27.48±4.270ng/ml，腹腔注射组的31.00±3.839ng/ml，灌胃致敏组的26.83±3.73ng/ml均有显著差异(p<0.01)。正常对照组小鼠的血清中小麦蛋白特异性IgE相对含量(以450nm波长下OD值表示)为0.12±0.007，与经皮致敏组的0.56±0.033，腹腔注射组的0.59±0.035和灌胃致敏组的0.52±0.040也都有极显著差异(p<0.01)，如图3，4。而经皮致敏组、腹腔注射组和灌胃致敏组小鼠血清总IgE含量没有显著性差异，这些说明相较于正常小鼠，三种致敏方式均引起了免疫反应，与已经较成熟的腹腔注射致敏和灌胃致敏相比，经皮致敏同样可以成功诱导小鼠产生更多的小麦IgE抗体。

3)小鼠血清中组胺含量测定

检测结果显示，正常对照组小鼠，经皮致敏组，腹腔注射组和灌胃致敏组小鼠血清中组胺含量分别为12.15±0.830ng/ml，86.70±3.773ng/ml，96.44±0.813ng/ml，71.30±2.539ng/ml(见图5)。

4)小鼠血清中细胞因子的检测

结果显示，与对照组相比，致敏组小鼠血清中Th1型抗体(IFN-γ)和Th2型细胞因子(IL-4，IL-13)含量均显著升高。说明三种致敏方式构建的模型小鼠发生免疫反应，体内T细胞增殖分化，且在T细胞分化过程中，Th1/Th2分化平衡被打破，使T细胞向Th2分化方向偏移。经皮致敏模型小鼠Th2型细胞因子(IL-4，IL-13)高于灌胃致敏小鼠，低于腹腔注射致敏小鼠(图6，7)，而Th1型抗体(IFN-γ)含量则相反低于灌胃致敏小鼠，高于腹腔注射致敏小鼠(图8)，说明经皮致敏模型小鼠T细胞向Th2分化方向偏移程度，要低于腹腔注射模型，高于灌胃致敏模型。

5)组织病理学观察

镜下观察HE染色切片，可见正常组小鼠结肠组织均无明显炎症反应(图9ab)。经皮致敏小鼠结肠组织出现大量炎症细胞浸润(图10a、b)。

5.实验结论

小麦面筋蛋白小鼠过敏模型的构建主要包括两个部分：致敏和激发。目前较成熟的小麦蛋白致敏方式有：腹腔注射和灌胃致敏。同一种过敏原不同的致敏途径会引起程度甚至种类不同的免疫反应。在本部分研究中，比较了腹腔注射致敏和灌胃致敏建立模型的效果。结果显示：相比于灌胃致敏，经皮致敏组小鼠血清中的总IgE、小麦蛋白特异性IgE的表达量更高，组胺含量更高，Th2类细胞因子(IL-4、IL-13)表达量更高，因此，经皮致敏效果要优于灌胃致敏。而上述指标，经皮致敏小鼠又均略逊于腹腔注射致敏组。从结肠组织切片对比来看，经皮致敏小鼠结肠组织发生炎症反应，出现大量炎症细胞浸润。

综上所述，经皮致敏方式可以用来构建小麦面筋致敏小鼠模型，略优于灌胃致敏方式构建小鼠致敏模型，略逊于腹腔注射方式构建的小鼠致敏模型，但差别并不显著。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.小麦面筋蛋白经皮致敏动物模型的构建方法，其特征在于，取小麦面筋蛋白经皮致敏，构建动物模型。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：取小麦面筋蛋白溶于缓冲液中，冰水超声，获得小麦面筋蛋白溶解液；再与氢氧化铝佐剂混合乳化，制得小麦面筋蛋白致敏液；

步骤2：将刚离乳的Balb/c小鼠(3周龄)无植物蛋白饲料适应性喂养3周，于21、28、35、42天分别对小鼠经皮致敏500μl所述小麦面筋蛋白致敏液致敏小鼠；

步骤3：激发；第56天给每只小鼠灌胃含有10～15mg小麦面筋蛋白的缓冲液。

3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤1中，以mg/ml计，所述小麦面筋蛋白与所述缓冲液的重量体积比为10:1。

4.如权利要求1至3任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤1中，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液中；所述缓冲液的pH值为7.4。

5.如权利要求1至4任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤1中，所述超声的功率为100W，40KHz，所述超声的时间为2～2.5h。

6.如权利要求1至5任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤1中所述小麦面筋蛋白溶解液与氢氧化铝佐剂按照10:1混合乳化。

7.如权利要求1至6任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤1中，所述小麦面筋蛋白的制备方法包括如下步骤：

步骤A：以g/ml计，取面粉与水按照10:6的重量体积比和成面团；

步骤B：15～25℃，将面团浸入500ml的0.5mol/L NaCl溶液中浸泡1h，浸泡期间搅拌不少于1次；

步骤C：搅拌面团，将包含淀粉的NaCl溶液倒出，保留面筋组分，每次加入1L 0.5mol/LNaCl溶液洗涤面筋，所述洗涤的次数不少于5次；

步骤D：采用蒸馏水洗涤面筋，然后加入淀粉酶，在55℃下反应10min；所述淀粉酶的酶活为40000u/g；所述淀粉酶的加入量为0.5g/100g面粉；

步骤E：采用蒸馏水洗涤面筋至少3次，得到小麦面筋蛋白，冻干，粉碎，于4℃保存。

8.如权利要求1至7任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤2中所述小麦面筋蛋白致敏液中，所述小麦面筋蛋白的浓度为2.18～2.72mg/ml。

9.如权利要求1至8任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤2中所述经皮给药具体为：致敏前刮净小鼠腹部，用砂纸摩擦小鼠腹部皮肤，使小鼠腹部变红，但未出血，取500μL所述小麦面筋蛋白致敏液均匀涂抹于小鼠腹部，用弹性纱布包裹，放入笼中1h，然后拆除纱布，用无菌水冲洗给药区域。

10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述砂纸的目数为400目。

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