CN106872717A

CN106872717A - 一种炎症性肠病临床检测标志物及其应用

Info

Publication number: CN106872717A
Application number: CN201710213475.2A
Authority: CN
Inventors: 李建明; 沈彤; 李师; 蔡令栋
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2017-04-01
Filing date: 2017-04-01
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2037-04-01
Also published as: CN106872717B

Abstract

一种炎症性肠病临床检测标志物及其应用，具体涉及炎症性肠病中的分子标志物‑Erbin基因，及其调控的下游自噬通路的抑制剂氯喹在制备炎症性肠病产品中的应用。实验结果表明注射氯喹的小鼠，DSS诱导的Erbin^+/+和Erbin^‑/‑小鼠肠粘膜损伤显著下降，虽然相比之下，Erbin^‑/‑小鼠肠损伤还是明显严重于Erbin^+/+小鼠，但与未注射氯喹的小鼠相比，肠粘膜屏障完整性升高，炎性细胞浸润显著减少，炎症性肠病的症状得到显著缓解，表明自噬抑制剂氯喹可提高肠粘膜完整性，发挥很好的抑制IBD的功效，因此对炎症性肠病预防及治疗都有一定的作用。

Description

一种炎症性肠病临床检测标志物及其应用

技术领域

本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于炎症性肠病诊断的分子标志物及其应用，具体涉及炎症性肠病中的分子标志物-Erbin基因，及其调控的下游自噬通路的抑制剂氯喹在制备炎症性肠病产品中的应用。

背景技术

炎症性肠病(inflammatorybowel disease,IBD)主要包括克罗恩病(Crohn’sdisease，简称CD)和溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，简称UC)，是一种慢性、非特异性肠道炎症性疾病，是结直肠癌重要的癌前病变。影响IBD发生发展的主要因素包括肠道免疫系统的功能失调、肠道微生物感染、肠道微生态紊乱以及宿主的遗传背景等。但是IBD的发病机制及关键分子还远未阐明。发现IBD关键分子对于IBD的诊断和治疗都是至关重要的。Erbin(又叫erbb，erbb2interactingprotein简称erbb2ip)最早作为ErbB2相互作用蛋白被发现，但是其功能目前并不太明确。从其表达特点看，Erbin在脑、心脏、肾脏、肌肉及胃等组织中较为丰富,因而它可能在维持这些器官细胞结构的完整、调节细胞的增殖和分化、发育过程中器官形态的发生及信号转导途径等方面起着重要的作用。Erbin的这些功能可以从与它相互作用的蛋白体现。Erbin可能作为很多信号通路的整合蛋白，发挥着重要的作用。有研究证实Erbin可以通过其PDZ结构域特异性地结合Nod2。而Nod2与IBD的关系已经得到确认，近期的基因组关联分析也证实Nod2及其家族成员在IBD中的作用。并且，Erbin可抑制Nod2依赖的NF-κB的炎症信号通路的激活及细胞因子的分泌等。Oehlers等在研究Nod信号通路与炎症的关系的时候发现，肠道沙门氏菌Salmonellaenterica感染斑马鱼后，Erbin在斑马鱼成鱼肠道白细胞中的表达量很高。综合我们自己的研究和相关文献，我们认为Erbin与IBD的发生发展密切相关，但其作用及其机制有待进一步确定。关于Erbin作为诊断炎症性肠病的分子标志物和自噬抑制剂作为一种抑制炎症性肠病药物的用途目前尚未见报道。

发明内容

解决的技术问题：本发明克服现有技术中治疗炎症性肠病药物的不足，及临床上炎症性肠病诊断标志物的局限，通过对Erbin及其下游自噬通路的深入研究，在确定Erbin抑制炎症性肠病发生的创新性发现的基础上，提供一种炎症性肠病临床检测标志物Erbin及其应用。

技术方案：Erbin在作为炎症性肠病临床检测标志物中的应用。

Erbin在制备炎症性肠病临床检测标志物中的应用。

Erbin在筛选制备治疗炎症性肠病药物中的应用。

Erbin所调控的下游自噬通路的抑制剂氯喹在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。

一种含有所述氯喹的具有治疗炎症性肠病及炎症性肠病相关结直肠癌的药物制剂。该药物制剂为含有自噬抑制剂的口服制剂、注射剂或外用制剂。所述的口服制剂为肠溶性片剂、胶囊剂、丸剂或颗粒剂。

Erbin的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。氯喹Hydroxychloroquine sulfate分子式C₁₈H₂₆ClN₃O·H₂SO₄。

本发明所述的实验中通过腹腔注射给药的方式将自噬抑制剂氯喹(供应商Sigma)腹腔注入小鼠体内。

本发明首先采用DSS诱导的方式，诱导C57小鼠模拟人溃疡性结肠炎模型。在小鼠肠炎模型中，我们观察到Erbin的表达显著低于对照未处理组。我们又基于Il-10^-/-小鼠模拟人自发慢性肠炎模型。在该小鼠模型中，我们也观察到Erbin的表达明显低于对照Il-10^+/+。以上结果提示Erbin在溃疡性结肠炎中起着重要的作用。

另外，用Erbin全身性敲除的小鼠(Erbin^-/-)和同窝Erbin^+/+，通过DSS诱导的方式构建其溃疡性结肠炎模型。我们发现Erbin^-/-小鼠的结直肠炎症水平明显高于对照组。提示Erbin的缺失会促进肠炎的发生。我们同时检测了该模型中的自噬相关指标，发现Erbin能负调控自噬的标志蛋白LC3B的表达水平，正向调控自噬通路中ATG16L1的表达，而对ATG7和ATG2A的表达没有影响。因此我们推测自噬抑制剂，这一抑制自噬小体和溶酶体结合的药物氯喹，极可能抑制溃疡性结肠炎的发生及缓解其发展，也能够成为治疗IBD相关结直肠癌的有效药物。

本发明应用DSS诱导的小鼠结肠炎动物模型模拟人炎症性肠病模型，用野生型小鼠Erbin^+/+和Erbin^-/-小鼠作为工具；通过腹腔注射自噬抑制剂氯喹。实验结果表明注射氯喹的小鼠，DSS诱导的Erbin^+/+和Erbin^-/-小鼠肠粘膜损伤显著下降，虽然相比之下，Erbin^-/-小鼠肠损伤还是明显严重于Erbin^+/+小鼠，但与未注射氯喹的小鼠相比，肠粘膜屏障完整性升高，炎性细胞浸润显著减少，炎症性肠病的症状得到显著缓解，表明自噬抑制剂氯喹可提高肠粘膜完整性，发挥很好的抑制IBD的功效，因此对炎症性肠病预防及治疗都有一定的作用。

有益效果：本发明通过构建大量模拟人IBD的动物模型，发现Erbin在IBD发生发展中的重要作用。Erbin的下降伴随着肠粘膜屏障损伤以及粘膜上皮细胞大量脱落，炎性细胞浸润显著增加，肠道炎症显著加剧。此时自噬小体持续产生，我们观察到炎症较为严重的Erbin缺失组小鼠的自噬标志物LC3B的表达量高于对照。在体外细胞诱导炎症反应的实验中，我们用肿瘤坏死因子TNFα刺激CT26结直肠癌细胞，我们发现随着刺激时间的增加，细胞中自噬的标志物LC3B的表达持续增加，Erbin缺失组增加的幅度最为明显。同时，我们观察到在Erbin缺失组自噬小体增加的过程中伴随有大量的细胞死亡。我们推测Erbin是通过促进细胞自噬性死亡来加速炎症的发生。因此，我们推测如果抑制自噬通路，很可能会抑制肠炎的发生及发展。于是使用抑制自噬溶酶体和自噬小体结合的药物氯喹来阻断自噬通路，我们进一步进行动物体内实验。在DSS诱导Erbin^-/-小鼠肠炎的同时给小鼠腹腔注射氯喹，对比氯喹作用的前后，发现这种自噬抑制剂能有效缓解Erbin^-/-小鼠的肠道损伤，于是我们推测氯喹作为Erbin调控自噬的抑制剂，可以用于缓解Erbin缺失造成的肠炎进程。最终我们确认Erbin可作为炎症性肠病的临床检测标志物，同时它所调控的下游自噬通路的抑制剂氯喹可作为制备防治炎症性肠病的药物。

附图说明

图1是Erbin在DSS诱导的C57小鼠IBD模型的结直肠中表达情况示意图。

图2是Erbin在自发性慢性肠炎小鼠Il-10^-/-结直肠中的表达情况示意图。

图3是Erbin在患有溃疡性结肠炎(UC)病人肠上皮中的表达示意图。

图4是Erbin^-/-及其对照Erbin^+/+小鼠在DSS诱导前后结直肠大体观、HE图及其对应的炎症评分示意图。

图5是Erbin^-/-及其对照Erbin^+/+小鼠在DSS诱导前后结直肠组织蛋白中自噬的标志物LC3B及其自噬通路中ATG16L1，ATG7，ATG2A蛋白的表达示意图。

图6是基于结直肠癌细胞CT26构建的Erbin稳定敲低的细胞株(Erbin/ShRNA)及其对照，经过8小时，16小时，24小时，28小时的加药(TNFα)，模拟体内实验刺激炎症的发生，检测LC3B的转录水平表达及其相应的细胞生存率柱状图。每个时间点的细胞分为三组，对照组加PBS，对照组加TNFα，Erbin稳定低表达组加TNFα。

图7是Erbin的缺失会加重肠炎，氯喹会缓解这一现象示意图。实验分为两组：通过DSS诱导Erbin^+/+和Erbin^-/-小鼠5天，构建其溃疡性结肠炎模型；另一组为DSS诱导Erbin^-/-小鼠5天的同时腹腔注射60mg/kg氯喹。在第5天同时解剖小鼠，取结直肠做HE。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1：Erbin作为炎症性肠病诊断标志物的实验

1、构建IBD动物模型

葡聚糖硫酸钠(DSS)化学诱导小鼠IBD模型分别给20只8周龄的C57小鼠以及Erbin^+/+和Erbin^-/-小鼠喂食浓度为5％，分子量为36000-40000的DSS溶液，自由饮用7天构建模拟人溃疡性结肠炎的小鼠模型；同样喂食20只Erbin全身缺失的小鼠(Erbin^-/-)和20只Erbin^+/+小鼠予以正常饮食饮水，7天后处死小鼠，取结直肠。

2、Il-10^-/-自发性慢性肠炎小鼠模型

Il-10^-/-小鼠在SPF饲养环境下生长6个月会自发肠炎，表现为便血，脱肛，在HE片中我们观察到有大量的炎细胞的浸润，肠上皮有大量的增生及修复。与人慢性肠炎的状态相似，作为模拟人类疾病的模型使用。

3、蛋白的提取及其免疫印迹(Western Blot)

取肠组织,加入蛋白裂解液制备蛋白样品，测定样品蛋白质的浓度。将蛋白在6％聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上进行电泳，将蛋白质条带转移至聚偏乙烯(PVDF)膜上；5％脱脂奶粉TBST溶液，用于封闭和稀释一抗Erbin(后续检测LC3B，ATG2A，ATG6L1，ATG7)(Erbin买自公司Bethyl，其余自噬相关抗体均买自CST公司)，封闭1h后，一抗4℃过夜；用BST溶液洗膜。荧光二抗室温避光孵育l h，TBST溶液洗膜。加入化学发光试剂孵育后在暗室曝光显影。

结果图1和图2显示溃疡性结肠炎动物模型中Erbin的蛋白表达较对照未处理组低。我们在DSS喂食7天后诱导成功的小鼠模型中取结直肠，提取蛋白，检测Erbin的表达。同时我们在6个月已出现有便血脱肛表型的Il-10^-/-自发慢性肠炎模型小鼠结直肠蛋白中也检测Erbin的表达。均提示Erbin在诱导溃疡性结肠炎和在慢性肠炎的肠组织中表达都较低。

4、免疫组化

石蜡组织切片3次逐级脱蜡，封闭内源性过氧化物酶，梯度乙醇至水；抗原修复。PBS缓冲液冲洗，滴加Erbin的一抗。湿盒内室温孵育1.5h。PBS缓冲液冲洗3次，滴加二抗，湿盒内室温孵育30min。PBS冲洗3次，DAB显色，显微镜下观察，自来水冲洗终止显色。苏木精对比染色，1％盐酸乙醇风化，氨水返蓝。脱水、透明、中性树胶封片。

结果图3显示在临床溃疡性结肠炎病人的组织中，Erbin的表达明显低于正常组。

5、HE染色及炎症监测指标

将制作好的石蜡切片经过二甲苯3次各5分钟和由高到低浓度的酒精各1分钟，再浸入水中水化5-10分钟。切片浸入苏木精中3分钟，流水冲去浮色，再至于温水中1分钟返蓝。切片浸入伊红20-30秒，经过95％，100％的酒精脱色，用中性树胶封片。待树脂干后可长期保存，显微镜下拍片。

评价小鼠一般情况以及个体质量变化。主要观察小鼠毛色是否光滑、精神是否活跃,大便是否成形，有无腹泻便血,每天记录个体质量变化。参照Oka等制定的标准监测疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分的变化，处死后进行结肠炎症评分。发现死亡小鼠立即解剖明确是否因炎症过重死亡。小鼠DAI评分，其中包括综合粪便性状、隐血和体质量变化。评价各组结肠黏膜损伤组织病理学变化。参照McCarthy等组织学评分标准(大致正常为0分，轻度炎症浸润为1分，明显的炎症浸润，伴隐窝炎或隐窝脓肿为2分，明显的炎症浸润，伴杯状细胞丢失为3分，明显的炎症浸润，伴黏膜糜烂为4分)，导致死亡的小鼠各项评分均取最高值。统计学处理：结果以mean±SD表示，统计方法采用SPSS 11.5软件进行分析Erbin^-/-溃疡性结肠炎组与对照组，组间两两比较，采用t检验分析，p<0.05为差异具有显著性。

图4的结果显示3.5个月左右的未处理组Erbin的缺失与对照野生型小鼠的结直肠镜下观差别不明显，而通过DSS诱导为急性溃疡性结肠炎之后，Erbin缺失的小鼠肠炎明显严重于对照组的肠炎。表现为炎症范围的扩大，炎症程度的加深，隐窝损伤的较为严重。

以上结果提示Erbin可以抑制炎症性肠病的发生发展。

图5的结果显示不管是在肠炎组还是在未处理组，Erbin和自噬标志物LC3B呈现负调控关系。整体LC3B在肠炎组整体若于对照未处理组。提示Erbin促进肠炎的作用是通过抑制自噬通路来完成的。

Erbin会抑制细胞自噬性死亡

6、细胞培养

基于小鼠CT26结直肠癌细胞，我们向上海吉凯公司购买了慢病毒，构建了Erbin稳定低表达的细胞系(Erbin/ShRNA)。在含10％FBS的1640培养基中，置于37℃、5％CO₂培养箱中生长，至对数生长期用于试验；细胞生长至融合度大于80％时，进行传代：PBS缓冲液洗2遍，胰酶体积约覆盖细胞表面，37℃培养箱作用1min，显微镜明场下观察，可见细胞收缩边缘清晰时，弃去消化液，加入完全培养基终止消化，用移液器吹打瓶壁上的细胞制成单细胞悬液，接种到新的培养皿内培养。

7、总RNA的提取，RT-PCR

细胞的RNA直接收取细胞后按照Trizol法抽提总RNA。将小鼠结肠取出后置于冰PBS中清洗数次，按照Trizol法提取总RNA。测定浓度后取1μg总RNA进行反转录，得到的cDNA产物稀释10倍用于RT-PCR的模板。

我们基于以上提好的总RNA，利用罗氏的逆转录试剂盒逆转，cDNA备用检测自噬标志物LC3B的mRNA水平；通过ABI公司的实时定量PCR仪(型号：Setp-one)检测。

我们用一对细胞(Erbin-Control，Erbin/ShRNA)，Erbin-Control细胞中加入PBS(稀释TNFα药物的溶液)，Erbin-Control细胞中加入TNFα药物，Erbin/ShRNA细胞中加入TNFα药物。分别观察加药后8小时，16小时，24小时，28小时后，检测LC3B的转录水平的表达情况。

具体操作：将CT26-Control和Erbin/ShRNA细胞消化、计数、铺板(3.5cm皿)。待细胞长至90％时开始第一次加药，弃原培养基，加入1mL 1640空培养基，加入1μLTNF-α(储存浓度100μg/mL，作用终浓度100ng/mL)，CT26-Control对照皿加入1μL PBS缓冲液。收集细胞：将细胞培养基上清收集至4mL EP管中，用少量PBS缓冲液洗涤培养皿并与上清合并。用胰酶消化贴壁细胞并与之前上清合并。2000rpm，5min，离心，弃上清，并用PBS缓冲液再洗涤一次，2000rpm，5min，弃上清。

如图6结果中的上图显示，采用RT-PCR的定量分析结果显示，LC3B的表达随着时间的增长递增，TNFα加入细胞模拟体内实验的炎症反应，在该药物的刺激下，我们观察到自噬小体的增加幅度明显增高，而Erbin的缺失会放大这一效应，表明Erbin的缺失所引起的炎症反应会更快的促进自噬小体的生成。

8、细胞存活率实验

细胞计数分盘，加药如上。在测死亡率时每组收集的细胞中加PI：用含5μg/mLPropidium Iodide(简称PI，碧云天，ST511)的PBS缓冲液1mL悬细胞沉淀，室温、避光反映10分钟。测细胞死亡率:使用流式细胞仪(美国Beckman Coulter，型号FC500)检测细胞死亡率。原理：碘化丙啶(PI)不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，碘化丙啶(PI)可以染色坏死细胞。

图6结果中的下图显示随着加TNF-α时间的增长，在前两个时间点8小时和16小时，三组细胞的死亡率几乎没有差异。在24小时，Erbin/ShRNA加TNF-α组细胞的死亡率开始高于另外两组，在28小时，Erbin/ShRNA加TNF-α组细胞的死亡率显著高于另外两组，Control加PBS和Control加TNF-α两组的细胞死亡几乎没有差异。这提示在炎症的时候，Erbin缺失会促进自噬性死亡的发生。我们进一步猜想自噬性死亡会不会进一步加速炎症。

动物体内实验自噬抑制剂氯喹

抑制肠炎

实验分组：

选用6-8周、Erbin^+/+和Erbin^-/-小鼠分成三组：3只Erbin^+/+小鼠喂食浓度为5％，分子量为36000-40000的DSS溶液；3只Erbin^-/-小鼠喂食DSS溶液；3只Erbin^-/-小鼠喂食DSS的同时腹腔注射氯喹(Sigma)60mg/kg，诱导5天。HE染色。

图7结果显示HE染色结果显示Erbin的缺失会加重肠炎，但当同时注射氯喹后，我们发现这种自噬抑制剂会减轻上皮损伤。在未加入氯喹组，Erbin^-/-小鼠的结直肠炎症程度最深，表现为上皮几乎全部消失，大量炎症因子的浸润。DSS诱导肠炎的同时腹腔注射氯喹会使得Erbin^-/-小鼠的炎症减缓，上皮中隐窝仍可见。

实验过程中，未见有明显不良反应，有望开发成新一代安全有效，防治炎症性肠病及炎症性肠病相关结肠癌的新药。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理和构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 李建明

<120> 一种炎症性肠病临床检测标志物及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1419

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Thr Thr Lys Arg Ser Leu Phe Val Arg Leu Val Pro Cys Arg Cys

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Arg Glu Gln Leu Ile Asp Tyr Leu Met Leu Lys Val Ala His Gln

1295 1300 1305

Pro Pro Tyr Thr Gln Pro His Cys Ser Pro Arg Gln Gly His Glu

1310 1315 1320

Leu Ala Lys Gln Glu Ile Arg Val Arg Val Glu Lys Asp Pro Glu

1325 1330 1335

Leu Gly Phe Ser Ile Ser Gly Gly Val Gly Gly Arg Gly Asn Pro

1340 1345 1350

Phe Arg Pro Asp Asp Asp Gly Ile Phe Val Thr Arg Val Gln Pro

1355 1360 1365

Glu Gly Pro Ala Ser Lys Leu Leu Gln Pro Gly Asp Lys Ile Ile

1370 1375 1380

Gln Ala Asn Gly Tyr Ser Phe Ile Asn Ile Glu His Gly Gln Ala

1385 1390 1395

Val Ser Leu Leu Lys Thr Phe Gln Asn Thr Val Glu Leu Ile Ile

1400 1405 1410

Val Arg Glu Val Ser Ser

1415

<210> 2

<211> 8647

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

ggacggagct ggatcctgct tctcgccaag gcaggaagtg agtttcgcac tgcaattccg 60

ggcggtgtca cgagtgaaaa gttttgtttt tttttttttc ggcggagatc ctcgttgggg 120

ctgggaaact cctgcaaaac tcgagaccag gaagccagcc cgcaccccaa cccccaccaa 180

agccacctac tcttcttctg tgggaggcca gtccacatcc gctctcaccc gagagagata 240

ttcagctgga tccaaagtga ctgatgaagg gaaggaaatc atgtcaagcg aagccttgaa 300

aaagctgccc tgagacggtg tcccgccgaa agaatgttgg ctcaattaag aaacatcagg 360

gagataaatt caacccagtg tgtctaaaaa tgactacaaa acgaagtttg tttgtgcggt 420

tggtaccatg tcgctgtcta cgaggggaag aggagactgt cactactctt gattattctc 480

attgcagctt agaacaagtt ccgaaagaga tttttacttt tgaaaaaacc ttggaggaac 540

tctatttaga tgctaatcag attgaagagc ttccaaagca actttttaac tgtcagtctt 600

tacacaaact gagtttgcca gacaatgatt taacaacgtt accagcatcc attgcaaacc 660

ttattaatct cagggaactg gatgtcagca agaatggaat acaggagttt ccagaaaata 720

taaaaaattg taaagttttg acaattgtgg aggccagtgt aaaccctatt tccaagctcc 780

ctgatggatt ttctcagctg ttaaacctaa cccagttgta tctgaatgat gcttttcttg 840

agttcttgcc agcaaatttt ggcagattaa ctaaactcca aatattagag cttagagaaa 900

accagttaaa aatgttgcct aaaactatga atagactgac ccagctggaa agactggatt 960

tgggaagtaa cgaattcacg gaagtgcctg aagtacttga gcaactaagt ggattgaaag 1020

agttttggat ggatgctaat agactgactt ttattccagg gtttattggt agtttgaaac 1080

agctcacata tttggatgtt tctaaaaata atattgaaat ggttgaagaa ggaatttcaa 1140

catgtgaaaa ccttcaagac ctcctattat caagcaattc acttcagcag cttcctgaga 1200

ctattggttc gttgaagaat ataacaacgc ttaaaataga tgaaaaccag ttaatgtatc 1260

tgccagactc tataggaggg ttaatatcag tagaagaact ggattgtagt ttcaatgaag 1320

ttgaagcttt gccttcatct attgggcagc ttactaactt aagaactttt gctgctgatc 1380

ataattactt acagcagttg cccccagaga ttggaagctg gaaaaatata actgtgctgt 1440

ttctccattc caataaactt gagacacttc cagaggaaat gggtgatatg caaaaattaa 1500

aagtcattaa tttaagtgat aatagattaa agaatttacc ctttagcttt acaaagctac 1560

agcaattgac agctatgtgg ctctcagata atcagtccaa acccctgata cctcttcaaa 1620

aagaaactga ttcagagacc cagaaaatgg tgcttaccaa ctacatgttc cctcaacagc 1680

caaggactga ggatgttatg tttatatcag ataatgaaag ttttaaccct tcattgtggg 1740

aggaacagag gaaacagcgg gctcaagttg catttgaatg tgatgaagac aaagatgaaa 1800

gggaggcacc tcccagggag ggaaatttaa aaagatatcc aacaccatac ccagatgagc 1860

ttaagaatat ggtcaaaact gttcaaacca ttgtacatag attaaaagat gaagagacca 1920

atgaagactc aggaagagat ttgaaaccac atgaagatca acaagatata aataaagatg 1980

tgggtgtgaa gacctcagaa agtactacta cagtaaaaag caaagttgat gaaagagaaa 2040

aatatatgat aggaaactct gtacagaaga tcagtgaacc tgaagctgag attagtcctg 2100

ggagtttacc agtgactgca aatatgaaag cctctgagaa cttgaagcat attgttaacc 2160

atgatgatgt ttttgaggaa tctgaagaac tttcttctga tgaagagatg aaaatggcgg 2220

agatgcgacc accattaatt gaaacctcta ttaaccagcc aaaagtcgta gcacttagta 2280

ataacaaaaa agatgataca aaggaaacag attctttatc agatgaagtt acacacaata 2340

gcaatcagaa taacagcaat tgttcttctc catctcggat gtctgattca gtttctctta 2400

atactgatag tagtcaagac acctcactct gctctccagt gaaacaaact catattgata 2460

ttaattccaa aatcaggcaa gaagatgaaa attttaacag ccttttacaa aatggagata 2520

ttttaaacag ttcaacagag gaaaagttca aagctcatga taaaaaagat tttaacttac 2580

ctgaatatga tttgaatgtt gaagagcgat tagttctaat tgagaaaagt gttgactcaa 2640

cagccacagc tgatgacact cacaaattag atcatatcaa tatgaatctt aataaactta 2700

taactaatga tacatttcaa ccagagatca tggaaagatc aaaaacacag gatattgtgc 2760

ttggaacaag ctttttaagc attaattcta aagaggaaac tgagcacttg gaaaatggaa 2820

acaagtatcc taatttggaa tccgtaaata aggtaaatgg acattctgag gaaacttccc 2880

agtctcctaa taggactgaa ccacatgaca gtgattgttc tgttgactta ggtatttcca 2940

aaagcactga agatctctcc cctcagaaaa gtggtccagt tggatctgtt gtgaaatctc 3000

atagcataac taatatggag attggagggc taaaaatcta tgatattctt agtgataatg 3060

gacctcagca gccaagtaca accgttaaaa tcacatctgc tgttgatgga aaaaatatag 3120

tcaggagcaa gtctgccaca ctgttgtatg atcaaccatt gcaggtattt actggttctt 3180

cctcatcttc tgatttaata tcaggaacaa aggcaatttt caagtttgat tcaaatcata 3240

atcccgaaga gccaaatata ataagaggcc ccacaagtgg cccacaatct gcacctcaaa 3300

tatatggtcc tccacagtat aatatccaat acagtagcag tgctgcagtc aaagacactt 3360

tgtggcactc caaacaaaat ccccaaatag accatgccag ttttcctcct cagctccttc 3420

ctagatcaga gagcacagaa aatcaaagtt atgctaaaca ttctgccaat atgaatttct 3480

ctaatcataa caatgttcga gctaatactg cataccattt acatcagaga cttggcccag 3540

caagacatgg ggaaatgtgg gccatctcac caaacgaccg acttattcct gcagtaactc 3600

gaagtacaat ccagcgacaa agtagtgtgt cctccacagc ctctgtaaat cttggtgatc 3660

caggctctac aaggcgggct cagattcctg aaggagatta tttatcatac agagagttcc 3720

actcagcggg aagaactcct ccaatgatgc caggatcaca gagacccctt tctgcacgaa 3780

catacagcat agatggtcca aatgcatcaa gacctcagag tgctcgaccc tctattaatg 3840

aaataccaga gagaactatg tcagttagtg atttcaatta ttcacggact agtccttcaa 3900

aaagaccaaa tgcaagggtt ggttctgagc attctttatt agatcctcca ggaaaaagta 3960

aagttcctcg tgactggaga gaacaagtac ttcgacatat tgaagccaaa aagttagaaa 4020

agaagcatcc ccagacatcc agttcaggag atccttgtca agatggtata ttcatttcag 4080

gacagcagaa ctactcatca gccacactta gtcacaaaga tgttcctcca gacagcttga 4140

tgaaaatgcc tttgagtaat ggacagatgg gccagcctct caggcctcag gcaaattata 4200

gtcaaataca tcacccccct caggcatctg tggcaaggca tccctctaga gaacaactaa 4260

ttgattactt gatgctgaaa gtggcccacc agcctccata tacacagccc cattgttctc 4320

ctagacaagg ccatgaactg gcaaaacaag agattcgagt gagggttgaa aaggatccag 4380

aacttggatt tagcatatca ggtggtgtcg ggggtagagg aaacccattc agacctgatg 4440

atgatggtat atttgtaaca agggtacaac ctgaaggacc agcatcaaaa ttactgcagc 4500

caggtgataa aattattcag gctaatggct acagttttat aaatattgaa catggacaag 4560

cagtgtcctt gctaaaaact ttccagaata cagttgaact catcattgta cgagaagttt 4620

cctcataagc actgtggaca aaaaaagcgg ggaagacagc aagatttatt ggaagatact 4680

tacaggggaa attaatattt tgactatttt tatatataaa gaagaactca aaaaattatg 4740

ttcaaatttg tacattaatg aaataatgga acttgtggtt agagggaaag aaccactgta 4800

cagaatataa aggagactgt tgaattcata ccatataaaa cttgttaggt ttttaaacat 4860

agcaatcaag gctacaaaaa caaacctgtg ttgtttttgt atagattgta ggtttatttt 4920

tggatttcat atacatgact gaactgtgtg caaggcaata gttagccttg attttagccc 4980

agagacagat ggcagagcta tctctctcat agcttttatg cccttatttt tattcaactg 5040

gtattaatgt ttttctcctg aaactacttt ttttgatgtg ggcaagagat ttgaagtgtt 5100

ggcttttgct atgtgcatat tgaattgaag agtgagtagg tgaaggtggt gctggtgggt 5160

tcactttcca aggccagact aaaacagtta ttttctataa aaatctggaa gcaaagaatg 5220

gggatgggga gagctacgtg gtagtatgtt tttattagga gaataatgca ataaaatatg 5280

taatgtcttt tttataaagc aaaaaagaca ataattgcat ttatgagctc ggcaggatct 5340

gttcttgtca tagccattga ctatacattt gctactggtg attcagtttt taatttttta 5400

gtcacaggaa atttttaact ctactgtaga tgcatgtcca tgcattttct gtgttatgga 5460

aatccactga tttttttttt tttttcaaat ggtggtactt gcaatctgtt ttataattag 5520

tgctccattt aaatctaatt tataattttt attttaagca gcaaatgaaa caaaaatggc 5580

cagttttaag attgtgttgc ctgtaacaca aaatgttacg aaggtttagg aaagcctctt 5640

tgatttttgt ttggccttgc attgccttgg taaagtaaaa ggaaacagta cacttggagc 5700

taggaaacca aagcaagctt tgtgaaactg gcacagtgat agagaattgc tgtggagagt 5760

tatagagcaa agggatgggt ccttgaggcc tgccagtgtg taaaggtgtt caaataaagg 5820

gctgtttcta caggtaacat taaatgtgaa ctcaacactt ccagagtctt taaagggttt 5880

ctatgtgtat cagtgtaata gtgttttacc accaactgcc tttctttgtt cctagttact 5940

gtaacaaata tttgatgata gaggtttatt aattttgttt atccagacca ttaattttat 6000

ttgtttttgt tctatgtaat caaataaaat ttgagtaaca tgtaatggta aggattaatg 6060

catggttatt tggaccagaa aaaagtgcca tagaagacca ataactgttt agttgaggct 6120

agtctggaac ctttcattag agcaatattt ggttattgca cttcattttt atttactaag 6180

aaatgcaatt tgggaatttt taatctgtta tgctttgttt atcaaccttg attttaatta 6240

agacttttat aagactagct taaaacacca accaacatta tttttgcaaa agtgagttgg 6300

actcactttc cattcttgct agtcagagta agtaggcagc acttttaaaa atatgtgaac 6360

tcaaatattg cacttctttc aagatgttat caattggtta ttgtactgta tagttttaat 6420

aattttgatt gaaacccttt aacaactctt tgtaaatttt aactcatttt agttgatttt 6480

cagtactatt tacataggaa ttgattttta tggatatagt agaagaaatg tgctgtattt 6540

tgataaaatt cacttattgt atgtgtgttg taatctaaaa aaaaaaagaa tgacaaacag 6600

cttctttaag acaagtctcg gtgttccctt tattcttagt ttgtttttaa atattaattt 6660

tggcattcta aaatagctaa catttctttt attgatttca gattttcaca ggcacattct 6720

acttttaatc agaaatatat ttaataagta taattgtgaa gttttcaact actttacctt 6780

gaaccacata taccaattat aattttggaa aaggaattaa gcctcacgga acaatggatc 6840

ttcagcaaac cttaacttca ttgtctgcac attacattga agtattataa atgcaacaga 6900

tgttatatgc actggcattt tatcctactc tagttagtta aaattttata gtattcttgc 6960

aacacataaa gttgcgtaag aaactttacc aagaggagta ttatagccaa gttttctttg 7020

aaagtattgg aaaactaaaa ttaaatgaca aggactttga attagaattt tgctgtaata 7080

aagtttcaaa atttgaataa aataattaaa ttttttgagg aagtggagaa gacattttta 7140

gtttatatat tgttgagtaa attgtagtta aggcctatac ccataactaa ctttagtaag 7200

tattatatag caattcatca aaaccacaac tgtcttttag tgattttgtc tttaagagta 7260

atttcttact ctaaccagta aaaaaataat actgatcaga gtaatttata cggcatacaa 7320

tagttgatac aatctaaaga tttatgctaa ttaaggaatt atcacttcat ctgaatcaat 7380

gaaattctaa aattccctac atatttattt tgtaaatatt cttctgacct ctttggactg 7440

gatatgaaga tatatatata tacacttaat tcttttaaac acaaaacttg ccataagcag 7500

aaccaaactt ttaagtatta atttgctgca cttaaaaaat cccattagca gctatgtaat 7560

atttttatca accaacattt attcattcca aatttttgta tatatctaga tgaagtaaca 7620

catagaggat agataacaaa ctaatgatgt ttaaactggt ttatttacaa aattcggggt 7680

tagagaaatt ctcatgaaaa atatacaatt tttttttagc attaaaaccc tgtatatcta 7740

ggtgtggaag aagtgtagtt tatctcaaat tattattatt tacttctaaa gggaggcatt 7800

aagatgggaa atgtttctct gatggagatt gacgtgtgaa atctatttgg aagggtattt 7860

ttttcactca gtctgttgca ttcttacagc cttctgtttt aatgttcagt gaataggttt 7920

cttatgaaat ggacattgaa ataaaaatta tgattcaaga gcattaattg atgaacaagt 7980

gaacaagatg cctctttaaa aaaaaaaaag aaaaagtaat ctagacaggc agccaactca 8040

gacctttggg tattcctttg tttctaaata aggaccttca gaaaaagttg accatattct 8100

acctaaagct gctaattctt tacagaattc ataagcccag gggatagtaa gtagtcattt 8160

agttttggaa agttcttaag agaatgctat cttctacagt ctcatgaagc agtttttcaa 8220

gattagaatc tgtggtcagc tataacgtac agtcctaata tccaaccacc tgagaagctc 8280

atcctaagct gagaaagcct aaaatgttag agaatgttta gagaaaacac ctgaaatttt 8340

ttttaagaga acaacctagg ttttattgta gagaacaatc aaaatactcc tgaacctttc 8400

tatagaatct ttaggagaga ggctgacaaa aagaatcctt ctgttacaac tttcttttct 8460

aatgtaacaa ccagggacaa tggtgatctg tcacgcatct gcccatctag cttctcaatc 8520

ggcccacggt tttatttcag gataaaattt gagaaactag tatcactggg gaaggaagaa 8580

acctaagctg taaaattatg cttttcccct caagggattc aataaagctt atttttcatg 8640

aaaacaa 8647

Claims

1.Erbin在作为炎症性肠病临床检测标志物中的应用。

2.Erbin在制备炎症性肠病临床检测标志物中的应用。

3.Erbin在筛选制备治疗炎症性肠病药物中的应用。

4.Erbin所调控的下游自噬通路的抑制剂氯喹在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。

5.一种含有氯喹用于治疗炎症性肠病及炎症性肠病相关结直肠癌的药物制剂。

6.根据权利要求5所述的药物制剂，其特征在于，该药物制剂为含有自噬抑制剂的口服制剂、注射剂或外用制剂。

7.根据权利要求5所述的药物制剂，其特征在于，所述的口服制剂为肠溶性片剂、胶囊剂、丸剂或颗粒剂。