ES2270638T3 - Deteccion de microorganismos acido-resistentes en las heces. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la detección de una infección en un mamífero por un microorganismo ácido-resistente en ee (a) una muestra de heces del mamífero se incuba con dos o tres anticuerpos monoclonales diferentes, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros, bajo condiciones que permiten la formación de complejos de antígenos del microorganismo ácido-resistente con los anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos o los aptámeros, y en el que (aa) el primer anticuerpo monoclonal o fragmento o derivado del mismo o el primer aptámero se une específicamente a un epítope del primer antígeno que, como mínimo en parte de los mamíferos, después del tránsito intestinal presenta una estructura que se corresponde con la estructura nativa o con la estructura ante la cual un mamífero produce anticuerpos después de una infección o inmunización con el microorganismo ácido-resistente o con un extracto o lisado del mismo o con una proteína del mismo o un fragmento de la misma o con un péptido sintéticoque presenta una secuencia de la proteína o fragmento; (ab) el segundo anticuerpo monoclonal o el fragmento o derivado del mismo o el segundo aptámero se une específicamente a un epítope de un segundo antígeno que es diferente del epítope del primer antígeno y que, como mínimo en parte de los mamíferos, después del tránsito intestinal presenta una estructura que se corresponde con la estructura nativa o con la estructura ante la cual un mamífero produce anticuerpos después de una infección o inmunización con el microorganismo ácido-resistente o o con un extracto o lisado del mismo o con una proteína del mismo o un fragmento de la misma o con un péptido sintético que presenta una secuencia de la proteína o fragmento; pudiendo solaparse las partes de los mamíferos según (aa) y según (ab) y correspondiendo la suma de las mismas a más de un 70% de los mamíferos infectados; y (b) se detecta la formación de como mínimo un complejo antígeno-anticuerpo o complejo antígeno-aptámero según (aa) o (ab).

Description

Detección de microorganismo ácido-resistentes en las heces.

La invención se refiere a un procedimiento para la detección de infecciones por microorganismos ácido-resistentes en mamíferos, donde (a) se incuba una muestra de heces del mamífero con como mínimo dos anticuerpos monoclonales diferentes, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros, bajo condiciones que permiten la formación de complejos de antígenos del microorganismo ácido-resistente con los anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros, y donde (aa) el primer anticuerpo monoclonal o el fragmento o derivado del mismo o el primer aptámero se une específicamente a un epítope del primer antígeno que, como mínimo en parte de los mamíferos, después del tránsito intestinal presenta una estructura que se corresponde con la estructura nativa o con aquella ante la cual un mamífero produce anticuerpos después de una infección o de una inmunización con el microorganismo ácido-resistente o con un extracto o un lisado del mismo o con una proteína o fragmento de la misma o con un péptido sintético; (ab) el segundo anticuerpo monoclonal o el fragmento o su derivado o el segundo aptámero se une específicamente a un epítope de un segundo antígeno que es diferente del epítope del primer antígeno y que, como mínimo en parte de los mamíferos, después del tránsito intestinal presenta una estructura que se corresponde con la estructura nativa o con aquella estructura ante la cual un mamífero produce anticuerpos después de una infección o inmunización con el microorganismo ácido-resistente o con un extracto o lisado del mismo o con una proteína o fragmento de la misma o con un péptido sintético; pudiendo solaparse las partes de los mamíferos según (aa) y según (ab) y correspondiendo la suma de las mismas esencialmente a la cantidad total de los mamíferos infectados; y (b) se detecta la formación de como mínimo un complejo antígeno-anticuerpo/complejo antígeno-aptámero según (aa) o (ab).

Preferentemente, el microorganismo ácido-resistente es una bacteria, en particular Helicobacter pylori, Helicobacter hepaticus o Mycobacterium tuberculosis o Campylobacter jejuni o Campylobacter pylori. También es preferible que los dos epítopes sean epítopes de una ureasa y una proteína de choque térmico, preferentemente Hsp60, una alquilhidroperóxido-reductasa, preferentemente de proteínas de 26 kDa, de 20 kDa (3-deshidroquinasa tipo II), de proteínas de 16,9 kDa (proteína activadora de neutrófilos) o de proteínas de 33,8 kDa (fructosabifosfato-aldolasa). En otra forma de realización preferente de la invención, la muestra de heces se analiza con tres anticuerpos monoclonales diferentes, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros, uniéndose el primer anticuerpo, fragmento o derivado del mismo o el primer aptámero específicamente a un epítope de una ureasa y el segundo y el tercer anticuerpos (o derivados, fragmentos o aptámeros), en cada caso, a un epítope de las diferentes proteínas arriba mencionadas, preferentemente Hsp60 (cuando uno de los dos primeros epítopes es un epítope de una alquilhidroperóxido-reductasa) o una alquilhidroperóxido-reductasa (cuando uno de los dos primeros epítopes es un epítope Hsp60). La invención también se refiere a composiciones de diagnóstico y farmacéuticas y a dispositivos de ensayo que contienen los componentes arriba mencionados, y también a los envases que los incluyen.

Actualmente, la detección de infecciones en organismos mamíferos por patógenos o parásitos microbianos se puede realizar de diferentes modos directos e indirectos, tanto invasores como no invasores. Si se utilizan técnicas invasoras se daña la integridad corporal del individuo analizado, por ejemplo en caso de una biopsia o de extracción de suero. Las técnicas de diagnóstico no invasoras detectan variaciones en parámetros que se pueden medir sin intervenir en el organismo. Para ello se ensayan y analizan preferentemente líquidos corporales y excreciones como aliento, orina, saliva, sudor o heces. En los métodos directos se detecta la presencia del patógeno o parásito, sus componentes o sus productos de descomposición, por ejemplo mediante tinción y análisis microscópico o mediante reacciones enzimáticas específicas. Los procedimientos indirectos recurren a la detección de reacciones del organismo huésped frente al patógeno o parásito, por ejemplo la presencia de anticuerpos contra antígenos del patógeno en suero, orina o en la saliva del huésped. En otro procedimiento indirecto se administran al paciente sustancias indicadoras que son modificadas de forma específica por el patógeno o por el parásito microbiano, y la forma modificada se detecta en muestras (prueba de respiración).

La intervención en el organismo, por ejemplo para obtener una muestra de tejido, en la mayoría de los casos supone una carga para el organismo y con frecuencia también implica un elevado coste en aparatos y un riesgo para la salud. Por ello, la obtención relativamente sencilla de muestras de líquidos corporales y excreciones arriba descritos hacen que las técnicas no invasoras sean el método elegido con preferencia. Además, dado que no todos los huéspedes reaccionan del mismo modo frente a un patógeno o a un parásito concreto y debido a que la reacción del huésped puede producirse con demora y además puede persistir después de eliminar el patógeno o el parásito del organismo, siempre son preferibles los procedimientos directos. Por consiguiente, idealmente se lleva a cabo un diagnóstico mediante la detección directa y no invasora del patógeno o del parásito en líquidos corporales o excreciones.

Además, los procedimientos diagnósticos también deberían estar optimizados con respecto a otros aspectos: alta reproducibilidad, sensibilidad y especificidad, disponibilidad garantizada de los materiales a utilizar con una calidad constante, bajo coste de producción y realización y utilización sencilla e independiente de aparatos costosos son parámetros que han de ser tenidos en cuenta.

Por los motivos arriba mencionados, en el diagnóstico médico cada vez están adquiriendo más importancia los procedimientos basados en la alta selectividad y afinidad de unión de determinados tipos de sustancias (por ejemplo anticuerpos, receptores, lectinas, aptámeros) por estructuras moleculares que se pueden elegir de modo que sean altamente específicas para la sustancia/microorganismo a detectar en cada caso. Sobre todo la posibilidad de inmovilizar estas sustancias en superficies sólidas y se acoplarse con núclidos radiactivos, enzimas que provocan reacciones de color en combinación con los sustratos adecuados, o partículas coloreadas con una afinidad de unión altamente específica (por ejemplo ELISA = Enzyme linked immunosorbent assay - ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas) ha llevado a desarrollar procedimientos de detección de sustancias endógenas y exógenas más económicos, más sencillos y que requieren menos tiempo.

En las fases iniciales del desarrollo de estos procedimientos de detección sólo se utilizaban anticuerpos policlonales. Sin embargo, éstos tienen algunas desventajas bien conocidas por los especialistas, en particular una disponibilidad limitada y con frecuencia también reacciones cruzadas. El desarrollo de procedimientos para producir anticuerpos monoclonales (Köhler & Milstein (1975)), los avances en el aislamiento de receptores y su expresión dirigida en sistemas huésped celulares, el desarrollo de lectinas con alta afinidad por determinados hidratos de carbono y el descubrimiento de que existen ácidos nucleicos (aptámeros) que se pueden unir específicamente a estructuras moleculares han podido eliminar en gran medida estas desventajas. Actualmente, la especificidad y la sensibilidad de los procedimientos de detección se pueden optimizar con métodos relativamente sencillos.

Gracias a la alta especificidad, estos procedimientos son especialmente adecuados para detectar sustancias individuales definidas, como haptenos, péptidos o proteínas, siempre que el elemento estructural identificado sea constante dentro de la población de muestra a analizar y específico para la sustancia a detectar. También son adecuados para la medida en líquidos corporales, con lo que constituyen una opción evidente para la detección directa de patógenos en tal matriz de muestra. Correspondientemente, en el estado actual de la técnica se han descrito procedimientos para el diagnóstico, por ejemplo de Entamoeba histolytica (Haque (1993), J. Infect. Dis. 167: 247-9), Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC; Park (1996), J. Clin. Microbiol. 34: 988-990), Vibrio Cholerae (Hasan (1994), FEMS Microbiol. Lett. 120: 143-148), partículas análogas a torovirus (Koopmans (1993), J. Clin. Microbiol. 31: 2738-2744) o Taenia saginata (Machnicka (1996), Appl. Parasitol. 37: 106-110) en las heces. Un procedimiento de diagnóstico para la gastroenteritis causada por adenovirus (Hermann (1987), J. Infect. Dis. 155: 1167-1171) utiliza la combinación de dos anticuerpos monoclonales dirigidos contra diferentes serotipos de adenovirus entéricos para poder detectar estos serotipos sin que influya la presencia de otros adenovirus no entéricos. En este contexto, si se conoce el serotipo del adenovirus con el que está identificado un paciente, la detección también se puede llevar a cabo de forma fiable con el anticuerpo monoclonal correspondiente aislado.

Los patógenos arriba descritos tienen en común que son viables y se reproducen en el intestino, en la mucosa intestinal o en el lumen intestinal de su huésped, en cualquier caso del ser humano. Por consiguiente, poseen mecanismos que les permiten sobrevivir y multiplicarse en presencia de los sistemas de descomposición y digestión activos en el intestino. En consecuencia, es probable que con la deposición de las heces salga una gran cantidad de patógenos intactos o casi intactos. Por regla general, los patógenos o parásitos se pueden detectar fácilmente en las heces, o en muestras de heces preparadas, con reactivos de detección, por ejemplo anticuerpos que reconocen componentes de los patógenos o parásitos.

Sin embargo, existe una serie de patógenos y parásitos que, aunque pueden aparecer en las heces debido a las relaciones del tejido invadido por ellos (por ejemplo pulmón, estómago, páncreas, duodeno, hígado) con el tracto gastrointestinal, no son viables y/o no se pueden reproducir en el propio intestino. Estos patógenos y parásitos se denominan aquí microorganismos ácido-resistentes. Al grupo de estos patógenos y parásitos pertenecen, por ejemplo, Helicobacter pylori (H. pylori) y Helicobacter hepaticus, Mycobacterium tuberculosis y otras micobacterias, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumoniae, Pneumocystis carinii, Campylobacter jejuni, Campylobacter pylori y otros. Algunos de estos agentes patógenos se pueden detectar en el esputo, por ejemplo. Sin embargo, la detección de Mycobacterium tuberculosis, por ejemplo, sólo se puede realizar en el esputo durante un breve período de tiempo: después de abrirse una caverna que contiene el agente patógeno. La detección se dificulta además por el hecho de que no siempre es posible obtener una muestra de esputo del individuo a examinar. Este es el caso, por ejemplo, en niños pequeños, pacientes desconcertados o animales. Otros patógenos, por ejemplo Legionella pneumophilae, se pueden detectar específicamente mediante antígenos que llegan a la orina a través de los riñones. Pero esto sólo es posible cuando la cantidad que se encuentra en la orina es suficiente para la detección. La detección en las heces sería una alternativa bien recibida para este método. Sin embargo, para estos organismos el tránsito intestinal implica un fuerte ataque por los mecanismos de digestión y descomposición del mamífero y, en particular, por la flora intestinal. Esto puede destruir o reducir mucho la concentración de estructuras moleculares específicas del agente patógeno en cuestión.

La degradación de los agentes patógenos en el intestino en casos de bacterias ácido-resistentes ha demostrado ser un problema para lograr una detección segura en muestras de heces. La cantidad de gérmenes que llegan al estómago de un individuo infectado es pequeña en comparación con otras bacterias que anidan en el intestino. Además, después de abandonar el estómago, los gérmenes y fragmentos de gérmenes han de recorrer un largo camino rico en proteasas a través del intestino. Por estas circunstancias, en las heces sólo se pueden encontrar pequeñas cantidades de proteínas intactas. Otra consecuencia de esto es que la combinación de dos epítopes en un antígeno, necesaria para un ensayo ELISA, ya no se da forzosamente como en la proteína nativa, y los epítopes cercanos tienen mayor probabilidad de dar un resultado positivo en una detección que requiere dos epítopes en la misma molécula. La diferente distribución individual de antígenos detectados en individuos infectados indica además la existencia de propiedades individuales en el procesamiento de los antígenos durante el tránsito intestinal. El contenido descrito en el documento EP-A 0 806 667 presenta una primera propuesta para reducir este problema. Dicha solicitud demostraba que con el lisado de una cepa determinada de H. pylori se podían inducir anticuerpos policlonales que reconocían una variedad más amplia de cepas de diferentes regiones geográficas. Sin embargo, en esta solicitud no se indica qué antígenos son reconocidos por el suero. Además se excluía la posibilidad de un diagnóstico correspondiente mediante anticuerpos monoclonales. Teniendo en cuenta que los sueros inmunes pueden variar a pesar de todos los esfuerzos de normalización, el procedimiento desarrollado en la solicitud arriba mencionada se ha de considerar como subóptimo para su uso universal. Además, para preparar los sueros policlonales hay inmunizar constantemente nuevos animales. Los procedimientos correspondientes son costosos y requieren mucho tiempo.

R. Negrini y col. describen en SCANDINAVIAN JOURNAL OF GASTROENTEROLOGY, tomo 27, nº 7, julio de 1992 (1992-07), páginas 599-605, la utilización de anticuerpos monoclonales contra Helicobacter pylori para el diagnóstico de una gastritis atribuible a H. pylori en suero. En este artículo se advierte sobre el peligro de reacciones cruzadas entre antígenos de H. pylori y antígenos de cepas análogas. Por otra parte, H. Yamaguchi y col. describen en JOURNAL OF MEDICAL MICROBIOLOGY, tomo 46, (1997), páginas 819-824, la producción y caracterización de anticuerpos monoclonales específicos dirigidos contra la proteína de choque térmico 60 de H. pylori.

En el documento WO 96/34624 se describen composiciones inmunógenas contra infecciones por Helicobacter para producir anticuerpos dirigidos contra Helicobacter. Sin embargo, ninguna de las referencias bibliográficas mencionadas da a conocer anticuerpos que se puedan considerar adecuados para la detección de H. pylori en una muestra de heces.

Por consiguiente, el objetivo de la presente invención consistía en mejorar los procedimientos desventajosos del estado actual de la técnica anteriormente mencionados y poner a disposición un procedimiento fácilmente normalizable y económico para la detección segura de microorganismos ácido-resistentes.

Este objetivo se resuelve mediante las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones.

Por tanto, la invención se refiere a un procedimiento para la detección de una infección por un microorganismo ácido-resistente en un mamífero en el que

(a)

una muestra de heces del mamífero se incuba con dos o tres anticuerpos monoclonales diferentes, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros, bajo condiciones que permiten una formación de complejos de antígenos del microorganismo ácido-resistente con los anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos o los aptámeros, y en el que

(aa)

el primer anticuerpo monoclonal o fragmento o derivado del mismo o el primer aptámero se une específicamente a un epítope del primer antígeno que, como mínimo en parte de los mamíferos, después del tránsito intestinal presenta una estructura que se corresponde con la estructura nativa o con la estructura contra la cual un mamífero produce anticuerpos después de una infección o inmunización con el microorganismo ácido-resistente o un extracto o lisado del mismo o una proteína o un fragmento de la misma o un péptido sintético que presenta una secuencia de la proteína o fragmento;

(ab)

el segundo anticuerpo monoclonal o fragmento o derivado del mismo o el segundo aptámero se une específicamente a un epítope de un segundo antígeno que es diferente del epítope del primer antígeno y que, como mínimo en parte de los mamíferos, después del tránsito intestinal presenta una estructura que se corresponde con la estructura nativa o con la estructura contra la cual un mamífero produce anticuerpos después de una infección o inmunización con el microorganismo ácido-resistente o con un extracto o lisado del mismo o con una proteína o fragmento de la misma o un péptido sintético que presenta una secuencia de la proteína o fragmento;

pudiendo solaparse las partes de los mamíferos según (aa) y según (ab) y correspondiendo la suma de las mismas esencialmente a la cantidad total de los mamíferos infectados; y

(b)

se detecta la formación de como mínimo un complejo antígeno-anticuerpo o complejo antígeno-aptámero según (aa) o (ab).

En el sentido de esta invención, el concepto "microorganismo ácido-resistente" abarca todos aquellos microorganismos que, a causa de sus propiedades/mecanismos de adaptación al huésped, resisten los efectos físicos y químicos del tracto digestivo, de modo que se pueden detectar mediante una identificación, preferentemente inmunológica, o mediante la utilización de aptámeros. Como ejemplos de microorganismos ácido-resistentes de este tipo se mencionan: Helicobacter pylori, Helicobacter hepaticum, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium pseudotuberculosis, Mycobacterium cansassii, Campylobacter jejuni y Campylobacter pylori.

En el sentido de esta invención, el concepto "muestra de heces del mamífero" se refiere a cualquier muestra de heces que pueda ser utilizada para el procedimiento de detección según la invención. Entre ellas se cuentan principalmente aquellas muestras de heces que han sido preparadas mediante procedimientos ya conocidos de pruebas diagnósticas. La preparación se puede realizar, por ejemplo, según RIDASCREEN® Entamoeba Enzymimmunoassay (R-Biopharm GmbH, Darmstadt).

En el sentido de esta invención, "fragmentos" o "derivados" de anticuerpos monoclonales presentan la misma especificidad de unión que los anticuerpos monoclonales. Estos fragmentos o derivados se pueden obtener mediante procedimientos habituales; véase por ejemplo Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press, Cold Spring Harbor, EE. UU., 1988. Fragmentos son, por ejemplo, fragmentos Fab, F(ab')_{2} o Fv. Derivados son, por ejemplo, fragmentos scFv. Los derivados también pueden consistir en sustancias producidas químicamente que presentan propiedades de unión iguales o mejores que las de los anticuerpos. Estas sustancias se pueden producir por ejemplo mediante peptidomimética o mediante diferentes rondas de phage display (exposición en fago) y selección subsiguiente por propiedades de unión mejoradas. De acuerdo con la invención, por "aptámeros" se entienden ácidos nucleicos como ARN, ADNss (ss = cadena simple), ARN modificado o ADNss modificado, que se unen a numerosas secuencias diana con alta especificidad y afinidad. El término "aptámero" es conocido en el estado actual de la técnica y se define por ejemplo en Osborne y col., Curr. Opin. Chem. Biol. 1 (1997), 5-9, o en Stull y Szoka, Pharm. Res. 12 (1995), 465-483.

El concepto "como mínimo dos" en relación con la cantidad de anticuerpos utilizados, etc. no tiene límite superior y significa por ejemplo tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez anticuerpos, etc.

Las "condiciones que permiten una formación de complejos" pueden ser ajustadas fácilmente por los especialistas (véase también Harlow y Lane en la publicación arriba citada) y son, por ejemplo, condiciones fisiológicas.

En el sentido de esta invención, el concepto "después del tránsito intestinal presenta una estructura que corresponde a la estructura nativa" significa que el epítope de un antígeno después del tránsito intestinal es reconocido por un anticuerpo monoclonal, derivado o fragmento del mismo o por el aptámero que ha sido obtenido contra el mismo antígeno/epítope que no ha pasado el tránsito intestinal, o que se une a éste. En otras palabras, el epítope/antígeno unido específicamente por el anticuerpo arriba mencionado o por derivados o fragmentos del mismo o por aptámeros ha resistido el paso por el tránsito intestinal intacto o esencialmente intacto y no se ha degradado. Como fuente para la estructura nativa del epítope/antígeno se puede utilizar por ejemplo un extracto bacteriano preparado con una Prensa Francesa y purificado adicionalmente mediante procedimientos habituales (véase por ejemplo Sambrook y col., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2ª edición 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor, EE. UU.), o un lisado bacteriano purificado adicionalmente mediante procedimientos estándar (por ejemplo Sambrook y col. en la publicación arriba citada).

De acuerdo con la invención, el concepto "después del tránsito intestinal presenta una estructura que corresponde a la estructura contra la cual un mamífero produce anticuerpos después de una infección o inmunización con el microorganismo ácido-resistente o con un extracto o lisado del mismo o con una proteína o un fragmento de la misma o con un péptido sintético" significa que el epítope reconocido por el anticuerpo monoclonal, fragmento, derivado o aptámero corresponde a un epítope presente en el sistema inmunológico de un mamífero, preferentemente un ser humano. Los mecanismos de la presentación de antígenos y también los mecanismos que conducen al procesamiento de antígenos y la diversidad de anticuerpos resultante de ello son conocidos en el estado actual de la técnica y se describen por ejemplo en Janeway y Travers, Immunologie, 2ª edición 1997, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg. Estos epítopes pueden ser diferentes de los epítopes nativos. El contacto del mamífero con los microorganismos o las proteínas o fragmentos o con los péptidos sintéticos puede tener lugar por infección natural (excepto en el caso de los péptidos sintéticos) o por inmunización. Para la inmunización también se pueden utilizar extractos, lisados, péptidos sintéticos, etc. del microorganismo/proteína. En el estado actual de la técnica se conocen esquemas de inmunización adecuados, descritos por ejemplo por Harlow y Lane en la publicación arriba citada. También se pueden obtener anticuerpos adecuados por ejemplo por inmunización y/o screening en sucedáneos como péptidos sintéticos, proteínas preparadas por métodos recombinantes, extractos, lisados o proteínas parcialmente digeridas.

De acuerdo con la invención, el concepto "se une específicamente" significa que el anticuerpo monoclonal, el fragmento o derivado del mismo o el aptámero no presenta ninguna o esencialmente ninguna reactividad con otros epítopes en muestras de mamíferos no infectados.

El concepto "pudiendo solaparse las partes de los mamíferos según (aa) y según (ab) y correspondiendo la suma de las mismas esencialmente a la cantidad total de los mamíferos infectados" significa que en las heces aparece como mínimo uno, pero en caso dado también dos o más epítopes/antígenos a los que se unen específicamente los anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados o los aptámeros, y que los anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados o los aptámeros detectan como mínimo un epítope de un antígeno esencialmente en cada mamífero infectado. El concepto "esencialmente la cantidad total" significa que el epítope, y con ello una infección correspondiente por el microorganismo, se puede detectar en más del 70%, preferentemente en como mínimo en el 75%, en especial en más del 85%, de forma especialmente preferente en más del 90% y en particular en más del 95% de los afectados. Idealmente, las infecciones se detectan en el 100% de los afectados.

En el sentido de esta invención, el concepto "complejo antígeno-anticuerpo" no sólo abarca complejos que corresponden al antígeno con el anticuerpo nativo, sino también complejos que corresponden a fragmentos o derivados de los mismos.

Sorprendentemente, de acuerdo con la invención se ha comprobado que con una cantidad limitada de anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros que se unen como mínimo a dos epítopes diferentes de diferentes antígenos de microorganismos ácido-resistentes se puede llevar a cabo un diagnóstico relativamente seguro de una infección debida a estas bacterias/patógenos. Así, en esta forma de realización de la invención, los antígenos de una muestra de heces preparada se pueden unir por ejemplo a una fase sólida y el agente infeccioso se puede detectar con una cantidad limitada de anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros presentes en su forma marcada. Si el antígeno presente después del tránsito intestinal (todavía) se encuentra en forma dimérica o multimérica, los mismos anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros se pueden utilizar como capturador y también como detector. Esta forma de realización también incluye la posibilidad de que un epítope se encuentre varias veces en la misma subunidad. La invención incluye formas de realización en las que otros epítopes que presentan las propiedades arriba mencionadas son reconocidos por otros anticuerpos monoclonales o fragmentos o derivados de los mismos o por otros aptámeros. Un antígeno también puede ser detectado por diferentes anticuerpos monoclonales o aptámeros que reconocen el mismo epítope o diferentes epítopes del antígeno. Por ejemplo, tres anticuerpos monoclonales o tres aptámeros pueden reconocer tres epítopes diferentes en dos fragmentos de proteína. Estas últimas formas de realización son adecuadas para aumentar aun más la seguridad en el establecimiento del diagnóstico. En caso de estructuras superiores, por ejemplo de dímeros o multímeros, el mismo anticuerpo monoclonal también se puede unir a varios epítopes en la misma proteína multímera en el procedimiento según la invención. A continuación se describen más detalladamente ejemplos de estas formas de realización.

La invención abarca tanto formas de realización en las que sólo se utilizan anticuerpos monoclonales o fragmentos o derivados de los mismos o sólo aptámeros, como formas de realización en las que en un ensayo se utilizan diferentes tipos de reactivos de detección. Un primer anticuerpo monoclonal se puede utilizar con un segundo derivado de anticuerpo o un primer aptámero se puede utilizar con un segundo fragmento de anticuerpo, por nombrar sólo dos ejemplos. En este sentido, los conceptos "primero" y "segundo" se refieren al primer y el segundo reactivo de detección. Ello no significa que siempre se utilicen dos anticuerpos, derivados o fragmentos de los mismos o siempre dos aptámeros.

Los resultados según la invención son sorprendentes sobre todo porque el estado actual de la técnica indicaba lo contrario. Por ejemplo, en el caso de H. pylori se comprobó que los antígenos principales no presentan la especificidad y sensibilidad deseadas en ensayos ELISA; véase Newell y col., Serodiag. Immunother. Infect. Dis. 3 (1989), 1-6. Además, el documento EP-A 0 806 667 indica que no es posible realizar una detección segura de infecciones por H. pylori con anticuerpos monoclonales a causa de la variabilidad genética de las cepas de H. pylori.

El procedimiento según la invención resulta ventajoso en comparación con el estado actual de la técnica arriba mencionado sobre todo porque permite un diagnóstico relativamente seguro con únicamente dos anticuerpos monoclonales o fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros. Preferentemente, para la detección, por ejemplo en ELISA, se utilizan pares de anticuerpos, fragmentos, derivados de los mismos o aptámeros, uniéndose los dos anticuerpos del par al mismo epítope o a distintos epítopes en el mismo antígeno. Por ejemplo, la H. pylori ureasa forma estructuras multímeras de varias subunidades tanto iguales como diferentes. De este modo, en ELISA o en otros ensayos, los mismos anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros se pueden utilizar como anticuerpos/aptámeros de captura y también como anticuerpos/aptámeros de detección. La utilización de anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos, o de aptámeros permite mantener fácilmente un estándar en la fiabilidad del procedimiento de diagnóstico, lo que constituye una gran ventaja en comparación con los procedimientos de diagnóstico conocidos hasta la fecha y utilizados para este fin. Además se suprime la constante inmunización y posterior examen de animales de ensayo necesaria por ejemplo para el procedimiento según EP-A 0 806 667. Otra ventaja del procedimiento según la invención consiste en su configuración como procedimiento directo y no invasor, lo que aumenta la conveniencia para del paciente mencionada en la introducción y también la fiabilidad en la determinación del estadío de la enfermedad.

En una forma de realización preferente, el microorganismo ácido-resistente es una bacteria ácido-resistente.

En el estado actual de la técnica se conoce una serie de bacterias ácido-resistentes. En una forma de realización especialmente preferente, la bacteria ácido-resistente es una bacteria del género Helicobacter o del género Mycobacterium o del género Campylobacter.

En otra forma de realización especialmente preferente, la bacteria es una bacteria de la especie Helicobacter pylori, Helicobacter hepaticum o una bacteria de la especie Mycobacterium tuberculosis o una bacteria de la especie Campylobacter jejuni o Campylobacter pylori.

En otra forma de realización preferente, el epítope del primer antígeno es un epítope de una ureasa, por ejemplo una \alpha-ureasa o una \beta-ureasa, y el epítope del segundo antígeno es un epítope de una proteína de choque térmico, una alquilhidroperóxido-reductasa o de una proteína 20 kDa (3-deshidroquinasa tipo II), de la proteína 16,9 kDa (proteína activadora de neutrófilos) o de la proteína 33,8 kDa (fructosabifosfato-aldolasa).

Sorprendentemente, de acuerdo con la invención se comprobó que en una población de mamíferos, en particular de pacientes humanos, cuyas heces fueron analizadas en cuando a infecciones por bacterias ácido-resistentes, prácticamente todos los miembros de dicha población presentaban en sus heces como mínimo uno de los epítopes arriba mencionados, por lo que es muy probable que con un juego de únicamente dos anticuerpos monoclonales correspondientes, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros se pueda establecer un diagnóstico relativamente seguro.

De forma especialmente preferente, la ureasa es \beta-ureasa de H. pylori.

En otra forma de realización especialmente preferente, la proteína de choque térmico es Hsp60.

También es especialmente preferente que la Hsp60 sea Hsp60 de H. pylori.

En otra forma de realización especialmente preferente, la alquilhidroperóxido-reductasa es la proteína 26 kDa de H. pylori.

También es preferible que las otras proteínas anteriormente mencionadas sean proteínas de H. pylori.

En otra forma de realización (preferente), el procedimiento según la invención para la detección de una infección de un mamífero por un microorganismo ácido-resistente incluye los siguientes pasos, en los que (a) una muestra de heces del mamífero se incuba con tres anticuerpos monoclonales diferentes, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros, bajo condiciones que permiten la formación de complejos de antígenos del microorganismo ácido-resistente con los anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos o con los aptámeros, y en los que (aa) el primer anticuerpo monoclonal o fragmento o derivado del mismo o el primer aptámero se une específicamente a un epítope del primer antígeno que, como mínimo en parte de los mamíferos, después del tránsito intestinal presenta una estructura que se corresponde con la estructura nativa o con la estructura ante la cual un mamífero produce anticuerpos después de una infección o inmunización con el microorganismo ácido-resistente o un extracto o lisado del mismo o una proteína o un fragmento de la misma o un péptido sintético; (ab) el segundo anticuerpo monoclonal o el fragmento o derivado del mismo o el segundo aptámero se une específicamente a un epítope de un segundo antígeno que es diferente del epítope del primer antígeno y que, como mínimo en parte de los mamíferos, después del tránsito intestinal presenta una estructura que se corresponde con la estructura nativa o con la estructura ante la cual un mamífero produce anticuerpos después de una infección o inmunización con el microorganismo ácido-resistente o con un extracto o lisado del mismo o con una proteína o fragmento de la misma o con un péptido sintético; y (ac) el tercer anticuerpo monoclonal o el fragmento o derivado del mismo o el tercer aptámero se une específicamente a un epítope de un tercer antígeno que es diferente del epítope del primer y el segundo antígenos y que, como mínimo en parte de los mamíferos, después del tránsito intestinal presenta una estructura que se corresponde con la estructura nativa o con la estructura ante la cual un mamífero produce anticuerpos después de una infección o inmunización con el microorganismo ácido-resistente o con un extracto o lisado del mismo o con una proteína o un fragmento de la misma o con un péptido sintético; pudiendo solaparse las partes de los mamíferos según (aa), según (ab) y según (ac) y correspondiendo la suma de las mismas esencialmente a la cantidad total de los mamíferos infectados; y se detecta la formación de como mínimo un complejo antígeno-anticuerpo/complejo antígeno-aptámero según (aa), (ab) o
(ac).

En lo que respecta a las definiciones y formas de realización preferentes de este procedimiento se remite a las formas de realización explicadas más arriba. Las aclaraciones con respecto a la combinación de reactivos de detección diferentes en caso de utilización de como mínimo dos reactivos de detección son aplicables aquí correspondientemente para tres reactivos de detección. Por ejemplo, en el ensayo se puede combinar un primer anticuerpo monoclonal con un segundo fragmento y un tercer aptámero. Evidentemente, esta combinación no significa que en el ensayo se utilicen otros dos aptámeros. Por consiguiente, el término "tercero" se refiere al tercer reactivo de detección, independientemente de su posible estructura. Lo mismo es aplicable a los términos "primero" y "segundo".

Preferentemente, el epítope del primer antígeno es un epítope de una ureasa, preferiblemente de \beta-ureasa de H. pylori, el epítope del segundo antígeno es un epítope de una proteína de choque térmico, preferentemente Hsp60, en especial de H. pylori, y el epítope del tercer antígeno es un epítope de una alquilhidroperóxido-reductasa, preferentemente de la proteína 26 kDa de H. pylori. En otras formas de realización preferentes, los epítopes del segundo y el tercer antígeno son epítopes de una proteína 20 kDa (3-deshidroquinasa tipo II), de una proteína 16,9 kDa (proteína activadora de neutrófilos) o de una proteína 33,8 kDa (fructosabifosfato-aldolasa), en combinación con la ureasa como primer antígeno, y en caso dado la Hsp60 o la proteína 26 kDa como segundo o tercer antígeno. En otra forma de realización preferente de la invención, los epítopes del segundo antígeno son epítopes de Hsp60 y los epítopes del tercer antígeno son epítopes de la proteína 20 kDa (3-deshidroquinasa tipo II), de la proteína 16,9 kDa (proteína activadora de neutrófilos) o de la proteína 33,8 kDa (fructosabifosfato-aldolasa). Además son posibles otras formas de realización bajo detección de combinaciones de las proteínas anteriormente mencionadas o sus epítopes, también sin
ureasa.

En exámenes en serie de muestras de heces de pacientes infectados por H. pylori para detectar proteínas específicas de H. pylori (ureasa, HSP60, alquilhidroperóxido-reductasa) mediante ELISA utilizando anticuerpos monoclonales se comprobó que la localización de diferentes antígenos en muestras de heces de diferentes pacientes es muy poco homogénea. Sorprendentemente, también se comprobó que combinaciones de anticuerpos monoclonales que reconocen epítopes que se solapan parcialmente eran muy adecuados para la detección de estos antígenos mediante ELISA en sándwich (véase Tabla 3).

De acuerdo con la invención, los anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o los aptámeros pueden reconocer y unirse de forma específica a epítopes lineales o de conformación. En otra forma de realización preferente, como mínimo uno de los anticuerpos monoclonales o uno de sus fragmentos, derivados o aptámeros se une a un epítope de conformación.

En una forma de realización especialmente preferente, todos los anticuerpos monoclonales, etc. se unen a epítopes de conformación.

En la cartografía de epítopes se analizaron 5 de los mAK (anticuerpos monoclonales) murinos especialmente adecuados para ELISA de heces (Tabla 3). Sorprendentemente, en tres de estos anticuerpos no se pudo detectar ningún epítope lineal. Por ello se supuso que estos mAK reconocen epítopes de conformación. Esto se confirma en el caso de los anticuerpos anti-\beta-ureasa mediante los resultados de inmunotransferencia, que muestran que la ureasa desnaturalizada ya no es reconocida o sólo es reconocida muy débilmente (véase Tabla 2).

En otra forma de realización, la invención se refiere a un procedimiento para la detección de una infección por Helicobacter pylori en heces de mamíferos, en el que (a) una muestra de heces se incuba con como mínimo dos anticuerpos monoclonales diferentes, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros bajo condiciones que permiten una formación de complejos antígeno-anticuerpo/antígeno-aptámero, y en el que (aa) el primer anticuerpo monoclonal, el fragmento o derivado del mismo o el primer aptámero se une específicamente a la \beta-ureasa o a un fragmento de la misma; (ab) el segundo anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo o el segundo aptámero se une específicamente al antígeno 26 kDa o a un fragmento del mismo o se une específicamente a Hsp60 o a un fragmento de la misma; y (b) se detecta la formación de como mínimo un complejo antígeno-anticuerpo/complejo antígeno-aptámero según (aa) o (ab).

Además, la invención se refiere a un procedimiento para la detección de una infección por Helicobacter pylori en heces de mamíferos, en el que (a) una muestra de heces se incuba con tres anticuerpos monoclonales diferentes, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros bajo condiciones que permiten la formación de complejos antígeno-anticuerpo/antígeno-aptámero, y en el que (aa) el primer anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo o el primer aptámero se une específicamente a la \beta-ureasa o a un fragmento de la misma; (ab) el segundo anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo o el segundo aptámero se une específicamente a Hsp60 o a un fragmento de la misma; y (ac) el tercer anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo o el tercer aptámero se une específicamente al antígeno 26 kda o a un fragmento del mismo; y (b) se detecta la formación de como mínimo un complejo antígeno-anticuerpo/complejo antígeno-aptámero según (aa), (ab) o (ac).

En lo que respecta a las definiciones y formas de realización a utilizar preferentes se remite a las anteriores explicaciones.

En las dos formas de realización indicadas más arriba, dichas proteínas son evidentemente proteínas de H. pylori.

En otra forma de realización preferente, el anticuerpo específico de Hsp60 es el anticuerpo producido por el hibridoma HP16m/2A5-E6-E5 depositado en el Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) el 23 de junio de 1998 de acuerdo con los estatutos del Tratado de Budapest con el número de depósito DSM ACC2356.

En otra forma de realización preferente, el anticuerpo específico del antígeno 26 kDa es el anticuerpo producido por el hibridoma HP15m/3E8-D9-D6 depositado en el Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) el 23 de junio de 1998 de acuerdo con los estatutos del Tratado de Budapest con el número de depósito DSM ACC2355.

En otra forma de realización preferente, el anticuerpo específico de la \beta-ureasa es el anticuerpo producido por los hibridomas HP8m/4H5-D4-C9 o HP9.1m/3C2-F8-E2 depositados en el Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) el 23 de junio de 1998 de acuerdo con los estatutos del Tratado de Budapest con los números de depósito DSM ACC2360 o DSM ACC2362. El anticuerpo específico de la \beta-ureasa HP8m/1H5-G2-B4 descrito en los ejemplos/figuras se produce a través de un clon descendiente del hibridoma depositado HP8m/4H5-D4-C9. Los dos anticuerpos producidos por el clon progenitor y el clon descendiente son codificados por secuencias de ADN idénticas y presentan las mismas propiedades.

En una forma de realización especialmente preferente, la cadena pesada del anticuerpo que se une a un epítope de Hsp60 presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

GFSLSRYSVH

CDR2:

MIWGGGSTDYNSGLKS

CDR3:

NMGGRYPDYFDY

En otra forma de realización especialmente preferente, la secuencia de ADN que codifica la cadena pesada del anticuerpo que se une a un epítope de Hsp60 presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente el CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

GG GTTCTCATTA TCCAGATATA GTGTACAC

CDR2:

ATGATATGGG GTGGTGGAAG CACAGACTAT AATTCAGGTC TCAAATCC

CDR3:

AATATG GGGGGTAGGT ACCCGGACTA CTTTGACTAC

En una forma de realización especialmente preferente, la cadena ligera del anticuerpo que se une a un epítope de Hsp60 presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente el CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

RASKSVSTSGYSYIH

CDR2:

LASNLES

CDR3:

QHSRELPLT

Además, en otra forma de realización especialmente preferente, la secuencia de ADN que codifica la cadena ligera de este anticuerpo presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente el CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

A GGGCCAGCAA GAGTGTCAGT ACATCTGGCT ATAGTTACAT ACAC

CDR2:

C TTGCATCCAA CCTAGAATCT

CDR3:

CAGC ACAGTAGGGA GCTTCCGCTC ACG

En otra forma de realización especialmente preferente del procedimiento según la invención, la cadena pesada del anticuerpo que se une a una proteína 26 kDa presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente el CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

GFTFNSYAMY

CDR2:

RIRSKSDNYATYYANSVKD

CDR3:

DHDKFPFYYALDY

En otra forma de realización especialmente preferente, la secuencia de ADN que codifica la cadena pesada del anticuerpo que se une a un epítope de la proteína 26 kDa presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente el CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

GG TTTCACCTTC AATTCCTATG CCATGTAC

CDR2:

CGCATAAGAA GTAAAAGTGA TAATTATGCA ACATATTATG CCAATTCAGT GAAAGAC

CDR3:

GATCATG ATAAGTTTCC TTTTTACTAT GCTCTGGACT AC

En otra forma de realización especialmente preferente del procedimiento según la invención se utiliza un anticuerpo, fragmento o derivado del mismo cuya cadena ligera del anticuerpo que se une a una proteína 26 kDa presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente el CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

TASSSVSSSYLH

CDR2:

STSNLAS

CDR3:

HQYHRSPPT

Además, en otra forma de realización especialmente preferente, la secuencia de ADN que codifica la cadena ligera de este anticuerpo presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente el CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

A CTGCCAGCTC AAGTGTGAGT TCCAGTTACT TGCAC

CDR2:

AGCACTTCCA ACCTGGCTTC T

CDR3:

CAC CAGTATCATC GTTCCCCACC GACG

En otra forma de realización especialmente preferente del procedimiento según la invención, la cadena pesada del anticuerpo que se une a un epítope de \beta-ureasa presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente el CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

GFTFSSHFMS

CDR2:

SISSGGDSFYPDSLKG

CDR3:

DYSWYALDY

o:

CDR1:

GYAFSTSWMN

CDR2:

RIYPGDGDTNYNGKFKG

CDR3:

EDAYYSNPYSLDY

En otra forma de realización especialmente preferente, la secuencia de ADN que codifica la cadena pesada del anticuerpo que se une a un epítope de \beta-ureasa presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente el CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

GG CTACGCATTC AGTCCTCCT GGATGAAC

CDR2:

CGGATTTATC CTGGAGATGG AGATACTAAC TACAATGGGA AGTTCAAGGG C

CDR3:

GAG GATGCCTATT ATAGTAACCC CTATAGTTTG GACTAC

o:

CDR1:

GG ATTCACTTTC AGTAGCCATT TCATGTCT

CDR2:

TCCATTAGTA GTGGTGGTGA CAGTTTCTAT CCAGACAGTC TGAAGGGC

CDR3:

GACTAC TCTTGGTATG CTTTGGACTA C

En otra forma de realización especialmente preferente del procedimiento según la invención, la cadena ligera del anticuerpo que se une a un epítope de \beta-ureasa presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente el CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

TASQSIGTRIH

CDR2:

YGSESIS

CDR3:

QQSNTWPLT

o:

CDR1:

HASQNINVWLS

CDR2:

KASNLHT

CDR3:

QQGRSYPLT

Además, la cadena ligera de la secuencia de ADN que codifica este anticuerpo presenta preferentemente los siguientes CDR:

CDR1:

A GGGCCAGTCA GAGCATTGGC ACAAGAATAC AC

CDR2:

TAT GGTTCTGAGT CTATCTCT

CDR3:

CAACAA AGTAATACCT GGCCGCTCAC G

o:

CDR1:

C ATGCCAGTCA GAACATTAAT GTTTGGTTAA GC

CDR2:

AAG GCTTCCAACT TGCACACA

CDR3:

CAACAG GGTCGAAGTT ATCCTCTCAC G

También es especialmente preferente que las cadenas pesadas y ligeras que presentan los CDR anteriormente indicados aparezcan juntas en un anticuerpo, fragmento o derivado del mismo que se une específicamente a la Hsp60, la proteína 26 kDa o la \beta-ureasa, o un fragmento de éstas, preferiblemente de H. pylori. No obstante, la invención también abarca formas de realización en las que estas cadenas pesadas o ligeras se combinan con otras cadenas ligeras o pesadas, pudiendo conservarse esencialmente o mejorarse las propiedades de unión. En el estado actual de la técnica se conocen procedimientos correspondientes. Algunos anticuerpos especialmente preferentes presentan, en las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, las secuencias de aminoácidos representadas en las Figuras 1 y 2, las Figuras 3 y 4, las Figuras 5 y 6 o las Figuras 7 y 8, o las regiones son codificadas por las secuencias de ADN allí representadas.

En una forma de realización preferente, antes de la incubación con los anticuerpos se dan los siguientes pasos con la muestra de heces: la muestra de heces se resuspende 1:3 a 1:25, de forma preferente aproximadamente 1:10, en un tampón de resuspensión y a continuación se mezcla en una mezcladora Vortexer. Un tampón de resuspensión es, por ejemplo, PBS 150 mM, 0,1% SDS.

En otra forma de realización preferente, la detección de la formación del como mínimo un complejo antígeno-anticuerpo/complejo antígeno-aptámero tiene lugar en el paso (b) mediante un procedimiento inmunológico.

En otra forma de realización preferente, la detección de la formación del como mínimo un complejo antígeno-anticuerpo/complejo antígeno-aptámero tiene lugar en el paso (b) mediante ELISA, RIA, Western Blot o un procedimiento inmunocromatográfico.

Estos procedimientos son conocidos en sí en el estado actual de la técnica; véase Harlow y Lane en la publicación arriba citada.

En una forma de realización especialmente preferente del procedimiento según la invención, en el procedimiento inmunológico, en particular en RIA o ELISA, se utiliza el mismo anticuerpo o fragmento o derivado o el mismo aptámero tanto para la unión con la fase sólida como para la detección del epítope. Mientras que si el anticuerpo de captura/aptámero de captura se puede unir de forma no modificada a la fase sólida, por ejemplo una placa microtitulada, el anticuerpo, el fragmento o derivado del mismo o el aptámero utilizado para la detección está marcado. Por otra parte, este anticuerpo, fragmento o derivado del mismo o este aptámero puede no estar marcado y, en consecuencia, el epítope del microorganismo, preferentemente el epítope bacteriano, también se puede detectar a través de un tercer anticuerpo marcado, fragmento o derivado del mismo o de un tercer aptámero marcado, pudiendo este anticuerpo, fragmento o derivado del mismo o este aptámero consistir en un anticuerpo específico de una especie o específico de una clase de Ig o un aptámero correspondiente. En el estado actual de la técnica se conocen marcados de anticuerpos, por ejemplo con marcadores radiactivos o fluorescentes; véase Harlow y Lane en la publicación arriba citada. Lo mismo es aplicable correspondientemente a los aptámeros. La forma de realización anteriormente descrita es especialmente adecuada para la detección de ureasa, preferentemente \beta-ureasa, la cual, en caso dado después del tránsito intestinal, todavía se encuentra en forma de dímero, dado el caso en forma multimérica. Evidentemente, en esta forma de realización también se pueden utilizar combinaciones de anticuerpos, fragmentos, derivados y aptámeros, por ejemplo combinaciones de anticuerpos, etc. que se unen a diferentes epítopes del mismo antígeno.

En otra forma de realización preferente del procedimiento según la invención, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de ratón.

Además, en una forma de realización preferente, los anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos o los aptámeros están fijados a un soporte.

La fijación de los anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos o de los aptámeros a un soporte es especialmente ventajosa para la realización de revisiones rutinarias. Además, la combinación anticuerpo-soporte/aptámero-soporte se puede empaquetar bien como instrumental de prueba o en forma de kit.

En una forma de realización especialmente preferente, el material de soporte es un material de soporte poroso.

En otra forma de realización especialmente preferente, el material de soporte es una tira de prueba.

Además, en una forma de realización preferente, el material de soporte es de celulosa o un derivado de celulosa.

El mamífero cuyas heces se pueden analizar con el procedimiento según la invención puede ser un animal, por ejemplo un animal doméstico como un gato o un perro, un animal de granja, por ejemplo un cerdo, u otro tipo de animal, como un ratón, un tigre o un hurón.

En una realización preferente, el mamífero es un ser humano.

La invención se refiere además a un anticuerpo monoclonal, un fragmento o un derivado del mismo que incluye una región V que presenta una combinación de los CDR anteriormente mostrados o que es producido por uno de los hibridomas anteriormente indicados.

En este contexto es preferente un anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo que presente como mínimo una de las regiones V representadas en las Figuras 1 a 8. Preferentemente, este anticuerpo presenta dos de las regiones V representadas en las Figuras 1 y 2, 3 y 4, 5 y 6 o en las Figuras 7 y 8. También es preferible que estas regiones V sean codificadas por las secuencias de ADN representadas en las Figuras 1 a 8.

En una forma de realización especialmente preferente de la invención, el anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo es un anticuerpo de ratón o un fragmento o derivado del mismo, o un anticuerpo quimérico, preferentemente un anticuerpo humanizado, o un fragmento o derivado del mismo. El derivado también puede ser una proteína de fusión. También es preferible que el anticuerpo esté marcado, por ejemplo con un coloide, con un marcado radiactivo, fluorescente, fosforescente o quimioluminiscente.

La producción de anticuerpos humanos y humanizados quimerizados y de otros derivados es bien conocida en el estado actual de la técnica (por ejemplo Vaughan y col., 1998; Orlandi y col., 1989; Harlow y Lane en la publicación arriba citada).

La invención se refiere también a un aptámero que se une específicamente al mismo epítope que el anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo. La producción de aptámeros de este tipo puede realizarse mediante procedimientos conocidos en el estado actual de la técnica.

La invención se refiere además a otros anticuerpos, derivados o fragmentos de los mismos, que se unen específicamente al epítope según la invención. Estos anticuerpos pueden ser por ejemplo anticuerpos monoclonales que se pueden producir mediante procedimientos habituales utilizando el epítope como hapteno/componente de un antígeno.

La presente invención se refiere también a una composición diagnóstica que contiene como mínimo dos anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros tal como se definen más arriba, en caso dado fijados en un material de soporte.

Además, la presente invención se refiere a un dispositivo de ensayo para la detección de como mínimo un epítope tal como se define más arriba, que incluye (a) como mínimo dos anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros tal como se definen más arriba, fijados en un material de soporte; (b) un dispositivo para la preparación y análisis de muestras de heces, y en caso dado (c) una mezcla de como mínimo dos anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros.

Otro objeto de la invención consiste en un dispositivo de ensayo que incluye (a) como mínimo dos anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros tal como se definen más arriba, estando los anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros conjugados con oro coloidal, partículas de látex u otras partículas colorantes cuyo tamaño oscila típicamente entre 5 nm y 100 nm, preferentemente entre 20 nm y 60 nm; (b) un dispositivo para la preparación y análisis de muestras de heces, y en caso dado (c) una mezcla de como mínimo dos anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros.

Además, la presente invención se refiere a un kit que contiene (a) como mínimo dos anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros tal como se definen más arriba, dado el caso fijados en un material de soporte; en caso dado (b) un dispositivo para la preparación y análisis de muestras de heces, y en caso dado (c) una mezcla de como mínimo dos anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros.

Finalmente, la invención se refiere a un envase que contiene la composición diagnóstica según la invención, el dispositivo de ensayo según la invención o el kit según la invención.

Los componentes de la composición diagnóstica según la invención, el dispositivo de ensayo según la invención o el kit según la invención pueden estar envasados en recipientes, por ejemplo frascos o tubitos, dado el caso en tampones y/o soluciones. En determinadas circunstancias, uno o más componentes pueden estar envasados en un mismo recipiente.

Las Figuras muestran:

Figura 1: secuencia de ADN que codifica una cadena ligera de un anticuerpo monoclonal específico para HSP60 (DMS ACC2356). El número de depósito DMSZ se refiere aquí y en cualquier otro lugar de la solicitud al hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal. También está representada la secuencia de aminoácidos codificada.

Figura 2: secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal específico para HSP60 (DMS ACC2356). También está representada la secuencia de aminoácidos codificada.

Figura 3: secuencia de ADN que codifica una cadena ligera de un anticuerpo monoclonal específico para una proteína 26 kda (DMS ACC2355). También está representada la secuencia de aminoácidos codificada.

Figura 4: secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal específico para una proteína 26 kda (DMS ACC2355). También está representada la secuencia de aminoácidos codificada.

Figura 5: secuencia de ADN que codifica una cadena ligera de un primer anticuerpo monoclonal específico para una ureasa (DMS ACC2360). También está representada la secuencia de aminoácidos codificada.

Figura 6: secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de un primer anticuerpo monoclonal específico para una ureasa (DMS ACC2360). También está representada la secuencia de aminoácidos codificada.

Figura 7: secuencia de ADN que codifica una cadena ligera de un segundo anticuerpo monoclonal específico para una ureasa (DMS ACC2362). También está representada la secuencia de aminoácidos codificada.

Figura 8: secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de un segundo anticuerpo monoclonal específico para una ureasa (DMS ACC2362). También está representada la secuencia de aminoácidos codificada.

Los ejemplos aclaran la invención.

Ejemplo 1 Aislamiento de antígenos de H. pylori Cultivo de H. pylori

En unas placas Petri se aplicó H. pylori (cepa NCTC 11637) sobre agar Wilkins-Chalgren añadiendo un 10% de sangre de caballo y también anfotericina B, vancomicina y cefsulodina (Sigma Chemicals), y se cultivó durante 3-4 días en atmósfera microaerófila (Anaerocult GasPAk, Merk) a 37ºC. El contenido de 2 placas se suspendió en 350 ml de medio BHBI en un matraz de 1 l (Schott) adicionando los antibióticos arriba indicados, el medio se gaseó durante 10 minutos con una mezcla de gas formada por un 10% de CO_{2}, un 5% de O_{2} y un 85% de N_{2}, y se cerró el matraz. El cultivo se agitó durante 2 días a 37ºC en un agitador rotatorio, después de 24 h se abrió el tapón del matraz. A continuación, su contenido se introdujo de forma estéril en un matraz de 10 l, se rellenó con 4,7 l de medio BHBI, el medio se gaseó durante 10 minutos con una mezcla de gas formada por un 10% de CO_{2}, un 5% de O_{2} y un 85% de N_{2}, y se cerró el matraz. De nuevo se agitó durante 2 días a 37ºC en un agitador rotatorio, después de 24 h se abrió el tapón del matraz. A continuación, el volumen total se centrifugó a 11.000 g durante 10 minutos, se decantó el sobrenadante y se pesó la pella bacteriana. Para el almacenamiento, la pella se resuspendió en una solución fisiológica de sal común junto con glicerina 15% en una proporción 2:1 (peso:volumen) y se congeló a -80ºC. Para comprobar la identidad de las bacterias cultivadas se llevó a cabo una inspección visual de las mismas y se realizaron pruebas de actividad de ureasa, oxidasa y catalasa. La ausencia de contaminantes se probó mediante el cultivo de un poco de suspensión, tomada antes de su congelación, a 37ºC, al aire, durante 48 h.

Ejemplo 2 Procedimiento general para la elección de antígenos adecuados para la detección de microorganismos

Después de la incubación se prepara un lisado del microorganismo. La separación del lisado se realiza por filtración en gel. A continuación se aíslan aquellas proteínas que se encuentran en grandes cantidades en el lisado. Estas proteínas se identifican mediante secuenciación proteínica y comparación con secuencias de bancos de datos adecuados. De este modo se pueden determinar proteínas características o específicas para el microorganismo correspondiente. Después se desarrolla un esquema de purificación adecuado para estos antígenos seleccionados.

Ejemplo 3 Preparación de H. pylori ureasa, alquilhidroperóxido-reductasa y HSP60

La preparación de los tres antígenos de H. pylori, ureasa, alquilhidroperóxido-reductasa y HSP60 corresponde a una modificación de un método conocido (Eschweiler y col., 1993). Una pella bacteriana congelada se mezcló con butanol al 10% en una proporción 1:2 (peso:volumen), se agitó en una mezcladora de alta hasta que se descongeló por completo y después durante aproximadamente otros 15 minutos. Después de 20 minutos de sedimentación a 20.000 g y 4ºC, se decantó el sobrenadante y la pella se extrajo de nuevo durante 30 minutos con butanol al 10% como se indica más arriba. Después de una nueva sedimentación análoga a la anterior, los sobrenadantes se reunieron y la pella se congeló para su posterior utilización.

Aislamiento de ureasa y alquilhidroperóxido-reductasa (como oligómeros)

Los sobrenadantes claros reunidos se filtraron a través de filtros de 0,8 \mum y se transfirieron inmediatamente a una columna Source Q 16/10 (con HEPES 20 mM, pH 7,0, equilibrada). Unas fracciones eluidas con HEPES 20 mM, pH 7,0, NaCl 2M se analizaron directamente mediante un ensayo rápido para comprobar la actividad ureasa (se mezclaron 4 ml urea 1M, 1 ml HEPES 0,2M, pH 7,0 y 80 \mul de una solución de 5 g/l de rojo de fenol, y la mezcla se rellenó hasta 20 ml con agua destilada; a continuación se introdujeron en un tubo de ensayo 100 \mul de esta solución con la misma cantidad de una fracción; el cambio de color de amarillo a rojo indicaba la presencia de ureasa). Las fracciones positivas en ureasa se introdujeron y deshicieron en una columna de cromatografía rellena de Sephacryl S200 50/100 (Pharmacia) (tampón: Tris 50 mM, NaCl 100 mM, 0,05% NaN_{3}, pH 7,3). La concentración de proteínas en la salida se controló midiendo la densidad óptica a 280 nm. Las fracciones del primer pico de proteínas contenían ureasa oligomérica (peso molecular aproximadamente 550-600 kDa), seguida de un segundo pico atribuible a la alquilhidroperóxido-reductasa (también como oligómero). Las fracciones con intersección se desecharon y las fracciones puras (comprobación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida) se reunieron y concentraron a vacío (Speed-Vac) o por ultrafiltración. Las fracciones de alquilhidroperóxido-reductasa que contenían cantidades aun mayores de ureasa se sometieron a purificación posterior con ayuda de una columna de afinidad de \beta-ureasa (anticuerpo Hp8m/1H5-G2B4, Connex, matriz de sefarosa 4B activada con CNBr, Amersham Pharmacia, acoplamiento según instrucciones del fabricante).

Aislamiento de HSP60 (como oligómero)

El antígeno HSP60 no se pudo obtener en cantidad suficiente con el método de extracción con butanol arriba descrito. Por ello, las bacterias se desintegraron con ultrasonidos. Una pella bacteriana fresca o la pella obtenida después de la extracción con butanol al 10% se descongeló, se resuspendió en PBS 150 mM, pH 7,5, en una proporción 1:10 y se trató con ultrasonidos (4 x 90 s con 90 s de pausa en cada caso) en un tubo Falcon sobre agua helada en un sonicador (Sonifire) en la fase 25-30% (fase 7). Después de 40 minutos de centrifugación a 20.000 g, el sobrenadante se introdujo y deshizo en una columna de cromatografía rellena de Sephacryl S200 50/100 (Pharmacia) (tampón: Tris 50 mM, NaCl 100 mM, 0,05% NaN_{3}, pH 7,3). La HSP60 se coeluía con ureasa, por lo que las fracciones positivas en ureasa (véase más arriba) se reunieron y se sometieron a purificación posterior en una columna de afinidad de \beta-ureasa (véase más arriba).

Ejemplo 4 Producción de anticuerpos policlonales y monoclonales (pAK; mAK) contra antígenos específicos de H. pylori

Se produjeron antisueros policlonales de pab Productions (Hebertshausen) mediante procedimientos estándar contra antígenos purificados como se describe más arriba. La producción de anticuerpos monoclonales se realiza por métodos conocidos por los especialistas (Harlow & Lane, 1988; Peters & Baumgarten, 1990).

Inmunización

Como inmunógenos se utilizaron las proteínas purificadas ureasa, HSP60 y alquilhidroperóxido-reductasa y también \alpha-ureasa y \beta-ureasa recombinantes (Austral Biologics). Con cada inmunógeno se inmunizaron (cebado) 4-6 ratones (BALB/c x C57 Black, generación F1, 8-12 semanas de edad) y la inmunización se reforzó 3-4 veces a intervalos de aproximadamente cuatro semanas. Para cada inyección, 200-300 \mul de soluciones de antígeno (25-50 \mug antígeno/animal) se emulsionaron en una proporción 1:1 con un adyuvante de Freund (Difco) completo (cebado) o incompleto (refuerzo), y se inyectaron vía intraperitoneal a 100 \mul/ratón. Antes de la fusión se tomó sangre de los ratones por el seno retroorbital y a partir del antisuero obtenido de ella se determinó el título de anticuerpos mediante Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA, véase más abajo).

Fusión y screening de fusión

De 2 a 3 días después del último refuerzo, se fusionaron células de bazo de los ratones inmunizados con las células de mieloma P3x63Ag8.653 (ATCC CRL-1580; Kearney y col., 1979) en una proporción 5:1 con polietilenglicol 4000. Las células fusionadas se suspendieron en el medio de clonación (medio RPMI 1640 + 20% FCS + 200U IL-6/ml) con suplemento de hipoxantina-aminopterina-timidina (100x concentrado, Sigma) y se cultivaron en placas microticuladas de 96 pocillos, con una densidad celular de 2-6 x 10^{4} células/pocillo (37ºC, 6% CO_{2} y 95% humedad relativa del aire).

Aproximadamente 10 días después, el sobrenadante de cultivo se estudió en ELISA (véase más abajo) para detectar la presencia de anticuerpos con la especificidad deseada.

Establecimiento y cultivo de los hibridomas

Se reclonaron clones que producen anticuerpos específicos de antígeno dos veces de acuerdo con el principio de dilución límite (limiting dilution) (Coller & Coller, 1983) en un medio de clonación con suplemento de hipoxantina-timidina (100x concentrado, Sigma). A continuación, el clon final monoclonal se adaptó al cultivo en un matraz plano en medio RPMI 1640 con 10% FCS y se expandió para la crioconservación de 5-10 partes alícuotas de 2-5 x 10^{6} células cada una y la producción de sobrenadantes de cultivo con contenido en anticuerpos.

ELISA

Para la determinación del título y para el examen de los sobrenadantes de cultivo en cuanto a anticuerpos específicos de antígeno se eligió el método ELISA directo. Se recubrieron las placas ELISA (MaxiSorb; Nunc) durante la noche a 5ºC con una suspensión de antígeno (2-6 \mug antígeno/ml tampón de carbonato, 0,1M, pH 9,5). Para bloquear los sitios de unión todavía libres se añadieron a pipeta 200 \mul de PBS con un 2% de leche desnatada en polvo (peso:volumen) por pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Se incubaron 100 \mul de sobrenadante de cultivo durante 1-2 h a temperatura ambiente. La detección de los anticuerpos unidos se realiza mediante adición de un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano (POD) (IgG-POD conejo-anti-ratón, DAKO). En el siguiente paso, la POD transforma el sustrato incoloro tetrametilbencidina (TMB; Sigma) en un producto azul. Después de un período de 5 a 10 minutos, o tan pronto como el control negativo también presentaba una ligera coloración azul, la reacción se interrumpía por adición de ácido sulfúrico 1N (100 \mul/pocillo). La intensidad de la reacción de coloración se midió en un ELISA-Reader (espectral MWG). La medida se realizó a 455 nm contra la longitud de onda de referencia 620 nm. Entre los pasos de procedimiento individuales, la placa ELISA se lavó 2-3 veces con 250 \mul PBS con 0,025% Tween 20 (volumen:volumen).

Resultados

En total se generaron 24 mAK contra \beta-ureasa, 6 mAK contra \alpha-ureasa, 8 mKA contra proteína 26 kDa y 10 mAK contra HSP60. Entre este repertorio de anticuerpos se eligieron los mAK que presentaban los límites de detección más bajos para los antígenos correspondientes.

Ejemplo 5 Purificación de mAK de sobrenadantes de cultivo de hibridoma y producción de conjugados

La purificación de mAK a partir de sobrenadantes de cultivo de hibridoma se realiza mediante cromatografía de afinidad por proteína G (modificado según: Pharmacia Biotech, 1994).

Los sobrenadantes de cultivo se filtraron (0,8 \mum) y se condujeron directamente a través de la matriz de proteína G. Se lavaron con Tris/HCl hasta que cayó la señal en el detector. La elución se llevó a cabo con 0,1M glicina/HCl, pH 3,0, y la detección de la concentración proteínica se llevó a cabo en el eluato mediante la densidad óptica a 280 nm. Se pueden utilizar todas las fracciones en el área de la señal de elución única.

Una posible contaminación con IgG bovina del suero añadido se ha de considerar como poco crítica, ya que los anticuerpos de detección encontrados no experimentan reacción cruzada con Ig bovina.

El acoplamiento de anticuerpos monoclonales a biotina y POD se llevó a cabo de acuerdo con los métodos dados a conocer en la literatura (Harlow & Lane, 1988).

Ejemplo 6 Caracterización del anticuerpo monoclonal Isotipificación

Los mAK murinos se isotipificaron con el Isotyping Kit IsoStrip de Boehringer Mannheim.

Inmunotransferencia

Para el análisis de inmunotransferencia, por cada gel se cocieron 30-50 \mug de antígeno purificado o 300 \mug de lisado de H. pylori en tampón de muestra reductor (Laemmli, 1970) y se aplicaron sobre un minigel SDS-poliacrilamida preparativo al 12% (8,6 x 7,7 x 0,1 cm, Biometra). La separación electroforética se llevó a cabo a 25-30 mA/gel.

Las proteínas (antígenos) separadas en el gel se inmovilizaron después sobre una membrana de nitrocelulosa en el procedimiento Semidry-Blot (transferencia semiseca).

La membrana se bloqueó durante 30 minutos a temperatura ambiente con un 2% de leche desnatada en polvo en PBS y se lavó tres veces durante 5 minutos con TBS/Tween 20 (0,2%). Para el siguiente paso de incubación, la membrana se sujetó en la unidad Accutran Cross-Blot-Screening (Schleier y Schüll) utilizando una placa de rejilla con 34 canales transversales. En cada uno de los canales transversales formados se dispusieron 250 \mul TBS/Tween 20 y en cada caso se añadieron 250 \mul de los sobrenadantes de cultivo de hibridoma a ensayar. Se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación.

Después de lavarla tres veces (véase más arriba), la membrana se incubó durante 1 hora con el anticuerpo secundario conjugado con POD (IgG-POD conejo-anti-ratón, DAKO).

La membrana se lavó tres veces y el complejo inmune se hizo visible por la adición de la solución de sustrato de 3,3-diaminobencidina (DAB, Sigma).

Caracterización de interacciones anticuerpo-antígeno mediante cartografía de epítope

Para poder identificar el sitio de unión de anticuerpo en una proteína se sintetizaron secuencias de péptido solapadas por las proteínas de H. pylori \alpha-ureasa y \beta-ureasa, HSO60 y proteína 26 kDa (en cada caso dos aminoácidos desplazados entre sí) con 12 restos de aminoácido en una fase sólida, y se acoplaron de forma covalente a una membrana de acetato de celulosa (Jerini GmbH, Berlín). Estas membranas se incubaron con sobrenadante de cultivo de hibridoma y, a continuación, los anticuerpos unidos se sometieron a transferencia sobre membranas de celulosa mediante el procedimiento Semidry-Blot. Después se bloqueó la membrana y los anticuerpos inmovilizados se detectaron tal como
se describe en el punto 5.2 con un anticuerpo secundario marcado con POD (IgG-POD conejo-anti-ratón, DAKO).

Determinación del límite de detección para antígenos de H. pylori en ELISA

Entre los pasos de procedimiento individuales, la placa ELISA se lavó 2-3 veces con 300 \mul PBS con 0,025% Tween (tampón de lavado) (volumen:volumen). Se recubrieron las placas ELISA (MaxiSorb; Nunc) durante 1 hora a 37ºC con 100 \mul de una solución de un anticuerpo antígeno conejo-anti-H. pylori policlonal (pAK; aproximadamente 10 \mug anticuerpo/ml tampón de carbonato, 0,1M, pH 9,5). Para bloquear los sitios de unión todavía libres se añadieron a pipeta 200 \mul de PBS 150 mM con un 2% de leche desnatada en polvo (peso:volumen) por pocillo, y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. 50 ng/ml de antígenos H. pylori purificados disueltos en PBS 150 mM bajo adición de un 0,1% de leche desnatada en polvo se diluyeron en pasos 1:2. El tampón se utilizó como control negativo. A continuación se añadieron 100 \mul de sobrenadante de cultivo diluido 1:10 del mAK a examinar contra el mismo antígeno y la mezcla se incubó durante 30-60 minutos a temperatura ambiente. La detección del anticuerpo unido se llevó a cabo tal como se describe en el punto 3.4. Como límite de detección se aceptó la concentración más baja con la que todavía se detectaba una extinción mayor o igual que el doble del control.

TABLA 1 Resultados de la caracterización de mAK

1

Resultados

La Tabla 1 resume los resultados de la isotipificación, los análisis de inmunotransferencia y la determinación de los límites de detección correspondientes a los mAK enumerados en dicha Tabla 1.

TABLA 2 Resultados de la cartografía de epítopes de anticuerpos monoclonales contra antígenos H. pylori

2

En dos mAK anti-\alpha-ureasa y dos mAK anti-HSP60 no se pudo cartografiar ningún epítope con el método de inmunotransferencia. De tres mAK dirigidos contra la \beta-ureasa y cuatro mAK dirigidos contra la alquilhidroperóxido-reductasa sólo se pudo determinar el epítope en uno de los mAK en cada caso (véase la Tabla 2). Por consiguiente, este método no parecía adecuado para predecir eventuales solapamientos de los epítopes de anticuerpos con la misma especificidad.

Ejemplo 7 Caracterización de interacciones anticuerpo-antígeno mediante espectroscopía de resonancia en plasmón superficial

La medida del solapamiento de epítopes con espectroscopía SPR proporciona información sobre la accesibilidad simultánea de epítopes de anticuerpos. De este modo se pueden encontrar pares de anticuerpos adecuados para el desarrollo de ELISA y ensayo rápido (Fägerstam LG y col., 1990; Malmqvist M., 1996).

Realización de la espectroscopía de resonancia en plasmón superficial en Pharmacia BIAcore

Todos los pasos se realizaron en un Pharmacia Biacore Processsing Unit CA de acuerdo con protocolos estándar (NHS/EDC, BIAcore Methods Manual). Para ello, en primer lugar se inmovilizó un anticuerpo conejo-anti-ratón policlonal sobre la matriz de dextrano del chip de soporte de vidrio BIAcore CM5. Mediante la adición del primer anticuerpo monoclonal específico del antígeno de H. pylori (1^{er} mAK; 100 \mug/ml; 10 \mul), éste se sometió a reacción con el anticuerpo de captura inmovilizado y se midió la variación correspondiente en el detector (\DeltaRU_{1}; RU Resonance Units). Después de añadir antígeno de H. pylori (45 \mug/ml; 5 \mul), éste reaccionó con el 1^{er} mAK. A continuación, el anticuerpo de captura libre restante se bloqueó con un anticuerpo de ratón no específico (1 mg/ml; 10 \mul) y también epítopes oligoméricos mediante adición de 1^{er} mAK adicional (100 \mug/ml; 10 \mul). Después de la reacción subsiguiente del segundo anticuerpo específico del antígeno de H. pylori (2º mAK; 100 \mug/ml; 10 \mul) con el antígeno unido, se determinó de nuevo la variación en la señal del detector (\DeltaRU_{2}) y se estableció su relación porcentual con respecto a la variación en el detector después de la adición del 1^{er} mAK (\DeltaRU_{2}/\DeltaRU_{1}). Una proporción \DeltaRU_{2}/\DeltaRU_{1} < 10% indicaba la presencia de epítopes solapados. (Los epítopes de un antígeno se califican de solapados cuando un primer anticuerpo ha ocupado todos los epítopes de un antígeno a los que se ha de unir y dificulta o impide la unión posterior de un segundo anticuerpo.) Además, a través de medidas cinéticas se pueden calcular los valores de las constantes de velocidad de adsorción y desorción de anticuerpos.

Resultados

Se ensayaron doce anticuerpos anti-ureasa monoclonales y cinco anticuerpos contra alquilhidroperóxido-reductasa. Comparando entre sí las 144 o las 25 posibilidades de combinación, respectivamente, se identificaron aquellas combinaciones que presentaban una accesibilidad simultánea de los epítopes y cuyas constantes de afinidad parecían favorables para la utilización en ELISA de heces. La Tabla 3 muestra una selección de los resultados de la combinación de diferentes anticuerpos contra ureasa y compara las constantes cinéticas de la idoneidad de estas combinaciones de anticuerpos en ELISA de heces (véase Ejemplo 9). En este contexto, la idoneidad de pares de anticuerpos para ELISA no se ha de limitar a epítopes independientes. También una combinación de anticuerpos que reconocen epítopes solapados en parte (como por ejemplo HP9.1m-2D1 y HP8m-4H5) se ha de explicar por el hecho de que las proteínas oligoméricas como la ureasa presentan un mismo epítope varias veces. Esto posibilita en ELISA la unión de un anticuerpo de captura con un epítope y la unión simultánea de uno o más anticuerpos de detección con uno o más epítopes iguales de la proteína oligomérica.

TABLA 3 Cuatro relaciones de pares de mAK para ureasa determinadas mediante resonancia en plasmón superficial y su comportamiento en ELISA

3

Ejemplo 8 Selección de pares de anticuerpos para su utilización en ELISA con heces humanas

En aquellos anticuerpos que presentaban los límites de detección más bajos al medir el sobrenadante de cultivo se determinaron solapamientos de epítopes por resonancia en plasmón superficial. Las combinaciones más prometedoras en estas medidas (menor solapamiento posible de epítopes, constante de velocidad alta para la adsorción, constante de velocidad baja para la desorción) se ensayaron en cuanto a su límite de detección en ELISA de heces.

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Ejemplo 9 Detección de H. pylori en heces humanas mediante ELISA

Abreviaturas: detector = anticuerpo de detección; capturador = anticuerpo de captura.

Como muestras de ensayo se utilizaron muestras de heces de pacientes del Centro Clínico Gro\betahadern, Munich, cuyo estado de infección por H. pylori (categorías 0 y 4) se comprobó mediante análisis serológicos e histológicos. En la categoría 0 se clasificaron los pacientes cuyo resultados clínicos de serología e histología eran claramente negativos, y en la categoría 4 se clasificaron los pacientes cuyo resultados clínicos de serología e histología eran claramente positivos.

Entre los pasos de procedimiento individuales, la placa ELISA se lavó 2-3 veces con 250 \mul PBS con adición de 0,025% Tween 20 (tampón de lavado 1) o con 0,2% Tween 20 (tampón de lavado 2; volumen:volumen). Se recubrieron las placas ELISA (MaxiSorb; Nunc) durante 1 hora a 37ºC con 100 \mul de una solución de mAK (2,5 \mug anticuerpo/ml tampón carbonato, 0,1M, pH 9,5). Para bloquear los sitios de unión todavía libres se añadieron a pipeta 200 \mul de PBS 150 mM con un 0,2% de gelatina de pescado o un 1% de leche desnatada en polvo (peso:volumen) por pocillo, y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El lavado se llevó a cabo con el tampón de lavado 1. Las heces humanas se suspendieron en una proporción 1:10 (peso:volumen) con PBS 150 mM añadiendo un 2% de leche desnatada en polvo, y se añadieron antígenos de H. pylori purificados disueltos en PBS 150 mM en concentraciones conocidas. En cada caso se incubaron 100 \mul de las suspensiones por pocillo durante 1 hora. La placa primero se aclaró a mano y se lavó 4 veces con el tampón de lavado 2. A continuación se añadieron 100 \mul de una solución con mAK acoplado con biotina (0,5 \mug anticuerpo/ml PBS) contra el mismo antígeno y se incubó durante 30-60 minutos a temperatura ambiente. La detección de los antígenos unidos se realizó mediante la adición de un conjugado de estreptavidina con POD (DAKO). La POD transforma el sustrato incoloro TMB (Sigma) en un producto azul. Después de un período de 5 a 10 minutos, o tan pronto como el control negativo también presentaba una ligera coloración azul, la reacción se interrumpía por adición de ácido sulfúrico 1N (100 \mul/pocillo). La intensidad de la reacción de coloración se midió en un ELISA-Reader (espectral MWG). La medición se realizó a 455 nm contra la longitud de onda de referencia 620 nm.

Tabla 4

Detección de antígenos de H. pylori de las heces de pacientes con seguridad negativos (categoría 0) o con seguridad positivos (categoría 4) mediante ELISA utilizando anticuerpos monoclonales:

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4A Muestras de categoría 0: 0 significa positivo falso, 1 significa negativo correcto

4

5

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TABLA 4B Muestras de categoría 4: 0 significa negativo falso, 1 significa positivo correcto

6

7

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TABLA 4C Valores de verdad para la detección de ureasa, proteína 26 kDa y HSP60

8

En el caso de la ureasa, como anticuerpos de captura y anticuerpos de detección se utilizaron HP8m/4H5 + HP16m/XG1. El límite de detección era de 0,075 ng/ml. En el caso de la proteína 26 kda, como anticuerpos de captura se utilizaron HP15m/4H12 y como anticuerpos de detección se utilizaron HP15m/3E8. El límite de detección era de 1,5 ng/ml. En el caso de la HSP60, como anticuerpos de captura se utilizaron HP18.1m/3F11 y como anticuerpos de detección se utilizaron HP16m/2A5 + HP18.1m/4D9. El límite de detección era de 6 ng/ml.

Resultados

Las Tablas 4a-4c muestran los resultados del análisis de muestras de heces para ureasa, alquilhidroperóxido-reductasa y HSP60. La última columna (combinación 3) muestra en cada caso los valores correspondientes al valor de verdad resultante de la combinación de los tres antígenos (ureasa, proteína 26 kda, HSP60).

En total, de 40 muestras de control de categoría 0 analizadas (Tabla 4a), 30 se identificaron como negativas (especificidad 75%); de 44 muestras de categoría 4 (Tabla 4b), 33 se identificaron como positivas (sensibilidad 75%). En 6 de 44 muestras se pudieron detectar los tres antígenos, en 25 de 44 muestras se pudo detectar ureasa, en 11 de 42 muestras se pudo detectar alquilhidroperóxido-reductasa y en 18 de 44 muestras se pudo detectar HSP60. En consecuencia, para la combinación de los tres antígenos (ureasa, 26 kda, HSP60) se alcanzó una especificidad de un 75% y una sensibilidad de un 75% (Tabla 4c).

La Tabla 5 muestra el resultado del análisis de 3 muestras tomadas de las heces de un paciente en tres lugares diferentes. Los datos numéricos corresponden a la extinción medida a 650 nm dividida por la extinción de una muestra cero, es decir, el múltiplo del fondo (H). Se observó una distribución no homogénea de los antígenos detectados.

TABLA 5 Distribución de antígenos de H. pylori en muestras de heces tomadas en diferentes lugares de las deposiciones de un individuo infectado

9

Ejemplo 10 Clonación y determinación de las secuencias de las áreas variables funcionales de inmunoglobulinas en líneas celulares de hibridoma

En primer lugar se aisló ARN total de líneas celulares de hibridoma productoras de anticuerpo según Chomczynski (Chomczynski, 1987).

A continuación se sintetizó el ADNc correspondiente de acuerdo con métodos estándar (Sambrook y col., 1989).

Las regiones de ADN que codificaban la cadena ligera kappa y el segmento Fd de la cadena pesada (VH + CH1) de los anticuerpos correspondientes se amplificaron mediante PCR. Para ello se utilizó el juego oligonucleótido-cebador indicado en la Tabla 6. El ADNc aislado de las líneas celulares de hibridoma individuales se utilizó como matriz.

El juego de cebador utilizado condujo a un sitio de corte 5'-XhoI y un sitio de corte 3'-SpeI en los fragmentos Fd de la cadena pesada, y a un sitio de corte 5'-SacI y un sitio de corte 3'-XbaI en las cadenas ligeras kappa. Para la amplificación por PCR de los fragmentos de ADN codificadores de Fd de cadena pesada, 11 cebadores 5'-VH diferentes (MVH 1-8 y MULH1-3) se combinaron en cada caso con el cebador 3'-VH MIgG1. Para la amplificación por PCR de los fragmentos de ADN codificadores de las cadenas ligeras, 11 cebadores 5'-VK diferentes (MUVK 1-7 y MULK1-4) se combinaron en cada caso con el cebador 3'-VK 3'MUCK.

En todas las amplificaciones por PCR se utilizó el siguiente programa de temperaturas: desnaturalización inicial a 94ºC durante 3 minutos, desnaturalización a 94ºC durante 25 segundos, adición de cebador a 52ºC durante 60 segundos, polimerización a 72ºC durante 90 segundos. Este programa se conservó durante 40 ciclos, seguidos de una complementación final de los fragmentos durante 10 minutos a 72ºC.

Los resultados de las amplificaciones por PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se aislaron bandas de ADN del peso molecular esperado. A continuación, las bandas aisladas se sometieron a una digestión de restricción utilizando las enzimas XhoI y SpeI (cadenas pesadas) o SacI y XbaI (cadenas ligeras), y los fragmentos obtenidos se clonaron en el vector plásmido Bluescript KS (Stratagene) después de haber desintegrado éste previamente con las enzimas de restricción XhoI y SpeI o SacI y XbaI.

A continuación se analizó la secuencia de preparaciones de plásmido de los fragmentos de cadenas pesadas y ligeras clonadas. Para cada línea celular de hibridoma se eligieron secuencias que codificaban áreas variables funcionales de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina (VH o VL). De este modo, para cada línea celular de hibridoma se pudo identificar exactamente un área VH funcional y un área VL funcional. Las secuencias VH y VL funcionales se reproducen en las Figuras 1-8. La clonación y secuenciación se realizaron de acuerdo con métodos estándar (Sambrook y col., 1989).

TABLA 6 Lista de las áreas variables funcionales de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina utilizadas para la amplificación por PCR

10

Bibliografía

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Claims (50)

1. Procedimiento para la detección de una infección en un mamífero por un microorganismo ácido-resistente en el que

(a)

una muestra de heces del mamífero se incuba con dos o tres anticuerpos monoclonales diferentes, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros, bajo condiciones que permiten la formación de complejos de antígenos del microorganismo ácido-resistente con los anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos o los aptámeros, y en el que

(aa)

el primer anticuerpo monoclonal o fragmento o derivado del mismo o el primer aptámero se une específicamente a un epítope del primer antígeno que, como mínimo en parte de los mamíferos, después del tránsito intestinal presenta una estructura que se corresponde con la estructura nativa o con la estructura ante la cual un mamífero produce anticuerpos después de una infección o inmunización con el microorganismo ácido-resistente o con un extracto o lisado del mismo o con una proteína del mismo o un fragmento de la misma o con un péptido sintético que presenta una secuencia de la proteína o fragmento;

(ab)

el segundo anticuerpo monoclonal o el fragmento o derivado del mismo o el segundo aptámero se une específicamente a un epítope de un segundo antígeno que es diferente del epítope del primer antígeno y que, como mínimo en parte de los mamíferos, después del tránsito intestinal presenta una estructura que se corresponde con la estructura nativa o con la estructura ante la cual un mamífero produce anticuerpos después de una infección o inmunización con el microorganismo ácido-resistente o con un extracto o lisado del mismo o con una proteína del mismo o un fragmento de la misma o con un péptido sintético que presenta una secuencia de la proteína o fragmento;

pudiendo solaparse las partes de los mamíferos según (aa) y según (ab) y correspondiendo la suma de las mismas a más de un 70% de los mamíferos infectados; y

(b)

se detecta la formación de como mínimo un complejo antígeno-anticuerpo o complejo antígeno-aptámero según (aa) o (ab).

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el microorganismo es una bacteria ácido-resistente.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la bacteria ácido-resistente es una bacteria del género Helicobacter o del género Mycobacterium o del género Campylobacter.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la bacteria es una bacteria de la especie Helicobacter pylori o Helicobacter hepaticus o de la especie Mycobacterium tuberculosis o de la especie Campylobacter jejuni o Campylobacter pylori.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el epítope del primer antígeno es un epítope de una ureasa y el epítope del segundo antígeno es un epítope de una proteína de choque térmico, de una alquilhidroperóxido-reductasa o de la proteína 20 kDa (3-deshidro-quinasa tipo II), de la proteína 16,9 kDa (proteína activadora de neutrófilos) o de la proteína 33,8 kDa (fructosabifosfato-aldolasa).

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la ureasa es \beta-ureasa de H. pylori.

7. Procedimiento según la reivindicación 5 ó 6, en el que la proteína de choque térmico es una Hsp60.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la alquilhidroperóxido-reductasa es la proteína 26 kDa de H. pylori.

9. Procedimiento en particular según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que

(a)

una muestra de heces del mamífero se incuba con tres anticuerpos monoclonales diferentes, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros bajo condiciones que permiten la formación de complejos de antígenos del microorganismo ácido-resistente con los anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos o los aptámeros, y en el que

(aa)

el primer anticuerpo monoclonal o fragmento o derivado del mismo o el primer aptámero se une específicamente a un epítope del primer antígeno que, como mínimo en parte de los mamíferos, después del tránsito intestinal presenta una estructura que se corresponde con la estructura nativa o con la estructura ante la cual un mamífero produce anticuerpos después de una infección o inmunización con el microorganismo ácido-resistente o con un extracto o lisado del mismo o con una proteína del mismo o fragmento de la misma o con un péptido sintético;

(ab)

el segundo anticuerpo monoclonal o el fragmento o derivado del mismo o el segundo aptámero se une específicamente a un epítope de un segundo antígeno que es diferente del epítope del primer antígeno y que, como mínimo en parte de los mamíferos, después del tránsito intestinal presenta una estructura que se corresponde con la estructura nativa o con la estructura ante la cual un mamífero produce anticuerpos después de una infección o inmunización con el microorganismo ácido-resistente o con un extracto o lisado del mismo o con una proteína del mismo o fragmento de la misma o con un péptido sintético; y

(ac)

el tercer anticuerpo monoclonal o el fragmento o derivado del mismo o el tercer aptámero se une específicamente a un epítope de un tercer antígeno que es diferente del epítope del primer y el segundo antígenos y que, como mínimo en parte de los mamíferos, después del tránsito intestinal presenta una estructura que se corresponde con la estructura nativa o con la estructura ante la cual un mamífero produce anticuerpos después de una infección o inmunización con el microorganismo ácido-resistente o con un extracto o lisado del mismo o con una proteína del mismo o fragmento de la misma o con un péptido sintético;

pudiendo solaparse las partes de los mamíferos según (aa), según (ab) y según (ac) y correspondiendo la suma de las mismas esencialmente a la cantidad total de los mamíferos infectados; y

(b)

se detecta la formación de como mínimo un complejo antígeno-anticuerpo o un complejo antígeno-aptámero según (aa), (ab) o (ac).

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el epítope del primer antígeno es un epítope de una ureasa, preferentemente de \beta-ureasa de H. pylori, el epítope del segundo antígeno es un epítope de una proteína de choque térmico, preferentemente de HSP60 de H. pylori, y el epítope del tercer antígeno es un epítope de una alquilhidroperóxido-reductasa, preferentemente de la proteína 26 kDa de H. pylori, o en el que el epítope del segundo o el tercer antígeno es un epítope de una alquilhidroperóxido-reductasa o de la proteína 20 kDa (3-deshidroquinasa tipo II), de la proteína 16,9 kDa (proteína activadora de neutrófilos) o de la proteína 33,8 kDa (fructosabifosfato-aldolasa).

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que como mínimo uno de los anticuerpos monoclonales o uno de los fragmentos, derivados o aptámeros se une a un epítope de conformación.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que todos los anticuerpos monoclonales o fragmentos, derivados o aptámeros se unen a epítopes de conformación.

13. Procedimiento para la detección de una infección por Helicobacter pylori en las heces de un mamífero, en el que

(a)

una muestra de heces se incuba con dos anticuerpos monoclonales diferentes, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros bajo condiciones que permiten una formación de complejos antígeno-anticuerpo/antígeno-aptámero, y en el que

(aa)

el primer anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo o el primer aptámero se une específicamente a \beta-ureasa o a un fragmento de la misma;

(ab)

el segundo anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo o el segundo aptámero se une específicamente al antígeno 26 kDa o a un fragmento del mismo o se une específicamente a Hsp60 o a un fragmento de la misma; y

(b)

se detecta la formación de como mínimo un complejo antígeno-anticuerpo/complejo antígeno-aptámero según (aa) o (ab).

14. Procedimiento para la detección de una infección por Helicobacter pylori en las heces de un mamífero, en el que

(a)

una muestra de heces se incuba con tres anticuerpos monoclonales diferentes, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros bajo condiciones que permiten una formación de complejos antígeno-anticuerpo/antígeno-aptámero, y en el que

(aa)

el primer anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo o el primer aptámero se une específicamente a \beta-ureasa o a un fragmento de la misma;

(ab)

el segundo anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo o el segundo aptámero se une específicamente a Hsp60 o a un fragmento de la misma; y

(ac)

el tercer anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo o el tercer aptámero se une específicamente al antígeno 26 kDa o a un fragmento del mismo; y

(b)

se detecta la formación de como mínimo un complejo antígeno-anticuerpo/complejo antígeno-aptámero según (aa), (ab) o (ac).

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 7 a 14, en el que el anticuerpo específico de Hsp60 es el anticuerpo producido por el hibridoma HP16m/2A5-E6-E5 depositado en el Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) el 23 de junio de 1998 de acuerdo con los estatutos del Tratado de Budapest con el número de depósito DSM ACC2356.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 8 a 15, en el que el anticuerpo específico del antígeno 26 kda es el anticuerpo producido por el hibridoma HP15m/3E8-D9-D6 depositado en el Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) el 23 de junio de 1998 de acuerdo con los estatutos del Tratado de Budapest con el número de depósito DSM ACC2355.

17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 16, en el que el anticuerpo específico de \beta-ureasa es el anticuerpo producido por los hibridomas HP8m/4H5-D4-C9 o HP9.1m/3C2-F8-E2 depositados en el Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) el 23 de junio de 1998 de acuerdo con los estatutos del Tratado de Budapest con los números de depósito DSM ACC2360 o DSM ACC2362.

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 7 a 17, en el que la cadena pesada del anticuerpo que se une a un epítope de Hsp60 presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente el CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

GFSLSRYSVH

CDR2:

MIWGGGSTDYNSGLKS

CDR3:

NMGGRYPDYFDY

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la secuencia de ADN que codifica la cadena pesada del anticuerpo presenta como mínimo una de las siguientes secuencias de ADN codificadoras de CDR, preferentemente la secuencia de ADN codificadora del CDR3 y en especial las tres secuencias de ADN codificadoras de CDR siguientes:

CDR1:

GG GTTCTCATTA TCCAGATATA GTGTACAC

CDR2:

ATGATATGGG GTGGTGGAAG CACAGACTAT AATTCAGGTC TCAAATCC

CDR3:

AATATG GGGGGTAGGT ACCGGACTA CTTTGACTAC

20. Procedimiento según una de las reivindicaciones 7 a 19, en el que la cadena ligera del anticuerpo que se une a un epítope de Hsp60 presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente el CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

RASKSVSTSGYSYIH

CDR2:

LASNLES

CDR3:

QHSRELPLT

21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que la secuencia de ADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo presenta como mínimo una de las siguientes secuencias de ADN codificadoras de CDR, preferentemente la secuencia de ADN codificadora del CDR3 y en especial las tres secuencias de ADN codificadoras de CDR siguientes:

CDR1:

A GGGCCAGCAA GAGTGTCAGT ACATCTGGCT ATAGTTACAT ACAC

CDR2:

C TTGCATCCAA CCTAGAATCT

CDR3:

CAGC ACAGTAGGGA GCTTCCGCTC ACG

22. Procedimiento según una de las reivindicaciones 8 a 21, en el que la cadena pesada del anticuerpo que se une a una proteína 26 kDa presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente el CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

GFTFNSYAMY

CDR2:

RIRSKSDNYATYYANSVKD

CDR3:

DHDKFPFYYALDY

23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que la secuencia de ADN que codifica la cadena pesada del anticuerpo presenta como mínimo una de las siguientes secuencias de ADN codificadoras de CDR, preferentemente la secuencia de ADN codificadora del CDR3 y en especial las tres secuencias de ADN codificadoras de CDR siguientes:

CDR1:

GG TTTCACCTTC AATTCCTATG CCATGTAC

CDR2:

CGCATAAGAA GTAAAAGTGA TAATTATGCA ACATATTATG CCAATTCAGT GAAAGAC

CDR3:

GATCATG ATAAGTTTCC TTTTTACTAT GCTCTGGACT AC

24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 8 a 23, en el que se utiliza un anticuerpo, fragmento o derivado del mismo, cuya cadena ligera del anticuerpo que se une a una proteína 26 kda presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente el CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

TASSSVSSSYLH

CDR2:

STSNLAS

CDR3:

HQYHRSPPT

25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que la secuencia de ADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo presenta como mínimo una de las siguientes secuencias de ADN codificadoras de CDR, preferentemente la secuencia de ADN codificadora del CDR3 y en especial las tres secuencias de ADN codificadoras de CDR siguientes:

CDR1:

A CTGCCAGCTC AAGTGTGAGT TCCAGTTACT TGCAC

CDR2:

AGCACTTCCA ACCTGGCTTC T

CDR3:

CAC CAGTATCATC GTTCCCCACC GACG

26. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 25, en el que la cadena pesada del anticuerpo que se une a un epítope de \beta-ureasa presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente el CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

GFTFSSHFMS

CDR2:

SISSGGDSFYPDSLKG

CDR3:

DYSWYALDY

o:

CDR1:

GYAFSTSWMN

CDR2:

RIYPGDGDTNYNGKFKG

CDR3:

EDAYYSNPYSLDY

27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que las secuencias de ADN del anticuerpo que codifican la cadena pesada presentan como mínimo una de las siguientes secuencias de ADN codificadoras de CDR, preferentemente la secuencia de ADN codificadora del CDR3 y en especial las tres secuencias de ADN codificadoras de CDR siguientes:

CDR1:

GG CTACGCATTC AGTCCTCCT GGATGAAC

CDR2:

CGGATTTATC CTGGAGATGG AGATACTAAC TACAATGGGA AGTTCAAGGG C

CDR3:

GAG GATGCCTATT ATAGTAACCC CTATAGTTTG GACTAC

o:

CDR1:

GG ATTCACTTTC AGTAGCCATT TCATGTCT

CDR2:

TCCATTAGTA GTGGTGGTGA CAGTTTCTAT CCAGACAGTC TGAAGGGC

CDR3:

GACTAC TCTTGGTATG CTTTGGACTA C

28. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 27, en el que la cadena ligera del anticuerpo que se une a un epítope de la \beta-ureasa presenta como mínimo uno de los siguientes CDR, preferentemente el CDR3 y en especial los tres CDR siguientes:

CDR1:

TASQSIGTRIH

CDR2:

YGSESIS

CDR3:

QQSNTWPLT

o:

CDR1:

HASQNINVWLS

CDR2:

KASNLHT

CDR3:

QQGRSYPLT

29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que la secuencia de ADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo presenta como mínimo una de las siguientes secuencias de ADN codificadoras de CDR, preferentemente la secuencia de ADN codificadora del CDR3 y en especial las tres secuencias de ADN codificadoras de CDR siguientes:

CDR1:

A GGGCCAGTCA GAGCATTGGC ACAAGAATAC AC

CDR2:

TAT GGTTCTGAGT CTATCTCT

CDR3:

CAACAA AGTAATACCT GGCCGCTCAC G

o:

CDR1:

C ATGCCAGTCA GAACATTAAT GTTTGGTTAA GC

CDR2:

AAG GCTTCCAACT TGCACACA

CDR3:

CAACAG GGTCGAAGTT ATCCTCTCAC G

30. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 29, en el que los anticuerpos presentan en las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas las secuencias de aminoácidos representadas en las Figuras 1 y 2, las Figuras 3 y 4, las Figuras 5 y 6 o las Figuras 7 y 8.

31. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 30, en el que las áreas codificadoras de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas presentan las secuencias de ADN representadas en las Figuras 1 y 2, las Figuras 3 y 4, las Figuras 5 y 6 o las Figuras 7 y 8.

32. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 31, en el que antes de la incubación con los anticuerpos se dan los siguientes pasos con la muestra de heces: (a) resuspensión de la muestra de heces 1:3 a 1:25, de forma preferente aproximadamente 1:10, en un tampón de resuspensión, y (b) mezcla en una mezcladora de vórtice.

33. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 32, en el que la detección de la formación del como mínimo un complejo antígeno-anticuerpo/complejo antígeno-aptámero tiene lugar en el paso (b) mediante un procedimiento inmunológico.

34. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 33, en el que la detección de la formación del como mínimo un complejo antígeno-anticuerpo/complejo antígeno-aptámero tiene lugar en el paso (b) mediante ELISA, RIA, Western Blot o un procedimiento inmunocromatográfico.

35. Procedimiento según la reivindicación 33 ó 34, en el que en el RIA o en el ELISA se utiliza el mismo anticuerpo o su fragmento o derivado o el mismo aptámero tanto para la unión con la fase sólida como para la detección del epítope.

36. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 35, en el que los anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos o los aptámeros están fijados a un soporte.

37. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 36, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de ratón.

38. Procedimiento según la reivindicación 36, en el que el material de soporte es un material de soporte poroso.

39. Procedimiento según la reivindicación 36 ó 38, en el que el material de soporte es una tira de prueba.

40. Procedimiento según la reivindicación 36, 38 ó 39, en el que el material de soporte es de celulosa o un derivado de celulosa.

41. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 40, en el que el mamífero es un ser humano.

42. Anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo, que incluye una región V que presenta una combinación de los CDR mostrados en una de las reivindicaciones 18 a 29 o que es producido por uno de los hibridomas mostrados en las reivindicaciones 15 a 17.

43. Anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo según la reivindicación 42, que presenta como mínimo una de las regiones V representadas en las Figuras 1 a 8.

44. Anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo según la reivindicación 42 ó 43, que es un anticuerpo de ratón o un fragmento o derivado del mismo, o un anticuerpo quimérico, preferentemente un anticuerpo humanizado, o un fragmento o derivado del mismo.

45. Aptámero que se une al mismo epítope que el anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo según una de las reivindicaciones 42 a 44.

46. Composición diagnóstica que contiene como mínimo dos anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros tal como se definen en una de las reivindicaciones anteriores, en caso dado fijados a un material de soporte.

47. Dispositivo de ensayo para la detección de como mínimo un epítope tal como se define en una de las reivindicaciones anteriores, que incluye

(a)

como mínimo dos anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros tal como se definen en una de las reivindicaciones anteriores, fijados en un material de soporte;

(b)

un dispositivo para la preparación y análisis de muestras de heces, y en caso dado

(c)

una mezcla de como mínimo dos anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros.

48. Dispositivo de ensayo para la detección de como mínimo un epítope tal como se define en una de las reivindicaciones anteriores, que incluye

(a)

como mínimo dos anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros tal como se definen en una de las reivindicaciones anteriores, estando los anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros conjugados con oro coloidal, partículas de látex u otras partículas colorantes cuyo tamaño oscila típicamente entre 5 nm y 100 nm, preferentemente entre 20 nm y 60 nm;

(b)

un dispositivo para la preparación y análisis de muestras de heces, y en caso dado

(c)

una mezcla de como mínimo dos anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros.

49. Kit que contiene

(a)

como mínimo dos anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros tal como se definen en una de las reivindicaciones anteriores, dado el caso fijados a un material de soporte; en caso dado

(b)

un dispositivo para la preparación y análisis de muestras de heces, y en caso dado

(c)

una mezcla de como mínimo dos anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos o aptámeros.

50. Envase que contiene la composición diagnóstica según la reivindicación 46, el dispositivo de ensayo según la reivindicación 47, 48, o el kit según la reivindicación 49.