JP5283228B2

JP5283228B2 - 卵白アレルゲンの検出方法

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Publication number: JP5283228B2
Application number: JP2009170621A
Authority: JP
Inventors: 政信秋元; 重城加藤; 真浪岡
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Filing date: 2009-07-21
Publication date: 2013-09-04
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Description

本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性及び変性の卵白アレルゲンを指標としたアレルゲンの検出方法や、それに用いられるアレルゲンの検出用キットに関する。

また、本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性又は変性のオボアルブミンを定性的かつ定量的に高感度で分析することができる、オボアルブミンを指標とした卵白アレルゲンの検出方法や、それに用いられる卵白アレルゲンの検出用キットに関する。

自然環境の減少、車や工場などからの排気ガス、住宅事情等、或いは食べ物の変化など様々な因子により、現在では、３人に１人が何らかのアレルギー疾患をもつといわれている。特に、食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質（以下、食物アレルゲンという）の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こし、このような食物アレルギーの患者が増加していることから、医学上及び食品産業上、深刻な問題を生じている。これらの危害は死に至らせることがあり、未然に処置を施す必要がある。そのためには、表示を通じて消費者へ情報提供の必要性も高まっており、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会は、アレルギー物質として知られている８種の原材料を含む食品にあっては、それを含む旨の表示について合意し、加盟国で各国の制度に適した表示方法を検討することとした（１９９９年６月）。日本では過去の健康危害などの程度、頻度を考慮して重篤なアレルギー症状を起した実績のある２４品目の食品について、その表示方法が定められた（２００２年４月より施行）。アレルギーを引き起こす食品としては、卵類、牛乳類、肉類、魚類、甲殻類及び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母若しくはゼラチンなどが知られており、特に乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１カゼインや、ホエーアレルゲンの主要成分であるβラクトグロブリンや、卵白アレルゲン成分としてはオボアルブミンとオボムコイドや、小麦アレルゲンの主要成分としてグリアジンや、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質や、落花生の主要タンパク質であるＡｒａｈ１が知られている。

従来、アレルゲンを検出する方法としては、例えば、アレルゲンに特異的に反応するイムノグロブリンを定量する方法（特開平０５−２４９１１１号公報参照）や、抗原抗体複合体を含有する検体中の該抗原抗体複合体を酸処理等により解離させ、必要に応じてアルカリを用いて中和処理を行った後、該検体中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を測定する方法（特開平０７−１４０１４４号公報参照）等が知られている。

また、現在、乳、卵、小麦、そば、落花生の特定原材料を検出するための公定法として、加熱・非加熱複合抗原より得られるポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（特開２００３−１５５２９７号公報参照；以下「市販公定法Ａ」という）、あるいは精製抗原より得られたポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（以下「市販公定法Ｂ」という）が用いられている。これらは、特異的にアレルゲンを検出するために有効な方法であるが問題も多い。例えば、市販公定法Ａでは複合抗原を用いているため、何に対する抗体なのかが不明で、交差性が高く、例えば、イムノブロット法などによる抗原の同定ができず、また非特異反応が増える可能性がある。また、市販公定法Ｂでは、抗原が精製されているため抗体の特異性は明確であるものの、未変性の抗原を用いて作製された抗体を使用しているため、変性／未変性により抗体が結合する程度に違いがあるため、同じ添加量であっても、加熱前、加熱後での定量値が異なるという問題があった。特に、小麦は他の特定原材料（卵、乳、そば、落花生）の中でも過酷な加熱処理が施される場合が多い（例えばパン、唐揚げ等）ため、小麦アレルゲンは未変性から加熱変性まで、広範囲な状態で存在する。そこで、小麦アレルゲンを検出するためには、どの様な状態のアレルゲンに対して結合するかを明らかにしたモノクローナル抗体を作製し、その特性に応じて利用する必要がある。

さらに、卵の同定、定量に関しては、オボムコイドを指標として、すでにポリクローナル抗体を用いた方法（例えば、Int. Archs. Allergy appl. Immun., 75, 8-15, 1984参照）あるいはモノクローナル抗体を用いた方法（例えば、Nutr. Sci. Vitaminol. 45, 491-500, 1999参照）が知られている。また、オボムコイドを認識するモノクローナル抗体で、未変性オボムコイドと反応するが熱変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、熱変性オボムコイドと反応するが未変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、及び未変性オボムコイドと熱変性オボムコイドに反応するモノクローナル抗体を用いて、加熱変性状態をも識別してオボムコイドを定量し、卵アレルゲンの同定と正確な定量を可能とする免疫学的定量方法が報告されている（例えば、特開２００２−２５３２３０号公報参照）。

本発明の課題は、卵白アレルゲンを含む食品において、卵白アレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても検出できる高感度な免疫学的な検出方法及びそれに用いられる検出キット等を提供することにある。

本発明者らは、特定原材料である卵白アレルゲンを検出する方法について鋭意検討し、未変性及び変性の卵白アレルゲンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を用いると、特定原材料の卵白アレルゲンを検出することができることを見い出した。

特定原材料の一つである卵白の検出方法の検討を行うに当たっては、精製オボアルブミンに対するモノクローナル抗体を作出し、その中から未変性抗原に結合できるＭＡｂと、変性抗原に結合できるＭＡｂとをそれぞれ複数選択し、未変性抗原結合ＭＡｂ群と変性抗原結合ＭＡｂ群を組み合わせることで、抗原となるオボアルブミンが変性／未変性のいかなる状態にあっても高感度で検出できることを見い出し、特に未変性抗原結合ＭＡｂ群と変性抗原結合ＭＡｂ群を組み合わせて用いた場合、未変性オボアルブミンあるいは変性オボアルブミンのみが存在する場合であっても、未変性抗原結合ＭＡｂ（群）単独使用や変性抗原結合ＭＡｂ（群）単独使用におけるよりも優れた検出感度で検出しうることを確認した。また、卵白アレルゲンであるオボアルブミンに対するＭＡｂを組み合わせることにより、食品中の卵白がいかなる加工工程を経た場合にでも、本発明による検出方法や検出キットを利用する者がより簡便に検査対象製品からの卵白アレルゲンを検出しうることを確認した。

本発明（卵白アレルゲン）の試験１における各希釈段に対する抗オボアルブミンＭＡｂの反応性を示す図である。本発明（卵白アレルゲン）の試験２における各希釈段に対する抗オボアルブミンＭＡｂの反応性を示す図である。本発明（卵白アレルゲン）の試験３における各希釈段に対する抗オボアルブミンＭＡｂの反応性を示す図である。

本発明の卵白アレルゲンの検出方法としては、還元カルボキシメチル化オボアルブミンを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体を用いることを特徴とする卵白アレルゲンの検出方法であれば特に制限されず、さらに、未変性オボアルブミンを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体を用いることが好ましい。また、本発明の卵白アレルゲン検出用キットとしては、還元カルボキシメチル化オボアルブミンを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体を備えたことを特徴とする免疫学的なアレルゲン検出用キットであれば特に制限されず、さらに、未変性オボアルブミンを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体を備えたものが好ましい。ここで「卵白アレルゲン」とは、卵白の主要タンパク質であるオボアルブミンを含むものをいう。

上記未変性オボアルブミンを認識する抗オボアルブミンモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ２を挙げることができ、また、上記還元カルボキシメチル化オボアルブミンを認識する抗オボアルブミンモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ２等を好適に例示することができる。また、ＰＮＯＡ１とＰＮＯＡ２等の抗未変性オボアルブミンモノクローナル抗体や、ＰＤＯＡ１とＰＤＯＡ２等の抗変性オボアルブミンモノクローナル抗体の組み合せ、特にＰＮＯＡ１とＰＮＯＡ２等の抗未変性オボアルブミンモノクローナル抗体とＰＤＯＡ１とＰＤＯＡ２等の抗変性オボアルブミンモノクローナル抗体を組み合わせることで、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。例えば、これらの抗体を用いることで、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、食品中の未変性オボアルブミン及び／又は変性オボアルブミンを、１．０〜１０．０ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析することができる。

本発明の卵白アレルゲンの検出方法においては、尿素と２−メルカプトエタノールを用いてオボアルブミンを抽出することが好ましく、また、未変性オボアルブミンを認識する２種類のモノクローナル抗体及び変性オボアルブミンを認識する２種類のモノクローナル抗体を用いることが好ましい。また、本発明の卵白アレルゲン検出用キットにおいては、オボアルブミンを抽出するための尿素と２−メルカプトエタノールを含むものが好ましく、また、未変性オボアルブミンを認識する２種類のモノクローナル抗体及び変性オボアルブミンを認識する２種類のモノクローナル抗体を備えるものが好ましい。

以上の本発明の免疫学的なアレルゲンの検出方法は、未変性及び変性の卵白アレルゲン（以下「食物アレルゲン」ということがある）を含む試料を、標識化した抗オボアルブミンＭＡｂと接触させ、あるいは標識化した抗体の存在下にオボアルブミンＭＡｂと接触させ、抗原抗体反応により標識化免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識物質を用いて分離・測定する検出段階とからなり、かかる免疫反応段階における抗原抗体反応の方法も特に制限されず、例えば、以下の方法を例示することができる。

不溶性担体に結合した本発明の抗オボアルブミンＭＡｂに試料中の食物アレルゲンを捕捉させた後に標識化抗ＩｇＧ抗体を反応させるサンドイッチ法や、不溶性担体に結合した抗オボアルブミンＭＡｂと異なるエピトープを認識する標識抗オボアルブミンＭＡｂ（第二抗体）を用いるサンドイッチ二抗体法や、不溶性担体に結合した抗オボアルブミンＭＡｂに試料中の卵白アレルゲンを標識化抗原の存在下で反応させる競合法や、卵白アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する磁気ビーズ結合標識抗オボアルブミンＭＡｂを作用させた後、磁力により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する磁気ビーズ法や、卵白アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する標識抗オボアルブミンＭＡｂを作用させて凝集沈殿させた後、遠心分離により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法や、金コロイド等で標識された抗オボアルブミンＭＡｂと食物アレルゲンであるオボアルブミンが結合した抗原抗体複合体が試験ストリップ上を毛管現象等により移動する途中に、オボアルブミンと結合する抗オボアルブミンＭＡｂをあらかじめ固定しておき、抗原抗体複合体を補足させることで現れる着色ラインの有無によって定性分析するイムノクロマト法の他、二重免疫拡散法、放射免疫拡散法など公知の免疫測定法を利用することができるが、抗オボアルブミンＭＡｂとして、それぞれ異なるエピトープを認識する２以上のモノクローナル抗体を用いる方法、例えば、食品中の未変性アレルゲン及び／又は変性アレルゲンが１００〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうる高感度の点でサンドイッチ二抗体法が、定性的には簡便性からイムノクロマト法が好ましい。また、食肉製品等の食品試料中からアレルゲンを抽出する場合、尿素と２−メルカプトエタノールを用いることが望ましい。

上記抗原抗体反応において用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等を挙げることができ、また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管、ラテックスビーズ状等の種々の形状で用いることができる。更に、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は特に限定されるものでなく、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。

本発明の卵白アレルゲンの検出方法や卵白アレルゲン検出用キットに用いられる抗オボアルブミンＭＡｂの免疫グロブリンのクラス及びタイプは特に制限されないが、抗オボアルブミンＭＡｂとして、ＩｇＧクラス、タイプκの抗体が好適に用いられる。また、モノクローナル抗体の形態としては、全抗体又はＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ等の断片を用いることもできる。抗体の由来は特に限定されるものではないが、マウス、ラット、ヒト、兎、鶏等を挙げることができるが、作製の簡便性からマウスに由来するモノクローナル抗体が好適に用いられる。また、抗オボアルブミンＭＡｂは、未変性又は変性のオボアルブミン等で免疫した動物から採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合により調製されるハイブリドーマを培地上で培養するか、又は動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、該培養物又は腹水から採取することにより製造することができる。

抗オボアルブミンＭＡｂ産生ハイブリドーマは、例えば、未変性及び／又は変性のオボアルブミンを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗オボアルブミンＭＡｂ産生ハイブリドーマを作出することができる。上記の抗体産生細胞としては、例えば未変性及び／若しくは変性のオボアルブミン又はこれを含有する組成物を投与して免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球等を挙げることができる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えば未変性及び／又は変性のオボアルブミンをそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に１〜２回／月、１〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。ミエローマ細胞としては、マウス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。

細胞融合は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で混合することにより行なうことができる。細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択し、次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、抗オボアルブミンＭＡｂを産生するハイブリドーマを得ることができる。また、オボアルブミン等の未変性の食物アレルゲンのみを用いて免疫した抗免疫動物から、有利に抗変性オボアルブミンＭＡｂを得ることができる場合もある。この場合、抗変性オボアルブミンＭＡｂ等の抗変性食物アレルゲンＭＡｂ産生ハイブリドーマをスクリーニングしてもよいし、あるいは、固相状態でのＥＬＩＳＡで未変性のオボアルブミン等の未変性の食物アレルゲンに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択し、この抗体産生ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体から液相状態で未変性のオボアルブミンに対してのみ特異的に反応する抗オボアルブミンＭＡｂを得ることができる。前記のように、抗体産生ハイブリドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体を培養物から採取することができるが、培養物又は腹水からのモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、例えば、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。

また、標識化抗体作製に用いられる標識物質としては、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質であればよく、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、金コロイド等を使用するのができ、酵素としてはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等を、蛍光物質としては、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等を、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、アクリジニウム塩類等を、放射性物質としては^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ若しくは^１３１Ｉ等を例示することができる。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光剤、発光剤等が用いることができる。

本発明の食物アレルゲン検出用キットには、有効成分としての抗オボアルブミンＭＡｂ、好ましくはそれぞれ異なるエピトープを認識する２以上の抗オボアルブミンＭＡｂを含むが、これらは保存安定性の点から、溶液状態よりも凍結乾燥物として収容されていることが好ましく、検出用キットにはかかる抗オボアルブミンＭＡｂを溶解する緩衝液や培養液の他、試料を調製するための緩衝液等を含んでいてもよい。また、より好ましい別の態様の本発明の抗食物アレルゲン検出用キットとしては、前記イムノクロマト法における試験ストリップを挙げることができる。この場合、異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つを、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体とすることが好ましい。

本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ２を挙げることができ、これらハイブリドーマは、平成１７（２００５）年２月２４日（受領日）付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１
中央第６）に寄託されている。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

１．変性／未変性オボアルブミンに結合可能なＭＡｂの確立
１−１材料及び方法
１）ニワトリオボアルブミン（以下「ＯＡ」ということがある）の調製
新鮮なニワトリ卵より卵白のみを採取し、泡立てないように均質化後、等量の飽和硫酸アンモニウムを加え、濾紙Ｎｏ．１（アドバンテック東洋）で濾過した。そして、得られたろ液に０．５Ｍの硫酸を添加しｐＨ４．６に調整後、一晩放置した。８，０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離により得られた沈殿を蒸留水に溶解し、同じ方法で再結晶化し、粗ＯＡ画分を得た。粗ＯＡはさらに、TSK gel DEAE 650S（Tosoh）を用いたイオン交換クロマトグラフィにより精製した。移動相には５０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．４）を用い、ＮａＣｌの０から０．３ＭのリニアグラジェントによりＯＡを分画し、透析による脱塩後、凍結乾燥を行った。この凍結乾燥ＯＡを用い、生理食塩水で０．１％のＯＡ溶液を作製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管した。

２）免疫
供試動物として、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）４尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＯＡが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＯＡが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。なお、抗変性ＯＡＭＡｂを得る場合、最終免疫のみに後述する還元カルボキシメチル化ＯＡを用いた。

３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＯＡを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗ＯＡ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。

４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％ＯＡ溶液１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００mｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０^６cells/wellとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ_２下３７℃で培養した。

５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗ＯＡ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＯＡに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ cell/wellとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０^６cells/wellとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。

６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性ＯＡ（以下「ＮＯＡ」ということがある）あるいは還元カルボキシメチル化ＯＡ（以下「ＲＣＭＯＡ」ということがある）に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。ＲＣＭＯＡは、精製ＯＡ（上記凍結乾燥物）を１０ｍｇ量り、１．４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、５％のＥＤＴＡ１００μｌ、１．２ｇの尿素、３３μｌの２−メルカプトエタノールを加え２．５ｍｌに定容した後、窒素ガス置換を行い、３７℃、１時間の還元処理を行った。さらに、１ＭのＮａＯＨ３００μｌに溶解した８９ｍｇのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で１時間のカルボキシメチル化を行い、ＲＣＭＯＡとした。培養上清のＮＯＡあるいはＲＣＭＯＡに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにより調べた。

７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０^６cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム（アマシャムファルマシア）により精製した。

８）ＭＡｂの特性とＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
抗ＯＡＭＡｂの特性を決定するために、固相法と液相法を用いた。固相法として、ＮＯＡ又はＲＣＭＯＡをあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化された抗原（ＮＯＡ又はＲＣＭＯＡ）に抗未変性／変性ＯＡＭＡｂを作用させる方法を用い、また、液相法として、ウサギ抗ＯＡポリクローナル抗体をあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、このポリクローナル抗体にＮＯＡ又はＲＣＭＯＡを結合させた状態で、抗未変性／変性ＯＡＭＡｂを作用させる方法を用いた。また、ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。

９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。

１−２結果
１）抗ＯＡＭＡｂの特性とクラス、サブクラス
ＮＯＡに対する特異性を持つＭＡｂ９種類、及び、ＲＣＭＯＡに対する特異性を持つＭＡｂ１０種類を得た。それぞれ液相あるいは固相の抗原に対する特異性を表１に示した。

２）組合せ条件
ＮＯＡを検出するためのＭＡｂあるいはＲＣＭＯＡを検出するためのＭＡｂの組合せは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出感度の点から選出した。その結果、ＮＯＡでは３０１Ｂ５と３１６Ｇ１や３０４Ｅ４（ＰＮＯＡ１；ＦＥＲＭＢＰ−１０２６５）と３０６Ｂ２（ＰＮＯＡ２；ＦＥＲＭＢＰ−１０２６６）、ＲＣＭＯＡでは１１７Ｆ９と１１９Ｄ１１や９４８Ｇ１１（ＰＤＯＡ１；ＦＥＲＭＢＰ−１０２７５）と９６２Ｂ８（ＰＤＯＡ２；ＦＥＲＭＢＰ−１０２７６）を高い組合せとして選択した。

２．サンドイッチＥＬＩＳＡによる変性及び未変性抗原の検出
２−１材料及び方法
ＮＯＡ溶液は、精製ＯＡをＰＢＳで１００ｐｐｂ溶液となるように調製し、３倍の希釈段を作製した（希釈段Ａ）。一方、ガラス試験管に精製ＯＡを１ｍｇ量り、６ｇの尿素、０．２ｍｌの２−メルカプトエタノール、１ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）、１．５ｍｌの蒸留水を加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。冷却後、１００ｍｌ容メスフラスコに移し、ＰＢＳで１００ｍｌにメスアップした。これをさらにＰＢＳで１００倍希釈し、尿素変性ＯＡ（以下「ＵＤＯＡ」という）１００ｐｐｂ溶液とした。さらに尿素濃度を０．０１Ｍに保ちながら３倍の希釈段を作製した（希釈段Ｂ）。また、ＮＯＡ１００ｐｐｂ溶液とＵＤＯＡ１００ｐｐｂ溶液を等量ずつ混ぜ（ＮＯＡ及びＵＤＯＡは各５０ｐｐｂ溶液となる）、尿素濃度を０．００５Ｍに保ちながら３倍の希釈段を作製した（希釈段Ｃ）。また、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試した条件を表２に示す。コーティングＭＡｂ濃度は単独の場合は２５μｇ／ｍｌに、また混合した場合には各１２．５μｇ／ｍｌとし、合計で２５μｇ／ｍｌとなるようにした。

２−２結果
図１に示すように、未変性ＯＡを対象とした（試験１）では３０１Ｂ５単独と、３０１Ｂ５と１１９Ｄ１１の混合の曲線はほとんど重なったが、１０ｐｐｂ以下のより希薄な状態において３０１Ｂ５単独よりも３０１Ｂ５と１１９Ｄ１１の混合の曲線では若干混合の方が吸光値は高く、検出感度が上げられる可能性が考えられた。また、変性ＯＡを対象とした（試験２）のＵＤＯＡでは、３０１Ｂ５単独では吸光値が認められず、３０１Ｂ５及び３１６Ｇ１はＵＤＯＡに関与しないものと考えられたが、１１９Ｄ１１単独と３０１Ｂ５と１１９Ｄ１１の混合の曲線では明らかに混合の方が吸光値は高く、ＭＡｂを混合することにより検出感度を上げることができるものと考えられた（図２）。これは未変性／変性ＯＡを対象とした（試験３）でも認められ、３０１Ｂ５単独よりも３０１Ｂ５と１１９Ｄ１１の混合の方が明らかに吸光値が高かった（図３）。試験１〜３のいずれの場合も、単独でコーティングされた抗体濃度は２５ｇ／ｍｌであり、混合ではそれぞれ半分の濃度の１２．５mｇ／ｍｌであったことから、ＭＡｂの種類を増やす混合系を用いることで、抗体濃度が同じあるいは少なくても、より抗原の検出感度を上げることが可能であることが明らかとなった。

３．イムノクロマトによる変性及び未変性ＯＡの検出
３−１材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるように１１９Ｄ１１及び３１６Ｇ１のＭＡｂ単独あるいは混合溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（日本ミリポア社製）に６８μｌ／ｃｍ^２となるよう塗布し、乾燥させた。

２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるよう１１７Ｆ９及び３０１Ｂ５のＭＡｂ単独あるいは混合溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。

３）イムノクロマトストリップの組立と評価
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。被検液としては、上記２．で調製したＮＯＡ並びにＵＤＯＡを適宜希釈して用いた。

３−２結果
３０１Ｂ５及び金コロイド標識３１６Ｇ１の組合せによりＮＯＡは１０ｐｐｂまで検出することができたが、ＵＤＯＡは１ｐｐｍでも検出できなかった。一方、１１７Ｆ９及び金コロイド標識１１９Ｄ１１の組合せにより、ＵＤＯＡは１０ｐｐｂまで検出することができたが、ＮＯＡは１ｐｐｍでも検出できなかった。これに対して、３０１Ｂ５及び１１７Ｆ９の固定化抗体混合物、並びに３１６Ｇ１及び１１９Ｄ１１の金コロイド抗体混合物を用いたイムノクロマトストリップを作製した場合、変性ＯＡあるいは未変性ＯＡを１０ｐｐｂまで検出可能であった。この様に変性ＯＡに結合可能なＭＡｂと未変性ＯＡに結合可能なＭＡｂを組み合わせることにより、製造工程中に混入した未変性卵白が対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応できるイムノクロマトストリップの設計が可能となった。

市販の卵アレルゲン検出用イムノクロマトストリップでは、ブランクとして０．０１Ｍの尿素のみを含むＰＢＳを滴下したところ、非特異的なバンドが生じてしまい、擬陽性となってしまった。これでは卵白アレルゲン検査において、熱などにより不溶化した卵白アレルゲンを抽出するためのたんぱく質変性剤である尿素を使用できず、アレルゲンとして検出できる対象が極めて狭い範囲に限られてしまう危険性が考えられた。

本発明によると、食品等に含まれる卵白アレルゲンについての免疫学的な検出方法において、これらアレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても正確に定性かつ定量的に検出することができる。

Claims

未変性オボアルブミンを認識し、変性オボアルブミン、還元カルボキシメチル化オボアルブミン、及び尿素変性オボアルブミンを認識しない、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の組合せを用いて、未変性オボアルブミンを指標として分析するか、又は、
変性オボアルブミン、還元カルボキシメチル化オボアルブミン、及び尿素変性オボアルブミンを認識し、液相未変性オボアルブミンを認識しない、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の組合せを用いて、変性オボアルブミンを指標として分析することを特徴とする卵白アレルゲンの検出方法。
未変性オボアルブミンを認識し、変性オボアルブミン、還元カルボキシメチル化オボアルブミン、及び尿素変性オボアルブミンを認識しない、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ１、及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ２であり、並びに、変性オボアルブミン、還元カルボキシメチル化オボアルブミン、及び尿素変性オボアルブミンを認識し、液相未変性オボアルブミンを認識しない、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ１、及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ２であることを特徴とする、請求項１記載の卵白アレルゲンの検出方法。
サンドイッチＥＬＩＳＡにより、食品中の未変性オボアルブミン又は変性オボアルブミンを、１．０〜１０．０ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうることを特徴とする請求項１又は２のいずれか記載の卵白アレルゲンの検出方法。
未変性オボアルブミンを認識し、変性オボアルブミン、還元カルボキシメチル化オボアルブミン、及び尿素変性オボアルブミンを認識しない、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の組合せを備え、未変性オボアルブミンを指標として分析するため、又は、
変性オボアルブミン、還元カルボキシメチル化オボアルブミン、及び尿素変性オボアルブミンを認識し、液相未変性オボアルブミンを認識しない、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の組合せを備え、変性オボアルブミンを指標として分析するための卵白アレルゲン検出用キット。
未変性オボアルブミンを認識し、変性オボアルブミン、還元カルボキシメチル化オボアルブミン、及び尿素変性オボアルブミンを認識しない、かつそれぞれ異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ１、及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ２であり、並びに、変性オボアルブミンを認識し、還元カルボキシメチル化オボアルブミン、及び尿素変性オボアルブミンを認識し、液相未変性オボアルブミンを認識しない、かつそれぞれ異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ１、及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ２であることを特徴とする、請求項４記載の卵白アレルゲン検出用キット。
それぞれ異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項４又は５記載の卵白アレルゲン検出用キット。
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ１。
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ２。
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ１。
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ２。