BR112019014299A2 - Método para diagnosticar ou monitorar infecção, anticorpos, usos, fragmento de peptídeo e método para gerar um anticorpo que se liga especificamente a map p900 - Google Patents

Abstract

um método para diagnosticar ou monitorar a infecção por mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (map), cujo método compreende detectar a presença do polipeptídeo (map p900) codificado pelo filamento positivo de is900, ou um fragmento do mesmo, em uma amostra de um indivíduo, em que map p900, ou um fragmento do mesmo, é detectado utilizando um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga ao map p900.

Description

“MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR OU MONITORAR INFECÇÃO, ANTICORPOS, USOS, FRAGMENTO DE PEPTÍDEO E MÉTODO PARA GERAR UM ANTICORPO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE A MAP P900” Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se à detecção de Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (MAP). Em particular, a invenção refere-se ao diagnóstico, monitoramento e tratamento da infecção por MAP e de distúrbios associados a essa infecção. A invenção proporciona anticorpos que se ligam especificamente a proteínas MAP e fragmentos de peptídeos específicos para MAP e a usos desses anticorpos e fragmentos de peptídeos.

Antecedentes da Invenção [002] Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (MAP) é um patógeno micobacteriano que é um membro do complexo Mycobacterium avium (MAC). Ao contrário de outros MACs ambientais, o MAP tem a capacidade específica de causar inflamação crônica do intestino de uma variedade de tipos histopatológicos em muitos animais, incluindo os primatas.

[003] MAP foi relatado pela primeira vez na Alemanha em 1895 como a causa da inflamação crônica do intestino em uma vaca leiteira. A condição veio a ser chamada de doença de Johne (JD). Durante a primeira metade do século XX, a JD afetou principalmente a Europa e a América do Norte, mas desde então se espalhou pelo mundo todo para se tornar um problema global.

[004] A infecção por MAP na ausência de JD clínica aparente pode persistir no rebanho por anos durante os quais eles espalharam MAP em seu leite e nas pastagens. O escoamento das pastagens contamina rios e águas superficiais das quais os seres humanos podem ser expostos em aerossóis e suprimentos de água doméstica. As populações humanas podem

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2/65 também ser expostas ao MAP viável residual no leite, do qual a sua eliminação por pasteurização não é assegurada. A presença de MAP vivo residual foi recentemente confirmada em leite em pó infantil (Botsaris et al. “Detection of viable Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in powdered infant formula by phage-PCR and confirmed by culture, International Journal of Food Microbiology 2016; 216: 91-94). O MAP agora é conhecido por ser capaz de infectar e causar inflamação crônica do intestino em muitas espécies, incluindo primatas. Seu envolvimento na causa da doença de Crohn (CD) em humanos é suspeito há muito tempo, mas apesar das crescentes evidências, essa grande incerteza de saúde pública nunca foi resolvida (Hermon-Taylor. “Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis, Crohn’s Disease and the Doomsday Scenario Gut Pathogens 2009; 1:15).

[005] O MAP ainda não foi visto em tecidos doentes na doença de Crohn e, atualmente, não existe um teste de diagnóstico clínico aplicável de maneira prática para a infecção por MAP na medicina humana. Em humanos, a falta de um diagnóstico clínico aplicável de maneira prática é uma grande necessidade médica não satisfeita (Nacy e Buckey, “Mycobacterium avium paratuberculosis: Infrequent Human Pathogen or Public Health Threat? A Report from the American Academy of Microbiology’’, 2008). Além disso, os diagnósticos de MAP disponíveis para animais não são bons para a detecção precoce de infecção subclínica de baixo grau.

Descrição Resumida da Invenção [006] O presente inventor desenvolveu um método sensível e fiável para a detecção de Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (MAP). O inventor desenvolveu anticorpos que são altamente específicos para MAP e que reconhecem regiões de MAP que estão expostas na superfície de MAP e dentro e na superfície de células hospedeiras infectadas com MAP. Os anticorpos ligam-se ao polipeptídeo codificado pelo filamento positivo de MAP

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IS900. Usando os anticorpos, o inventor mostrou que MAP está amplamente presente em amostras de pacientes com doença de Crohn, mas também outras doenças e condições, incluindo Psoríase, tireoidite de Hashimoto, síndrome do intestino irritável e outras (Scanu et al. “Mycobacterium avium Subspecies paratuberculosis Infection in Cases of Irritable Bowel Syndrome and Comparison with Crohn's Disease and Johne's disease: Common Neural and Immune Pathogenicities” Journal Clinical Microbiology. 2007; 45: 3883-3890). O inventor detectou MAP, não apenas em amostras de tecido das regiões afetadas, mas também em fluidos corporais incluindo sangue e leite materno. O inventor demonstrou que os anticorpos podem ser utilizados para detectar organismos de MAP, células infectadas com MAP e fragmentos de polipeptídeos de MAP clivados.

[007] Além disso, o inventor desenvolveu anticorpos que são específicos para uma sequência não fosforilada dentro do polipeptídeo codificado pelo filamento positivo de MAP IS900 ou para as mesmas sequências após fosforilação, isto é, os anticorpos são mutuamente exclusivos. Utilizando estes anticorpos específicos de não fosforilação e fosforilação, o inventor verificou que o estado de fosforilação pode ser utilizado para determinar o estado da infecção por MAP. Ele também verificou que anticorpos específicos para não fosforilação e fosforilação podem ser usados em combinação para caracterizar o nível e a atividade da infecção por MAP.

[008] O inventor identificou fragmentos de peptídeos do polipeptídeo MAP P900 que têm especificidade máxima para MAP e que são imunogênicos. A seleção das sequências de aminoácidos alvo de dentro das porções amino terminal e carboxi terminal extracelulares acessíveis do polipeptídeo MAP P900 é direcionada principalmente pela sua especificidade para o patógeno MAP, de modo que os anticorpos diagnósticos para eles não reajem de forma cruzada com sequências intimamente relacionadas.

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4/65 [009] Por conseguinte, a presente invenção proporciona um método para diagnosticar ou monitorar a infecção por Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (MAP), método esse que compreende detectar a presença do polipeptídeo (MAP P900) codificado pelo filamento positivo de IS900 (MAP IS900) ou um fragmento do mesmo, em uma amostra de um indivíduo, em que o MAP P900, ou um fragmento do mesmo, é detectado utilizando um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga ao MAP P900.

[010] O anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, preferencialmente liga-se à região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 24 a 71 ou 329 a 386 da SEQ ID NO: 1. Os anticorpos preferidos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, ligam a região de MAP P900 definida por:

- aminoácidos 26 a 71 da SEQ ID NO: 1;

- aminoácidos ou 329 a 385 da SEQ ID NO: 1;

- aminoácidos 26 a 39 da SEQ ID NO: 1;

- aminoácidos ou 52 a 68 da SEQ ID NO: 1;

- aminoácidos ou 345 a 359 ou 350 a 359 da SEQ ID NO: 1;

- aminoácidos 26 a 71 da SEQ ID NO: 1, em que a serina 37 é fosforilada;

- aminoácidos ou 345 a 359 ou 350 a 359 da SEQ ID NO: 1, em que a serina 357 é fosforilada e/ ou a serina 358 é fosforilada.

[011] O método da invenção pode utilizar dois ou mais dos referidos anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, para detectar MAP P900. Por exemplo, o método pode utilizar:

- pelo menos um anticorpo que se liga à região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 26 a 71 da SEQ ID NO: 1 e pelo menos um anticorpo adicional que se liga à região de MAP P900 definida por aminoácidos

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5/65 ou 329 a 385 da SEQ ID NO: 1;

- pelo menos um anticorpo que se liga à região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 26 a 39 da SEQ ID NO: 1 e pelo menos urn anticorpo adicional que se liga à região de MAP P900 definida por aminoácidos ou 52 a 68 da SEQ ID NO: 1;

- pelo menos um anticorpo que se liga à região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 52 a 68 da SEQ ID NO: 1 e pelo menos urn anticorpo adicional que se liga à região de MAP P900 definida por aminoácidos ou 345 a 359 ou 350 a 359 da SEQ ID NO: 1;

- pelo menos um anticorpo que se liga à região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 26 a 71 da SEQ ID NO: 1, em que a serina 37 é opcionalmente fosforilada e pelo menos um anticorpo adicional que se liga à região de MAP P900 definida por amino ácidos ou 345 a 359 ou 350 a 359 da SEQ ID NO: 1, em que a serina 357 e/ou a serina 358 é opcionalmente fosforilada.

[012] Em uma forma de realização, o método da invenção compreende determinar se a região de MAP P900 entre os aminoácidos 273 a 406 da SEQ ID NO: 1, ou um fragmento de qualquer um destes, foi clivada do MAP P900 ligado à membrana e, opcionalmente, se a região clivada de MAP P900, ou fragmento da mesma, se espalhou a partir de células microbianas e/ou células hospedeiras contendo MAP P900 ligado à membrana.

[013] Em uma forma de realização, o método da invenção utiliza pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma sequência de MAP P900 não fosforilada e pelo menos um anticorpo adicional que se liga especificamente à sequência de MAP P900 fosforilada. Preferivelmente, a sequência de MAP P900 não fosforilada é MVINDDAQRLLSQR e a sequência de MAP P900 fosforilada é MVINDDAQRLL[pS]QR, ou a sequência de MAP P900 não fosforilada é YLSALVSIRTDPSSR ou VSIRTDPSSR, e a sequência

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6/65 de MAP P900 fosforilada é YLSALVSIRTDPS[pS]R, YLSALVSIRTDP[pS]SR, YLSALVSIRTDPS[pS]R, VSIRTDPS[pS]R, VSIRTDP[pS]SR ou VSIRTDP[pS][pS]R.

[014] A amostra é de preferência uma amostra de um fluido corporal ou uma amostra de tecido. O fluido corporal pode ser, por exemplo, sangue, sêmen, líquido amniótico, fluido cerebrospinal, fluido sinovial ou leite materno, ou o tecido pode ser, por exemplo, pele, músculo, trato gastrointestinal, tiróide, nódulo linfático, cérebro ou trato geniturinário.

[015] O indivíduo preferencialmente tem doença de Crohn, psoríase, tireoidite, doença de Parkinson, diabetes tipo 1, artrite, espondilite anquilosante, síndrome do intestino irritável, colite ulcerativa, doença inflamatória intestinal, doença de Alzheimer, esclerose múltipla, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática e/ ou síndrome da fadiga crônica.

[016] A invenção também fornece:

- Um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, que se liga especificamente à região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 26 a 71 da SEQ ID NO: 1, de preferência um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, que se liga à sequência de aminoácidos MVINDDAQRLLSQR, AAVTTLADGGEVTWAID ou MVINDDAQRLL[pS]QR;

- Um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, que se liga especificamente a uma sequência fosforilada na região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 26 a 71 ou 345 a 371 da SEQ ID NO: 1; preferencialmente um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, que se liga à sequência MVINDDAQRLLSQR ou YLSALVSIRTDPSSR, quando um ou mais dos resíduos de serina é fosforilados;

- Um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigeno do

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7/65 mesmo, que se liga especificamente à sequência de aminoácidos YLSALVSIRTDPSSR ou NLKRPRRYDRRLLRA ou uma forma fosforilada de ambos, dentro da região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 329 a 360 da SEQ ID NO: 1;

- Uso de um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, como aqui definido, em um método ex vivo de diagnóstico ou monitoramento da infecção por MAP;

- Uso de um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, como aqui definido em um método ex vivo de monitoramento do tratamento da infecção por MAP ou tratamento de um indivíduo tendo doença de Crohn, colite ulcerativa, psoríase, tireoidite, sarcoidose, doença de Parkinson, esclerose múltipla, Diabetes tipo 1, artrite, espondilite anquilosante e síndrome do intestino irritável, doença inflamatória intestinal, doença de Alzheimer, esclerose múltipla, fibrose pulmonar idiopática e/ ou síndrome da fadiga crônica;

- Uso de um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, como aqui definido, para detectar MAP em um produto alimentar, tal como leite, outro produto lácteo ou um produto de carne;

- Uso de um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, como aqui definido, em um método para detectar MAP em uma amostra ambiental, tal como uma amostra de água superficial, água fluvial, água da estação de tratamento de água, água doméstica ou um aerossol, solo ou sedimento;

- Uso de um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, como aqui definido, para capturar um peptídeo para caracterização de Espectrometria de Massas (MS) ou Citometria de Massa;

- Um fragmento de peptídeo de MAP P900 de até 40 aminoácidos compreendendo uma ou mais das seguintes sequências: MVINDDAQRLLSQR,

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VTTLADGGEVTWAID, NLKRPRRYDRRLLRA, VSIRTDPSSR e YLSALVSIRTDPSSR, em que o peptídeo é opcionalmente fosforilado, em que o peptídeo fosforilado compreende preferencialmente uma das seguintes sequências: MVINDDAQRLL[pS]QR ou YLSALVSIRTDPS[pS]R,

YLSALVSIRTDP[pS]SR ou YLSALVSIRTDP[pS][pS]R;

- Um método de gerar um anticorpo que se liga especificamente a MAP P900, cujo método compreende administrar um peptídeo como aqui definido a um animal de laboratório para gerar uma resposta imune e isolar anticorpos do animal;

- Um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, como aqui definido, para uso no método terapêutico ou de diagnóstico realizado no corpo humano ou animal;

- Um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, como aqui definido, para uso em um método de tratamento ou prevenção de infecção por MAP.

Breve Descrição das Figuras [017] A Figura 1 mostra a coloração de MAP ISP900 no íleo em um homem de 40 anos com doença de Crohn usando dois anticorpos monoclonais específicos contra Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (MAP). Estes são A1 em vermelho (parte superior direita) e A4 em verde (parte superior esquerda). O painel inferior mostra os dois juntos.

[018] A Figura 2 mostra o cólon transverso de um indivíduo com doença de Crohn corado utilizando os anticorpos A1 (vermelho/ parte superior direita) e A4 (verde/ parte superior esquerda). O painel inferior mostra os dois juntos.

[019] A Figura 3 mostra o íleo de um indivíduo com doença de Crohn corado utilizando os anticorpos A1 (vermelho/ parte superior direita) e A4 (verde/ parte superior esquerda). O painel inferior mostra os dois juntos.

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9/65 [020] A Figura 4 mostra o reto de uma criança do sexo masculino, com 3 meses de idade, com doença de Crohn, corado utilizando os anticorpos A1 (vermelho/ parte superior direita) e A4 (verde/ parte superior esquerda). O painel inferior mostra os dois juntos.

[021] A Figura 5 mostra uma arteríola intestinal em uma ovelha com doença de Johne corada usando os anticorpos A1 (vermelho/ parte superior direita) e A4 (verde/ parte superior esquerda). O painel inferior mostra os dois juntos.

[022] A Figura 6 mostra uma arteríola intestinal em um indivíduo com doença de Crohn corada usando os anticorpos A1 (vermelho/ parte superior direita) e A4 (verde/ parte superior esquerda). O painel inferior mostra os dois juntos.

[023] A Figura 7 mostra os leucócitos carregados de MAP em leite materno corados usando o anticorpo A0X.

[024] A Figura 8 mostra leucócitos carregados de MAP no sangue. Uma imagem de contraste de fase das células é mostrada (parte superior direita) e coloração com o anticorpo A0X (parte superior esquerda). O painel inferior é uma sobreposição das duas imagens.

[025] A Figura 9 mostra uma célula de monócito do sangue de um homem de 25 anos de idade com doença de Crohn grave corada com A4 em vermelho (parte superior direita) e XA4P em verde (parte superior esquerda). A célula não é perfurada, portanto, a coloração é direcionada para a superfície da célula e quase certamente perturba sua função. Os alvos dos anticorpos monoclonais contêm a mesma sequência de aminoácidos que inclui 1 resíduo de serina. Esta serina não é fosforilada no alvo A4 e é fosforilada no alvo XA4P. O evento de fosforilação faz com que os alvos alterem sua imunogenicidade, de modo que, embora ambos aglomerem a superfície celular em aposição íntima entre si, eles não se misturam. O uso de anticorpos

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10/65 monoclonais A4 e XA4P permite, portanto, que as ações dos 2 produtos MAP sejam usadas para rastrear as moléculas e estudar suas localizações.

Breve Descrição da Listagem de Sequências [026] SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos de P900 codificada pelo filamento positivo de MAP IS900em MAP.

MTVTEVVVAQPVWAGVDAGKADHYCMVINDDAQRLLSQRVANDEAALLELI AAVTTLADG

GEVTWAIDLNAGGAALLIALLIAAGQRLLYI PG RTVH H AAGSYRG EG KTDAK DAAIIADQ

121 ARMRHDLQPLRAGDDIAVELRILTSRRSDLVADRTRAINRMRAQLLEYFP ALERAFDYNK

181 SRAALILLTGYQTPDALRSAGGARVAAFLRKRKARNADTVAATALQAANA QHSIVPGQQL

241 AATVVARLAKEVMALDTEIGDTDAMIEERFRRHRHAEIILSMPGFGVILGA EFLAATGGD

301 MAAFASADRLAGVAGLAPVPRDSGRISGNLKRPRRYDRRLLRACYLSAL VSIRTDPSSRT

361 YYDRKRTEGKRHTQAVLALARRRLNVLWAMLRDHAVYHPATTTAAA [027] Sublinhado indica regiões transmembranares previstas.

Descrição Detalhada da Invenção [028] A presente invenção proporciona um novo método para a detecção de Mycobacterium avium, subespécie paratuberculosis, utilizando anticorpos que se ligam especificamente ao polipeptídeo codificado pelo filamento positivo do IS900 (P900). A sequência de aminoácidos de MAP P900 é mostrada na SEQ ID NO: 1.

[029] A presente invenção refere-se a um método para detectar a presença ou ausência de Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (MAP) em uma amostra, método esse que compreende a detecção da

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11/65 presença ou ausência do polipeptídeo (P900) codificado pelo filamento positivo de IS900 (MAP IS900) ou um fragmento do mesmo, em uma amostra de um paciente, em que o polipeptídeo de MAP P900, ou um fragmento do mesmo, é detectado utilizando um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a P900.

[030] Em particular, a presente invenção refere-se a um método de diagnóstico ou monitoramento de infecção por Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (MAP), cujo método compreende a detecção da presença do polipeptídeo codificado pelo filamento positivo de IS900 (MAP IS900), ou um fragmento do mesmo, em uma amostra de um paciente, em que o polipeptídeo de MAP P900, ou um fragmento do mesmo, é detectado utilizando um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a MAP P900.

Anticorpo [031] O presente pedido de patente utiliza anticorpos, ou fragmentos de ligação ao anticorpo dos mesmos, que se ligam especificamente ao polipeptídeo codificado pelo filamento positivo de IS900 (P900) e/ ou a um fragmento do mesmo. A sequência de aminoácidos do P900 é apresentada na SEQ ID NO: 1. De um modo mais preferido, os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao anticorpo dos mesmos, ligam-se a uma região de P900 extracelular a MAP. A região extracelular a MAP está preferencialmente nos aminoácidos 24 a 71, de preferência nos aminoácidos 26 a 71, de SEQ ID NO: 1 (região extracelular N-terminal) ou nos aminoácidos 329 a 386, de preferência nos aminoácidos 329 a 385, da SEQ ID NO: 1 (região extracelular C-terminal).

[032] A presente invenção proporciona anticorpos e seus fragmentos de ligação a anticorpos que se ligam especificamente à região extracelular N-terminal ou à região extracelular C-terminal de MAP P900.

[033] Anticorpos preferidos, ou seus fragmentos de ligação ao

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12/65 antígeno, da invenção incluem anticorpos e fragmentos de anticorpos que se ligam especificamente à região de P900 definida pelos aminoácidos 26 a 71 da SEQ ID NO: 1 ou que se ligam especificamente a uma sequência fosforilada na região de P900 definido pelos aminoácidos 26 a 71 ou 329 a 385 da SEQ ID NO: 1.

[034] Os anticorpos, ou os seus fragmentos de ligação ao anticorpo, ligam-se a sequências de aminoácidos dentro do P900 que são específicas para MAP, isto é, os anticorpos ou os seus fragmentos de ligação ao anticorpo, ligam-se a uma sequência de MAP única. Em particular, as sequências a que os anticorpos se ligam não são encontradas em sequências homólogas codificadas por elementos de inserção de DNA em M. avium sp. intimamente relacionado conhecido na técnica, em particular em M avium spp avium, M avium ssp sylvat, M avium 2333, M avium chebnae, M porcinum, M Rhodesiac, M thermoresistibile, M avium 16 p44, M avium 2285; M intracellulare; M xenopi, M avium p44, M avium silvaticum, M avium hominissuis, Liefsonia xyli TR e/ou M avium AF071067. Os anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao anticorpo, ligam-se a uma sequência de MAP P900 mas não se ligam a sequências homólogas de outros organismos relacionados.

[035] Os anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao anticorpo, podem ligar-se a um epítopo linear (iste é, a uma sequência particular de aminoácidos) dentro do P900. Os anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao anticorpo, são tipicamente gerados utilizando um fragmento de peptídeo sintético de P900 como um imunogênio. Portanto, os anticorpos ou fragmentos de anticorpo, podem ligar-se a um fragmento de peptídeo de P900. Anticorpos que se ligam a um fragmento de P900 bem como a P900 de comprimento completo podem ser usados em um método da invenção, assim como anticorpos que se ligam apenas a um fragmento de P900, particularmente quando um fragmento ao qual o anticorpo se liga é clivado de P900 de

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13/65 comprimento completo em células infectadas com MAP que são então progressivamente exauridas daquele fragmento que pode ser transferido para outra célula. É preferível que o anticorpo se ligue ao P900 na superfície de células micobacterianas (MAP) e células hospedeiras infectadas com MAP. Tais anticorpos tipicamente também se ligam a um fragmento de peptídeo de MAP.

[036] O anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser um que se liga especificamente a uma sequência não fosforilada dentro do P900, ou um que se liga especificamente a uma sequência fosforilada dentro do P900. O anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser um que se ligue a uma sequência de aminoácidos de P900, independentemente do estado de fosforilação de P900.

[037] O polipeptídeo P900 pode ser fosforilado em resíduos de serina, tirosina e/ ou treonina. O anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, pode ligar-se especificamente a uma sequência de P900 que é fosforilada em um ou mais destes resíduos. De preferência, o resíduo fosforilado é um resíduo de serina. O anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ligar-se apenas a uma sequência de P900 na qual um ou mais resíduos de serina (e/ ou um ou mais resíduos de tirosina e/ ou um ou mais de treonina) é fosforilado ou apenas à sequência de P900 em que um ou mais resíduos de serina incluindo resíduos de serina adjacentes (e/ ou um ou mais resíduos de tirosina e/ ou um ou mais de treonina) não são fosforilados.

[038] O anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ligar-se especificamente a uma sequência não fosforilada nos aminoácidos 24 a 71 ou 329 a 386 da SEQ ID NO: 1, tal como nos aminoácidos 345 a 371 da SEQ ID NO: 1. O anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ligar-se especificamente a uma sequência

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14/65 fosforilada dentro da região de P900 definida pelos aminoácidos 24 a 71 ou 329 a 386 da SEQ ID NO: 1, preferencialmente nos aminoácidos 26 a 71 ou 345 a 371 da SEQ ID NO: 1.

[039] O anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ligar-se especificamente a uma sequência de aminoácidos em:

resíduos 24 a 44 da SEQ ID NO: 1 (YCMVINDDAQRLLSQRVANDE - designado por sítio AOX), preferivelmente resíduos 26 a 39 da SEQ ID NO: 1 (MVINDDAQRLLSQR - designado AOX) ou resíduos 26 a 39 nos quais S37 é fosforilada (MVINDDAQRLL[pS]QR designado por AOXP);

resíduos 52 a 71 da SEQ ID NO: 1 (AAVTTLADGGEVTWAIDLNA - designado por sítio XA1), preferencialmente, os resíduos 52 a 68 da SEQ ID NO: 1 (AAVTTLADGGEVTWAID - designado XA1);ou resíduos 329-360 da SEQ ID NO: 1 (NLKRPRRYDRRLLRACYLSALVSIRTDPSSRT), preferivelmente resíduos 329 a 343 da SEQ ID NO: 1 (NLKRPRRYDRRLLRA - designado A3), resíduos 345 a 359 da SEQ ID NO: 1 (YLSALVSIRTDPSSR - designado XA4), resíduos 345 a 359 da SEQ ID NO: 1 em que um ou mais dos resíduos de serina estão fosforilados, de preferência em que S357 (YLSALVSIRTDPS[pS]R) ou S358 (YLSALVSIRTDPS[pS]R - designado XA4P) é fosforilado ou ambos S357 e S358 são fosforilados (YLSALVSIRTDP[pS][pS]R);

- resíduos 350 a 359 da SEQ ID NO: 1 (VSIRTDPSSR-A4), ou resíduos 350 a 359 da SEQ ID NO: 1 nos quais S357 ou S358 é fosforilado ou ambos S357 e S358 são fosforilados;

- resíduos 370-386 da SEQ ID NO: 1 (KRHTQAVLALARRRLNV); ou

- resíduos 370-385 da SEQ ID NO: 1 (KRHTQAVLALARRRLN).

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15/65 [040] O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal, de um modo preferido, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo pode ser um anticorpo humano, humanizado ou quimérico, ou pode ser um anticorpo de camundongo ou anticorpo de outra espécie tal como Coelho, Cabra, Burro ou Alpaca. O anticorpo pode ser um anticorpo recombinante.

[041] O termo “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a MAP P900 e/ ou a um fragmento de peptídeo de MAP P900. Exemplos de fragmentos adequados incluem um fragmento Fab, um fragmento F (ab')2, um fragmento Fab’, um fragmento Fd, um fragmento Fv, um fragmento dAb e uma região determinante de complementaridade isolada (CDR). Os anticorpos de cadeia única, tais como os anticorpos scFv e de cadeia pesada, tais como os anticorpos VHH e camel, também estão abrangidos no termo “porção de ligação ao antígeno” de um anticorpo. O fragmento de ligação ao antígeno pode, por exemplo, ser: um domínio único “Nanocorpo” (Fridy etal. “A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires.” Nature Methods. 2014; 11: 1253-1260); urn fragmento peguilado; um fragmento biespecífico (por exemplo, dois fragmentos scFv ligados por um ligante peptídico); conjugado a uma toxina bacteriana, ou uma forma mutada do mesmo, tal como a exotoxina A de Pseudomonas ou a enterotoxina A de Staphylococcal; conjugado a polietilenoglicol; um diabody enfileirado (tandem); ou uma molécula de redirecionamento de afinidade dupla (DART) (Sheridan, “Ablynx’s nanobody fragments go places anotibodies cannot’, Nature Biotechnology, 2017 35: 1115-1117).

[042] O anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser marcado. A marcação ajuda na detecção do anticorpo ligado a P900 nos métodos de detecção da invenção. A marcação pode ser um

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16/65 fluoróforo, uma enzima tal como peroxidase de rábano silvestre, contas de ouro, um radioisótopo ou um marcador tal como um epítopo peptídico sintético particular ou um oligonucleotídeo sintético ou um lantanídeo. Qualquer fluoróforo adequado pode ser utilizado para marcar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. Por exemplo, o fluoróforo pode ser proteína verde fluorescente, rodamina, Oregon verd, eosina ou Texas vermelho. Quando o método da invenção utiliza um par de anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, cada membro do par é de preferência marcado diferencialmente, por exemplo com fluoróforos de cores diferentes, tais como um fluoróforo vermelho e um fluoróforo verde, de modo que a ligação de cada um dos anticorpos para a amostra pode ser distinguida e/ ou de modo que a co-localização dos anticorpos pode ser detectada.

Diagnosticando e Monitorando a Infecção por MAP [043] A invenção proporciona a utilização de um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a invenção, em um método ex vivo de diagnóstico ou monitoramento da infecção por MAP. O método pode ainda compreender o tratamento de um indivíduo diagnosticado como tendo uma infecção por MAP. O método pode ainda compreender a alteração do tratamento de um indivíduo com uma infecção por MAP, em que a infecção por MAP está sendo monitorada no indivíduo. Por exemplo, o tratamento pode ser um tratamento em que um ou mais agentes antimicrobianos, tais como uma combinação incluindo Rifabutina e Claritromicina, são administrados ao paciente, quer sozinhos quer em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. O tratamento pode ser uma vacina para MAP profilática ou terapêutica. O tratamento pode compreender imunoterapia passiva administrando ao indivíduo anticorpos monoclonais anti-MAP tais como os anticorpos aqui descritos.

[044] O método de detecção de MAP P900 proporcionado pela

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17/65 invenção pode ser utilizado para detectar infecção por MAP em um indivíduo. Tipicamente, o método é realizado ex vivo utilizando uma amostra retirada de um indivíduo humano ou animal. O indivíduo pode ter, ou ser suspeito de ter, doença de Crohn, psoríase, tireoidite, doença de Parkinson, Esclerose múltipla, diabetes tipo 1, artrite, espondilite anquilosante, colite, doença inflamatória intestinal ou síndrome do intestino irritável, doença de Alzheimer, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática e/ ou síndrome da fadiga crônica. O indivíduo pode ser um indivíduo saudável. Um indivíduo saudável é um humano ou animal sem sintomas de uma doença associada a infecção por MAP, tal como qualquer uma das doenças listadas acima. Em animais, o indivíduo pode ser suspeito de estar infectado com MAP ou de ter a doença de Johne. O animal pode ser qualquer animal, mas é preferivelmente um animal de laboratório, um animal selvagem, um animal de estimação ou é mais preferivelmente um animal de criação. O animal de criação é de preferência um animal utilizado para produção de leite ou para carne, tal como uma vaca, cabra, ovelha ou veado. O método pode ser usado para diagnosticar a infecção por MAP ou para monitorar a infecção por MAP. A infecção por MAP pode ser monitorada para determinar o progresso da infecção. Por conseguinte, o método da invenção pode ser utilizado para estudar o curso da infecção por MAP e/ ou para determinar o estado da infecção em um indivíduo.

[045] Os anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao anticorpo, específicos para MAP P900 podem ser utilizados isoladamente, ou em múltiplos, para diagnosticar, quantificar e caracterizar infecções por MAP em humanos e animais. Por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco ou mais anticorpos podem ser utilizados em um método da invenção. Tipicamente, os anticorpos utilizados em um método da invenção serão específicos para diferentes sequências de P900 e/ ou para as mesmas sequências de P900, mas nas formas fosforilada e não fosforilada.

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18/65 [046] O presente inventor verificou que a infecção com MAP e/ ou células em um indivíduo infectado com MAP, pode ser detectada utilizando anticorpos específicos para MAP P900 para corar amostras de tecido retiradas de um indivíduo. A coloração pode ser vista por qualquer meio adequado. Microscopia, em particular microscopia confocal, pode ser usada para identificar células de um indivíduo infectado com MAP. O MAP pode ser visto como partículas subcelulares distintas dentro de células infectadas. Os anticorpos específicos para MAP P900 podem também ser utilizados para detectar MAP P900 na superfície das células infectadas de um indivíduo.

[047] Além disso, o método da invenção pode compreender determinar se a região de MAP P900 entre os aminoácidos 26 a 71 e/ ou 273 a 406 da SEQ ID NO: 1, ou um fragmento de qualquer um destes, foi clivada do MAP P900 ligado à membrana.

[048] Uma maneira de fazer isso é usar pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma primeira região do P900, tal como a região entre os aminoácidos 26 a 71 da SEQ ID NO: 1 e pelo menos um anticorpo para uma segunda região do P900, tal como a região entre os aminoácidos 273 a 406 da SEQ ID NO: 1. Um fragmento de P900 foi clivado e liberado quando o anticorpo para a primeira região de P900 não co-localiza com o anticorpo para a segunda região de P900. Nesta situação, pode haver alguma co-localização parcial dos dois anticorpos, dependendo do grau de divagem e liberação. A colocalização de anticorpos pode ser determinada por qualquer método adequado. Por exemplo, um primeiro anticorpo pode ser marcado com um fluoróforo verde e um segundo anticorpo com um fluoróforo vermelho. A ligação dos anticorpos marcados à amostra pode ser visualizada usando um microscópio adequado (tal como um microscópio confocal). A observação de coloração verde ou vermelha indica áreas nas quais apenas um dentre o primeiro e segundo anticorpo está ligado, enquanto que a coloração dourada,

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19/65 laranja ou amarela mostra onde ambos os anticorpos estão co-localizados.

[049] O fragmento clivado de P900 pode estar na região 329 a 386, 329 a 385 ou 370 a 386 da SEQ ID NO: 1. Tipicamente, o fragmento pode ser detectado utilizando um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, que se liga a aminoácidos 329-360 da SEQ ID NO: 1, preferencialmente resíduos 329 a 359, 329 a 343, 345 a 360, 345 a 359, 350 a 359 ou 350 a 360 da SEQ ID NO: 1, resíduos 329 a 360, 329 a 359, 345 a 360 ou 345 a 359, 350 a 359 ou 350 a 360 da SEQ ID NO: 1, na qual S357 ou S358 é fosforilado ou S357 e S358 são fosforilados.

[050] O fragmento clivado detectado por um método da invenção pode ser detectado em células do indivíduo que não estão infectadas com células de MAP, mas que estão adjacentes a ou perto das células hospedeiras infectadas. Em tais células, os anticorpos mancham o compartimento citoplasmático. A presença de um fragmento de MAP P900 no compartimento citoplasmático de células do indivíduo pode ser utilizada como um indicador do estágio de infecção por MAP.

[051] A amostra testada em um método da invenção pode ser uma amostra de um tecido. O tecido é tipicamente retirado do local da suspeita de infecção. A amostra de tecido pode ser uma amostra de pele, uma amostra da boca, trato gastrointestinal, tireóide, pulmão, nódulo linfático, cérebro ou trato geniturinário. A amostra pode ser uma biopsia intestinal, particularmente quando o indivíduo tem doença de Crohn ou é suspeito de ter doença de Crohn ou outro distúrbio gastrointestinal tal como colite, doença inflamatória intestinal ou síndrome do intestino irritável. A amostra intestinal pode ser retirada de qualquer um ou mais dentre esôfago, estômago, duodeno, jejuno, íleo, ceco, apêndice, cólon e reto e região perianal. O método da invenção também pode ser utilizado para monitorar a vasculite, monitorando a infecção por MAP nos vasos sanguíneos, por exemplo, nos vasos sanguíneos do intestino. A amostra

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20/65 pode ser pele, onde o indivíduo tem ou é suspeito de ter Psoríase. A amostra é tipicamente uma amostra da tiroide, onde o indivíduo tem ou é suspeito de ter tireoidite de Hashimoto.

[052] O MAP P900 e/ ou seus fragmentos podem também ser detectados no sangue e em outros fluidos corporais, tais como leite materno ou fluido sinovial, de um indivíduo infectado com MAP. A amostra testada em um método da invenção pode, portanto, ser uma amostra de um fluido corporal, tal como sangue, urina, sêmen, líquido amniótico, fluido cerebrospinal, fluido sinovial e saliva ou leite materno.

[053] O estado da infecção por MAP também pode ser determinado utilizando anticorpos específicos para ο P900 não fosforilado e anticorpos que são específicos para ο P900 fosforilado. Tipicamente, o método utiliza anticorpos que se ligam à mesma sequência de aminoácidos de P900, em que um primeiro anticorpo se liga à sequência não fosforilada e o segundo anticorpo se liga à sequência fosforilada.

[054] Por exemplo, anticorpos que se ligam a MVINDDAQRLLSQR podem ser usados para detectar a presença de P900 em tecidos intestinais, enquanto anticorpos que se ligam a MVINDDAQRLL[pS]QR não colorem os tecidos intestinais em humanos. No entanto, anticorpos para MVINDDAQRLL[pS]QR se ligam ao P900, ou a um fragmento do mesmo, em glóbulos brancos infectados no sangue humano (leucócito), de modo que a presença de MVINDDAQRLL[pS]QR no sangue pode indicar a progressão da infecção por MAP do intestino para o sangue no indivíduo.

[055] Anticorpos para formas fosforiladas e não fosforiladas da mesma sequência de P900 ou similar, preferivelmente MVINDDAQRLLSQR (A0X) e MVINDDAQRLL[pS]QR (A0XP) ou VSIRTDPSSR (A4) e YLSALVSIRTDPS[pS]R (XA4P), podem ser usados para fornecer uma medida do nível de infecção por MAP. Nesta situação, a forma não fosforilada da

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21/65 sequência é o substrato e a sequência fosforilada é o produto da atividade da enzima fosforilante. O substrato e o produto estão em relação dinâmica entre si, onde a depleção de substrato é igualada pelo aumento do produto. Em um dado momento, a soma total de glóbulos brancos do sangue (leucócitos) circulantes e suas linhagens individuais contendo o substrato, o produto, ou ambos substrato e produto, fornece uma medida da proporção de leucócitos circulantes infectados com MAP. A razão entre os peptídeos não fosforilados e fosforilados reflete a atividade do sistema que provavelmente proporciona correlações cíclicas da atividade da doença e respostas aos tratamentos. Tipicamente, onde os anticorpos são mutuamente exclusivos, por exemplo, ligam-se quer à sequência fosforilada quer à sequência não fosforilada mas não a ambas, a quantidade total de ligação de anticorpo dá uma indicação da quantidade total de P900 presente na amostra e da proporção de células hospedeiras infectadas com MAP. Por exemplo, o número e/ ou proporção de leucócitos infectados pode ser determinado usando os anticorpos AOX e AOXP para detectar MAP em leucócitos. O número e/ ou proporção de leucócitos infectados correlaciona-se com a gravidade da infecção. A gravidade da infecção também se correlaciona com sintomas inflamatórios nos indivíduos infectados, por exemplo, em pessoas com doença de Crohn. Em indivíduos com doença de Crohn, a porcentagem de leucócitos infectados no sangue mostrou ser tão alta quanto cerca de 50%, mas pode ser menor, como mostrado na Tabela 2.

[056] O presente inventor demonstrou que o C-terminal de MAP P900 é clivado mostrando que a coloração do anticorpo AOX e/ ou AOXP do Nterminal nem sempre co-localiza com a coloração XA4 e/ ou XA4P do Cterminal. Os anticorpos e anticorpos da presente invenção podem, portanto, ser utilizados para monitorar o mecanismo patogênico envolvendo a divagem, liberação e/ ou o tráfego do C-terminal de MAP P900. O método da invenção

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22/65 pode ser utilizado para monitorar a infecção por MAP após o tratamento de um indivíduo. O tratamento do indivíduo pode ser um tratamento destinado a atingir a infecção por MAP ou um tratamento de uma doença que é associada ou causada por infecção por MAP, tal como doença de Crohn, psoríase, tireoidite, doença de Parkinson, esclerose múltipla, doença de Alzheimer, Diabetes tipo 1, Artrite, Espondilite anquilosante, Colite, Doença Inflamatória Intestinal ou Síndrome do intestino irritável, Sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática e/ ou síndrome da fadiga crônica. Assim, a invenção proporciona um método para monitorar a eficácia de um tratamento da infecção por MAP, ou o efeito de um tratamento para qualquer uma das condições acima, ou outra condição, na infecção por MAP. Por exemplo, o tratamento pode ser um tratamento em que um ou mais agentes antimicrobianos, tais como uma combinação incluindo Rifabutina e Claritromicina, são administrados ao paciente, quer sozinhos quer em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. O tratamento pode ser uma vacina para MAP profilática ou terapêutica. O tratamento pode compreender imunoterapia passiva administrando ao indivíduo anticorpos monoclonais anti-MAP tais como os anticorpos e peptídeos aqui descritos.

Usos da Invenção [057] O método da invenção pode ser usado para detectar a contaminação por MAP de amostras clínicas, ambientais e/ ou alimentares. Em tais métodos, os anticorpos, ou seus fragmentos de ligação a anticorpos, específicos para MAP P900, podem ser utilizados isoladamente ou em múltiplos. Por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco ou mais anticorpos podem ser utilizados em um método da invenção. Tipicamente, os anticorpos utilizados em um método da invenção serão específicos para diferentes sequências de P900 ou para as mesmas sequências de P900, mas nas formas fosforilada e não fosforilada.

[058] A invenção também proporciona a utilização de um

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23/65 anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da invenção para detectar MAP em uma amostra de alimento humano ou animal ou em uma amostra ambiental.

[059] A amostra de alimento pode ser uma amostra de um produto alimentar tal como leite ou outro produto lácteo ou um produto de carne. A infecção por MAP é conhecida por estar amplamente presente em animais de criação domésticos, incluindo gado leiteiro e de corte, rebanhos de carneiros e cabras, bem como veados de criação. Sabe-se que a infecção é sistêmica e, como a presente tecnologia já confirmou, esses patógenos podem estar presentes abundantemente no sangue, mesmo na ausência de sinais clínicos ou na presença de testes diagnósticos convencionais positivos, como ELISA. Uma característica particular da infecção por MAP é a passagem de células carregadas de MAP para o leite de todas as espécies testadas, de modo que a prole seja exposta à forma intracelular mais virulenta de MAP logo após o nascimento, quando é mais suscetível. O MAP é mais termoestável do que o M. tuberculosis e pode sobreviver às condições de pasteurização. Populações humanas são expostas ao MAP em suprimentos de leite pasteurizado de varejo. O melhor teste presentemente disponível para o MAP no leite é baseado em PCR, que é tecnicamente muito exigente e dispendioso para uma aplicação generalizada.

[060] A amostra ambiental é tipicamente uma amostra de água superficial, água fluvial, água doméstica e água da estação de tratamento de água, um aerossol, solo ou sedimento. As dificuldades técnicas que afetaram o teste de MAP de amostras clínicas também se aplicam àquelas usadas no teste de MAP em amostras a partir de sua captação, entre a liberação de um animal infectado para o meio ambiente, até a exposição humana. Os anticorpos, fragmentos de anticorpo e peptídeos da invenção podem ser utilizados para capturar e medir o MAP.

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Peptídeos [061] A invenção proporciona peptídeos de MAP imunogênicos. O peptídeo pode compreender os aminoácidos 26 a 71 da SEQ ID NO: 1, ou um fragmento desta sequência. O fragmento tipicamente compreende pelo menos 10 aminoácidos, tal como pelo menos 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos. O fragmento pode ter um limite superior de 20, 25, 30, 35, 40 ou 44 aminoácidos. O fragmento pode ser um fragmento dos resíduos 24 a 44 da SEQ ID NO: 1, ou pode ser um fragmento mais comprido compreendendo os resíduos 24 a 44 da SEQ ID NO: 1. Os fragmentos preferidos incluem um fragmento consistindo ou compreendendo os resíduos 26 a 39 da SEQ ID NO: 1 e um fragmento consistindo ou compreendendo os resíduos 52 a 68 da SEQ ID NO: 1, tal como um fragmento compreendendo ou consistindo nos resíduos 52 a 71 da SEQ ID NO: 1.

[062] O peptídeo pode compreender ou consistir nos aminoácidos 345 a 359 da SEQ ID NO: 1. O peptídeo compreendendo os aminoácidos 345 a 359 da SEQ ID NO: 1 pode ter um comprimento de 16 a 40 aminoácidos, tal como de 20 a 30 ou 22 a 27 aminoácidos, por exemplo 25 aminoácidos e é tipicamente um fragmento de P900.

[063] A invenção proporciona um peptídeo fosforilado que compreende os aminoácidos 26 a 71 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos 329 a 385 da SEQ ID NO: 1, ou um fragmento de qualquer uma destas sequências, tal como os aminoácidos 345 a 371 da SEQ ID NO: 1, em que um ou mais resíduos de serina e/ ou um ou mais resíduos de tirosina e/ ou um ou mais resíduos de treonina são fosforilados. Exemplos de peptídeos fosforilados da invenção compreendem ou consistem nos aminoácidos 26 a 39 da SEQ ID NO: 1 em que S37 é fosforilado, resíduos 350 a 359 da SEQ ID NO: 1 nos quais S357 ou S358 é fosforilado ou ambos S357 e S358 são fosforilados. Um peptídeo compreendendo uma destas sequências fosforiladas pode ter um

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25/65 comprimento de 15 a 40 aminoácidos, tal como de 20 a 30 ou 22 a 27 aminoácidos, por exemplo 25 aminoácidos, e é tipicamente um fragmento de P900. O peptídeo pode ser fosforilado em um ou mais resíduos de serina e/ ou em um ou mais resíduos de tirosina e/ ou em um ou mais resíduos de treonina. Tais fragmentos mais compridos incluem um peptídeo consistindo ou compreendendo os resíduos 345 a 359 da SEQ ID NO: 1, tal como um peptídeo consistindo ou compreendendo os resíduos 329-360 da SEQ ID NO:

1.

[064] O peptídeo da invenção pode ser modificado no N-terminal e/ ou no C-terminal e/ ou pode ser conjugado ou acoplado a uma molécula transportadora. Os peptídeos podem, por exemplo, ser conjugados com um sacarídeo bacteriano ou uma proteína transportadora, tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina de soro bovino (BSA), albumina de soro humano (HSA) ou ovalbumina (OVA). Os peptídeos podem ser biotinilados no N-terminal ou no C-terminal, podem ser amidados no N-terminal ou no Cterminal e/ ou podem ter uma marcação peptídica adicionada no N-terminal ou no C-terminal. A marcação peptídica pode ser, por exemplo, uma polilisina, tal como um octâmero de polilisina ramificado, ou um peptídeo de penetração celular, tal como uma oligo-arginina (por exemplo, um octâmero ou nonômero de poliarginina). De um modo preferido, o peptídeo é biotilado no N-terminal e tem um grupo amida ou um octâmero de polilisina ramificado no C-terminal. Um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais podem ser adicionados no Nterminal e/ ou no C-terminal, opcionalmente, além de outras modificações terminais. Por exemplo, um ou mais, tal como dois resíduos de alanina podem ser adicionados no N-terminal para aumentar a imunogenicidade e especificidade e/ ou resíduos carregados, por exemplo, GKK pode ser adicionado no N-terminal ou, de um modo preferido, no C-terminal para reduzir a hidrofobicidade. Quando resíduos, tais como GKK, são adicionados em um

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26/65 terminal, os resíduos de imagem simétrica, tal como KKG, podem ser adicionados no outro terminal.

[065] A presente invenção também proporciona polinucleotídeos que codificam os peptídeos e anticorpos da invenção, bem como vetores de expressão compreendendo tais polinucleotídeos e células hospedeiras compreendendo tais vetores de expressão.

Usos de Peptídeos [066] Os peptídeos da invenção podem ser utilizados para gerar anticorpos para utilização na presente invenção. A invenção proporciona um peptídeo de acordo com a invenção para utilização como imunogênio.

[067] A invenção proporciona um método de geração de um anticorpo que se liga especificamente a MAP P900, cujo método compreende administrar um peptídeo da invenção a um animal de laboratório para gerar uma resposta imune e isolar anticorpos do animal. O animal pode, por exemplo, ser um camundongo, coelho, rato, cabra, burro, alpaca. O método pode ainda compreender o rastrear os anticorpos isolados. Os anticorpos isolados podem ser rastreados quanto à ligação específica a MAP P900, determinando se os anticorpos se ligam a um peptídeo da invenção e se os anticorpos se ligam a peptídeos homólogos de um ou mais organismos relacionados. Um peptídeo é selecionado como sendo específico para MAP P900 onde se liga a um peptídeo da invenção, mas não se liga aos peptídeos homólogos de organismos relacionados, ou se liga ao(s) peptídeo(s) relacionado(s) em menor extensão do que ao peptídeo de MAP, por exemplo mostrando 30% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos de ligação. Por exemplo, pelo menos um, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais organismos relacionados podem ser escolhidos. Os organismos relacionados são tipicamente outros M avium sp e podem, por exemplo, ser selecionados a partir de M avium spp avium, M avium ssp sylvat, M avium 2333, M avium

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27/65 chebnae, M porcinum, M Rhodesiac, M thermoresistibile, M avium 16 p44, M avium 2285; M intracellulare; M xenopi, M avium p44, M avium silvaticum, M avium hominissuis, Liefsonia xyli TR e M avium AF071067. Peptideos exemplificativos de organismos relacionados são descritos nos Exemplos.

[068] Os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais da invenção podem ser gerados por métodos padrão.

[069] Anticorpos podem ser rastreados/ validados por qualquer uma das seguintes maneiras:

1. Coloração de MAP cultivado e micobactérias relacionadas em seu fenótipo extracelular;

2. Coloração de MAP cultivado e micobactérias relacionadas em seu fenótipo intracelular em cultura de células;

3. Western blots de MAP e outros lisados micobacterianos e desenvolvimento das manchas;

4. ELISA de ligação do anticorpo monoclonal aos mesmos peptideos no MAP e peptídeos relacionados em outros organismos;

5. Microdissecção por captura a laser de áreas coradas e não coradas em tecidos seguida de extração de DNA, PCR específico para MAP e verificação por sequenciamento de amplicons;

6. Separação celular ativada por fluorescência de células coradas com anticorpo e PCR;

7. Bloqueio diferencial da coloração de anticorpos de tecidos pelo peptídeo alvo sintético idêntico e não por peptídeos não relacionados;

Métodos exemplificativos são descritos nos Exemplos;

8. Co-localização de múltiplos anticorpos monoclonais em partículas submicrométricas de MAP no citoplasma de células infectadas.

Usos Médicos/ Métodos de Tratamento [070] A invenção proporciona um anticorpo, ou fragmento de

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28/65 anticorpo de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, para utilização em método terapêutico ou de diagnóstico realizado no corpo humano ou animal. O método terapêutico é tipicamente o tratamento ou a prevenção da infecção por MAP em um indivíduo. O método de diagnóstico é tipicamente o diagnóstico de infecção por MAP.

[071] A invenção também proporciona a utilização de um anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, na fabricação de um medicamento para utilização em um método de tratamento, prevenção ou diagnóstico de infecção por MAP.

[072] Também é proporcionado, pela invenção, um método de tratamento ou prevenção da infecção por MAP em um indivíduo com necessidade do mesmo, cujo método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente ou profilacticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno de acordo com a invenção. O indivíduo pode não apresentar nenhuma, uma ou mais das seguintes doenças: doença de Crohn, psoríase, tireoidite, doença de Parkinson, diabetes tipo 1, artrite, espondilite anquilosante, síndrome do intestino irritável, colite ulcerativa, doença inflamatória intestinal, doença de Alzheimer, esclerose múltipla sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática e/ ou síndrome da fadiga crônica.

[073] Os exemplos seguintes ilustram a invenção.

Exemplo 1: Fases do Desenvolvimento dos Anticorpos da Invenção Fase 1. Mapeamento de Domínios Peptídicos de Ligação a Anticorpos de Camundongos em P900 [074] 99,6% do genoma do MAP é praticamente idêntico na sequência do DNA e organização genética aos de outros M. avium sp que são onipresentes no ambiente e em animais e humanos saudáveis. Portanto, é difícil encontrar alvos únicos no MAP que sejam estericamente acessíveis e expressos abundantemente durante a infecção intracelular em humanos. Dos

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4.377 ORFs previstos no genoma do MAP, foi selecionado o gene que codifica IS900 (acesso NCBI: AE016958.1). O IS900 é um elemento de inserção de DNA de 1451-53bp descoberto pelo presente inventor e colegas no final de 1985 em três isolados de doença de Crohn de MAP (E. Green et al. Nucleic Acids Research 1989; 17: 9063-73). Está presente no MAP em 14-18 cópias idênticas inseridas em sítios altamente conservados em todo o genoma do MAP. Esse elemento multicópia tem seu próprio promotor, é abundantemente expresso em humanos e contribui para o amplo fenótipo patogênico.

[075] O filamento positivo do IS900 prevê uma proteína (P900) de 406 aminoácidos. A sua sequência de aminoácidos de comprimento completo é única do MAP, mas existem os “sósias” de P900 em micobactérias e actinomicetos estreitamente relacionados que cobrem a maior parte da molécula de P900.

[076] A proteína de P900 de comprimento completo codificada pelo filamento positivo do IS900 é tóxica para as células de E. coll. Uma versão truncada menos tóxica constituída pelos aminoácidos 49 a 377 do P900 foi feita e expressa como a proteína recombinante em E. coll.

[077] Dez camundongos foram imunizados com a proteína de P900 recombinante truncada, aderente a esferas magnéticas, porque foi verificado que a proteína recombinante livre não induz uma resposta imune satisfatória. Os soros de camundongos imunizados foram rastreados por ELISA contra P900 imobilizado e foram identificados 4 camundongos positivos. Utilizaram-se células de baço destes camundongos para a fusão de hibridoma resultando em 10 clones parentais. Os sobrenadantes destes e dos seus subclones sucessivos foram rastreados contra uma biblioteca de 64 peptídeos sintéticos de 15 aminoácidos, sobrepondo-se por 10 aminoácidos, abarcando a sequência de aminoácidos P900 truncada de ELIAAVTTLADGGEV... até... DRKRTEGKRHTQAVL. Os anticorpos eram todos IgM e os clones

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30/65 eventualmente se mostraram instáveis. Apesar da incapacidade de obter os reagentes monoclonais desejados, 8 peptídeos ou grupos de peptídeos foram identificados como imunogênicos dentro da proteína de P900 truncada. Na biblioteca de peptídeos, estes envolveram os peptídeos No. 2VTTLADGGEVTWAID, 27-NKSRAALILLTGYQT, 41-AKEVMALDTEIGDTD, 42ALDTEIGDTDAMIEE e um grupo dentro da sequência GRISGNLKRPRRYDRRLLRACYLSALVSIRTDPSSRTYYD.

[078] Utilizou-se a bioinformática para examinar estas sequências candidatas, tendo em conta: (i) a especificidade para MAP, especialmente em comparação com sequências homólogas codificadas por elementos de inserção de DNA em M. avium sp. intimamente relacionado bem conhecido na técnica; (ii) localização prevista na superfície externa do MAP acessível aos anticorpos; e (ill) sítios previstos para modificações pós-tradução, tais como fosforilação, miristilação, glicosilação, motivos de sinalização e sítios de divagem proteolítica limitados que podem afetar o reconhecimento do anticorpo, localização em uma célula infectada por MAP, trânsito, estabilidade, transporte e função.

Tabela 1: Exemplos de Peptídeos Semelhantes a A1 A3 e A4 em outros

Organismos

Peptídeo	Sequência	Organismo
Referência A1	VTTLADGGEVTWAIDLNA	MAP K-10 bovino, todas as cepas de MAP incluindo S397 de ovelha
	VTRLADGGEVTWAVD	M avium 16 p44
	VATMADGGEVTWAID	M porcinum ABV59207; M Rhodesiae WP014211331.1; M thermoresistible WP040548537
	VTRLADGGEVTWAVD	M avium 2285 EUA29312.1; M intracellulare EUA53942.1; M avium subsp. avium P44 CAA09798.1
	VTAQADGGDVTWAID	M xenopi 4042 EUA52288.1
A3	NLKRPRRYDRRLLRAGYL	MAP e M avium EMBLAAF08611.1 IS1626 do Japão
	NLQRPRRYNRRLLRA	M porcinum
	NLKRPRRYDRRLLRT	M avium p44
	NLHRPKRYNRRLRRV	M avium silvaticum

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31/65

Peptídeo	Sequência	Organismo
	NLHRPKRYNRRLRRV	M avium hominissuis
	NLHRPKRYDRRLLRA	Liefsonia xyli TR: Q6ACG7 AE016822
A4	YLSALVSIRTDPSSR	MAP
	YLSALYSIRSDPASR	M porcinum, M thermoresistible
	YTSALVSVRYDPSSR	IS116/110/902
	YLSAQIAIRTDPASR	M avium AF071067 e P44

Fase 2. Preparação de Anticorpos Policlonais para Sequências de P900 em

Coelhos e seus Testes em Humanos e Animais Preparação de Anticorpos Policlonais:

[079] Peptídeos iniciais preferidos designados A1VTTLADGGEVTWAIDLNA, A2-NKSRAALILLTGYQTPDA, A3NLKRPRRYDRRLLRAGYL e A4-YLSALVSIRTDPSSR foram identificados. Estes foram preparados como imunogênios octapeptídicos ramificados sintéticos em núcleos de polilisina e utilizados para imunizar coelhos. Títulos adequados de anticorpos policlonais foram prontamente obtidos para A1, A3 e A4. A2 não era imunogênico o coelho. A2 também foi intracelular no MAP e não foi estudado mais.

[080] Anticorpos nos soros A1 e A3 reagindo com o adjuvante completo de Freund (M. tuberculosis H37Ra, Difco, EUA) foram resumidos até o final usando o antígeno em excesso. Apenas o antígeno incompleto de Freund foi usado como adjuvante com A4. Os reagentes policlonais de coelho A1, A3 e A4 foram aplicados em estudos preliminares para explorar a sua capacidade de detectar as suas sequências alvo e, portanto, imunorreatividade de MAP em tecidos humanos e animais e sangue humano.

Imunorreatividade de MAP em Tecidos Humanos [081] Em um estudo inicial, biópsias da mucosa intestinal frescas foram obtidas de 14 pacientes com diagnóstico de doença de Crohn (CD) atendidos no ambulatório de endoscopia do St Thomas’ Hospital, Londres, Reino Unido e 10 pacientes controle sem doença inflamatória intestinal (nlBD)

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32/65 atendidos para triagem ou acompanhamento. A aprovação ética foi dada pelo Comitê de Ética Local (EC03/ 053). As biópsias foram embutidas em meio de congelação de tecidos de Jung e congeladas rapidamente em nitrogênio líquido na suíte de endoscopia. Elas foram então levadas para o laboratório, onde foram codificadas e armazenadas a -80 °C antes do uso.

[082] As biópsias orientadas foram subsequentemente cortadas em seções de 6 μιτι e montadas em lâminas revestidas com PTFE e coradas com anticorpos policlonais A1, A3 e A4 a uma diluição de 1: 400 a 1: 800. Os marcadores fenotípicos das células hospedeiras foram CD3 para células T, CD8 para monócitos/ macrófagos, CD19 para células B, CD66b para neutrófilos, CD83 para células dendríticas, PgP9.5 para células Gliais e CD31 para endotélio. Os anticorpos secundários foram TRITC de coelho anticamundongo (R0270 Dako, UK), FITC de coelho anti-camundongo (F0261, Dako), TRITC de suíno anti-coelho (R0156, Dako), FITC de suíno anti-coelho (F0205, Dako) e FITC de cabra anti-camundongo (F0479). As lâminas foram lavadas 3x em PBS e montadas em agente Fluoromount (F4680 Sigma-Aldrich, UK) seguido de uma lamínula.

[083] O uso de anticorpos A1, A3 e A4 isoladamente em concentrações de 1: 500 a 1: 800 resultou na coloração de células dentro do epitélio e na lâmina propria subjacente. Os anticorpos foram então utilizados em pares com A1 marcado com TRITC (vermelho) e A3 ou A4 com FITC (verde).

[084] O sítio A1 está localizado no domínio aminoterminal extracelular da proteína de P900 adjacente à primeira região transmembrana e bem contra a superfície da célula microbiana. O peptídeo A1 pareceu permanecer ligado ao MAP.

[085] Os sítios A3 e A4 estão localizados no centro do domínio extracelular carboxiterminal mais longo de cada lado da Cisteína 344. O

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33/65 domínio carboxiterminal pode ser ligado ou liberado por divagem proteolítica limitada perto da segunda região transmembranar.

[086] O uso de A1 (vermelho) e A4 (verde) com o peptídeo carboxiterminal ainda ligado resultou em co-localização (dourado) não apenas nas mesmas células, mas também em partículas submicrométricas no citoplasma das células infectadas. A liberação do carboxiterminal resultou em um gradiente progressivo de mudança de cor de dourado para laranja para vermelho e a migração visível do peptídeo liberado (verde) no citoplasma da célula afetada. Verificou-se que outras células continham o verde, sugerindo apenas a capacidade de o peptídeo carboxiterminal liberado trafegar para outras células que não continham MAP. Isto foi suportado pelo aparecimento em tecidos de vesículas intercelulares preenchidas verde, consistente com endossomas.

[087] Na superfície, o epitélio MAP mostrou infectar enterócitos, bem como células intra-epiteliais, consistentes com linfócitos e macrófagos. O MAP foi visto agrupar frequentemente em um “colar” ao redor da base do vacúolo de muco de células caliciformes, liberando peptídeos carboxiterminais verdes que migraram no citoplasma para o ápice dessas células, bem como no próprio vacúolo de muco.

[088] O MAP também foi visto infectar células amplamente na lâmina propria e particularmente aglomerados de células em torno das bases das gândulas simples. A coloração envolveu particularmente macrófagos, polimorfos e linfócitos B, mas não linfócitos T, embora a presença de linfócitos T adjacentes a aglomerados de MAP fosse frequentemente observada.

[089] A infecção por MAP abundante em biópsias endoscópicas da mucosa foi observada em todos os 14 pacientes com doença de Crohn. Os aglomerados escassos de MAP imunorreativo foram observados em 8 dos 10 indivíduos de controle. Os outros 2 indivíduos de controle não continham

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34/65 qualquer coloração de MAP. A adição de peptídeo específico ao tampão operacional bloqueou completamente a coloração dos tecidos pelo anticorpo correspondente. A utilização de outros peptídeos não teve efeito na ligação do anticorpo. Juntamente com a co-localização, este bloqueio específico reforçou a precisão e especificidade do sistema de detecção de MAP.

Verificação por PCR da Ligação do Anticorpo A1 ao MAP em Tecidos Humanos [090] A catapultagem por pressão de microdissecção a laser (LMPC) de loci imunorreativos de A1 foi realizada para determinar se o reconhecimento de anticorpos em tecidos equivalia à presença de MAP utilizando PCR IS900. Biópsias endoscópicas frescas da mucosa foram obtidas de 11 pacientes com consentimento e 4 indivíduos controle sem doença inflamatória intestinal. Os tecidos foram congelados rapidamente em nitrogênio líquido e seções criostáticas de 6μιτι foram cortadas como descrito anteriormente. As seções foram transferidas para lâminas de microscópio revestidas com PTFE para coloração de rotina com H&E. Aqueles para LMPC foram imobilizados em lâminas de membrana PEN (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Alemanha).

[091] Identificaram-se regiões de MAP imunorreativas em seções com anticorpo policlonal de coelho A1 utilizando o segundo anticorpo marcado H com fosfatase alcalina biotinilado para imunoglobulina de coelho. Após a lavagem das lâminas em PBS, utilizou-se o kit Vectastain Universal ABC-AP (Vector Laboratories UK) para a localização de regiões de MAP imunorreativas de acordo com as instruções do fabricante. Os anticorpos secundários foram localizados utilizando o Kit 1 Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate (Vector Laboratories UK).

[092] Utilizou-se a catapultagem por pressão e microdissecção a laser para isolar as regiões de MAP imunorreativas (IR) e não imunorreativas

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35/65 (nIR) utilizando o sistema de microdissecção Zeiss PALM MicroBeam Laser. Antes da microdissecção, foram tomados cuidados especiais para assegurar que as seções estavam completamente secas ao ar de modo a que as regiões excisadas se destacassem prontamente. As regiões IR e nIR foram identificadas visualmente e o tubo de tampa adesivo foi posicionado acima da área selecionada. Amostras foram acumuladas na tampa do tubo adesivo. A extraco de DNA foi realizada como descrito (T. Bull et al., 2003 J Clin Microbiol 2003; 41: 2915-23). Resumidamente, 200 pL de tampão de lise de micobactéria (MLB), 8,6 ml de água de grau molecular, 800 μΙ de NaCI 5M, 1M 10x TrisEDTA (TE) e 600 pL de SDS a 10% foram adicionados a cada tubo e incubados de um dia para outro a 37 ^SC. 10 pl de Proteinase K 10 mg/ ml (Sigma), 5 pl de Lisozima 100 mg/ ml (Sigma) e 4 pl de Lipase 120mg/ ml (Sigma) em MLB foram adicionados a cada tubo e incubados a 37 ^SC durante mais 3 horas. As amostras foram transferidas para tubos Lysing Matrix B Ribolyser e 400 pL de 1xTE foram adicionados. Os tubos foram mecanicamente interrompidos a 6,5 ms² por 45 segundos em um instrumento FastPrep Ribolyser. O procedimento de extração de DNA padrão de fenolclorofórmio-isoamila foi realizado. O DNA purificado foi ressuspendido em 50 pl de 1xTE. O PCR aninhado utilizando 2 pl de DNA molde foi realizado utilizando iniciadores de primeira volta L1 e L2 e iniciadores de segunda volta AV1 e AV2. O amplicon esperado de PCR de 298bp foi visualizado usando eletroforese em gel de agarose a 1%. Precauções rigorosas foram tomadas como descrito para excluir a contaminação do amplicon.

[093] Todos os 4 indivíduos de controle apresentaram resultado negativo pelo PCR IS900. As regiões imunorreativas de 7 dos 11 pacientes do grupo CD foram positivas para MAP por PCR IS900, confirmadas por sequenciamento de amplicon em 5. Todas as regiões nIR amostradas em pacientes com CD foram PCR-negativas Todos os 7 pacientes com teste

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36/65 positivo para MAP por PCR IS900 estavam em tratamento com apenas azatioprina. As 4 amostras negativas para PCR vieram de pacientes com doença de Crohn recebendo tratamento com azatioprina em combinação com Humira ou 6-mercaptopurina e Infliximab.

Detecção de MAP em Blocos Histopatológicos Fixados em Formalina e Embebidos em Parafina [094] A capacidade do sistema de diagnóstico para MAP em tecidos para operar em amostras histopatológicas embebidas em parafina fixadas de rotina facilita substancialmente a sua aplicação clínica e comercial. Além disso, permite que o teste seja aplicado retrospectivamente a materiais de arquivo para que, com as aprovações apropriadas, um número substancial de pacientes e suas amostras de tecido possam ser rastreados e respostas a perguntas como a prevalência de infecção por MAP em populações em risco como um todo possam ser investigadas economicamente. A ligação do anticorpo a sequências peptídicas sintéticas é dependente da sequência, em vez de dependente da conformação, permitindo que o método funcione com sucesso em tais amostras.

[095] O protocolo de recuperação antigênica e imunocoloração de seções de tecido embebidas em parafina usando os anticorpos policlonais de coelho foi otimizado como segue: cortes de tecido de 0,2 pm foram desparafinizados por 10 minutos em 3 trocas de xileno, reidratados em graus descendentes de álcool e colocados em água da torneira por 5 minutos. A recuperação do antígeno foi conseguida mergulhando as lâminas em água destilada contendo 0,05% de protease XIV Streptomyces Griseous Sigma P6911 P código 1000984453 a 37 ^SC durante 5 minutos. As lâminas foram deixadas a arrefecer até à temperatura ambiente e lavadas 3 vezes em 1 x PBS, cada uma durante 5 minutos. A ligação não específica ao receptor Fc foi bloqueada utilizando Trustain a 1/50 durante 15 minutos e, se necessário,

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37/65 permeabilizada em Triton X-100 a 0,1% durante 5 minutos. Seções foram lavadas brevemente em 1xPBS e depois incubadas em solução de anticorpo primário durante 1 hora à temperatura ambiente em um agitador orbital. As seções foram lavadas três vezes em 1xPBS, cada durante 5 minutos, e incubadas em anticorpo secundário conjugado com Dylite488/550 a 1/1000 durante 45 minutos à temperatura ambiente (TA). As seções foram lavadas três vezes em 1xPBS, cada uma durante 5 minutos, desidratadas, limpas em Xileno, montadas em material de montagem aquoso (Vectashield) e a tampa escorregou.

Fase 3. Preparação de Anticorpos Monoclonais Murinos para Sequências Peptídicas P900 Otimizadas nos Sítios AO, A1, A3 e A4 Selecionados e Derivados Fosforilados [096] Nesta fase, foi introduzido um sítio alvo adicional para a produção de anticorpos monoclonais designado A0, compreendendo a sequência MVINDDAQRL, resíduos 26-39 no domínio aminoterminal extracelular de P900. Poucas correspondências idênticas a essa sequência foram encontradas em bancos de dados do NCBI.

[097] A produção de anticorpos monoclonais murinos foi primeiro tentada da seguinte maneira. Os peptídeos imunogênicos em cada caso incorporando um tiol de Cys solitário para ligação a KLH foram preparados para A0 (MVINDDAQRL-C), A3 (C-NLKRPRRYDR) e A4 (C-VSIRTDPSSR) e 5 camundongos foram imunizados em cada grupo. Apesar das boas respostas imunológicas em alguns dos camundongos em cada grupo, não foram obtidos monoclonais que reconhecem seus alvos nativos nos tecidos. Verificou-se que isto se devia à utilização exclusiva do peptídeo alvo para rastrear ELISA e a seleção clonal sendo revestida diretamente nos poços da placa de ELISA. Isso resultou em artefato substancial e o projeto foi um fracasso completo.

[098] Por outro lado, o inventor verificou que era essencial que

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38/65 os peptídeos sintéticos alvo utilizados na triagem de ELISA fossem alfa-n biotinilados e ligados a poços revestidos com estreptavidina. Isto aumentou a acessibilidade estérica dos peptídeos móveis ligados e permitiu a adoção da configuração apropriada do peptídeo para o anticorpo na fase líquida. Houve estreita correlação entre a ligação do anticorpo ao peptídeo alvo nesta forma em ELISA e ao peptídeo nativo nos tecidos alvo.

[099] O revestimento essencial de estreptavidina e imobilização de peptídeo biotinila em poços de ELISA foi adoptado e utilizado ao longo do próximo projeto. Durante este projeto, os soros de camundongo e os sobrenadantes de cultura foram selecionados para ligação ao peptídeo de referência, mas não peptídeos negativos. As amostras selecionadas foram posteriormente testadas por imunofluorescência em tecidos humanos e animais e células infectadas com MAP.

[0100] Os imunogênios foram sintetizados utilizando as sequências peptídicas AOX MVINDDAQRLLSQR-C, A1 VTTLADGGEVTWAIDC e XA4 YLSALVSIRTDPSSR-C, em cada caso, o tiol de Cys foi utilizado para ligar a KLH utilizando métodos padrão. Estas construções foram utilizadas para imunizar grupos de 5 a 10 camundongos BalbC. Boas respostas sorológicas à imunização ocorreram em todos os grupos e clones candidatos promissores foram obtidos para cada grupo. Apesar das adições aos protocolos de imunização incluindo a imunização in vitro e seguir a imunização utilizando diferentes aductos imunogênicos em conjunto com muito trabalho adicional, não foram obtidos clones de IgG estáveis finais adequados.

[0101] Os materiais utilizados inicialmente no próximo projeto foram os seguintes:

Peptídeo imunogênico AO ac-MVINDDAQRL-8 octâmero de polilisina ramificado;

Peptídeo de referência Biotinila-MVINDDAQRL-amida;

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39/65

Peptídeo negativo 1

Peptídeo negativo 2

Peptídeo imunogênico polilisina ramificado;

Peptídeo de referência

Peptídeo negativo 1

Peptídeo negativo 2

Peptídeo imunogênico polilisina ramificado;

Peptídeo de referência

Peptídeo negativo 1

Peptídeo negativo 2

Peptídeo negativo 3

Peptídeo negativo 4

Peptídeo negativo 5

Peptídeo negativo 6

Peptídeo imunogênico polilisina ramificado;

Peptídeo de referência

Peptídeo negativo 1

Peptídeo negativo 2

Peptídeo negativo 3

Peptídeo negativo 4

Peptídeo negativo 5 [0102] Grupos de 5 imunizados com as construções

Biotinila-MVINDDLQR-amida;

Biotinila-MVINNDAE-amida;

A1 ac-VTTLADGGEVT-8octâmero de

Biotinila-VTTLADGGEVT-amida;

Biotinila-VATMADGGEVT-amida; Biotinila-VTRLADGGEVT-amida;

A3 ac-NLKRPRRYDR-8octâmero de

Biotinila-NLKRPRRYDR-amida;

Biotinila-NLKRPRR-amida;

Biotinila-NLRRPRRYHR-amida;

Biotinila-NLHRPRRYHR-amida;

Biotinila-NMRRPRRYNR-amida;

Biotinila-NLRRPKRYNR-amida; Biotinila-NLQRPRRYNR-amida ;

A4 ac-VSIRTDPSSR-8 octâmero de

Biotinila-VSIRTDPSSR-amida;

Biotinila-VSIRTDP-amida;

Biotinila-SIRSDPSSR-amida;

Biotinila-YSIRSDPASR-amida;

Biotinila-VSVRYDPSSR-amida;

Biotinila-IAIRTDPASR-amida.

camundongos Swiss Webster foram de peptídeo imunogênico no antígeno completo de Freund no dia 1 seguido por 2 doses de reforço no dia 14 e no dia utilizando o antígeno incompleto de Freund. O reforço foi continuado, mas

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40/65 ficou claro que nenhum dos quatro grupos estava respondendo satisfatoriamente. Os imunogênios peptídicos frescos ac-MVINDDAQRL-C, acVTTLADGGEVT-C, ac-NLKRPRRYDR-C e ac-VSIRTDPSSR-C foram sintetizados, acoplados via C- a KLH e as imunizações continuaram.

[0103] As respostas transitórias nos grupos AO e A1 não foram sustentadas. Ambos diminuíram (flatlined) e foram terminados.

[0104] O soro de um camundongo em cada um dos grupos A3 e A4 obteve um título suficiente para prosseguir para a fusão e desenvolvimento de clones parentais. Um subclone satisfatório não foi obtido posteriormente para A3 e este projeto foi encerrado. Foi conseguido um subclone satisfatório para A4 que reconheceu o peptídeo de referência e nenhum dos 5 peptídeos negativos e foi levado até à produção final e purificação por afinidade com Proteína A.

[0105] Nesta fase, três modificações adicionais foram introduzidas no protocolo:

1. O uso de camundongos Balb/ C;

2. Adoção da técnica de administração do imunogênio na base da veia caudal seguida pela fusão direta de células agrupadas dos nódulos linfáticos inguinais;

3. Projetos redesenhados com os seguintes novos imunogênios peptídicos;

Peptídeo imunogênico

Peptídeo de referência

Peptídeo negativo 1

Peptídeo negativo 2

Peptídeo imunogênico

BSA conjugado

Peptídeo de referência

AOX C-MVINDDAQRLLSQR-amida

Biotinila-MVINDDAQRLLSQR-amida

Biotinila-MVINDDLQRIILFL-amida Biotinila-MSINDDAQKLKDRL-amida

AOXP C-MVINDDAQRLL[pS]QR-amida

Biotinila-MVINDDAQRLL[pS]QR-amida

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41/65

Peptídeo negativo 1

Peptídeo imunogênico

C BSA conjugado

Peptídeo de referência amida

Peptídeo negativo 1 amida

Peptídeo negativo 2 amida

Peptídeo negativo 3 amida

Peptídeo negativo 4 amida.

[0106] A adição dos doh

Biotinila-MVINDDAQRLLSQR-amida

XA1 ac-AAVTTLADGGEVTWAIDGKKBiotinila-KKGAAVTTLADGGEVTWAIDBiotinila-KKGAAGTTLADGGEVTWAIDBiotinila-KKGSTVATMADGGEVTWAIDBiotinila-KKGQAVTRLADGGEVTWAVDBiotinila-KKGFEVTTLADGTEVATSPLresíduos de alanina ao terminal amino neste sítio foi concebida para aumentar a imunogenicidade e especificidade. A adição dos resíduos carregados de -GKK no carboxiterminal do peptídeo imunogênico foi concebida para ultrapassar a sua hidrofobicidade aumentada.

No caso de o peptídeo imunogênico formar micelas durante a reação de acoplamento, a presença da porção GKK carregada adjacente ao tiol da cisteína favorecería a sua acessibilidade ao BSA. A inclusão da imagem simétrica KKG- no aminoterminal do peptídeo de referência favorecería a seleção de anticorpo específico para a própria sequência alvo:

Peptídeo imunogênico

BSA conjugado

Peptídeo de referência

Peptídeo negativo 1

Peptídeo negativo 2

Peptídeo negativo 3

XA4P C-YLSALVSIRTDPS[pS]R-amida

Biotinila-YLSALVSIRTDPS[pS]R-amida

Biotinila-YLSALVSIRTDPSSR-amida

Biotinila-YLSALYSIRSDPA[pS]R-amida

Biotinila-YLSALVSVRYDPS[pS]RPetição 870190064835, de 10/07/2019, pág. 121/163

42/65 amida

Peptídeo negativo 4 Biotinila-YLSAQIAIRTDPA[pS]R-amida.

[0107] Todos os cinco projetos AOX, AOXP, XA1, A4 e XA4P incorporando seleção clonal para reconhecimento de peptídeos de referência por ELISA com limitada ou sem ligação a peptídeos de Controle Negativo, seguido de coloração de tecidos e células por sobrenadantes clonais selecionados ligando-se a tecidos e células, foram levados a conclusões bemsucedidas. Obtiveram-se monoclonais AOX, AOXP, XA1, A4 e XA4P purificados por afinidade.

Exemplo 2: Utilizações da Tecnologia de Diagnóstico para a Detecção e Caracterização de Infecções por MAP em Amostras de Humanos e Animais e em Segurança Alimentar

1. Detecção e medição de MAP infectando tecidos intestinais humanos [0108] Biópsias endoscópicas foram estudadas em 45 pessoas com doença de Crohn e outras desordens, tais como síndrome do intestino irritável (Scanu et al., Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis infection in cases of Irritable Bowel Syndrome and comparison with Crohn’s disease and Johne’s disease: common neural and immune pathogenicities. J Clin Microbiol 2007: 45: 3883-90). As amostras foram imediatamente fixadas em formalina, seguidas de processamento padrão e incorporação em blocos histopatológicos de parafina. Foi realizado trabalho preliminar que identificou seções de 2 pm como ótimas. As seções foram tratadas com um protocolo padrão de recuperação de antígenos. Elas foram então coradas com diluições de anticorpos monoclonais na faixa de 1 em 500 a 1 em 5000. Tanto a marcação direta de fluoróforos de anticorpos primários quanto o uso de anticorpos secundários marcados com fluoróforo foram empregados. Os tecidos foram corados com cada um dos anticorpos primários AOX, AOXP, XA1, A4, XA4P utilizados sozinhos e visualizados com o uso de um microscópio

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Zeiss AxioSkop 2 com ampliações de x100 e x200 para obter uma impressão geral da distribuição de MAP e, então, posteriormente em x400 e x1000. O MAP em humanos é uma forma negativa de coloração de Ziehl-Neelsen (Z-N) e parece estar na faixa de tamanhos de 0,3-1 pm. Maior ampliação é necessária para uma resolução satisfatória.

[0109]A0X, XA1, A4 e XA4P todos os MAP corados no intestino humano, mais especificamente em biópsias endoscópicas do intestino em todas as 45 pessoas com doença de Crohn testadas. Contudo, a coloração dos tecidos intestinais humanos por AOXP não foi observada em humanos além do sinal fluorescente ocasional do lúmen de um vaso sanguíneo de tecido contendo uma célula positiva para AOXP no sangue. Ao contrário dos animais, a fosforilação de AOX não parece ocorrer amplamente no intestino humano. AOXP fosforilado, no entanto, é visto no sangue humano em infecções por MAP. A coloração de MAP por AOX, AOXP, XA1, A4 e XA4P é observada no sangue humano na infecção por MAP e em todas as pessoas com doença de Crohn testadas.

[0110] Os anticorpos também foram utilizados em combinações e visualizados por microscopia confocal. De preferência, os anticorpos foram utilizados em pares. Os pares preferidos foram AOX com AOXP ou XA1 a partir do terminal amino da molécula de MAP parental e A4 com XA4P a partir da extremidade carboxiterminal. Os pares preferidos foram também AOX com A4 e XA1 com A4 marcado com um fluoróforo vermelho ou verde, respectivamente. Isso proporcionou coloração dourada quando os reagentes co-localizados especificamente no citoplasma, não apenas das mesmas células, mas nas partículas de MAP submicrométricas dentro do citoplasma das células infectadas. Tal co-localização proporcionou forte confirmação da especificidade da detecção de MAP.

[0111] A utilização de pares de anticorpos compreendendo XA1

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44/65 com A4 e AOX com A4 revelou um aspecto adicional do método. Isso ocorre porque enquanto AOX e XA1 pareciam permanecer ligados ao próprio organismo de MAP ou liberados para permanecer na célula ou exibidos na superfície da célula, A4 é frequentemente liberado da MAP para ser exibido na superfície da célula, bem como liberado da célula infectada para tráfego entre as células. Quando AOX ou XA1 são marcados com um fluoróforo vermelho e A4 é marcado com um verde, a co-localização dourada original é progressivamente exaurida para laranja e, em seguida, para vermelho, como o A4 marcado em verde trafega e entra em outras células. Estruturas ligadas a membranas preenchidas com verde A4 foram observadas, consistentes com a presença de vesículas intercelulares.

[0112] Amostras de biópsia de todos os pacientes com doença de Crohn apresentaram resultado positivo para MAP. Isto foi observado em células do compartimento da mucosa, particularmente na porção basal das células epiteliais e no citoplasma que rodeia a porção basal do muco nas células caliciformes. Outras células contendo MAP no compartimento da mucosa foram macrófagos intra-epiteliais e células dendríticas, bem como linfócitos intra-epiteliais. Células contendo MAP e bacilos livres também foram observados na camada de gel do muco luminal. Na lâmina propria, a infecção por MAP foi comum em macrófagos, polimorfos e linfócitos-B. Os linfócitos T raramente foram vistos como envolvidos, mas frequentemente ocorreram adjacentes aos macrófagos preenchidos com MAP. As células positivas para MAP foram frequentemente observadas no lúmen de pequenos vasos sanguíneos. Nas biópsias duodenais, a coloração de MAP das glândulas de Brunner foi limitada apenas aos macrófagos ocasionais preenchidos com MAP, enquanto as próprias células glandulares não foram afetadas. No entanto, as células contendo MAP estavam presentes no tecido conjuntivo intersticial das glândulas de Brunner. AOXP nas células dentro dos tecidos pareceu se

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45/65 concentrar em torno do núcleo. Essas imagens de MAP em tecidos humanos podem ser adaptadas para se tornarem quantitativas e permitir o monitoramento da carga infecciosa do MAP.

[0113] Amostras de resseção cirúrgica também estavam disponíveis de 4 pacientes com doença de Crohn. Essas amostras permitiram o exame não apenas das camadas mais profundas do intestino até a serosa, mas também de vasos sanguíneos maiores, vasos linfáticos, envoltura de gordura intestinal extra e nódulos linfáticos regionais no mesentério do intestino. Assim como nos tecidos das biópsias, a mucosa e a submucosa de cada um desses quatro pacientes foram fortemente positivas para MAP. Verificou-se também que a infecção por MAP se estendia através da parede do intestino envolvendo vasos linfáticos, o tecido entre as camadas musculares e a própria serosa. Em algumas seções, os vasos linfáticos cheios de organismos MAP corados foram vistos.

[0114] Há muito se sabe que uma das características patológicas da doença de Crohn é uma vasculite considerada auto-imune. Os anticorpos diagnósticos mostraram que as paredes espessadas de tais vasos sanguíneos foram extensivamente infiltradas com MAP, que também envolvia os tecidos conjuntivos perivasculares circundantes. Outra característica patológica característica da doença de Crohn é o aumento do tecido gorduroso ao redor do intestino. Isto é particularmente bem observado no íleo terminal, onde é denominado “envoltura de gordura”. Sabe-se que os adipócitos dessa gordura são uma fonte rica do marcador inflamatório CRP (proteína C-reativa). O método de diagnóstico mostrou que o citoplasma fino dos adipócitos nesse tecido era extensivamente infectado com MAP. O MAP abundante também foi observado em células dos tecidos conjuntivos intersticiais dentro da gordura. O MAP também foi visto envolver os nódulos linfáticos regionais.

[0115] Os tecidos intestinais de todas as 5 pessoas

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46/65 diagnosticadas com síndrome do intestino irritável (IBS) que foram testadas também foram vistos como sendo amplamente infectados com MAP de uma forma muito semelhante à CD. A coloração de MAP positiva de biópsias endoscópicas intestinais também foi observada em casos de tireoidite e Psoríase.

2. Tecidos do Intestino de Animais [0116] Foram estudadas amostras de tecido intestinal de 3 vacas, 1 ovelha, 1 cabra, 1 veado e 2 gamos, todos diagnosticados com doença de Johne (JD). Amostras de autópsia foram processadas e coradas com os anticorpos primários, como descrito para humanos. Os tecidos de todos os animais foram extensivamente infectados com MAP, que estava geralmente presente no fenótipo positivo de Ziehl-Neelsen. O MAP nos intestinos destes animais diagnosticados com doença de Johne corados com os anticorpos AOX, AOXP, A4 e XA4P, bem como com XA1. O aspecto microscópico de MAP em animais foi geralmente o do fenótipo clássico micobacteriano Z-N positivo, mas os anticorpos monoclonais do presente trabalho também demonstraram os patógenos na forma paucimicrobiana.

[0117] A carga infectante de MAP em animais com doença de Johne era mais pesada do que a encontrada em humanos, de acordo com a reconhecida forma pluribacilar comum de JD. O próprio fenótipo de MAP foi consistente com as células positivas para ZN. Houve extenso envolvimento da mucosa e da lâmina propria e de todas as camadas do intestino. Observaramse cordões de células que resultaram da microvasculatura cheia de leucócitos infectados com MAP. Além disso, as paredes espessas dos vasos sanguíneos vasculíticos e tecidos perivasculares foram infiltradas com células infectadas com MAP, como foi visto em humanos. A infecção por MAP também foi observada em feixes neurovasculares afetando as células ganglionares, bem como as bainhas nervosas. Isto é consistente com os danos bem descritos ao

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47/65 sistema nervoso entérico de animais diagnosticados com JD, tal como em humanos diagnosticados com CD. Uma diferença conspícua entre os tecidos intestinais destas 5 espécies de ruminantes e humanos é que AOXP está amplamente presente nestes tecidos intestinais de animais, mas parece estar ausente dos tecidos intestinais humanos.

3. Sangue Humano [0118] Ao contrário dos tecidos intestinais humanos, o AOXP, a forma fosforilada de AOX, é amplamente expresso no sangue humano. AOXP (MVINDDAQRLL[pS]QR) é a forma fosforilada de Serina do peptídeo AOX na região amino terminal extracelular da proteína IS900. XA4P (YLSALVSIRTDPS[pS]R) é o peptídeo A4 na região extracelular carboxiterminal da proteína IS900 com o distai dos seus dois resíduos de Serina adjacentes fosforilados. Em CD, tanto AOXP como XA4P são expressos dentro e na superfície de células contendo MAP em sangue humano.

[0119] Isto proporciona 2 pares de anticorpos mutuamente exclusivos estericamente acessíveis no polipeptídeo P900 para utilização em citometria de fluxo com AOX/ AOXP no domínio extracelular amino terminal e A4/ XA4P no domínio extracelular do carboxiterminal. Cada par existe em um equilíbrio dinâmico como substrato e produto, cuja soma fornece um sinal robusto para determinar a porcentagem de populações de leucócitos de sangue periférico infectadas com MAP intra-celular. O AOX/ AOXP permanece ligado ao MAP ou pode ser liberado dentro da célula e na superfície da célula hospedeira infectada. O A4/ XA4P fornece um sinal semelhante, mas A4 pode sair de células infectadas com MAP e trafegar entre células de modo que as populações de células contendo A4/ XA4P compreendam aquelas contendo organismos MAP com uma população menor adicional em que o A4/ XA4P foi adquirido por tráfego inter-celular.

[0120] A citometria de fluxo em amostras clínicas de sangue de

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EDTA de rotina foi realizada em 42 pessoas com doença de Crohn utilizando fluorofóforo direto marcado com AOX-FITC/ A0XP-PC5.5 e A4-FITC/ XA4PPC5.5 em um estudo exploratório. Todas as pessoas apresentadam resultado positivo para MAP, com a proporção da população total de leucócitos circulantes positivos para MAP variando de 3,9% a 47,1%. O uso de marcadores fenotípicos das principais linhagens de células sanguíneas permite uma decomposição de acordo com o tipo de célula hospedeira. Essas proporções eram geralmente maiores com A4/ XA4P do que com AOX/ AOXP. As razões AOX/ AOXP e A4/ XA4P forneceram uma medida da atividade de fosforilação. Uma alta razão de XA4P/ A4 tendeu a caracterizar pessoas com doença de Crohn em um estado de atividade mais elevado. Em tais pessoas, monócitos intactos em sangue completamente revestido com massas segregadas de A4/ XA4P podiam ser vistos.

[0121] Uma segunda citometria de fluxo foi realizada em 24 pacientes consecutivos com doença de Crohn para determinar a proporção (%) de leucócitos circulantes totais contendo MAP.

[0122]Amostras de sangue foram coletadas em tubos padrão EDTA Vacutainer. Adicionou-se, então, 100 μΙ de sangue ao número necessário de tubos Falcon de fundo redondo de 12 x 75 mm. Estes foram incubados durante 5 minutos com 5 μΙ de Seroblock Humano (Bio-Rad). Foi adicionado anticorpo anti-humano CD45 conjugado com APC (Beckman Coulter) a todos os tubos para permitir a abertura nas populações de leucócitos. Metade dos tubos (marcados com “superfície corada”) foram então tratados com os anticorpos monoclonais anti-MAP durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Foi então adicionado 0,5 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos OptiLyse C (Beckman Coulter) a todos estes tubos e incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. As células foram então lavadas adicionando 0,5 ml de PBS e centrifugadas a

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325G durante 5 minutos e o sobrenadante foi descartado.

[0123]Todos os tubos foram então fixados com 100 μΙ de Meio de Fixação A (Thermo Fisher Scientific) durante 5 minutos e depois lavados como acima. Os tubos que não tinham sido corados com anticorpo anti-MAP (marcado 'Permeabilisado’) foram incubados com Meio Permeabilizado Invitrogen B (Thermo Fisher Scientific) no pélete, anticorpos monoclonais anti-MAP foram adicionados e incubados por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro, seguido por lavagem com PBS, como acima. Todos os tubos foram então transformados em 1ml com tampão de fluxo (PBS (livre de Ca e Mg), 0,2% de azida sódica e 2% albumina de soro bovino (BSA). As amostras foram então adquiridas em um citômetro de fluxo CytoFLEX (Beckman Coulter) fechado em SSC vs CD45 e, posteriormente, os dados foram analisados utilizando o software CytExpert (Beckman Coulter).

[0124]Os resultados do segundo estudo em 24 pessoas com doença de Crohn são mostrados na tabela abaixo (Tabela 2). Havia 8 mulheres e 16 homens entre as idades de 18 e 49 anos. Os números na tabela ao longo das linhas indicam a % da população total de leucócitos circulantes em cada pessoa corada pelo correspondente anticorpo MAP AOX sozinho, AOXP sozinho ou ambos AOX + AOXP, assim como A4 sozinho, XA4P sozinho ou ambos A4 + XA4P. Como os anticorpos AO permanecem ligados aos seus peptídeos alvo por mais tempo do que os anticorpos A4, a SOMA dos dados de AO em uma pessoa individual foi tomada como a medida da % de leucócitos circulantes contendo MAP (coluna central destacada). Esta SOMA varia com o progresso, curso cíclico e respostas ao tratamento da doença de Crohn, proporcionando um acesso direto à contribuição para a patogenicidade feita por este elemento de inserção multicópia único.

[0125]Os dados de citometria de fluxo de A4, XA4P e A4 +

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XA4P proporcionam uma segunda percepção direta de uma provável contribuição para a patogenicidade de MAP, registando um outro aspecto da função in vivo do P900. Esta é a capacidade de observar a fosforilação e o tráfego do carboxiterminal ligado e liberado, tanto com a fosforilação da serina a jusante, como no presente trabalho, quanto e a do parceiro a montante e a presença e efeito de fosforilação dupla.

[0126]A Tabela 1 resume os dados de citometria de fluxo obtidos de 24 pacientes com doença de Crohn baseados na utilização dos anticorpos monoclonais AOX e AOXP no aminoterminal extracelular de P900 do lado esquerdo da tabela e A4 e XA4P no carboxiterminal extracelular de P900 à direita. Os dados para cada paciente em cada linha separam-se em ligação à superfície dos leucócitos (surf) e ligação a células permeabilizadas inteiras (perm). A proporção total de células infectadas por MAP é dada pela soma das porcentagens % em populações separadas de células permeabilizadas identificadas por AOX sozinho, AOXP sozinho e AOX + AOXP (destacado). Esta é a medida preferida porque os peptídeos AOX tendem a permanecer ligados às células micobacterianas intracelulares hospedeiras durante mais tempo que os peptídeos A4. À direita da tabela estão os resultados usando populações de células coradas A4, XA4P e A4 + XA4P. Neste estudo, a fosforilação fortemente prevista da serina distai em XA4P é utilizada, mas estudos semelhantes podem ter como alvo a serina proximal fosforilada do par ou em fosforilação dupla.

[0127]O potencial dos dados vem junto quando olhamos para detalhes. A % de carga total de MAP no grupo de 24 pacientes varia de 1,52% a 48,9% e aparece no presente estágio para variar com a atividade da doença. Picos ou diminuições nas % de células positivas para MAP podem seguir o início dos tratamentos anti-MAP. Mais dados virão à

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51/65 medida que um número maior de pessoas for testado e com doenças diferentes, particularmente no grupo “autoimune e auto-inflamatório”, e com acesso ao carregamento de tipos de células individuais. Mais dados também serão obtidos a partir do estudo dos correlates clínicos dos eventos de fosforilação e do monitoramento dos efeitos dos diferentes tratamentos.

[0128]Os dados mostram que a proporção de células com AOX/ AOXP ou ambos em suas superfícies é cerca de metade. Nas células permeabilizadas, a percentagem total de células com AOX/ AOXP está em estreita concordância com aquela utilizando A4/ XA4P, enquanto a soma de A4/ XA4P na superfície celular é consideravelmente menor do que com AOX/ AOXP. Isto seria consistente com uma perda maior de A4/ XA4P da superfície da célula, o que está de acordo com a sua reconhecida maior mobilidade. Estudos do efeito desses eventos de fosforilação exigirão estudos clínicos maiores.

[0129]O sistema de citometria de fluxo é o primeiro exemplo a ser desenvolvido para a infecção por paratuberculose na doença de Crohn. Isso agora pode ser usado para estudar a infecção por MAP em outras doenças, incluindo psoríase, tireoidite, doença de Parkinson, diabetes tipo 1, artrite, espondilite anquilosante, síndrome do intestino irritável, oolite ulcerativa, doença inflamatória intestinal, doença de Alzheimer, esclerose múltipla, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática e/ ou síndrome da fadiga crônica. Com a doença de Crohn, como com essas outras doenças, particularmente “condições auto-imunes”, a presença de MAP contribui ou não para a causa ou progressão da doença se a terapia anti-MAP específica leva, ou não, à remissão ou cura da doença. Atualmente, a vacina terapêutica de células T contra MAP está nos primeiros ensaios clínicos.

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Tabela 2

MAP

Monoclona AO A0	Α0Χ+	Α0Χ/	AO AO	Α0Χ+	AOX/	ΧΑ Α4+Χ Α4/Χ	ΧΑ Α4+Χ Α4/Χ
1			X XP	Α0ΧΡ	Α0ΧΡ	X XP	Α0ΧΡ	AOXP A4 4P	A4P	A4P	A4 4P	A4P	A4P
Paci	M	Ida	sur sur		SOM	pe per		SOM	sur sur		SOM	pe per		SOM
ente /F	de	f f	surf	A	rm m	perm	A	f f	surf	A	rm m	perm	A
			5,6			25, 2,9			3,1 6,6		15,7 3,9 19,		30,5
1	F	32	7 0,7	1,49	7,86	02 3	1,11	29,06	4 3	5,98	5	1 76	6,88	5
			2,3 4,9			7,5 12,			5,4 1,1			7,5 1,2		11,1
2	M	48	7 4	4,85	12,16	2 42	10,87	30,81	7 9	0,13	6,79	4 7	2,29	0
			7,5 0,0			7,6 5,7			3,0 3,7			9,0 4,2		16,1
3	M	29	9 5	1,30	8,94	6 1	8,33	21,70	9 0	1,44	8,23	5 3	2,82	0
			1,5 0,1			4,9 1,1			3,5 1,0			5,8 0,2
4	M	28	0 9	3,07	4,76	0 2	0,29	6,31	4 0	0,34	4,88	5 3	1,25	7,33
			0,9 0,7			11,10,			0,3 1,4			6,8 19,		29,0
5	M	37	0 7	1,37	3,04	02 33	0,19	illlll	1 2	0,90	2,63	5 24	2,94	3
			16, 0,7			20, 0,3			1,2 0,1			1,2 2,7
6	F	40	15 6	0,37	17,28	62 0	0,76	21,68	0 4	0,21	1,55	5 7	1,88	5,90
			10, 0,3			23, 0,4			2,5 0,1			2,8 12,		46,6
7	F	25	43 8	0,73	11,54	13 1	1,09	24,63	9 4	0,50	3,23	9 09	31,62	0
			1,3 6,6			2,3 8,1			8,3 8,7		23,1	11,10,		35,5
8	M	39	2 2	2,08	10,02	2 2	5,01	iili	5 3	6,09	7	92 83	12,83	8
			37, 0,1			45, 0,4			0,4 0,0			19, 5,7		28,6
9	M	20	93 7	0,02	38,12	82 4	1,83	48,09	1 0	0,12	2,50	89 6	3,01	6
			14, 1,4			23, 2,8			21,0,0		22,5	7,9 0,8		49,7
10	M	33	81 5	0,31	16,57	05 8	13,98	39,91	26 3	1,23	2	0 4	41,03	7
			3,9			4,9 1,9			2,2 0,0			2,3 4,1
11	F	48	5 1,8	1,49	7,24	2 7	1,71	8,60	0 2	0,28	2,50	5 7	1,72	8,24
			1,0 0,7			2,3 1,6			0,4 0,1			2,7 0,9
12	F	26	6 4	1,89	3,69	9 5	2,00	6,04	5 5	0,10	0,70	7 6	0,81	4,54
			1,3 1,6			3,4 2,6			2,1 0,9			3,0 1,4
13	M	27	9 5	2,00	5,04	2 1	2,02	8,05	7 6	0,81	3,94	4 6	1,35	5,85
			2,2			2,3 5,0			0,3 6,3			2,3 11,		21,9
14	M	29	8 2,3	1,86	6,44	1 1	2,36	9,68	0 1	2,50	9,11	3 74	7,91	8
			1,9 12,			3,4 15,			0,0 0,5			0,0 6,9		15,2
15	M	29	5 86	4,99	19,80	0 85	5,71	24,96	0 6	2,45	3,01	0 8	8,26	4
			0,0 1,3			0,1 1,4			0,6 0,6			1,3 1,3
16	M	25	2 2	0,03	1,37	1 1	0,00	1,52	8 4	0,46	1,78	8 7	0,47	3,22
			0,2 0,3			11,11,			0,0 2,2			2,2 4,3
17	M	37	4 3	0,05	0,62	40 39	5,81	28,60	5 4	0,14	2,43	7 1	1,09	7,67
			1,2 1,9			1,7 3,4			0,3 9,1		11,0	0,4 13,		15,7
18	M	18	6 6	6,63	9,85	8 1	5,39	10,58	6 1	1,53	0	2 6	1,76	8
			1,7 2,7			2,6 5,9			1,0 3,4			2,4 4,8		15,4
19	F	48	9 9	2,96	7,54	2 6	5,15	13,73	4 0	3,60	8,04	3 8	8,14	5
			0,9 5,1			1,2 5,6			5,1 0,5			5,6 0,8		12,0
20	F	18	2 5	0,64	6,71	2 7	1,20	8,09	2 3	2,61	8,26	2 5	5,61	8
			11, 0,3			15, 0,3			0,8 2,7			19,		30,8
21	M	20	78 6	8,85	20,99	41 0	9,28	24,99	5 0	0,36	3,91	92 4,1	6,84	6
			0,3 1,2			1,5 1,9			8,8 0,3		16,1	9,0 0,5		18,7
22	M	49	5 7	0,80	2,42	8 7	2,76	6,31	0 1	7,08	9	6 8	9,12	6
23	M	19	0,7 0,6	3,83	5,28	1,7 1,7	4,01	7,49	0,3 0,2	0,21	0,80	2,0 0,7	0,41	3,23

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8 6 2 8 1 6 6

0,0 4,0 0,9 6,8 0,0 6,7 11,3 0,4 7,8 13,2

24 F 48 5 9	0,02 4,16 4 3	0,21 7,98 0 6 4,62 8 9	1 4,91 1
SOM	231,4	425,8	174,	436,
A	4	0	30	73
méd				18,2
ia	9,64	iii|[	7,26	0

3.2 ClTOLOGIA [0130] Células isoladas do sangue periférico foram coradas com uma combinação de dois anticorpos monoclonais conjugados diretamente: A0X (FITC/ Verde) + A0XP (Cy 5.5/ Vermelho) ou A4 (FITC/ Verde) + XA4P (Cy 5.5/ Vermelho). As imagens confocais foram visualizadas usando um microscópio confocal Leica SP-2, gravadas e armazenadas em formato JPEG.

[0131] Resultados: as células de sangue periférico mostraram heterogeneidade considerável no seu padrão de coloração com células negativas, positivas apenas para um único anticorpo ou positivas para ambos os anticorpos. Esta última observação é demonstrada pela clara co-localização das moléculas relatoras fluorescentes. Embora o fenótipo de células positivas ainda não tenha sido estabelecido, as imagens de DIC (contraste por interferência diferencial) e dados de citometria de fluxo indicam que as células positivas são de origem não linfocítica.

4. Sangue Animal

4.1 Gatos [0132] Um gato doméstico (Gato 1) ficou doente com perda de peso, diarréia, abdome distendido e mau estado geral. A ecografia do abdome do animal clinicamente afetado mostrou espessamento da parede ao longo do cólon. A endoscopia e biópsia pelo veterinário mostrou clínica e histologicamente que o animal tinha Doença Inflamatória Intestinal. A citometria de fluxo foi realizada em 2 amostras de sangue com EDTA durante um período de 4 meses. A proporção de leucócitos circulantes totais infectados com MAP no gato foi de 7,6% e 9,8%. A microscopia de imunofluorescência nas amostras

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54/65 de biópsia endoscópica do Gato 1 confirmou a presença de MAP com um aspecto histológico semelhante ao observado em animais com doença de Johne e humanos com doença de Crohn.

[0133] Durante este período, um novo gatinho (Gato 2) foi introduzido na mesma casa. Estava clinicamente bem no momento da compra do criador. Uma semana após a introdução à casa, o gatinho desenvolveu diarréia com sangue. A microbiologia rotineira das fezes foi negativa. A citometria de fluxo foi novamente realizada em 2 amostras de sangue com EDTA durante um período de 4 meses. A proporção de glóbulos brancos circulantes infectados com MAP foi de 16,4% e 14,3%. Estes dados confirmaram que ambos os animais tinham uma infecção sistêmica por MAP.

4.2 Vacas Leiteiras [0134] Amostras de sangue com EDTA foram obtidas de 4 vacas leiteiras. Esses animais faziam parte de um rebanho leiteiro fechado de mais de 20 anos de idade, sem casos clínicos conhecidos da doença de Johne. O teste ELISA intermitente de amostras de leite individuais do rebanho mostrou que uma das 4 vacas amostradas tiveram 2 leituras de ELISA positivas e 2 outras vacas amostradas tiveram 1 leitura de ELISA positiva entre múltiplos resultados negativos. A quarta vaca não apresentou leituras de ELISA elevadas no leite. A citometria de fluxo foi realizada nas 4 amostras de sangue usando pares de anticorpos monoclonais AOX/ AOXP e A4/ XA4P. Os resultados mostraram que as proporções das populações totais de leucócitos circulantes nesses animais infectados com MAP intracelular foram 10,9%, 36,3%, 40,1% e 45,2%. Esses resultados são mais uma indicação da capacidade de uma infecção por MAP sistêmica significativa persistir em um estado subclínico. Eles também demonstram que a presente tecnologia de diagnóstico tem uma sensibilidade muito maior do que os métodos convencionais de diagnóstico, com a capacidade de revelar a verdadeira

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55/65 escala da ameaça de longo prazo à saúde animal e humana apresentada por esses patógenos.

5. Leite Materno Humano [0135] Um menino de 3 meses de idade apresentou sangramento retal e episódios de dor abdominal. Ele foi investigado incluindo endoscopia gastrointestinal superior e inferior com múltiplas biópsias, o que levou ao estabelecimento de um diagnóstico da doença de Crohn aos 8 meses. Os testes de MAP, posteriormente solicitados e realizados em seus blocos histopatológicos embebidos em parafina, mostraram infecção extensa com MAP do estômago e duodeno e em todas as biópsias do íleo terminal para o reto. Sua mãe, que não tinha a doença de Crohn, nunca havia lhe alimentado com nada além do próprio leite. No entanto, ela foi diagnosticada com tireoidite auto-imune, que está ligada geneticamente à doença de Crohn. O teste de MAP solicitado por ela em uma amostra de 50 ml de leite materno expresso mostrou abundantes células infectadas por MAP no pélete centrífugo.

6. Amostras de Pele Humana com Psoríase [0136]Amostras de pele com espessura total da biópsia por punção de 3-4 mm foram obtidas sob anestesia local de 2 adultos, cada um diagnosticado com psoríase. As amostras foram retiradas da região central de uma lesão de pele psoriática e uma amostra adicional da periferia da lesão sobreposta à pele normal. Uma amostra de pele normal entre as lesões também foi obtida. As amostras foram fixadas em formalina, processadas e embebidas em blocos histopatológicos de rotina, seguindo procedimentos padrão. Seções de 2pm foram cortadas, imobilizadas em lâminas de microscópio Vectabond, tratadas para recuperação de antígeno, e coradas com anticorpos monoclonais XA1/A4 e examinadas por microscopia confocal.

[0137] Biópsias retiradas de dentro das lesões psoriáticas foram

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56/65 positivas para MAP em ambos os adultos. A co-localização dourada de XA1 e A4 foi observada em células inflamatórias na camada epidérmica espessa com coloração persistindo no estrato córneo. A coloração também foi visível na camada germinativa. A coloração MAP positiva estendeu-se ao longo das células inflamatórias na rete e nas células inflamatórias dentro da derme. Células MAP positivas também foram vistas ao redor dos folículos pilosos. Uma característica associada conspícua foi a presença de MAP dentro da unidade pilo-sebácea.

[0138] Uma anormalidade das glândulas sebáceas podería contribuir para a natureza seca e escamosa das camadas superficiais das placas psoriáticas. Uma outra característica conspícua na derme foi o envolvimento de MAP de feixes neurovasculares com a co-localização de coloração XA1/ A4 destes patógenos dentro de paredes arteriais espessas e tecidos conjuntivos perivasculares. A coloração de MAP de feixes nervosos adjacentes também foi vista. A coloração de biópsias realizadas na periferia das placas psoriáticas mostrou que a coloração de MAP parou no limite entre a placa e a pele normal. MAP também estava ausente de biópsias de pele com aspecto normal entre placas. Isso seria consistente com o papel do MAP na formação da placa psoriática.

7. Medição da Proporção de Células Positivas para MAP no Líquido SlNOVIAL DA ARTICULAÇÃO NA ARTRITE [0139] Uma mulher adulta com psoríase apresentou desconforto e derrame agudo em sua articulação do joelho direito. Não houve histórico de trauma. A articulação estava quente e distendida, mas não estava intensamente fraca. Outras articulações não foram afetadas. Uma amostra de 20 ml de fluido ligeiramente opalescente cor de palha foi aspirada e as células separadas por centrifugação. Estas foram lavadas, coradas com fluoróforo marcado com AOX/ AOXP e examinadas por citometria de fluxo. A proporção

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57/65 de células contendo MAP no fluido articular foi de 8,56%. Isto foi semelhante à % de leucócitos periféricos positivos para MAP no seu sangue no momento.

8. Teste de Segurança Alimentar

8.1 Testes de MAP para Contaminação de Leite de Varejo [0140]A infecção por MAP de animais de criação tornou-se um problema global. Populações humanas são amplamente expostas ao MAP, particularmente em produtos lácteos. Novas iniciativas no desenvolvimento de procedimentos de diagnósticos suficientemente sensíveis no setor veterinário e de alimentos estão disponíveis usando Espectrometria de Massas, imunoensaios baseados em multiplex-bead e ensaio de phage-PCR combinado (Li et al., Early detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection in cattle with multiplex-bead based immunoassays. PLoS ONE 12(12): 2017 e0189783; Ricci et al., Exploring MALDI-TOF MS approach for a rapid identification of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis field isolates. Journal of Applied Microbiology 122, 568-577 2016; Botsaris G et al., Detection of viable Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in powdered infant formula by phage-PCFl and confirmed by culture. International Journal of Food Microbiology. Volume 216, 2016: 9194).

[0141] Existe uma extensa literatura sobre testes diagnósticos de MAP, mas na prática eles raramente são aplicados comercialmente. Em geral, isso ocorre porque o MAP não é amplamente reconhecido como um patógeno humano e os procedimentos de teste de MAP disponíveis atualmente exigem extração de DNA e PCR personalizados. Novas abordagens estão sendo tomadas no setor veterinário usando Espectrometria de Massas e imunoensaios baseados em multiplex-bead.

[0142]Os anticorpos anti-MAP AOX, AOXP, XA1, A4 e XA4P podem ser utilizados isoladamente e em conjunto, acessando sistemas de

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58/65 leitura disponíveis, tais como, por exemplo, Citometria de Fluxo e Espectrometria de Massas, para fornecer sistemas de detecção quantitativos, econômicos, sensíveis e automatizáveis.

8.2 Ensaios de MAP para Contaminação de Carne [0143]A contaminação de MAP da superfície de carne pode ocorrer nos matadouros. Considerando que a destruição desses organismos iria ocorrer durante o cozimento normal, isso pode não ser o caso da carne moída onde eles seriam dispersos por toda a amostra de carne. Atualmente, pouco se conhece sobre a distribuição da MAP no músculo esquelético de bovinos devido à falta de um método específico sensível para a detecção microscópica de MAP. A presente tecnologia de diagnóstico foi aplicada a amostras de carne obtidas de 10 vacas, cada uma das quais era suspeita de estar infectada com MAP. Amostras de músculo esquelético de cada um dos animais foram testadas inicialmente por cultura laboratorial de MAP seguida de PCR na cultura. Cinco das vacas mostraram-se positivas e 5 negativas. No presente método de diagnóstico, as amostras foram fixadas em formalina, processadas e embebidas em parafina seguindo procedimentos padrão de histopatologia. Seções de 3 pm foram retiradas de cada bloco e processadas por recuperação de antígeno, seguida de coloração com pares de anticorpos compreendendo A1 / A4 e AOX/ A4 e AOX/ AOXP. As amostras positivas foram classificadas de 1 (baixa) a 5 (alta) de acordo com a gravidade e distribuição de MAP.

[0144] Nove das 10 amostras apresentaram resultado positivo para MAP, 2 no nível 1,3 no nível 2, 2 no nível 3 e 1 em cada nível 4 e 5. As células MAP positivas foram alinhadas ao longo do sarcolema das fibras musculares e nos espaços interfibrilares. Do nível 3 para cima, o MAP estendia-se por toda a substância da amostra com organismos e seus produtos peptídicos dentro das fibras musculares, bem como entre eles.

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Aglomerados de organismos livres de MAP que invadem as fibras musculares romperam sua estrutura com alguns focos de aparente necrose. A extensão do envolvimento de MAP em grandes áreas do músculo foi conspicuamente maior do que se previa anteriormente.

9. Teste de Amostras Ambientais, tais como Águas Superficiais, Rios, Estações de Tratamento de Água, Sistemas de Água Doméstica, Aerossóis e Amostras de Solo e Sedimentos [0145]As dificuldades técnicas que afetaram o teste de MAP de amostras clínicas também se aplicam àquelas usadas no teste de MAP em amostras de captações fluviais, entre liberação de um animal infectado para o meio ambiente, para exposição humana. Os anticorpos AOX, AOXP, XA1, A4 e XA4P e os seus correspondentes peptídeos de MAP no presente trabalho podem ser utilizados para capturar e medir os peptídeos de MAP e MAP.

Exemplo 3: Especificidade de Anticorpos para MAP

1. Coloração de MAP Cultivado e Micobactérias Relacionadas em seu Fenótipo Extracelular [0146] Cultura micobacteriana: Duas cepas de Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (MAP), K10 e M47508, foram cultivadas em ágar com gema de ovo de Herold com Micobactina J (meio preparado BD BBL). A pureza foi monitorada utilizando ágar com gema de ovo de Herrold sem Micobactina J (BD BBL). As cepas não-micobacterianas foram cultivadas em placas de ágar Middlebrooks 7H10 (BD BBL). Quando o crescimento foi observado, colônias individuais foram suspensas em 1ml de PBS e centrifugadas a 13.000 rpm por 1 minuto em uma microcentrífuga, o sobrenadante foi removido e o pélete suspenso em 1ml de PBS.

[0147] Coloração micobacteriana: 200 μΙ de células cultivadas foram aliquotados em lâminas revestidas Vectabond (Vector Laboratories,

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Peterborough UK) e quando secas ao ar e fixadas com formalina a 10% (BDH) durante 30 minutos. As lâminas foram lavadas três vezes em 1X PBS (PH 7,4) e incubadas a 37 ^SC de um dia para outro para garantir a adesão. A permeabilização do envelope micobacteriano foi conseguida por incubação em lisozima (2 mg/mL, preparado em água), seguido de 5 minutos à temperatura ambiente com 0,1% de triton X-100. A ligação do receptor de Fc não específica foi bloqueada incubando as lâminas com TrueStain FcX (Cambridge BioScience, Cambridge UK) a 1/50 durante 30 minutos seguido por uma breve lavagem em 1 x PBS. De modo a estabelecer a especificidade do anticorpo, um conjunto duplicado de lâminas foi corado, no qual os anticorpos monoclonais individuais foram incubados com os seus peptídeos correspondentes durante 1 hora a uma concentração de 0,5 mg/ ml antes da incubação. As lâminas foram então incubadas em anticorpo primário nas seguintes diluições: A0X (1/1500), A0XP (1/2500), A4 (1/1500), XA4P (1/2500) de um dia para outro a 4 ^SC em um agitador orbital. As seções foram lavadas três vezes em 1x PBS cada durante 5 minutos e incubadas em anticorpo secundário conjugado com Dylite 550 (Thermo Fisher Scientific UK) a 1/1500 durante 45 minutos à temperatura ambiente. As seções foram lavadas três vezes em 1X PBS cada durante 5 minutos antes de serem montadas em material de montagem aquoso (Sigma F4680).

[0148] Resultados: Os anticorpos monoclonais A0X, A0XP, A4 e XA4P apresentaram coloração positiva para ambas as culturas de MAP, K10 e M47508, mas foram negativos para todas as cepas intimamente relacionadas testadas (ver Tabela 3). A coloração das culturas de MAP estava ausente quando bloqueada com peptídeos correspondentes, mas presente quando os anticorpos foram incubados com peptídeos não correspondentes. Estes dados indicam uma especificidade única destes quatro anticorpos monoclonais para MAP cultivado em laboratório e não para as espécies

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61/65 intimamente relacionadas selecionadas.

Tabela 3

Cepa micobacteriana	Anticorpo	Peptídeo de bloqueio AOX	Peptídeo de bloqueio AOXP	Peptídeo de bloqueio A4	Peptídeo de bloqueio XA4P
K10	AOX	-	+	+	+
K10	AOXP	+	-	+	+
K10	A4	+	+	-	+
K10	XA4P	+	+	+	-

M47508	AOX	-	+	+	+
M47508	AOXP	+	-	+	+
M47508	A4	+	+	-	+
M47508	XA4P	+	+	+	-

M avium ssp avium	AOX	-	-	-	-
M avium ssp avium	AOXP	-	-	-	-
M avium ssp avium	A4	-	-	-	-
M avium ssp avium	XA4P	-	-	-	-

M avium ssp sylvat	AOX	-	-	-	-
M avium ssp sylvat	AOXP	-	-	-	-
M avium ssp sylvat	A4	-	-	-	-
M avium ssp sylvat	XA4P	-	-	-	-

M avium 2333	AOX	-	-	-	-
M avium 2333	AOXP	-	-	-	-
M avium 2333	A4	-	-	-	-
M avium 2333	XA4P	-	-	-	-

M avium chelonae	AOX	-	-	-	-
M avium chelonae	AOXP	-	-	-	-
M avium chelonae	A4	-	-	-	-
M avium chelonae	XA4P	-	-	-	-

M porcinum	AOX	-	-	-	-
M porcinum	AOXP	-	-	-	-
M porcinum	A4	-	-	-	-
M porcinum	XA4P	-	-	-	-

M Rhodesiae	AOX	-	-	-	-
M Rhodesiae	AOXP	-	-	-	-
M Rhodesiae	A4	-	-	-	-
M Rhodesiae	XA4P	-	-	-	-

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62/65

Cepa micobacteriana	Anticorpo	Peptídeo de bloqueio A0X	Peptídeo de bloqueio A0XP	Peptídeo de bloqueio A4	Peptídeo de bloqueio XA4P
M thermoresistibile	A0X	-	-	-	-
M thermoresistibile	A0XP	-	-	-	-
M thermoresistibile	A4	-	-	-	-
M thermoresistibile	ΧΑ4Ρ	-	-	-	-

2. Coloração de MAP e Micobactérias Relacionadas em seu Fenótipo Intracelular em Cultura de Células U937.

[0149] Cultura celular: U937 uma linhagem celular pró-monocítica humana foi cultivada em RPMI 1640 mais 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 100 U/ ml de penicilina e 100 μΙ/ ml de estreptomicina a 37 ^SC em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2.

[0150]Infecção: Quando as células U937 estavam em fase de crescimento exponencial, foram contadas e avaliadas a viabilidade. 2 x 10⁵ células/ ml com viabilidade de 95% foram cultivadas em 2 ml de RPMI 1640 mais 10% de soro fetal de vitelo (FCS) sem antibióticos e desafiados com Mycobacterium paratuberculosis K10 a uma taxa de infecção de aproximadamente 10: 1. As células foram então incubadas a 37 ^SC em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 durante 5 horas, depois ressuspensas em 2 ml de meio de crescimento fresco e cultivadas durante mais 48 horas.

[0151]Coloração: Quatro alíquotas separadas de células contendo 2 x 10⁵ células/ mL foram tomadas e centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos. As células foram lavadas por re-suspensão em 5 mL de PBS e centrifugadas a 1200 durante 5 minutos. Isso foi repetido três vezes. Os anticorpos monoclonais A0X, A0XP, A4 e XA4P foram conjugados com Fluoresceína (kit Innova Biosciences 707-0015) ou PE-Cy 5.5 (kit 761-0015) e depois adicionados às células de modo que as concentrações finais de anticorpos fossem 1/1500, 1/2500, 1/1500, 1/2500, respectivamente. As células foram deixadas a incubar à temperatura ambiente durante 1 hora,

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63/65 lavadas três vezes pela adição de x3 volume de 1x PBS (pH 7,4) e centrifugação a 1500 rpm. 200 μΙ de células coradas foram aliquotados em uma lâmina de microscópio Vectabond (Cole-Parmer, St. Neots, UK) e visualizadas utilizando um microscópio confocal Leica SP2.

[0152] Resultados: A microscopia de imunofluorescência usando os quatro anticorpos monoclonais A0X, A0XP, A4 e XA4P diretamente conjugados, identificou a localização intracelular positiva da cepa de MAP, K10, dentro da linhagem celular pró-monocítica U937. A localização foi confirmada usando imagens de DIC (contraste por interferência diferencial).

3. ELISAs de Anticorpos Monoclonais Anti-MAP A0X, A0XP, A4 e XA4P QUE SE LIGAM AOS MESMOS PEPTÍDEOS E PEPTÍDEOS RELACIONADOS EM OUTROS Organismos [0153] Foram feitos arranjos com os Fornecedores dos 4 anticorpos monoclonais anti-MAP principais para realizar ELISAs nos reagentes monoclonais purificados por afinidade de proteína A final. De grande importância foi a necessidade de usar placas de ELISA revestidas com estreptavidina para imobilizar os peptídeos alvo sintéticos nos poços através de ligação de Biotina. O revestimento dos poços com peptídeo sintético só foi inadequado para os anticorpos para imunogênios peptídicos sintéticos no presente trabalho.

[0154] AOX clone 18C2/1C2 lgG1 de camundongo

Imunogênio: BSA-MVINDDAQRLLSQR-amida

	igG	igM
	1:10.000	1:50.000	1:100.000	1:10.000	1:50.000	1:100.000
Bio-MVINDDAQRLLSQRamida	1,254	0,598	0,302	0,068	0,075	0,073
Bio-MSINDDAQKLKDRLamida	0,064	0,057	0,057	0,063	0,066	0,077
Bio-MVINDDAQRLL[pS]QRamida	0,061	0,056	0,057	0,063	0,065	0,069

[0155] AOXP clone 3D2/2C5 lgG1 de camundongo

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64/65

Imunogênio: BSA-MVINDDAQRLL(pS)QR

	igG	igM
	1:1000	1:1000
Bio-MVINDDAQRLL[pS]QR-amida	0,741	0,173
Bio-MVINDDAQRLLSQR-amida	0,185	0,186

[0156]A4 clone 3F7A7/A12 lgG2ade camundongo

Imunogênio: BSA-VSIRTDPSSR-amida

	igG	igM
	1:2000	1:5000	1:10.000	1:2000	1:5000	1:10.000
Bio-VSIRTDPSSR-amida	0,577	0,386	0,194	0,068	0,064	0,074
Bio-SIRSDPSSR-amida	0,082	0,068	0,064	0,069	0,064	0,081
Bio-YSIRSDPASR-amida	0,088	0,07	0,062	0,068	0,067	0,072
Bio-VSVRYDPSSR-amida	0,082	0,076	0,07	0,069	0,085	0,078
Bio-IAIRTDPASR-amida	0,11	0,079	0,073	0,081	0,076	0,094

[0157] XA4P clone 2D4/1B5 lgG2a de camundongo

Imunogênio: BSA-YLSALVSIRTDPS(pS)R-amida

	igG	igM
	1:2000	1:2000
Bio-YLSALVSIRTDPS[pS]R-amida	1,329	0,146
Bio-YLSALVSIRTDPSSR-amida	0,066	0,062
Bio-YLSALYSIRSDPA[pS]R-amida	0,286	0,072
Bio-YLSALVSVRYDPS[pS]R	1,374	0,134
Bio-YLSAQIAIRTDPA[pS]R-amida	0,380	0,073

4. Bloqueio Diferencial da Coloração de Anticorpos de Tecidos pelo

Peptídeo Alvo Sintético Idêntico e não por Peptídeos não Relacionados [0158] Seções de tecido de parafina de 2 pm foram retiradas do ceco e do cólon ascendente de um paciente de Crohn e coradas individualmente com os quatro anticorpos monoclonais AOX, AOXP, A4 e XA4P. De modo a estabelecer a especificidade do anticorpo e excluir a coloração não específica, um conjunto paralelo de seções de tecido foi corado com os quatro anticorpos monoclonais pré-incubados com 0,5 pg de peptídeo sintético correspondendo às sequências antigênicas individuais.

[0159] Resultados: A coloração de AOX identificou aglomerados de células positivas de MAP dentro da lâmina propria e células ocasionais

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65/65 dentro dos vasos sanguíneos. O sinal foi bloqueado próximo da conclusão por pré-incubação com o peptídeo AOX. Nenhuma coloração aparente no tecido intestinal humano em seções bloqueadas ou não bloqueadas foi observada quando coradas com AOXP. A coloração com A4 mostrou células positivas ocasionais dentro da lâmina propria que foi parcialmente bloqueada com incubação prévia com peptídeo A4. A coloração XA4P identificou a coloração intra e perivascular de células positivas para MAP, além de focos de células positivas dentro da lâmina propria. O bloqueio com pré-incubação do peptídeo XA4P bloqueou parcialmente essa coloração.

Claims (36)

1. Reivindicações

   1. MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR OU MONITORAR INFECÇÃO por Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (MAP), caracterizado pelo fato de que o método compreende detectar a presença do polipeptideo (MAP P900) codificado pelo filamento positivo de IS900, ou um fragmento do mesmo, em uma amostra de um indivíduo, em que o MAP P900, ou um fragmento do mesmo, é detectado utilizando um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, que se liga ao MAP P900.
2. 2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, liga-se à região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 24 a 71 ou 329 a 386 da SEQ ID NO: 1.
3. 3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, liga a região de MAP P900 definida por:

   - aminoácidos 26 a 71 da SEQ ID NO: 1;

   - aminoácidos ou 329 a 385 da SEQ ID NO: 1;

   - aminoácidos 26 a 39 da SEQ ID NO: 1;

   - aminoácidos ou 52 a 68 da SEQ ID NO: 1;

   - aminoácidos ou 345 a 359 ou 350 a 359 da SEQ ID NO: 1;

   - aminoácidos 26 a 71 da SEQ ID NO: 1, em que a serina 37 é fosforilada;

   - aminoácidos ou 345 a 359 ou 350 a 359 da SEQ ID NO: 1, em que a serina 357 é fosforilada e/ ou a serina 358 é fosforilada.
4. 4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

   1 a 3, caracterizado pelo fato de que dois ou mais dos referidos anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antigeno dos mesmos, são utilizados para detectar MAP P900.

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   2/7
5. 5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o método utiliza:

   - pelo menos um anticorpo que se liga à região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 26 a 71 da SEQ ID NO: 1 e pelo menos um anticorpo adicional que se liga à região de MAP P900 definida por aminoácidos ou 329 a 385 da SEQ ID NO: 1;

   - pelo menos um anticorpo que se liga à região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 26 a 39 da SEQ ID NO: 1 e pelo menos um anticorpo adicional que se liga à região de MAP P900 definida por aminoácidos ou 52 a 68 da SEQ ID NO: 1;

   - pelo menos um anticorpo que se liga à região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 52 a 68 da SEQ ID NO: 1 e pelo menos um anticorpo adicional que se liga à região de MAP P900 definida por aminoácidos ou 345 a 359 ou 350 a 359 da SEQ ID NO: 1;

   - pelo menos um anticorpo que se liga à região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 26 a 71 da SEQ ID NO: 1, em que a serina 37 é opcionalmente fosforilada e pelo menos um anticorpo adicional que se liga à região de MAP P900 definida por amino ácidos ou 345 a 359 ou 350 a 359 da SEQ ID NO: 1, em que a serina 357 e/ou a serina 358 é opcionalmente fosforilada.
6. 6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o método compreende determinar se a região de MAP P900 entre os aminoácidos 273 a 406 da SEQ ID NO: 1, ou um fragmento de qualquer um destes, foi clivada do MAP P900 ligado à membrana.
7. 7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o método compreende determinar se a região clivada de MAP P900, ou fragmento da mesma, se espalhou a partir de células microbianas e/ou células hospedeiras contendo MAP P900 ligado à membrana.

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   3/7
8. 8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

   2 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo que se liga à região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 24 a 71 se liga à sequência de aminoácidos MVINDDAQRLLSQR, AAVTTLADGGEVTWAID ou MVINDDAQRLL[pS]QR e/ ou o anticorpo que se liga à região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 329 a 386 da SEQ ID NO: 1 se liga à sequência de aminoácidos YLSALVSIRTDPSSR ou NLKRPRRYDRRLLRA ou à sequência de aminoácidos YLSALVSIRTDPSSR na qual um dos mais dos resíduos de serina é fosforilado.
9. 9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

   4 a 8, caracterizado pelo fato de que o método utiliza pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma sequência de MAP P900 não fosforilada e pelo menos um anticorpo adicional que se liga especificamente à sequência de MAP P900 fosforilada.
10. 10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de MAP P900 não fosforilada é MVINDDAQRLLSQR, e a sequência de MAP P900 fosforilada é MVINDDAQRLL[pS]QR, ou a sequência de MAP P900 não fosforilada é YLSALVSIRTDPSSR ou VSIRTDPSSR, e a sequência de MAP P900 fosforilada é YLSALVSIRTDPS[pS]R, YLSALVSIRTDP[pS]SR, VSIRTDP[pS][pS]R, VSIRTDP[pS]SR ou VSIRTDP[pS][pS]R.
11. 11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra de um fluido corporal ou uma amostra de tecido.
12. 12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o fluido corporal é sangue, sêmen, líquido amniótico, fluido cerebrospinal, fluido sinovial ou leite materno, ou o tecido é amostra de pele, trato gastrointestinal, tiróide, nódulo linfático, cérebro ou trato geniturinário.

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13. 13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

    1 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem doença de Crohn, psoríase, tireoidite, doença de Parkinson, diabetes tipo 1, artrite, espondilite anquilosante, síndrome do intestino irritável, oolite ulcerativa, doença inflamatória intestinal, doença de Alzheimer, esclerose múltipla, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática e/ ou síndrome da fadiga crônica.
14. 14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um animal.
15. 15. ANTICORPO, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente à região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 26 a 71 da SEQ ID NO: 1.
16. 16. ANTICORPO, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga à sequência de aminoácidos MVINDDAQRLLSQR, AAVTTLADGGEVTWAID ou MVINDDAQRLL[pS]QR.
17. 17. ANTICORPO, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a uma sequência fosforilada na região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 26 a 71 ou 345 a 371 da SEQ ID NO: 1.
18. 18. ANTICORPO, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga à sequência MVINDDAQRLLSQR ou YLSALVSIRTDPSSR, quando um ou mais dos resíduos de serina é fosforilado.
19. 19. ANTICORPO, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente à sequência de aminoácidos YLSALVSIRTDPSSR ou NLKRPRRYDRRLLRA ou uma forma fosforilada de ambos, dentro da região de MAP P900 definida pelos aminoácidos 329 a 360 da SEQ ID NO: 1.

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20. 20. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo monoclonal, quimérico, recombinante, sintético ou de domínio único.
21. 21. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo marcado.
22. 22. USO de um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que é em um método ex vivo de diagnóstico ou monitoramento da infecção por MAP.
23. 23. USO de um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que é em um método ex vivo de monitoramento do tratamento da infecção por MAP ou tratamento de um indivíduo com doença de Crohn, colite ulcerativa, psoríase, tireoidite, sarcoidose, doença de Parkinson, esclerose múltipla, diabetes tipo 1, artrite, espondilite anquilosante e síndrome do intestino irritável, doença inflamatória intestinal, doença de Alzheimer, esclerose múltipla, fibrose pulmonar idiopática e/ ou síndrome da fadiga crônica.
24. 24. USO de um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que é para detectar MAP em um produto alimentar.
25. 25. USO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o produto alimentar é leite ou outro produto lácteo ou um produto de carne.
26. 26. USO de um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que é em um método para detectar MAP em

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    6/7 uma amostra ambiental.
27. 27. USO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a amostra ambiental é uma amostra de água superficial, água fluvial, água da estação de tratamento de água, água doméstica ou um aerossol, solo ou sedimento.
28. 28. USO de um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que é para capturar um peptídeo para caracterização de Espectrometria de Massas (MS).
29. 29. FRAGMENTO DE PEPTÍDEO de MAP P900, caracterizado pelo fato de que é de até 40 aminoácidos, compreendendo uma ou mais das seguintes sequências: MVINDDAQRLLSQR, VTTLADGGEVTWAID, NLKRPRRYDRRLLRA, VSIRTDPSSR e YLSALVSIRTDPSSR, em que o peptídeo é opcionalmente fosforilado.
30. 30. PEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o peptídeo consiste em até 25 aminoácidos da sequência de aminoácidos de MAP P900.
31. 31. PEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 30, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é fosforilado e compreende uma das seguintes sequências: MVINDDAQRLL[pS]QR ou YLSALVSIRTDPS[pS]R, YLSALVSIRTDP[pS]SR ou

    YLSALVSIRTDP[pS][pS]R.
32. 32. PEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é modificado no N-terminal e/ou no C-terminal e/ou é conjugado ou acoplado a uma molécula transportadora.
33. 33. MÉTODO PARA GERAR UM ANTICORPO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE A MAP P900, caracterizado pelo fato de que o método

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    7/7 compreende administrar um peptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 31, a um animal de laboratório para gerar uma resposta imune e isolar anticorpos do animal.
34. 34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a triagem dos anticorpos isolados para ligação específica a MAP P900 determinando se os anticorpos se ligam a um peptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 31, e se os anticorpos se ligam a peptídeos homólogos de organismos relacionados, em que um peptídeo é específico para MAP P900 quando se liga a um peptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 31, mas não se liga aos peptídeos homólogos de organismos relacionados.
35. 35. ANTICORPO, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que é para uso no método terapêutico ou de diagnóstico realizado no corpo humano ou animal.
36. 36. ANTICORPO, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método de tratamento ou prevenção de infecção por MAP.