CN113049832A - 定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种定量检测牛乳中过敏原α‑乳白蛋白的双抗体夹心法，本方法包括步骤：α‑乳白蛋白兔多克隆抗体的制备及鉴定，α‑乳白蛋白鼠单克隆抗体的制备与鉴定，α‑乳白蛋白双抗夹心ELISA检测方法的建立。与现有技术相比，本发明具有较高的灵敏度，特异性，精密度和准确度，能够满足牛乳中α‑乳白蛋白过敏原的检测要求。

Description

定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法
技术领域
本发明涉及免疫分析技术领域，，尤其是涉及一种定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法。
背景技术
食物过敏(对贝类和水果、蔬菜以外的食物过敏)在儿童中的发病率要比在成年人中更为常见、更高。牛奶、鸡蛋、小麦和大豆诱发的食物过敏在儿童中比成人中更常见。而且食物过敏与其他特应性疾病(包括特应性皮炎、哮喘和变应性鼻炎)的并发率也很高。特别是中度和重度特应性皮炎的儿童似乎有显着风险(约35％)的食物过敏。在成年人中没有类似的研究，因此在特应性皮炎的成年人中同时发生食物过敏的发生率尚不清楚。皮肤反应是食物过敏的最常见表现，包括IgE介导的(荨麻疹、血管性水肿、潮红和瘙痒)，细胞介导的(接触性皮炎和疱疹样皮炎)以及混合的IgE和细胞介导的(特应性皮炎)反应。急性荨麻疹是IgE介导的食物过敏的常见表现，尽管食物过敏不是急性荨麻疹的最常见原因，也很少是慢性荨麻疹的原因。荨麻疹是经历食物诱发过敏反应的患者的最常见症状。食物过敏症状通常在进食令人讨厌的食物后几分钟到两小时内出现。最常见的食物过敏体征和症状包括：口中刺痛或发痒，荨麻疹、瘙痒或湿疹，嘴唇、面部、舌头、喉咙或身体其他部位肿胀，喘息、鼻塞或呼吸困难，腹部疼痛、腹泻、恶心或呕吐，头晕、头晕或昏厥。对于某些人来说，对特定食物的过敏反应可能会感到不舒服，但并不严重。对于其他人来说，食物过敏反应可能会令人恐惧，严重时会导致休克甚至危及生命。目前，尚无有效的治疗手段来对食物过敏进行治疗，唯一的办法就是严格避免摄入含有过敏原的食物。
牛乳具有高蛋白质含量和均衡营养，因此被广泛用于食品工业。牛乳过敏在临床上是指机体对牛奶蛋白的异常免疫反应，一般认为是一种或多种牛奶蛋白与IgE介导的反应之间的相互作用所致。不涉及免疫系统的反应则被定义为牛奶蛋白不耐受。牛乳主要蛋白质是80％的酪蛋白和20％乳清蛋白。酪蛋白分为α-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白和γ-酪蛋白；乳清蛋白包括：α-乳白蛋白(α-LA)，β-乳球蛋白(β-LG)，牛血清白蛋白(BSA)，免疫球蛋白及含量甚微的乳铁蛋白等。研究表明牛乳中含有20多种可引起过敏反应的蛋白质，其中酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是最主要的过敏原物质。
α-乳白蛋白与溶菌酶在基因和结构上属于同源的，它是一个两结构域蛋白，由123个氨基酸残基的单条多肽链组成，并具有四个二硫键。牛乳中α-乳白蛋白类似于人乳中的α-乳白蛋白，故将其用于制备氨基酸组成几乎相似的婴儿食品中，它同时也是乳清中含量第二高的蛋白质，分子量为14.4kDa。据不完全统计，由α-乳白蛋白引起的牛乳过敏超过了51％。
在全球范围内，患有过敏性疾病的人群约占到全球总人口的25％，世界卫生组织(WHO)在20世纪末已将“食物过敏”列为21世纪重大卫生问题之一。我国对过敏原的法律法规也在逐步完善，旨在有效保护患有过敏性疾病人群的健康和安全。牛乳过敏属于食物过敏问题之一，目前尚无有效的牛乳主要过敏原诊断措施，而在食品及饮料的加工生产过程中，可能会产生交叉污染。因此，建立一个方便，快捷，灵敏，特异的牛乳主要过敏原检测方法，对于保障公众健康和安全意义重大，同时也为与国际接轨的过敏原标识制度提供了理论基础。
发明内容
酶联免疫分析是基于生物学演变而来的。酶联免疫吸附测定(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)，也称为酶免疫测定，是一种生物化学程序，通过酶促反应产生的信号用于检测和定量溶液中特定物质的量。酶联免疫吸附测定(ELISA)通常用于检测抗原，也可以用于其他物质的检测，包括抗体、激素和药物等。ELISA具有灵敏度高、特异性强，且成本低等优点。
酶联免疫分析的原理具体如下：首先，将抗原或抗体在物理吸附作用下与聚苯乙烯进行结合，保证其免疫活性的完整性；其次，抗体(抗原)与酶标抗原(酶标抗体)在化学键的作用下进行偶联作用，保证酶标抗体(酶标抗原)的酶活性和免疫活性的完整性；最后，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)与酶标抗体(酶标抗原)上的表面结合位点进行结合，再加入显色液后，根据显色情况进行结果判定。也可以在酶标仪处，进行OD450的测定，建立标准曲线，进行定量检测分析。酶作为催化剂，起到了催化化学反应和放大化学信号的作用，从而大大提高了检测的灵敏度。
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法。具有较高的灵敏度、特异性、精密度和准确度，能够满足牛乳中α-乳白蛋白过敏原的检测要求。
本发明以牛乳主要过敏原α-乳白蛋白作为免疫原分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠，制备兔源多克隆抗体和鼠源单克隆抗体，并对其性能进行鉴定评价，然后将两者进行夹心配对，从而建立能够检测牛乳主要过敏原α-乳白蛋白的双抗夹心ELISA检测方法，也为商用试剂盒的开发研制提供了理论基础。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法，包括以下步骤：
A、以牛乳过敏原α-乳白蛋白作为免疫抗原，免疫大白兔，获得兔多克隆抗体；
B、对兔多克隆抗体的纯度、效价、特异性及亲和力进行鉴定；
C、以牛乳过敏原α-乳白蛋白作为抗原，免疫小鼠，获得鼠单克隆抗体；
D、对鼠单克隆抗体的纯度、效价、特异性及亲和力进行鉴定；
E、建立α-乳白蛋白双抗夹心ELISA检测方法，包括：α-乳白蛋白最优捕获抗体的筛选、兔多抗工作浓度的优化、α-乳白蛋白酶标二抗最佳工作浓度的确定和标准曲线的建立。
优选地，步骤A和B中，兔多克隆抗体的获取和鉴定，包括以下步骤：
以牛乳α-乳白蛋白作为免疫抗原，与弗氏佐剂等量混合后，采用颈背部皮下注射的免疫方式对健康的新西兰大白兔进行免疫，制备得到兔血清；
将制备的兔血清通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀法进行纯化分离；采用SDS-PAGE凝胶电泳法对纯化后的兔血清进行纯度的鉴定，得到纯化的抗α-乳白蛋白多克隆抗体；对α-乳白蛋白进行四次免疫，每次免疫的剂量为500μg/只；对纯化后的兔血清采用间接ELISA法测定其效价。
进一步的优选地，四免后测得多抗效价均达到1:729000。
优选地，步骤B中，鼠单克隆抗体的获取包括以下步骤：
采用与兔多克隆抗体制备相同的免疫方式和免疫抗原对健康的适龄雌性BALB/c小鼠进行免疫，对α-乳白蛋白进行六次免疫，初免剂量均为100μg/只，加强免疫剂量均为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只，利用间接ELISA法检测小鼠免疫血清，选取六免血清效价最高的小鼠(α-乳白蛋白效价为1:243000)；
通过细胞融合和间接ELISA法检测筛选阳性孔，采用有限稀释法通过亚克隆后筛选得到8株稳定分泌α-乳白蛋白单抗的杂交瘤细胞株，分别记为：2H11、3A10、1C3、2F8、3A5、4A2、4A3、4B10；
采用体内腹水诱生法进行鼠单克隆抗体的大量生产。
优选地，步骤D中，对鼠单克隆抗体鉴定包括以下步骤：
通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对获得的腹水单抗进行纯化；采用SDS-PAGE凝胶电泳法对纯化后的腹水单抗的纯度进行鉴定；采用间接ELISA法测定其效价，根据商用单抗亚型试剂盒鉴定单抗亚型。
优选地：
间接ELISA法测定效价的结果表明α-乳白蛋白的2个单抗2H11和3A10效价偏低，为1:27000，α-乳白蛋白其余6个单抗1C3、2F8、3A5、4A2、4A3和4B10的效价均达到1:243000，鼠单克隆抗体亲和力常数为3.5×107L/mol；
商用单抗亚型试剂盒鉴定的而结果表明，α-乳白蛋白的3A10分泌的单抗亚型为IgG2b，α-乳白蛋白的其余细胞株分泌的单抗亚型为IgG1。
优选地，α-乳白蛋白最优捕获抗体的筛选、兔多抗工作浓度的优化和α-乳白蛋白酶标二抗最佳工作浓度的确定采用以下方法：
(1)包板：ELISA板的微量滴定孔用100μL捕获物包被抗体—鼠单克隆抗体，以5μg/mL包被，于4℃过夜，或37℃恒温烘箱孵育2h；
(2)洗板：接着用PBST重复洗涤三遍以除去未结合的抗体，拍干；
(3)封闭：每个孔中加200μL封闭缓冲液；
(4)加样品：用12孔排枪将稀释好的样品α-乳白蛋白标准品加入96孔酶标板中，每孔加液量为100μL，置于37℃恒温烘箱中孵育30min；
(5)加兔抗血清：按照步骤(2)操作步骤洗板，拍干后，取100μL检测抗体(多克隆抗体)在稀释缓冲溶液液PBS中稀释一定倍数后，将其加入到每个孔中，并在37℃恒温烘箱中孵育30min；
(6)加HRP标记的山羊抗兔IgG抗体：按照步骤(2)操作步骤洗板，拍干后，按照与先前步骤相同的方式，将HRP标记的山羊抗兔IgG——酶标二抗稀释至一定倍数后，加入孔中，每孔加液量为100μL，并在37℃恒温烘箱中孵育30min；
(7)显色：按照步骤(2)操作步骤洗板，拍干后，最后将新鲜配制的TMB底物显色溶液添加到每个孔中，100μL/well，在37℃恒温烘箱中孵育15min；
(8)终止：反应用2M H2SO4终止，每孔加液量为50μL，吸光度值为测定450nm。
优选地，α-乳白蛋白最优捕获抗体的筛选及兔多抗工作浓度的优化过程中：
将筛选得到的8株鼠单克隆抗体作为捕获抗体分别包被酶标板，控制包被浓度、α-乳白蛋白标准品稀释和兔多抗稀释浓度不变，用磷酸盐缓冲液稀将HRP标记的山羊抗兔IgG抗体释为1:5000、1:10000和1:15000三个梯度，以未加标品的磷酸盐缓冲液作为阴性对照，通过将α-乳白蛋白标准品稀释为5ng/mL和100ng/mL测定OD450，进行初步筛选，将α-乳白蛋白标准品稀释为100ng/mL和200ng/mL，进行最终确定，从而进行α-乳白蛋白最优捕获抗体的筛选及兔多抗工作浓度的优化。
优选地，α-乳白蛋白酶标二抗最佳工作浓度的确定过程中：
根据确定的最优捕获抗体和兔多抗最佳工作浓度，将α-乳白蛋白标准品浓度稀释为10ng/mL和200ng/mL两个梯度浓度，其余条件不变，其余条件不变，对HRP标记的山羊抗兔IgG抗体进行最优稀释倍数的确定，将其稀释为1:5000、1:10000和1:15000三个梯度浓度，以未加标品的磷酸盐缓冲液作为阴性对照，通过测定OD450，确定α-乳白蛋白酶标二抗最佳工作浓度。
优选地，最优捕获抗体选择4A2；兔多抗的工作浓度为1:15000；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(酶标二抗)最佳工作浓度为1:10000。
优选地，标准曲线的建立过程中：
按照确定的α-乳白蛋白最优捕获抗体、兔多抗最佳工作浓度和α-乳白蛋白酶标二抗最佳工作浓度下，以未加标品的磷酸盐缓冲液作为阴性对照，以吸光度OD450为纵坐标，以α-乳白蛋白标准品浓度为横坐标，并将横坐标设置成对数形式，利用Origin软件中的logistic模型进行四参数拟合，然后绘制出双抗夹心ELISA标准曲线。通过P/N(阳性/阴性)＞2.1来计算α-乳白蛋白的LOD。
优选地，标准曲线线性范围为2.5-40ng/mL，检出限为2.5ng/mL；该方法对α-乳白蛋白检测的批内变异系数CV在2.69-6.27％之间，批间变异系数CV在8.06-12.41％之间；该方法只与α-乳白蛋白发生交叉反应；该方法对α-乳白蛋白的回收率为84.6-93.6％。
与现有技术相比，本发明通过建立的双抗体夹心法测得α-乳白蛋白的批内变异系数CV在2.69-6.27％之间，批间变异系数CV在8.06-12.41％之间，具有较高的精密度，建立的标准曲线线性范围为2.5-40ng/mL，检出限为2.5ng/mL，对α-乳白蛋白的回收率为84.6-93.6％，具有较高的准确度，能够满足牛乳中α-乳白蛋白过敏原的检测要求。
附图说明
图1为α-乳白蛋白四免兔血清效价。
图2为α-乳白蛋白单抗SDS-PAGE电泳。
图3为Western-blotting检测α-乳白蛋白单克隆抗体的特异性。
图4为双抗体夹心ELISA法检测α-乳白蛋白标准曲线。
具体实施方式
一种定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，包括以下步骤：
A、以牛乳过敏原α-乳白蛋白作为免疫抗原，免疫大白兔，获得兔多克隆抗体；
B、对兔多克隆抗体的纯度、效价、特异性及亲和力进行鉴定；
C、以牛乳过敏原α-乳白蛋白作为抗原，免疫小鼠，获得鼠单克隆抗体；
D、对鼠单克隆抗体的纯度、效价、特异性及亲和力进行鉴定；
E、建立α-乳白蛋白双抗夹心ELISA检测方法，包括：α-乳白蛋白最优捕获抗体的筛选、兔多抗工作浓度的优化、α-乳白蛋白酶标二抗最佳工作浓度的确定和标准曲线的建立。
本发明采用酶联免疫技术，该酶联免疫技术首先是将抗原或抗体在物理吸附作用下与聚苯乙烯进行结合，保证其免疫活性的完整性；其次，抗体(抗原)与酶标抗原(酶标抗体)在化学键的作用下进行偶联作用，保证酶标抗体(酶标抗原)的酶活性和免疫活性的完整性；最后，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)与酶标抗体(酶标抗原)上的表面结合位点进行结合，再加入显色液后，根据显色情况进行结果判定。也可以在酶标仪处，进行OD450的测定，建立标准曲线，进行定量检测分析。酶作为催化剂，起到了催化化学反应和放大化学信号的作用，从而大大提高了检测灵敏度。目前，在对生物医学、农兽药残留、水产品和食品等的快速检测中，酶联免疫分析已得到了广泛的应用。同时，酶联免疫吸附试验(ELISA)在食品过敏原检测方面(定性定量分析)也应用的非常广泛。随着ELISA技术的发展，与之相对应的商用试剂盒也应运而生，从而达到了快速、简便的目的。
本发明检测对象为牛乳中的α-乳白蛋白，α-乳白蛋白占乳清蛋白的41％和牛乳中蛋白质总量的28％。据不完全统计，由α-乳白蛋白引起的牛乳过敏超过51％。本发明以牛乳主要过敏原α-乳白蛋白作为免疫原分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠，制备兔源多克隆抗体和鼠源单克隆抗体，并对其性能进行鉴定评价，然后将两者进行夹心配对，从而建立能够检测牛乳主要过敏原α-乳白蛋白的双抗夹心ELISA检测方法，通过该方法得到α-乳白蛋白的检出限为2.5ng/mL。标准曲线在2.5-40ng/mL范围内线性良好，该方法只与α-乳白蛋白发生交叉反应，表明具有较好的特异性；该方法对α-乳白蛋白的回收率为84.6-93.6％，表明该方法具有较高的准确度，能够满足牛乳中α-乳白蛋白过敏原的检测要求。
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：α-乳白蛋白兔多克隆抗体的制备与鉴定
1、α-乳白蛋白兔抗血清的制备
(1)制备兔多克隆抗体
将α-乳白蛋白作为免疫原，采用颈背部皮下多点少量注射的免疫方式对2.0kg左右的健康雄性新西兰大白兔进行免疫，制备兔多克隆抗体，具体操作步骤如下：
①准确称取500μg纯化蛋白作为免疫原(α-乳白蛋白)，使用无菌生理盐水将其稀释至一定体积，再加入等体积的弗氏完全佐剂(只有初次免疫使用弗氏完全佐剂)；然后使用银汞调和机将溶液和佐剂作用90s左右，重复四次，使其充分混匀，形成油包水的状态，即在水面上形成不分散的小油滴(油包水的状态非常重要)，将乳化彻底的免疫原用1mL一次性无菌注射器进行背部皮下注射免疫，打8-10个点，每种蛋白分别免疫两只兔子；
②初次免疫新西兰大白兔14d后，进行第二次免疫，操作步骤同①；
③第二次免疫7d后，进行第三次免疫，操作步骤同②；
④第四次免疫同第三次免疫；
⑤在第三次免疫前可在大白兔耳静脉或动脉采全血，将收集到的全血置于37℃烘箱静置1h左右(为防止气味挥发，可用封口膜封起)，血即将凝固，使用冷冻高速离心机在4℃，5000rpm条件下，离心10min，取上清重复操作，离心2次，检测效价；
⑥当血清效价达到要求时即可通过颈动脉进行取血。
(2)兔子颈动脉取血
①使用麻醉剂(3％戊巴比妥钠)按照1mL/kg体重的剂量对新西兰大白兔进行耳静脉注射麻醉后，将其仰卧式固定在手术操作台上；
②将大白兔头部放低使其颈部皮毛完全暴露于视野中，以颈部中线为中心进行剔毛，然后使用酒精对暴露皮肤进行消毒；
③顺着颈部的中心线，在距离头颈临界5-6cm处，使用手术刀直接切开长度约为10cm的切口，清理皮下组织，直到气管两侧胸锁乳突肌明显暴露在视野中；
④把处于气管与胸锁乳突肌间隙的颈三角区域的组织分离出来，可以看到有三条血管，颜色最红的是颈动脉，两条暗花的是静脉，用有齿止血钳分离出颈动脉，但注意不要损伤静脉；
⑤在颈动脉动脉下嵌入两根细线，分别放置于近心端和远心端，用止血钳夹住近心端的动脉；
⑥用10cm弯头手术剪子在两根细线间的动脉血管璧上倾斜30-45°剪开一个小口，插入静脉注射塑料管。用两根细线把远心端及近心端的静脉注射塑料管和动脉血管壁扎紧来固定放血管，使放血管不会由于压力的作用脱滑；
⑦松开止血钳，使血液流入无菌三角烧瓶中；
⑧将采好的血液置于37℃鼓风干燥箱中，大概在0.5-1h后血液会发生凝固，然后将三角烧瓶中的血液放置于4℃冰箱内，3-4h后血块收缩，此时渗出血清。等到血液凝固、血块彻底收缩后，再将渗出的血清置于冷冻高速离心机中，在4℃、3000rpm下，离心20min，而后将沉淀物除掉。将血清与甘油按1:1等比混合，并加入0.05％的叠氮钠，充分混匀后分装，-20℃保存备用。
2、兔免疫血清效价的测定
抗血清效价是免疫效果的重要指标之一。多克隆抗体效价的测定采用间接ELISA法，具体操作步骤如下：
(1)包被：将包被原稀释至1、0.5、100μL/well包被96孔酶标板，4℃过夜，或37℃恒温鼓风干燥箱内孵育2h；
(2)洗涤：倒去酶标孔内溶液，甩干，并用PBST洗3次，置于水平脱色摇床上，每次3分钟；
(3)封闭：每孔加200μL封闭液PBST，置于恒温鼓风干燥箱内37℃封闭2h；
(4)一抗稀释：一抗血清起始稀释至100倍(2μL一抗血清+998μL抗体稀释液)，再稀释至1000倍，随后在稀释板上进行3倍倍比稀释；
(5)加一抗：酶标板洗好后，加梯度稀释好的一抗，100μL/well，37℃恒温鼓风干燥箱内孵育30min；
(6)加二抗：酶标板洗好后，把HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(兔二抗)稀释2500倍和5000倍加加样，100μL/well，37℃恒温烘箱内孵育30min；
(7)显色：酶标板洗好后，加入新鲜配制的TMB底物显色液，100μL/well，37℃恒温烘箱内孵育15min；
(8)终止：2M H2SO4终止反应，50μL/well；
(9)读板：于酶标仪处读取OD450的值。
以P/N(阳性孔/阴性孔)＞2.1时抗体的稀释倍数作为兔抗血清的效价。
大白兔在第二次免疫后，进行耳静脉采血(如遇冷天，可进行耳动脉采血)，采用间接ELISA方法测定其效价，原则上选择效价高的兔子进行兔多克隆抗体血清的收集。由于初次免疫效价较低，从第二次免疫开始检测免疫α-乳白蛋白的2只大白兔血清效价，结果见图1。从图1可以看出，免疫α-乳白蛋白抗原第四次免疫后是2#兔血清效价最高，效价均达到1:729000。
3、兔多抗血清的纯化
(1)用移液枪准确吸取已制备好的兔抗血清5mL，在4℃，12000rpm下，离心10min，将上清吸出，加入离心管中，再加入10mL pH 5.0的60mmol/L醋酸钠溶液，搅拌均匀，将其pH调节至4.5左右，在室温下置于磁力搅拌器上搅拌30min，同时逐滴加入正辛酸，然后静置不少于2h，使其充分沉淀；
(2)将所得上清液在4℃，12000rpm下，离心30min，将离心所得上清液转移至透析袋中，置于pH 8.0、0.01mol/L PBS透析液中透析24h；
(3)在透析后的上清液中加入0.277g/mL的硫酸铵溶液，边加边搅拌，4℃静置12h，然后在4℃，12000rpm下，离心30min，弃去上清；
(4)将所得沉淀用0.01moL/L pH 7.4的PBS溶解，转移至透析袋中，透析72h，每6h换液一次，透析完全后，在4℃，12000rpm下，离心30min，弃去不溶性沉淀蛋白，最后使用PEG20000浓缩。
4、兔多克隆抗体浓度的测定
多抗浓度的测定采用BCA法，取96孔酶标板，按下面表1加入各试剂：
表1 BCA法测蛋白浓度的试剂列表
Figure BDA0002976064030000101
加完上述试剂后，准确吸取20μL待测样品溶液加入酶标板孔内，然后加入200μL新鲜配制的BCA显色液，轻轻摇动酶标板，置于37℃鼓风干燥箱中孵育30min，以PBS为空白对照孔，于酶标仪处测量590nm吸光度。以吸光值OD590为纵坐标，蛋白质浓度(mg/mL)为横坐标，绘制出标准曲线，根据样品的吸光值和线性方程计算出样品中蛋白质的含量。
5、兔多克隆抗体纯度的测定
本实验按照标准程序，通过借助SDS-PAGE凝胶电泳对生产的多克隆抗体的纯度进行鉴定。
(1)具体实验条件为：10％的分离胶和5％的浓缩胶；电极缓冲液为pH 8.3、0.1％SDS、0.384mol/L甘氨酸，0.05mol/L Tris，电压80V，电泳时间1.5h。
(2)具体操作步骤如下：用含有2％SDS，5％β-巯基乙醇，Tris-HCl(pH8.0)等样品缓冲液，将样品溶解稀释到1-2mg/mL，沸水浴3min左右，在8000rpm下离心10min，吸取10μL上样。电泳结束后，用考马斯亮蓝G-250染色液进行染色4h，然后在室温下，将凝胶置于水平摇床上用脱色液对其进行脱色。
兔免疫血清经过辛酸-饱和硫酸铵方法纯化后，采用SDS-PAGE凝胶电泳对其进行纯度鉴定，以确定所得到的兔多抗具有较高的纯度。其结果如下图2所示，抗α-乳白蛋白兔多抗轻链和重链清晰可见，重链蛋白分子量在50kDa左右，说明抗α-乳白蛋白兔多抗纯度较高。
实施例2：α-乳白蛋白鼠单克隆抗体的制备与鉴定
1、BALB/c小鼠的免疫
免疫方案(购买的BALB/c小鼠需要适应新环境后才能进行注射免疫，将预饲养时间设定为7天)。
表2小鼠免疫方案
Figure BDA0002976064030000111
2、杂交瘤细胞株的筛选建立
(1)骨髓瘤细胞SP 2/0的复苏与培养
在不使用的情况下，需要将骨髓瘤细胞SP 2/0冻存在液氮罐或-150℃超低温冰箱中。在细胞融合前一周左右，需要将冻存在液氮罐或-150℃超低温冰箱中的骨髓瘤细胞SP2/0进行复苏和扩大培养。具体操作步骤如下：先将超净台和细胞间进行紫外灭菌处理，同时将恒温水浴锅提前预热到37℃，将冻存管从液氮罐或-150℃超低温冰箱取出，迅速转移至已预热至37℃的恒温水浴锅中进行融化，时间控制在1min之内，然后在超净工作台中，把冻存管中融化的细胞转移至提前准备好的10mL 20％完全培养基中，置于离心机中，在500rpm下，离心10min，弃去上清，加入20％完全培养基，用移液枪轻轻吹打均匀后转移至细胞培养皿中，在细胞培养箱中进行培养(37℃，5％CO2)。
在骨髓瘤细胞SP 2/0培养的过程中，隔天换液，当细胞长至整个培养皿70-80％的时候，进行传代培养。融合前一天，对骨髓瘤细胞SP 2/0进行培养液换液处理，并将其生长期调整至对数生长状态下。在细胞融合当天，弃去细胞上清液，加入新鲜的不完全培养基DMEM，用移液枪将细胞从培养皿上吹打下来后，转移至50mL离心管中，在1000rpm下，离心10min，弃去上清液，
重复操作一次，将离心后的细胞弹松，重悬于10mL不完全培养基DMEM中，并取少量悬液梯度稀释10倍和100倍，使用血球计数板进行计数。
(2)阳性脾细胞的制备
选取第6次免疫后具有最高抗血清效价的小鼠作为脾源，在融合前3天，采取腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫剂量减半并且不加任何佐剂。在融合当天，进行摘眼球取血，用1.5mL PE管接取小鼠的眼血，取尽为止，然后将其置于37℃烘箱中10min左右，在对小鼠进行分层后，在4℃，1000rpm下离心10min，用移液枪收集上清并分装后，置于-20℃储存备用，收集的血清作为细胞融合阳性检测时的阳性对照；将采用颈部脱臼法处死后小鼠立即放入乘有75％乙醇的烧杯中进行消毒，时间控制在5min之内，将消毒的小鼠快速转移至灭菌好的超净台中，在无菌条件下，将脾脏取出，使用5mL注射器胶头在200目筛网上将其充分研磨，收集脾细胞悬液，在1000rpm下，离心10min。重新加入不完全培养基DMEM，重复操作三次，最后一次离心后，轻轻弹松离心管底部细胞，重悬于10mL不完全培养基DMEM中，并取少量悬液梯度稀释10，100和1000倍，使用血球计数板进行计数。
(3)细胞融合
将DMEM培养基，20％完全培养基，25％HAT选择培养基，提前置于37℃水浴中预热。取1mL诱导融合剂PEG 1450和15mL DMEM培养基置于37℃培养箱中提前预热。分别收集SP2/0骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞，按照1:5-15加入50mL离心管中，混合均匀后1000rpm离心10min，弃去上清，加入DMEM培养基重悬，重复上述操作一次。轻轻弹松离心管底部细胞，尽量让其均匀分布在50mL离心管底部。用移液枪吸取提前预热好的1mL PEG1450加入离心管，边加边转动离心管，整个过程要尽量保证匀速滴加，且确保离心管底部始终握于手心，并要在60-90s内完成，然后放置在离心管架上静置30s左右，期间从细胞培养箱中取出提前预热好的15mL DMEM培养基，用1mL移液枪吸取滴加进离心管中，进行终止融合反应，操作与滴加PEG 1450相同，在10min内完成。对融合后的细胞悬液进行离心，离心速度为1000rpm，离心时间为10min，弃去上清液，用HAT选择培养基对细胞进行重悬，注意动作一定要轻缓。将重悬后的细胞悬液，以每孔200μL的加液量平铺在96孔细胞培养板中，一共铺8块板，将其转移至二氧化碳细胞培养箱(37℃，5％CO2)进行培养。
(4)杂交瘤细胞的筛选
细胞上清阳性釆用间接ELISA法进行检测，具体操作步骤参考兔免疫血清效价的测定，将其中HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(兔二抗)改为HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体(鼠二抗)，将一抗血清改为细胞上清液。
(5)杂交瘤细胞的冻存
在制备单克隆抗体的过程中，细胞的冻存是至关重要的，我们需要将SP 2/0，杂交瘤细胞及亚克隆的杂交瘤细胞及时地进行冻存。细胞冻存的具体步骤如下：收集需要冻存的细胞，离心，弃去细胞上清液，加入1mL细胞冻存液，用移液枪轻轻吹打均匀后，转移至冻存管中，用封口膜封好管口，并做好标记(名称、细胞株编号、冻存日期等)。冻存管在4℃放置1h后，取出置于-20℃存放2h，最后在-80℃过夜后转入液氮中进行长期冻存保存备用。
(6)单克隆抗体的大量生产
需提前一周左右将无菌石蜡油注射入健康的BALB/c小鼠腹腔内，0.5mL/只。将制备的能稳定分泌α-乳白蛋白单抗杂交瘤细胞株注射进BALB/c小鼠腹腔体中，每只小鼠注射1×106个细胞左右。7天后，每天观察小鼠状态，若发现小鼠腹部明显变大，且用手触摸肚皮有紧绷感，即可用针头采集腹水，将抽取出的腹水在4℃，1×104rpm，离心10min，弃去上层脂类和下层沉淀物，收集中层澄清腹水并分装后，置于-20℃冻存备用。
(7)单克隆抗体特异性鉴定
单克隆抗体的特异性可以采用交叉反应实验和Western-blotting进行鉴定，本发明采用Western-blotting对所制备的α-乳白蛋白单抗特异性进行鉴定，结果如下图所示，如图3，α-乳白蛋白在14.4kDa左右有清晰的免疫印迹条带。这也进一步说明了所制备的单克隆抗体对α-乳白蛋白具有良好的特异性。
(8)单抗亚型鉴定
本发明釆用商业化的小鼠抗体Ig类/亚类试剂盒对所制备α-乳白蛋白单抗亚型进行鉴定，按照说明书进行操作，具体操作步骤如下：
①包被：将包被原稀释至1μg/mL，100μL/well包被酶标板，4℃过夜，或37℃恒温烘箱内孵育2h。
②洗涤：倒去酶标孔内液体，甩干，并用PBST洗3次，每次3min，重复操作3次。
③封闭：每孔加200μL封闭液，37℃封闭2h。
④一抗稀释：将纯化后的单抗起始稀释至1000倍(10μL单抗+990μL抗体稀释液)，随后在稀释板上进行3倍倍比稀释。
⑤加一抗：将梯度稀释的一抗加入洗好的酶标板内，100μL/well，37℃恒温烘箱内孵育30min。
⑥加二抗：酶标板洗好后，把提前稀释到1000倍的二抗(IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、Kappa、Lambda)加入酶标孔中，100μL/well，37℃恒温烘箱内孵育30min。
⑦显色：酶标板洗好后，加入新鲜配制的TMB显色液，100μL/well，37℃恒温烘箱内孵育15min。
⑧终止：2M H2SO4终止反应，50μL/well。
⑨读板：于酶标仪处读取OD450的值。根据显色深浅以及OD450判断单抗亚型。
(9)单抗亲和力鉴定
采用非竞争性间接ELISA方法测定抗体亲和力。具体方法为：将α-乳白蛋白浓度用PBS(0.01M，pH 7.4)梯度稀释为1.6，0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.25，0μg/mL，100μL/well，包被96孔酶标板，37℃孵育2h。用PBST洗板3次，每次3min，拍干后，每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h。将单抗从1000倍开始按3倍比稀释，100μL/well，加入封闭好的酶标板中，37℃孵育30min。洗板3次后，每孔加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育30min。最后每孔加入2M的H2SO4溶液终止反应，于酶标仪处测定OD450值。
在直角坐标系内，横坐标为抗体浓度(mol/L)的对数，纵坐标为相对应的吸光度，在坐标系内做出反应曲线，找出各条曲线的ODmax所对应的抗体浓度，并计算50％ODmax所对应的抗体浓度。根据公式(1)计算该株抗体的亲和常数K。
K＝(n-1)/2(n[Ab']t-[Ab]t) 公式(1)
注：n为每组中两个包被浓度的倍数，[Ab']t、[Ab]t分别为每组中两个50％ODmax所对应的抗体浓度。
根据公式计算该株抗体的亲和常数K。得到α-乳白蛋白亲和力标准曲线，通过计算，结果得出，α-乳白蛋白单克隆抗体的亲和常数为3.5×107L/mol，一般认为，当亲和常数K在107-1012L/mol范围时，抗体亲和力较高，故所获单克隆抗体亲和力较高。
实施例3：α-乳白蛋白双抗夹心ELISA方法的建立
1、α-乳白蛋白双抗夹心ELISA方法
具体操作步骤如下：
(1)包板：ELISA板的微量滴定孔用100μL捕获物包被抗体(单克隆抗体)以5μg/mL包被，于4℃过夜，或37℃恒温烘箱孵育2h；
(2)洗板：接着用PBST重复洗涤三遍以除去未结合的抗体，拍干；
(3)封闭：每个孔中加200μL封闭缓冲液；
(4)加样品：用12孔排枪将稀释好的样品(标准品)加入96孔酶标板中，每孔加液量为100μL，置于37℃恒温烘箱中孵育30min；
(5)加兔抗血清：按照步骤(2)操作步骤洗板，拍干后，取100μL检测抗体(多克隆抗体)在稀释缓冲溶液液PBS中稀释一定倍数后，将其加入到每个孔中，并在37℃恒温烘箱中孵育30min；
(6)加HRP标记的山羊抗兔IgG抗体：按照步骤(2)操作步骤洗板，拍干后，按照与先前步骤相同的方式，将HRP标记的山羊抗兔IgG稀释至一定倍数后，加入孔中，每孔加液量为100μL，并在37℃恒温烘箱中孵育30min；
(7)显色：按照步骤(2)操作步骤洗板，拍干后，最后将新鲜配制的TMB底物显色溶液添加到每个孔中，100μL/well，在37℃恒温烘箱中孵育15min；
(8)终止：反应用2M H2SO4终止，每孔加液量为50μL，吸光度值为测定450nm。
2、α-乳白蛋白最优捕获抗体的筛选及兔多抗工作浓度的优化
将筛选得到的8株α-乳白蛋白鼠源单克隆抗体作为捕获抗体分别包被酶标板，包被浓度为5μg/mL，α-乳白蛋白标准品稀释至一定浓度梯度进行加样，用磷酸盐缓冲液将辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(酶标二抗)稀释为1:5000、1:10000和1:15000三个梯度，将辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(酶标二抗)稀释为1:10000，以未加标品的磷酸盐缓冲液作为阴性对照。
本发明将筛选得到的8株α-乳白蛋白鼠源单克隆抗体作为捕获抗体分别包被酶标板，控制包被浓度、α-乳白蛋白标准品稀释和兔多抗稀释浓度不变，用磷酸盐缓冲液稀将辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(酶标二抗)释为1:5000、1:10000和1:15000三个梯度，以未加标品的磷酸盐缓冲液作为阴性对照，将α-乳白蛋白标准品稀释为5ng/mL和100ng/mL，通过测定OD450，可以初步筛选得到4A2和2F8与兔多抗配对成功；将α-乳白蛋白标准品稀释为100ng/mL和200ng/mL，结果如表3所示，可以最终确定，兔多抗的最佳稀释倍数选择为1:15000，最优捕获抗体选择4A2。
表3捕获抗体筛选及兔多抗最佳工作浓度的优化
Figure BDA0002976064030000161
3、α-乳白蛋白酶标二抗最佳工作浓度的确定
本发明根据上述内容确定的最优捕获抗体和兔多抗最佳工作浓度，将α-乳白蛋白标准品浓度稀释为10ng/mL和200ng/mL两个梯度浓度，其余条件不变，对α-乳白蛋白辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(酶标二抗)进行最优稀释倍数的确定，将其稀释为1:5000、1:10000和1:15000三个梯度浓度，以未加标品的磷酸盐缓冲液作为阴性对照，通过测定OD450，结果如下表4所示，可以看出，酶标二抗的最佳稀释倍数选择为1:10000。
表4酶标二抗最佳工作浓度的优化
Figure BDA0002976064030000162
4、双抗夹心ELISA法检测α-乳白蛋白标准曲线的建立
本发明按照以上确定的最优捕获抗体和兔多抗最佳工作浓度和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(酶标二抗)最佳工作浓度下，其余条件不变，以未加标品的磷酸盐缓冲液作为阴性对照，将α-乳白蛋白标准品的浓度设置为0，1.25，2.5，5，10，20，40，80，160，320ng/mL共10个浓度梯度，以吸光度OD450为纵坐标，以α-乳白蛋白标准品浓度(ng/mL)为横坐标，并将横坐标设置成对数形式，利用Origin软件中的logistic模型进行四参数拟合，然后绘制出双抗夹心ELISA标准曲线。通过P/N(阳性/阴性)＞2.1来计算α-乳白蛋白的LOD。如图4所示，α-乳白蛋白浓度在2.5-40ng/mL范围内具有良好的线性关系，LOD可达2.5ng/mL。
5、α-乳白蛋白双抗夹心ELISA方法特异性的测定
本发明选择了5种牛乳中主要蛋白(牛血清白蛋白BSA、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白和卵清蛋白OVA)，将5种交叉反应物蛋白稀释至0.1、1、10ng/mL三个梯度，用建立的α-乳白蛋白双抗夹心ELISA方法检测其OD450值，磷酸缓冲液PBS作为阴性对照；通过计算得到P/N值结果如表5所示，可以看出，本实验建立的α-乳白蛋白双抗夹心ELISA检测方法只与α-乳白蛋白蛋白发生交叉反应，和其余蛋白不发生交叉反应，说明本文建立的α-乳白蛋白双抗夹心ELISA检测方法具有很高的特异性。
表5交叉反应结果(P/N)
Figure BDA0002976064030000171
6、α-乳白蛋白双抗夹心ELISA方法精密度的测定
本发明通过批内差异和批间差异两个因素来对所建立的α-乳白蛋白双抗夹心ELISA方法进行精密度的评价，而批内差异和批间差异一般需要通过变异系数CV来表示。
变异系数CV(％)＝SD/X×100％ 公式(2)其中：SD—标准偏差；X—平均数
具体测定方法如下：
a、批内差异：将α-乳白蛋白标准品稀释成40、80和160ng/mL三个梯度浓度，在同一批实验内每个浓度做5个平行，比较相同浓度下吸光度OD450变化情况，计算变异系数CV。
b、批间差异：将α-乳白蛋白标准品稀释成40、80和160ng/mL三个梯度浓度，每个浓度在每天进行两次测定分析，连续进行5天测定，根据5天测定的吸光度OD450变化情况，计算变异系数CV。
通过将α-乳白蛋白标准品稀释成8、16和30ng/mL三个梯度浓度，在批内和批间进行测定，计算变异系数CV，结果如下表6所示，本文建立的α-乳白蛋白双抗夹心ELISA方法对α-乳白标准品检测的批内变异系数CV在2.69-6.27％之间，批间变异系数CV在8.06-12.41％之间，无论批内还是批间CV均低于15％，说明建立的α-乳白蛋白双抗夹心ELISA检测方法具有较高的精密度。
表6α-乳白蛋白加标批内批间变异系数CV测定结果(n＝5)
Figure BDA0002976064030000181
7、α-乳白蛋白双抗夹心ELISA方法加标回收率的测定
在超市中购买外包装袋上没有标注含有牛乳过敏原α-乳白蛋白的饼干，将α-乳白蛋白标准品溶液稀释成5、10和20ng/mL三个梯度浓度对购买的饼干进行添加回收。每个浓度分别做3个平行，测定样品中α-乳白蛋白的含量，并计算其加标回收率。
回收率(％)＝(加标样品检测值-未加标样品检测值)÷加标量×100％ 公式(3)
结果如表7所示，可以看出，本文建立的α-乳白蛋白双抗夹心ELISA检测方法得到的α-乳白蛋白加标回收率的范围在84.6-93.6％之间，能够满足牛乳实际样品中过敏原α-乳白蛋白的检测要求。
表7α-乳白蛋白双抗夹心ELISA加标回收结果(n＝3)
Figure BDA0002976064030000182
Figure BDA0002976064030000191
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，包括以下步骤：
A、以牛乳过敏原α-乳白蛋白作为免疫抗原，免疫大白兔，获得兔多克隆抗体；
B、对兔多克隆抗体的纯度、效价、特异性及亲和力进行鉴定；
C、以牛乳过敏原α-乳白蛋白作为抗原，免疫小鼠，获得鼠单克隆抗体；
D、对鼠单克隆抗体的纯度、效价、特异性及亲和力进行鉴定；
E、建立α-乳白蛋白双抗夹心ELISA检测方法，包括：α-乳白蛋白最优捕获抗体的筛选、兔多抗工作浓度的优化、α-乳白蛋白酶标二抗最佳工作浓度的确定和标准曲线的建立。
2.根据权利要求1所述的定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，步骤A和B中，兔多克隆抗体的获取和鉴定，包括以下步骤：
以牛乳α-乳白蛋白作为免疫抗原，与弗氏佐剂等量混合后，采用颈背部皮下注射的免疫方式对健康的新西兰大白兔进行免疫，制备得到兔血清；
将制备的兔血清通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀法进行纯化分离；采用SDS-PAGE凝胶电泳法对纯化后的兔血清进行纯度的鉴定，得到纯化的抗α-乳白蛋白多克隆抗体；对α-乳白蛋白进行四次免疫，每次免疫的剂量为500μg/只；对纯化后的兔血清采用间接ELISA法测定其效价。
3.根据权利要求1所述的定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，步骤B中，鼠单克隆抗体的获取包括以下步骤：
采用与兔多克隆抗体制备相同的免疫方式和免疫抗原对健康的适龄雌性BALB/c小鼠进行免疫，对α-乳白蛋白进行六次免疫，初免剂量均为100μg/只，加强免疫剂量均为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只，利用间接ELISA法检测小鼠免疫血清，选取六免血清效价最高的小鼠；
通过细胞融合和间接ELISA法检测筛选阳性孔，采用有限稀释法通过亚克隆后筛选得到8株稳定分泌α-乳白蛋白单抗的杂交瘤细胞株，分别记为：2H11、3A10、1C3、2F8、3A5、4A2、4A3、4B10；
采用体内腹水诱生法进行鼠单克隆抗体的大量生产。
4.根据权利要求3所述的定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，步骤D中，对鼠单克隆抗体鉴定包括以下步骤：
通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对获得的腹水单抗进行纯化；采用SDS-PAGE凝胶电泳法对纯化后的腹水单抗的纯度进行鉴定；采用间接ELISA法测定其效价，根据商用单抗亚型试剂盒鉴定单抗亚型。
5.根据权利要求4所述的定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法，其特征在于：
间接ELISA法测定效价的结果表明α-乳白蛋白的2个单抗2H11和3A10效价偏低，为1:27000，α-乳白蛋白其余6个单抗1C3、2F8、3A5、4A2、4A3和4B10的效价均达到1:243000，鼠单克隆抗体亲和力常数为3.5×107L/mol；
商用单抗亚型试剂盒鉴定的而结果表明，α-乳白蛋白的3A10分泌的单抗亚型为IgG2b，α-乳白蛋白的其余细胞株分泌的单抗亚型为IgG1。
6.根据权利要求3所述的定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，α-乳白蛋白最优捕获抗体的筛选、兔多抗工作浓度的优化和α-乳白蛋白酶标二抗最佳工作浓度的确定采用以下方法：
(1)包板：ELISA板的微量滴定孔用100μL捕获物包被抗体—鼠单克隆抗体，以5μg/mL包被，于4℃过夜，或37℃恒温烘箱孵育2h；
(2)洗板：接着用PBST重复洗涤三遍以除去未结合的抗体，拍干；
(3)封闭：每个孔中加200μL封闭缓冲液；
(4)加样品：用12孔排枪将稀释好的样品α-乳白蛋白标准品加入96孔酶标板中，每孔加液量为100μL，置于37℃恒温烘箱中孵育30min；
(5)加兔抗血清：按照步骤(2)操作步骤洗板，拍干后，取100μL检测抗体(多克隆抗体)在稀释缓冲溶液液PBS中稀释一定倍数后，将其加入到每个孔中，并在37℃恒温烘箱中孵育30min；
(6)加HRP标记的山羊抗兔IgG抗体：按照步骤(2)操作步骤洗板，拍干后，按照与先前步骤相同的方式，将HRP标记的山羊抗兔IgG——酶标二抗稀释至一定倍数后，加入孔中，每孔加液量为100μL，并在37℃恒温烘箱中孵育30min；
(7)显色：按照步骤(2)操作步骤洗板，拍干后，最后将新鲜配制的TMB底物显色溶液添加到每个孔中，100μL/well，在37℃恒温烘箱中孵育15min；
(8)终止：反应用2M H2SO4终止，每孔加液量为50μL，吸光度值为测定450nm。
7.根据权利要求6所述的定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，α-乳白蛋白最优捕获抗体的筛选及兔多抗工作浓度的优化过程中：
将筛选得到的8株鼠单克隆抗体作为捕获抗体分别包被酶标板，控制包被浓度、α-乳白蛋白标准品稀释和兔多抗稀释浓度不变，用磷酸盐缓冲液稀将HRP标记的山羊抗兔IgG抗体释为1:5000、1:10000和1:15000三个梯度，以未加标品的磷酸盐缓冲液作为阴性对照，通过将α-乳白蛋白标准品稀释为5ng/mL和100ng/mL测定OD450，进行初步筛选，将α-乳白蛋白标准品稀释为100ng/mL和200ng/mL，进行最终确定，从而进行α-乳白蛋白最优捕获抗体的筛选及兔多抗工作浓度的优化。
8.根据权利要求7所述的定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，α-乳白蛋白酶标二抗最佳工作浓度的确定过程中：
根据确定的最优捕获抗体和兔多抗最佳工作浓度，将α-乳白蛋白标准品浓度稀释为10ng/mL和200ng/mL两个梯度浓度，其余条件不变，其余条件不变，对HRP标记的山羊抗兔IgG抗体进行最优稀释倍数的确定，将其稀释为1:5000、1:10000和1:15000三个梯度浓度，以未加标品的磷酸盐缓冲液作为阴性对照，通过测定OD450，确定α-乳白蛋白酶标二抗最佳工作浓度。
9.根据权利要求8所述的定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，标准曲线的建立过程中：
按照确定的α-乳白蛋白最优捕获抗体、兔多抗最佳工作浓度和α-乳白蛋白酶标二抗最佳工作浓度下，以未加标品的磷酸盐缓冲液作为阴性对照，以吸光度OD450为纵坐标，以α-乳白蛋白标准品浓度为横坐标，并将横坐标设置成对数形式，利用Origin软件中的logistic模型进行四参数拟合，然后绘制出双抗夹心ELISA标准曲线。通过P/N(阳性/阴性)＞2.1来计算α-乳白蛋白的LOD。
10.根据权利要求1或9所述的定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，标准曲线线性范围为2.5-40ng/mL，检出限为2.5ng/mL；该方法对α-乳白蛋白检测的批内变异系数CV在2.69-6.27％之间，批间变异系数CV在8.06-12.41％之间；该方法只与α-乳白蛋白发生交叉反应；该方法对α-乳白蛋白的回收率为84.6-93.6％。
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