CZ2003749A3 - Kmen bakterií mléčného kvašení, potravinářský výrobek, farmaceutický prostředek a vakcína - Google Patents

Kmen bakterií mléčného kvašení, potravinářský výrobek, farmaceutický prostředek a vakcína Download PDF

Info

Publication number
CZ2003749A3
CZ2003749A3 CZ2003749A CZ2003749A CZ2003749A3 CZ 2003749 A3 CZ2003749 A3 CZ 2003749A3 CZ 2003749 A CZ2003749 A CZ 2003749A CZ 2003749 A CZ2003749 A CZ 2003749A CZ 2003749 A3 CZ2003749 A3 CZ 2003749A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
peptide
cooh
bacterial strain
lactic acid
tolerogenic
Prior art date
Application number
CZ2003749A
Other languages
English (en)
Inventor
Jaques Edouard Germond
Blaise Corthesy
Beat Mollet
Rodolphe Fritsche
Original Assignee
Société des Produits Nestlé S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Société des Produits Nestlé S. A. filed Critical Société des Produits Nestlé S. A.
Publication of CZ2003749A3 publication Critical patent/CZ2003749A3/cs

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23CDAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1234Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23CDAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1236Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt using Leuconostoc, Pediococcus or Streptococcus sp. other than Streptococcus Thermophilus; Artificial sour buttermilk in general
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23LFOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/065Microorganisms
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23LFOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74Bacteria
    • A61K35/741Probiotics
    • A61K35/744Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745Bifidobacteria
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74Bacteria
    • A61K35/741Probiotics
    • A61K35/744Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08Antiallergic agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23CDAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C2220/00Biochemical treatment
    • A23C2220/20Treatment with microorganisms
    • A23C2220/202Genetic engineering of microorganisms used in dairy technology
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23VINDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11Lactobacillus
    • A23V2400/151Johnsonii
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23VINDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/21Streptococcus, lactococcus
    • A23V2400/231Lactis
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23VINDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/51Bifidobacterium
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Dairy Products (AREA)

Description

Předkládaný vynález se týká nových kmenů bakterií mléčného kvašení, které jsou schopné snižovat sklon jedinců k vyvinutí alergických reakcí. Předkládaný vynález se týká zvláště nových kmenů bakterií mléčného kvašení, které exprimují polypeptidy včetně tolerogenních peptidů a jejich použití při snížení sklonu jedince vytvářet alergické reakce. Vynález se také týká potravinářských výrobků nebo farmaceutických prostředků s obsahem uvedených mikroorganismů nebo jejich aktivních frakcí.
Dosavadní stav techniky
Alergie jsou nepřiměřené reakce imunitního systému na řadu různých látek (alergeny). Obecně se u jedinců nevytváří významná imunitní reakce proti látkám, které se pravidelně vyskytují v životním prostředí, jako je pyl nebo potraviny, přičemž tato nereaktivita se považuje zejména za důsledek supresivního (potlačovacího) mechanismu samotného imunitního systému. Nesprávný stav imunitního systému však neplní tuto supresivní aktivitu (označovanou jako tolerance), což vede ke specifické imunitní reakci proti alergenu alergické reakci. K alergickým reakcím patří uvolňování biologicky aktivních sloučenin, jako jsou zánětlivé mediátory histamin, leukotrieny a'enzymy, z určitých typů buněk, hlavně žírných buněk a bazofilních granulocytů, do okolní tkáně a cévních struktur. Žírné buňky jsou rozptýleny ve všech tkáních organismu, zatímco bazofily cirkulují v cévním systému. Po řadě za sebou následujících dějů s účastí • · · · • · · · protilátek IgE se z cílových žírných buněk uvolňují sloučeniny/mediátory, což nakonec vede k farmakologickým reakcím,
V minulosti se počet jedinců trpících alergií zvyšoval, což se často připisuje stále stoupajícímu znečištění atmosféry způsobenému například výfukovými plyny. K tomuto vývoji patrně také přispívá zvýšená spotřeba látek proteinové povahy projevující se zvláště ve stoupajícím výskytu alergií na potraviny. Navíc se předpokládá, že další možnou příčinou atopických onemocnění je omezení mikrobiálních infekcí, ke kterému v rozvinutých zemích dochází.
Alergie na potraviny a dokonce nesnášenlivost některých potravin se nyní stala docela běžným jevem. U většiny postižených jedinců se projevuje netolerance na některé složky potravin, přičemž u pěti procent populace se dokonce vyvíjejí natolik vážné reakce na požité látky, že vyžadují lékařskou péči.
V posledních letech byly získány důkazy, že hlavní příčinou netolerance k potravinám je absorpce normálně vylučovaných látek tělem, přičemž tyto látky jsou u vnímavých jedinců absorbovány v gastrointestinálním traktu. Tato nesprávná absorpce je patrně způsobena defekty ve tkáni, kterou je vyložen trávicí trakt (Peters a další (1988) Can. J. of Gastroenterol. 2, 127; Olaison a další, (1990) Scand. J. of Gastroenterol. 25, 321; Hollander a další, (1986) Ann. of Int. Med. 105, 883). Nedávno byla identifikována schopnost epiteliálních buněk, kterými je vyložen Gl trakt, zpracovávat a předkládat antigeny, což by mohlo také odpovídat za spouštění nepřiměřených imunitních reakcí vedoucích k zánětu a alergickému projevu (Campbell a další (1999) Immunol. Rev. 172, 315).
Projevy alergie na potraviny se mohou týkat v podstatě kterékoli tělesné tkáně. Z důvodů velké absorpční plochy je gastrointestinální trakt pravděpodobně hlavním místem, kde dochází k absorpci látek vyvolávajících obtíže. Mnoho příznaků alergií na potraviny se projevuje • · · · • · · · v samotném trávicím traktu, ale mohou také postihovat jiné tkáně včetně kůže a dýchacích cest.
V oboru se pro léčení alergií, zvláště alergií na potraviny, navrhuje mnoho různých způsobů.
Jeden takový přístup se pokouší modifikovat samotný zdroj alergenního materiálu tak, že dojde ke snížení jeho alergického potenciálu. To může být dosaženo snížením množství nebo zákazem potraviny nebo jejích složek, které by byly příčinou uvedených potíží. Častým problémem je však skutečnost, že specifická antigenní látka (alergen) v určitém potravinářském materiálu není často známá, takže ve většině případů není jasné, která složka by měla být selektivně odstraňována.
V US 5,480,660 se uvádí, že nástup alergické reakce u pacientů s alergiemi na pšenici může být zmírněn odstraněním nebo snížením množství proteinů s molekulovou hmotností nepřevyšující 30 000 Da a proteinů s molekulovou hmotností mezi 50 000 a 70 000 Da z mouky.
V JP 11 04 67 21 se popisuje způsob snížení alergenicity potravinářského materiálu s obsahem proteinů, při kterém se potravinářský materiál smíchá s pšeničnou moukou a směs se zahřívá po dobu více než 3 min při 180 °C.
V US 4,293,571 se popisuje příprava hypoalergenního materiálu, při které se proteinový materiál vystaví hydrolytickému působení, zbylé nehydrolyzované proteiny se koagulují působením tepla a koagulovaný materiál a makropeptidy, které by mohly obsahovat alergeny, se odstraní v následném kroku ultrafiltrace.
V US 5,039,532 se popisuje další způsob přípravy hypoalergenního potravinářského materiálu, při kterém se pšeničný výrobek zpracuje enzymatickou hydrolýzou.
Všechny tyto způsoby zpracování potravinářského materiálu nebo dokonce jeho vyloučení z denní diety se však v praxi obtížně • · · 1 • · · · provádějí, protože vyžadují revizi diety, často se zavedením přísných omezujících opatření, a mohou popřípadě ovlivnit kvalitu života a/nebo zastavit očekávaný růst jedince.
Rozdílný přístup k léčení alergie na potraviny a potravinové netolerance je zaměřen na obnovení a udržení integrity střeva, takže jím alergeny přítomné v potravinách v podstatě nemohou procházet. V této souvislosti popisuje dokument US 5,192,750 použití Nacetylglukosaminu, který umožní vytvoření nezbytné bariéry ve sliznici proti průchodu alergenů přítomných v potravinách a pro udržení její normální funkce.
Podle dalšího přístupu léčení alergií se navrhuje vakcinace jedinců proti molekulám IgE, která inhibujé spouštění žírných buněk a bazofilů. Z tohoto hlediska navrhuje WO 97/31948 specifické peptidy pro vakcinaci, které napodobují svou trojrozměrnou konformací části molekuly IgE, tedy imunoglobulinů účastnících se uvolňování mediátorů působících při regulaci alergických a zánětlivých reakcí. Předpokládá se, že vlastní imunitní systém jedince popřípadě vytvoří protilátky proti uvedeným molekulám IgE, takže dojde k vychytání těchto imunoglobulinů IgE. Tento způsob má však nevýhodu v tom, že vytvořené protilátky mohou mít zkříženou reaktivitu s jinými třídami imunoglobulinů, takže může být nepříznivě ovlivněn přirozený obranný mechanismus jedince.
V přihlášce EP 99200130,5 přihlašovatel předkládaného vynálezu, která dosud nebyla zveřejněna, se popisuje další přístup. Navrhuje se hypoalergenní prostředek, který obsahuje jako základ nealergenní, významně hydrolyzovaný proteinový materiál a/nebo volné aminokyseliny, a alespoň jeden tolerogenní peptid příslušného alergenního proteinu. I když tento prostředek má mnoho výhod proti dosavadnímu stavu techniky, stále je obtížné získat tolerogenní peptid, který se musí vyrábět pro každou šarži de novo.
♦ · · · ς ... ; · .....
υ - ··· · ·· ·· ,,
V oboru tedy stále existuje potřeba poskytnout zlepšené prostředky pro léčení alergií. Tyto prostředky jsou předmětem předkládaného vynálezu.
Podstata vynálezu
Řešením výše uvedených problémů jsou nové kmeny bakterií mléčného kvašení, které jsou schopné snižovat sklon jedince k vyvinutí alergických reakcí. Tyto nové bakterie mléčného kvašení exprimují polypeptid, který nese tolerogenní peptid tak, že specifická sekvence a eventuálně i konfigurace tolerogenního peptidu je zachována, je udržena jeho stabilita a může tak být zpracován a rozpoznán imunitním systémem jedince.
Bylo ukázáno, že bakterie mléčného kvašení, zvláště laktobacily a bifidobakterie modulují imunitní systém, aniž by opustily své přirozené lumenální prostředí, produkcí informačních látek (messengers) (cytokinů), které se účastní při řízení imunitního systému. Bakterie mléčného kvašení nespouštějí produkci prozánětlivých cytokinů, jako je IL-8, TNF-α, MCP-1 a GM-CSF, ale spíše podporují produkci cytokinů inhibujících záněty, jako je TGF-β (Blum a další (1999) Antonie van Leeuwenhoek 76, 199), s důležitými důsledky co se týče udržování jak imunitní rovnováhy ve střevě, tak i integrity epiteliální bariéry (Planchon a další (1999) J. Cell Physiol. 181, 55). Bylo ukázáno, že podávání homogenátů laktobacilů spolehlivě vyvolává supresivní účinek na proliferaci mononukleárních buněk indukovanou mitogeny (Pessi a další (1999) Appl. Environ. MTicrobiol. 65, 4725).
Bakterie mléčného kvašení (lactic acid bacteria, LAB) se mohou používat pro heterologní (nadměrnou) produkci proteinů a peptidů se systémy umožňujícími expresi cizího genu na základě integrace do chromosomu nebo episomálních plasmidových elementů (viz např.
• · • · ♦ · • ·
Kuipers a další (1997) Tibtech 15, 140). Bakterie mléčného kvašení mají dále schopnost kolonizovat povrchy sliznic a vyvolávat vlastní adjuvantní účinek spojený s muramylpeptidy, což vede k degradaci peptidoglykanů.
Dále bylo ukázáno, že některé kmeny rodu Lactobacillus podporují imunitní odpovědi specifické pro antigen, zvláště ve třídě IgA (Majamaa a další (1995) J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 20, 333). Neschopnost lidského IgA v komplexu s antigeny aktivovat komplement může být důležitá při udržování integrity povrchů sliznic. To by zabránilo místním zánětlivým reakcím včetně přílivu leukocytů a uvolňování imunologických efektorů, zvyšujícím permeabilitu membrány sliznic v důsledku poškození tkáně. Navíc by mohl IgA prostřednictvím tohoto imunitního vylučovacího mechanismu omezit další absorpci okolních přítomných antigenů a tím odstranit anafylaktické reakce zprostředkované protilátkami isotypů IgE a IgG.
Dále bylo ukázáno, že laktobacily zvyšují produkci IFN-gama izolovanými T-buňkami (Halpern a další (1991) Int. J. Immunother. 7, 205). V nedávné době bylo ukázáno, že IFN-gama inhibuje uvolňování TNF-alfa z žírných buněk střevní sliznice (Bissonnette a další (1995) Int. Arch. Allergy Immunol. 107, 156). Zvýšená sekrece IFN-gama by mohla zabránit škodlivým účinkům TNF-alfa (Hernandez-Pando a další (1994) Immunology 82, 591) a tím působit proti poruchám permeability v souvislosti s alergií na potraviny. Například narušení střevní bariéry ve smyslu neschopnosti zabránit příjmu antigenu u atopického ekzému může být klíčovým prvkem určujícím nadměrné imunitní odpovědi na běžné alergeny potravin a životního prostředí.
V průběhu intenzivních studií v rámci předkládaného vynálezu objevili autoři způsob jak kombinovat výhodné vlastnosti bakterií mléčného kvašení se schopností tolerogenních peptidů, pro vytvoření účinného prostředku pro omezení nebo dokonce minimalizaci sklonu jedinců k alergickým reakcím.
• · · ·
Bakterie mléčného kvašení použitá v rámci předkládaného vynálezu s výhodou patří do skupiny Lactobacillus nebo skupiny Bifidobacterium nebo skupiny Lactococcus, a výhodněji je odvozená z druhů L. acidophilus, L. johnsonii, L. gasseri, L. casei, L. paracasei nebo L. reuteri, kde všechny tyto bakterie jsou lidského, popřípadě živočišného původu.
Tolerogenní peptid, tedy peptid odvozený z daného proteinu způsobujícího alergii u jedince, má obecně velikost přibližně 200 až 6000 Da, a jde o peptid schopný indukovat toleranci vůči alespoň tomu proteinu, ze kterého je odvozen. Navíc bude indukována tolerance vůči jakémukoli materiálu, který obsahuje stejnou antigenní determinantu jako je determinanta představovaná specifickým tolerogenním peptidem. Podle předkládaného vynálezu je tento peptid vložen rekombinantními prostředky do polypeptidů syntetizovaného v bakterii mléčného kvašení, přičemž polypeptid může být vzhledem k bakterii endogenní nebo exogenní. Tolerogenní peptid je vložen takovým způsobem, že je předkládán (prezentován) na vnější části výsledného rekombinantního polypeptidů, takže může být rozpoznán imunitním systémem.
Polypeptid může být exprimován v bakterii mléčného kvašení některým ze způsobů známých v oboru. Například pro episomální expresi mohou být použity některé z komerčně dostupných vektorů pNZ124 (Platteuw a další (1994) Appl. Env. Microbiol. 60, 587), pGK12 (Walke a další (1996) FEMS Microbiol. 138, 233) nebo pG+host9 (Maguin a další (1996) J. Bacteriol. 178, 931). Pokud se vezme v úvahu značná stabilita integrace do chromosomu, tento způsob by mohl být pro rekombinantní gen kódující příslušný polypeptid výhodný. Pro integraci do chromosomu se může použít homologní rekombinace, například použitím rekombinantního genu bakterie mléčného kvašení obsahujícího tolerogenní peptid a náhradou endogenního genu. Způsoby zavádění rekombinantních • · · · φ φ • * · ·
genů do chromosomu hostitele jsou rovněž známé odborníkům v oboru.
Polypeptid může být protein normálně éxprimovaný do vnitřního prostředí buňky, ale může také jít o polypeptid sekrenovaný bakterií mléčného kvašení, nebo polypeptid vkládaný do její buněčné stěny, přičemž část obsahující tolerogenní peptid je umístěna v extracelulární části. Příklady polypeptidů použitelných v rámci předkládaného vynálezu jsou pepN, pepX, laktát dehydrogenáza nebo βgalaktosidáza, nebo polypeptid ze skupiny bakteriosinů nebo protein S-vrstvy nebo proteáza ukotvená na buněčné stěně.
Povaha tohoto polypeptidu není rozhodující za podmínky, že tolerogenní peptid může být vložen takovým způsobem, aby byl přístupný imunitnímu systému. Jakmile již byl jednou identifikován vhodný tolerogenní peptid, odborník v oboru bude schopen uspořádat tolerogenní peptid do takového umístění. Z tohoto hlediska bude odborník v oboru brát v úvahu trojrozměrné modely polypeptidů, do kterých má být tolerogenní peptid vložen, a na základě takových informací budou schopni navrhnout odpovídající rekombinantní protein.
Ve výhodném provedení jsou rekombinantní polypeptidy sekrenovány nebo jsou zařazeny v buněčné stěně bakterie tak, že tolerogenní peptid je trvale předkládán do vnějšího prostředí.
Tolerogenní peptid je odvozen z potravinářského materiálu, který způsobuje alergickou reakci. Není však nezbytné, aby jeho aminokyselinová sekvence odpovídala sekvenci zjištěné u nativního proteinu, ale pro daný účel bude vhodná jakákoli peptidová sekvence, která bude mít v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci a v případě možnosti i trojrozměrnou konformaci jako výchozí peptid nebo z něj odvozený polypeptid, vykazující stejné výsledky, tj. indukci a snížení alergické odpovědi.
• · · · * ·»· ·
Jako výhodné zdroje tolerogenních peptidů je možné uvést mléko, sóju, burské oříšky, korýše, ryby, maso, sezam nebo pšenici. Těmito peptidy mohou být například β-laktoglobulin, bovinní sérový albumin nebo kasein.
Pro identifikaci tolerogenních peptidů se sledovaný alergenní materiál nejprve vystaví enzymatické hydrolýze až do přibližně 10 až 50 % a zbytková enzymatická aktivita v proteinové směsi se inaktivuje např. působením tepla. Roztok proteinového hydrolyzátu se vyčeří a dále zpracuje podle potřeby. Takto získané peptidy se oddělí např. vysrážením roztoku nebo dělením na chromatografické koloně.
Frakce obsahující různé peptidy se potom testují na tolerogenní vlastnosti na zvířecím modelu. Pro tento účel se zvířata jako jsou myši krmí příslušnými peptidovými frakcemi a potom se imunizují alergenem a měří se reakce na něj, např. pozorováním změny vnějšího vzhledu nebo specifickým měřením hladin IgE u zvířat. Jako důsledek budou tolerogenní peptidové frakce snižovat sklon zvířete reagovat na alergen, takže je možno určit příslušný peptid (frakci).
Jakmile byl ověřen tolerogenní peptid a jeho aminokyselinová sekvence, vloží se metodami genetického inženýrství do genu kódujícího proteinový nosič bakterie, sekvence DNA tohoto polypeptidu, jejíž exprese se požaduje. Způsoby a techniky pro manipulaci se sekvencemi DNA a expresi proteinů v mikroorganismech se popisují v Sambrook a další, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor (1992).
Předkládaný vynález se také týká potravinářského výrobku a farmaceutického prostředku s obsahem alespoň jedné z těchto rekombinantních bakterií mléčného kvašení.
Bakteriální kmen může být do výrobku nebo prostředku přidán v množství v rozmezí od 105 do 1012 cfu (jednotky schopné vytvořit kolonie, colony forming unit) na gram materiálu. Podobně může být do
Φ · » · výrobku přidán supernatant kultury bakterií mléčného kvašení nebo jeho aktivní frakce.
Potravinářský výrobek může být mléko, jogurt, tvaroh, sýr, fermentované mléčné výrobky, fermentované výrobky na bázi mléka, zmrzlina, fermentované výrobky na bázi cereálií, práškové mléčné výrobky, výrobky pro děti a v případě zvířat krmivá pro domácí zvířata.
Farmaceutický prostředek může být ve formě tablet, kapalných suspenzí bakterií nebo prostředků obsahujících části bakterií, jako např. pouze frakci buněčné stěny získanou lyží bakteriálních buněk a oddělením složky buněčné stěny, sušených potravinových doplňků, potravinových doplňků s obsahem vody, sušeného stravy nebo stravy s obsahem vody pro výživu žaludeční sondou.
Farmaceutický prostředek se podává ústy, ale může se také podávat nosem.
Předkládaný vynález také zahrnuje vakciny s obsahem bakterie podle předkládaného vynálezu nebo její části. Bakterie může být živá nebo může být oslabená, např. může být v případě potřeby oslabena její schopnost růstu. Jako části bakterie se bude používat především buněčná stěna nesoucí potřebný antigen. Buněčnou stěnu je možno snadno získat lyží buněk a oddělením jednotlivých složek.
Následující příklady budou ilustrovat vynález, aniž by jej však měly omezovat.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 jsou ukázány primární sekvence peptidů obsažených v příslušných frakcích hydrolyzátu β-laktog lobu lín u; svislé čáry znamenají disulfidické vazby.
Na obr. 2 jsou ukázány výsledky získané pro frakce tolerogenních peptidů/peptidu při různých experimentech.
··· * · ··< ·
- 11 Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace tolerogenních peptidů
a) Izolace peptidů
220 g β-laktoglobulinu (Sigma) bylo rozpuštěno v bidestilované vodě na koncentraci 5 % (hmotn./hmotn.). K získanému roztoku byl přidán trypsin zpracovaný TPCK při poměru enzym/substrát (E/S) 1/100 (hmotn./hmotn.) a roztok byl inkubován při 40 °C, pH 7,6 za stálého míchání. Po 1 hod bylo přidáno stejné množství enzymu za získání konečného (E/S) poměru 2/100. Inkubace pokračovala další 4 hod a enzym byl inaktivován teplem (85 °C, 5 min) pro ukončení reakce. Úplný tryptický hydrolyzát byl potom lyofilizován a získané peptidové produkty byly děleny preparativní chromatografii na kationtové pryskyřici.
Bylo získáno 15 různých peptidových frakcí v rozmezí od 2 do 23 aminokyselin (od přibližně 240 do 2720 Da). Jednotlivé frakce byly nanofiltrovány, diafiltrovány, dialyzovány, znovu lyofilizovány a uchovávány v suchém stavu při teplotě laboratoře až do použití. Frakce byly také charakterizovány na obsah peptidů použitím kapalinové chromatografie s vysokou účinností (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) s reverzními fázemi. Celkem bylo odděleno 15 frakcí (F1 - F15) obsahujících jako hlavní složku peptidy (označené T).
Frak- ce F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F19 F11 F12 F13 F14 F15
Hmot. (9) 52 13,9 11 11,8 2,57 1,94 4,37 13,1 5,01 6,53 1,05 3,46 1,9 2,67 28,8
OP* - T6 T17 T18 T23 T23 - T7 T9 T20 T21 T24 T9 T12 T24 T12 T21 T10 T21 T11 T10 T10 T11 T10 T11 -
* obohacený peptid • ·
- 12 • · · · · • · » · · · • ······ · • · · · ♦ ··· · ·· ··
Peptidy byly izolovány a sekvenovány. Jejich sekvence jsou uvedeny na obr. 1. Jako tolerogenní se ukázaly při různých experimentech různé peptidy (experimenty se podrobně popisují v článku Pecquet R., Bovetto L., Maynard F., Frisché R., Peptides obtained by tryptic hydrolysis of bovine B-lactoglobulin induce specific oral tolerance in mice, J. Allergy Clin. Immunol. (2000) 105: 514 - 21, který se zahrnuje odkazem).
b) Syntéza tolerogenních peptidů
Byla provedena chemická syntéza tří tolerogenních peptidů βlaktoglobulinu (BLG) T6, T17 a T6/T17 identifikovaných ve výše uvedeném odkazu a kontrolního peptidu T13, s obklopujícími zbytky ze sekvence BLG a jedním zbytkem Cys navíc, jak je ukázáno níže:
T6 CFKIDALNENKVSR
91
TI7 CNKVLVLDTDYKKYS
100
T6/T17
C F ΚIDALNENKVLVLD TD Y KK Y S
100
TI3 LIVTOTMKSRC
8
c) Testování na zvířatech
Pro hodnocení tolerogenních vlastností různých peptidů byly použity samice myší Balb/c získaných od firmy IFFA-Crédo (L’Abresle, Francie). Zvířata byla množena a chována na nemléčné dietě. Na počátku experimentů byly myši staré 3 týdny. Žaludeční sondou dostávaly nativní β-laktoglobulin (5 mg/g tělesné hmotnosti), různá množství štěpeného β-laktoglobulinu a různá množství různých peptidů • 0 · 0 ·
získaných v odstavci a) výše. Kontrolní myši dostávaly fyziologický roztok. Po 5 dnech na této dietě byly všechny myši imunizovány βlaktoglobulinem a ovalbuminem (jakost V, Sigma) jako nepříbuzným antigenem pro hodnocení specificity imunitní odpovědi. Hodnocení hypersenzitivity opožděného typu (DTH) bylo provedeno 21 dnů po systémovém podání porovnáním tloušťky levé zadní tlapky před a po imunizaci. 24 hod po imunizaci byla měřena tloušťka tlapky zvířat (vyjádřená jako Δ tloušťky (mm)). Potom byla všem myším odebrána krev a potom sleziny, které byly spojeny podle příslušnosti k jednotlivým skupinám. Pro každou skupinu byly provedeny testy proliferace specifické pro splenocyty. Individuálně byl odebírán střevní obsah. Sérum a střevní vzorky byly jednotlivě zamraženy při -80 °C až do provedení testů. Ve vzorcích séra i střevního obsahu byly zjišťovány hladiny IgE proti β-laktoglobulinu a IgE proti ovalbuminu.
d) Stanovení protilátek IgE
Sérum a střevní tekutiny byly zředěny a testovány v duplikátech na protilátky IgE proti β-laktoglobulinu a ovalbuminu testem ELISA. Jako negativní kontroly byly použity spojené vzorky z 20 neimunizovaných myší. Titry byly zjišťovány výpočtem zředění vzorku, který poskytl dvojnásobek absorbance negativní kontroly. Titry byly vyjádřeny jako log 10 převrácené hodnoty zředění.
e) Buněčné kultury
Roztoky slezinných buněk byly homogenizovány v PBS a vyčištěny. Buňky byly společně pěstovány v přítomnosti βlaktoglobulinu nebo fytohemaglutininu A. V průběhu posledních šesti hodin kultivace byl přidán tritiovaný thymidin ([3H]-Thy (Amersham, Zurich) a destičky byly sklizeny a analyzovány scintilačním čítáním. Projevy stimulace byly počítány jako poměr exprimovaných hladin • · · ·
- 14 • · ·►···· • · · · · · • ····»· · · • · · · · · ··· · ·· ·· testovacího vzorku a kontroly s odečtenou hladinou blanku vyjádřený jako střední cpm inkorporovaného [3H]-Thy, přičemž kultivace se prováděly v triplikátech.
f) Tolerance indukovaná orálním podáváním syntetických peptidů
Syntetické peptidy byly analyzovány na svou tolerogenní kapacitu v parenterálním myším modelu. Byly získány následující výsledky;
Titr IgE (log) (test/kontrola) SI slezinných lymfocytů (test/kontrola) SI MLN lymfocytů (test/kontrola)
T-6 3,24/3,39 0,53 0,29
T-17 2,67/3,39 0,31 0,41
T-6/T-17 3,40/3,39 0,92 0,81
T-13 3,20/3,39 1,70 0,87
SI; Index stimulace
MLN: Mezenterická lymfatická uzlina
Je zřejmé, že syntetický peptid T-17 snížil jak produkci IgE, tak i proliferaci T-buněk, zatímco peptid T-6 potlačil pouze odpověď Tbuněk. Naopak peptid T-13, což je kontrolní peptid, neindukoval orální toleranci na BLG.
Příklad 2
Konstrukce rekombinantního polypeptidů
Peptidy T6 a T17 identifikované v příkladu 1 jako peptidy 2o s tolerogenními vlastnostmi byly fúzovány s proteázou zakotvenou v buněčném povrchu, aby mohly být předloženy na povrchu bakterie.
Jako negativní kontrola byl použit peptid T13 tvořící část N-konce βlaktoglobulinu.
Proteáza ukotvená na buněčném povrchu (výše) pocházela z Lactobacillus bulgaricus, jehož sekvence byla publikována autory
Gilbert a další (1996) J. Bacteriol., 178, 3059 - 3065. Tento protein byl charakterizován jako protein o délce 2000 aminokyselin, složený z úvodního peptidu o délce 33 aminokyselin (oblast pre), odpovědný za export enzymu buňkou, a následné řady 154 aminokyselin (oblast pro), která je odpovědná po rozštěpení za aktivaci proteolytické io aktivity enzymu, a 700 až 800 aminokyselin aktivního místa. Následná oblast (přibližně 1000 aminokyselin) má pravděpodobně úlohu ve specificitě štěpení a transportu vytvořených peptidů v buňce, a také zasahuje do buněčné stěny. Proteáza je k buněčné stěně ukotvená karboxylovým koncem, přičemž za specifickou kovalentní vazbu ke struktuře peptidoglykanu buněčné stěny je odpovědných alespoň 200 aminokyselin.
Proteázový gen byl nejprve amplifikován se svým promotorem použitím následujících dvou primerů:
5'-TTTTGTGGATCCTTAACTTCATAGCACG-3' (proti směru transkripce vzhledem k promotoru genu, nese místo BamHl)
5'-ATATTATCTAGAATTGAATAGATTGCC-3' (ve směru transkripce vzhledem k ro-independentnímu terminátoru genu, nese místo Xbal)
Produkt amplifikace byl štěpen BamHl a Xbal a byl klonován do věktoru bakterie mléčného kvašení pNZ124, který byl štěpen stejnými restrikčními enzymy, a konstrukt byl případně zaveden elektroporaci do bezplasmidového (beta-galaktosidáza a proteáza - negativního) Lactococcus lactis.
• · • · · ·
- 16 • · · « · · · • · * · · *
Oblast aktivního místa klonované proteázy byla nahrazena sekvencí sledovaného peptidu/polypeptidu. K tomu účelu byla klonovaná proteáza štěpena enzymem Nhel, kde štěpicí místo je umístěno 50 bp ve směru transkripce vzhledem k sekvenci štěpícího místa úvodního peptidu, a Pvul, 800 bp dále ve směru transkripce. Sekvence DNA kódující sledované peptidy (až do 10 aminokyselin) byla vložena mezi dvě restrikční místa jako dva oligonukleotidy, které byly navrženy tak, aby vytvořily na svých koncích dvě restrikční místa, jakmile dojde k hybridizaci. Návrh oligonukleotidu bere v úvahu, že po navázání na proteázový gen zůstane čtecí rámec rekombinantního proteinu otevřený.
Vložení většího z polypeptidů bylo provedeno amplifikací DNA s použitím primerů obsahujících dvě restrikční místa. Amplifikační produkt byl štěpen restrikčními enzymy. V obou případech byly fragmenty DNA ligovány do proteázového genu a elektroporací zavedeny do Lactococcus lactis a Lactobacillus johnsonii.
Rekombinantní plasmidové konstrukty obsahující peptidy T6, popř. T17, byly uloženy 22. září 2000 podle Budapešťské úmluvy v Institute Pasteur, pod depozitními čísly CNCM I-2563 a CNCM I-2564.
Příklad 3
Transformace Lactococcus lactis a Lactobacillus johnsonii
Pro účely transformace byly pěstovány kmeny Lactococcus lactis (MG1363, bezplasmidový) a Lactobacillus johnsonii kmen Lal (dostupný u Institute Pasteur pod depozitním číslem CNCM 1-1225) přes noc v médiu MRS při 37 °C v anaerobním systému GasPak. Alikvot této kultury byl použit pro zaočkování další kultivační půdy (MRS) s obsahem 0,5 M sacharózy. Po dalším novém zaočkování na poměr 2 % do 200 ml MRS + 0,5M sacharózy byla kultura pěstována na OD595 0,6. Buňky byly odděleny centrifugací při 5000 ot/min při
- 17 • · °C 10 min, centrifugát byl jednou promyt 1/2 objemu roztoku obsahujícího 1M sacharózu a 2,5 mM Cal2, jednou 1/4 objemu roztoku obsahujícího 1M sacharózu, 2,5 mM CaCI2) a získaný centrifugát byl resuspendován v 3,5 ml roztoku 1M sacharózy, 2,5 mM CaCI2 + 0,459 ml 87 % glycerolu (10 % konečná koncentrace). Buňky byly buď přímo použity pro transformaci nebo zamraženy při -80 °C.
Pro elektroporaci bylo 40 pl buněk smícháno s 10 až 100 ng DNA (v objemu <5 μΙ) a převedeny do ledové elektroporační kyvety 0,2 cm. Byly použity pulsy při impedanci 200 Ω, 25 pF, 2,5 kV v ledově chladné 0,2 cm elektroporační kyvetě. Do kyvety byl přidán 1 ml roztoku MRS + 20 mM MgCI2, 2 mM CaCI2 a suspenze byla inkubována 2 až 3 hod při vhodné teplotě (při 30 °C pro Lactococcus lactis a 37 °C pro Lactobacillus johnsoniř, jestliže se používají plasmidy ts (pG+host9), inkubuje se při 30 °C). Po transformaci plasmidovou DNA byly alikvoty 10 μΙ a 100 μΙ vysety na agarové plotny MRS obsahující vhodné antibiotikum; po transformaci ligační směsí byly použity alikvoty 100 μΙ a 500 μΙ. Plotny byly inkubovány anaerobně 24 až 48 hod při stejné teplotě jako výše.
Jako selekční médium bylo použito MRS s erythromycinem (2,5 pg/ml) nebo MRS s kanamycinem (5 pg/ml).
Příklad 4
Vytvoření krysího antiséra a monoklonálních protilátek proti tolerogenním peptidům BLG
Peptidy BLG T6, T17, T6/T17 a T13 (ukázané v příkladu 1) byly navázány na KLH aktivovanou maleimidem a byly použity společně s adjuvans Titermax pro imunizaci krys krmených dietou prostou mléčných proteinů. Metodou ELISA bylo ukázáno, že vzorky krve odebírané v intervalech 2 týdnů až 115 dnů po první imunizaci obsahují protilátky specifické pro peptidy BLG.
- 18 • « · · ···· • · · · · » ···»·· * ··· · . • · · · · ···· • ·· ·· · « · ·
Antiséra ani-T6 a anti-T13 rovněž reagovala jak s nativní (ELISA) nebo denaturovanou (SDS PAGE + westernový přenos) formou BLG. Bylo ukázáno, že anti-T6 a anti-T17 specificky rozpoznávají peptidy BLG exprimováné na povrchu rekombinantního L.
lactís. Výsledky jsou ukázány v tabulce I.
Tabulka I
Reaktivita antisér proti β-laktoglobulinovým peptidům
Antisérum specifické pro T6 T17 T6/17 T13
Číslo krysy A1 A2 A3 B4 B5 B6 C7 C8 C9 D10 D11 D12
T6 (ELISA) +++ ± + - NT NT - NT NT - NT NT
T17(ELISA) - NT NT + - - +++ NT NT - NT NT
T6/17 (ELISA) +++ NT NT NT NT +++ + - - NT NT
T13 (ELISA) - NT NT - NT NT - NT NT + ±
Nat. BLG (ELISA) +++ ± +++ + - - - - - + + +
Den. BLG (SDS- PAGE+WB) +++ NT ++ - NT NT - NT NT ± +++ ++
LI/T6 (ELISA) + +++ - NT NT - - - - NT NT
LI/T17 (ELISA) - NT NT + - - - - - - NT NT
LI/T13 (ELISA) - NT NT - NT NT - NT NT - - -
ELISA/OD 490 nm (15 min/37 °C) +++ >0,3 ++ 0,2 - 0,3
0,1 - 0,2 ± 0,05-0,1
- <0,1
NT nebylo testováno nat. BLG 3 x krystalizovaný BLG (Sigma) rozpuštěný v PBS
- 19 den. BLG 3 x krystalizovaný BLG (Sigma) rozpuštěný a povařený ve vzorkovacím pufru SDS
Ll/T rekombinantní Lactococcus lactis nesoucí proteinázu
Lactobacillus bulgaricus s peptidovým inzertem BLG
Pro produkci hybridomů sekrenujících monoklonální protilátky proti peptidu BLG byly z imunizovaných krys izolovány sleziny. Slezinné buňky byly fúzovány s myelomovými buňkami standardními způsoby a již první cyklus screeningu umožnil identifikaci populací buněk produkující protilátky buď anti-T6 nebo anti-T17. Klonování těchto buněk bylo provedeno použitím sorteru buněk, aby byla zajištěna přítomnost pouze jediné buňky v jamce.
Příklad 5
Detekce tolerogenních peptidů protilátkami
Pro zjištění, zda bakterie mléčného kvašení exprimuje tolerogenní peptidy takovým způsobem, aby byly dostupné a rozpoznatelné protilátkami, byly bakterie obsahující rekombinantní gen pěstovány v 50 ml kultuře a buňky byly odděleny centrifugací. Buňky byly potom dvakrát promyty 50 ml TBS a popřípadě suspendovány v 6 ml TBS. 75 pl suspenze bylo převedeno do jamky (typu half well flat-bottom ELISA) a destičky byly ponechány bez víčka 24 hod při 37 °C tak, že jamky vyschly. Destičky byly promyty třikrát směsí TBS/PBS až do odmytí nenavázaných bakterií a jamky byly potom blokovány směsí TBS-kasein (1,5 g/l) 2 hod při 37 °C. Do jamek bylo přidáno krysí antisérum obsahující protilátky proti specifickým peptidům. Jamky byly inkubovány přes noc při laboratorní teplotě s použitím ředění TBS-kasein s obsahem 0,2 % Tween 20. Potom byly jamky třikrát promyty TBS a byly přidány vyvíjecí protilátky (kozí protilátka proti krysímu IgG konjugovaná s HRP) a jamky byly
inkubovány při 37 °C při zředění roztokem TBS-kasein s obsahem 0,2% Tween 20. Jamky byly třikrát promyty TBS a vyvíjeny OPD/H2O2 a odečítány při 490 nm.
Bylo možno pozorovat, že oba kmeny Lactococcus lactis a Lactobacillus johnsonii měly pozitivní reakci, což ukazuje, že tolerogenní peptid je rozpoznáván protilátkami.
Příklad 6
Příprava králičího antiséra proti aminokyselinovým zbytkům 472-659 proteinázy prtB L. bulgaricus
Cílová sekvence prtB (bp 1414-1977) kódující aminokyselinové zbytky 472-659 (první aminokyselina je iniciační methionin) byla amplifikována PCR použitím pMD114jako templátu a primeru proti směru exprese (prtB5’-1414) sekvence
5'-GCGGATCCGGCTTGGGCGGTGCAGATG-3' (obsahující štěpící místo 5’-BamHI), a primeru po směru exprese (prtB3’-1977) sekvence
5'-CGCAAGCTTGTGCGAAGTGTTCATGGC-3' (obsahující místo 5’-HindlII).
Specifický produkt PCR byl získán použitím Taq DNA polymerázy (Perkin-Elmer) s použitím tří cyklů obsahujících krok denaturace při 95 °C 30 s, krok teplotní hybridizace primeru při 56 °C 30 s a krok prodlužování při 72 °C 45 s, a následujících 27 cyklů s krokem teplotní hybridizace prováděných při 60 °C.
Po odsolení a odstranění primerů a dNTPs (High Pure PCR Product Purification Kit, Roche) byl vzorek štěpen BamHI a HindlII, potom byla provedena elektroforéza na agarózovém gelu a požadované pruhy DNA byly z gelu vyříznuty (E. Z. N. A. Gel Extraction Kit, Peqlab).
• · · ·
Vyčištěný produkt amplifikace byl vložen mezi místa BamHI a Hindlll expresního vektoru pQE-9 E. coli (Qiagen) ve směru exprese vzhledem k sekvenci kódující šestihistidinovou značku.
Tímto vektorem byl transformován kmen E. coli M15 [pREP4] a 5 indukcí kultury použitím 1 mM IPTG bylo dosaženo exprese heterologního proteinu.
Buňky z jednolitrové kultury byly zcentrifugovány a lyžovány za denaturujících podmínek (8M močovina). Vyčeřený lyzát byl získán centrifugací a byl nanesen na agarózové kuličky Ni2+-NTA (Qiagen), ekvilibrované při pH 8,0, což umožnilo vazbu proteinu s šestihistidinovou značkou. Po kroku promytí při pH 6,3 byl rekombinantní protein eluován při pH 4,5.
Materiál byl neutralizován 100 mM Tris-CI (pH 7,5), množství bylo zjištěno testem na proteiny s kyselinou bicinchoninovou (Pierce) a koncentrace byla nastavena na 1 mg/ml s použitím stejného pufru.
Antigen byl emulgován v kompletním Freundovu adjuvans a podán vícenásobnou intradermální injekcí dvěma králíkům. Injekce byly prováděny ve dnech 0, 14, 28 a 56. Krev byla nakonec odebrána v den 80.
Reaktivita antiséra, která byla překvapivě vysoká, byla potvrzena metodou ELISA, na rekombinantním Lc exprimujícím na buněčném povrchu proteinázu prtB L. bulgaricus a imunologickým přenosem, u supernatantu z kultury rekombinantního Lc exprimujícího sekrenovanou formu proteinázy.
- 22 Doklad o uložení rekombinantních plasmidovych konstruktů podle
Budapešťské dohody
Originál (for SUBMISSION) - printed on 21.092001 03:55:36 PM
0-1- Form - PCT/RO/134 (EASY) Indications Relating to Deposited Microorganism(s) or Other Biological
Materiál (PCT Rule 13bis)
0-1-1 Prepared using PCT-EASY Version 2.92 (updated 01.03.2001) -
0-2 International Application No.
0-3 Applicanťs or agenťs filé reference 80263 WO
1 1-1 1-2 The indications made below relate to the deposited mícroorganism(s) or other biological materiál referred to in tiie description on: page line 13 15
1-3 1-3-1 1-3-2 1-3-3 1-3-4 Identification of Deposit Name of depositary institution Address of depositary institution Dáte of deposit Accession Number Collection nationale de cultures de micro-organisměs Institut Pasteur, 28, rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15, France 22 September 2000 (22.09.2000) CNCM 1-2564
1-4 Additional Indications ΝΟΝΕ
1-5 Designated States for Which Indications are Made all designated States
1-6 Separate Fumishing of Indications These indications will be submitted to the International Bureau láteř ΝΟΝΕ
2 2-1 2-2 The indications made below relate to the deposited microorganism(s) oř other biological materiál referred to in the description on: page line 13 15
2-3 2-3-1 2-3-2 2-3-3 2-3-4 Identification of Deposit Name of depositary institution Address of depositary institution Dáte of deposit Accession Number Collection nationale de cultures de micro-organisne s Institut Pasteur, 28, rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15, France 22 September 2000 (22.09.2000) CNCM 1-2563
2-4 Additional Indications ΝΟΝΕ
2-5 Designated States for Which Indications are Made all designated States
2-6 Separate Fumishing of Indications These Indications wlil be submitted to the International Bureau láteř ΝΟΝΕ
-23 • *
Originál (for SUBMISSION) - prinled on 21.09.2001 03:55:36 PM
FOR RECEMNG OFFICE USE ONLY
0-5 This form was received by the intemational Bureau on:
0-5-1 Authorized ořficer
Zastupuje:
• · · · · • · · · · ·
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (12)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Kmen bakterií mléčného kvašení exprimující na buněčném povrchu zakotvenou proteázu Lactobacillus bulgaricus, kde tato proteáza Lactobacillus bulgaricus zakotvená na povrchu obsahuje tolerogenní peptid, který je heterologní vzhledem k této proteáze Lactobacillus bulgaricus zakotvené na povrchu tak, že peptid je stabilizován proti degradaci žaludečními/dvanáctníkovými enzymy, zachovává si své tolerogenní vlastnosti a je předkládán na periferní části proteázy Lactobacillus bulgaricus zakotvené na povrchu.
  2. 2. Kmen bakterií podle nároku 1, který je zvolený z rodu Lactobacillus nebo Bifidobacterium.
  3. 3. Kmen bakterií podle některého z předcházejících nároků, kde tolerogenní peptid je odvozený z potravinářského materiálu.
  4. 4. Potravinářský výrobek, vyznačující se tím, ž e obsahuje kmen bakterií podle některého z předcházejících nároků, nebo jeho supernatant.
  5. 5. Potravinářský výrobek podle nároku 4, vyznačující se tím, že je zvolený ze skupiny mléka, jogurtu, tvarohu, sýra, kvašených mlék, kvašených produktů na bázi mléka, zmrzliny, výrobků na bázi kvašených cereálií, práškových mléčných výrobků, výrobků pro děti nebo krmiv pro domácí zvířata.
  6. 6. Potravinářský výrobek podle některého z nároků 4 nebo 5, vyznačující se tím, že kmen bakterií je obsažený v tomto výrobku v množství od 107 do 1011
    5 cfu/dávkovou formu.
  7. 7. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje kmen bakterií podle některého z nároků 1 nebo 3, nebo jeho supernatant.
  8. 8. Farmaceutický prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že kmen bakterií je v něm obsažen v množství od 101° do 1012 cfu/dávkovou formu.
    15
  9. 9. Použití kmene bakterií podle některého z nároků 1 až 3, nebo jeho supernatantu, pro výrobu poživatelného nosiče pro léčení alergie.
  10. 10. Použití potravinářského výrobku nebo farmaceutického
    20 prostředku podle některého z nároků 1 až 8 pro výrobu poživatelného nosiče pro léčení alergie.
  11. 11. Použití podle nároku 10, kde prostředek je podáván orální nebo nazální cestou.
  12. 12. Vakcina, vyznačující se tím, že obsahuje kmen bakterií podle některého z nároků 1 až 3, nebo jeho části.
    - 26 13. Vakcina podle nároku 12, vyznačující se tím, že se použije frakce buněčné membrány lyžované bakterie.
    Zastupuje:
    U2
    HiJ
    HN-A-L-K-COCH
    Η,Ν-1-I-A'E-K-COOH
    Peptid T2 h,n-H-I-R-cooh Peptid T3 η,ν-Έ-D-K-cooh (146-148) (136-138)
    Peptid T5 k^E-N-G-E-C-A-Q-K-cock (62-69) η,ν-1-D-A-L-N-E-N-K-coch
    H,N-A-L -P-M-COCH
    Peptid T7 β,ν-G-L-D-I-Q-K-coch (9-14)
    Peptid T9.T1O,T11 h,n-W-E-N-G-E-C-A,-Q,-K,-cooh (61-67,-68,-69)
    Peptid TI (139-141)
    Peptid. T4 5 (71-75)
    Peptid T6 (84-91)
    10 Peptid. T8 (142-145)
    Peptid T12 η,η-T-P-E-V-D-D-E-A-L-E-K-cooh (125-135)
    Peptid T14 η,ν-A-L-P-M-H-TR-cooh (142-148) = T8 (142-145) + 72 (146-148)
    Peptid TI6 k^-V-A-G-T-W-Y-cooh 20 (15-20)
    Peptid TI3 - k^-L-I-V-T-Q-T-M-K-cooh (1-8)
    Peptid Τ15 η,ν-1-P-A-V-F-K-cooh (78-82)
    Peptid T17 h,h-V-L-V-L-D-T-D-Y-K,-K-cooh (92-99,100)
    Peptid TI 8 iw-T-P-E-V-D-D-E-A-L-E-K-F-D-K-cOoa (125-138) = 712 (125-135)+73 (136-138)
    25 Peptid TI9 h.n-A-A-S-D-1-S-L-L-D-A-Q-S-A-P-L-R-cooh (25-40)
    Peptid T20, T21 h^-W,-E-N-G-E-C-A-Q-K-«ch (61,62-69):S-S:(149-162) I
    30 h^-L-S-F-N-P-T-Q-L-E-E-Q-C-H-I-cooh
    Peptid T22 η,ν-S-L-A-M-A-A-S-D-I-S-L-L-D-A-Q-S-A-P-L-R-cooh (21-40)
    35 Peptid T23 η,ν-V-Y-V-E-E-L-K-P-T-P-E-G-D-L-E-í-L-L-Q-K-cock (41-60)
    Peptid T24 ^-L-S-F-N-P-T-Q-L-E-E-Q-C-H-I-cooh (149-162)
    Obr. 1
    Skupiny indukce orální tolerance
    Obr. 2
    -<
    • · · · · » · · « ······ · • · · ♦ « «·
    Výpis sekvencí <110>·Société Des Produits Nestlé S. A.
    <120> Lactic acid bacteria capable of reducing an individual's tendency to develop allergic reactions <130> 80263 <140> PCT/EP01/10956 <141> 2001-09-21 <150> EP 00120867.7 <151> 2000-09-25 <160> 29 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> bovine <400> 1
    Ile Ile Ala Glu Lys 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> bovine <400> 2
    Giu Asn Gly Glu Cys Ala Gin Lys 1 5 <2I0> 3 <211> 8
CZ2003749A 2000-09-25 2001-09-21 Kmen bakterií mléčného kvašení, potravinářský výrobek, farmaceutický prostředek a vakcína CZ2003749A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP00120867 2000-09-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2003749A3 true CZ2003749A3 (cs) 2003-06-18

Family

ID=8169939

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2003749A CZ2003749A3 (cs) 2000-09-25 2001-09-21 Kmen bakterií mléčného kvašení, potravinářský výrobek, farmaceutický prostředek a vakcína

Country Status (21)

Country Link
US (1) US7498162B2 (cs)
EP (1) EP1379635A2 (cs)
JP (1) JP2004514424A (cs)
KR (1) KR20030034178A (cs)
CN (1) CN1246456C (cs)
AR (1) AR033574A1 (cs)
AU (2) AU2002220561B2 (cs)
BG (1) BG107657A (cs)
BR (1) BR0114105A (cs)
CA (1) CA2420160A1 (cs)
CZ (1) CZ2003749A3 (cs)
HU (1) HUP0302585A3 (cs)
IL (1) IL154284A0 (cs)
MX (1) MXPA03001673A (cs)
NO (1) NO20031159L (cs)
NZ (1) NZ524527A (cs)
PL (1) PL365246A1 (cs)
RU (1) RU2294366C2 (cs)
SK (1) SK3642003A3 (cs)
WO (1) WO2002024883A2 (cs)
ZA (1) ZA200301244B (cs)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1239032A1 (en) * 2001-03-02 2002-09-11 Société des Produits Nestlé S.A. Lactic acid bacteria as agents for treating and preventing allergy
EP1319410A1 (en) * 2001-12-11 2003-06-18 Société des Produits Nestlé S.A. Use of micro-organisms for a directed delivery of substances to specific parts of the gut
WO2004112773A1 (fr) * 2003-04-24 2004-12-29 Shin-Jen Shiao Compositions pharmaceutiques utilisees pour le traitement de maladie immune et amelioration
US8877178B2 (en) 2003-12-19 2014-11-04 The Iams Company Methods of use of probiotic bifidobacteria for companion animals
US20050158294A1 (en) 2003-12-19 2005-07-21 The Procter & Gamble Company Canine probiotic Bifidobacteria pseudolongum
KR20070089231A (ko) * 2004-12-14 2007-08-30 알크-아벨로 에이/에스 이종 단백질성 화합물을 제시하는 박테리아 세포를포함하는 약제학적 조성물
WO2006097949A1 (en) * 2005-03-16 2006-09-21 Actial Farmacêutica, Lda. Mixture of at least 6 species of lactic acid bacteria and/or bifidobacteria in the manufacture of sourdough
CA2609617C (en) 2005-05-31 2014-07-08 The Iams Company Feline probiotic lactobacilli
BRPI0611492B1 (pt) 2005-05-31 2021-10-13 Mars, Incorporated Bifidobactéria probiótica felina
US20100233318A1 (en) * 2006-03-31 2010-09-16 Luppo Edens Process for the hydrolysis of milk proteins
PL2124966T3 (pl) 2007-02-01 2016-01-29 Iams Europe B V Sposób zmniejszania reakcji zapalnej i stresu u ssaków za pomocą antymetabolitów glukozy, awokado lub ekstraktów awokado
US9771199B2 (en) * 2008-07-07 2017-09-26 Mars, Incorporated Probiotic supplement, process for making, and packaging
US9232813B2 (en) * 2008-07-07 2016-01-12 The Iams Company Probiotic supplement, process for making, and packaging
CN104782760A (zh) * 2009-01-27 2015-07-22 阿拉食品公司 长保质期的乳和乳相关产品
MX336030B (es) * 2009-05-11 2016-01-07 Nestec Sa Lactobacillus johnsonii la1 mcc533 (cncm i-1225) y padecimientos inmunes.
US10104903B2 (en) 2009-07-31 2018-10-23 Mars, Incorporated Animal food and its appearance
EP3097791B1 (en) * 2010-06-04 2018-05-16 N.V. Nutricia Non-digestible oligosaccharides for oral induction of tolerance against dietary proteins
CN106918709B (zh) * 2011-09-02 2020-03-10 Dh科技发展私人贸易有限公司 检测过敏原的系统和方法
WO2013083140A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 N.V. Nutricia Beta-lactoglobulin peptides for treating cow's milk protein allergy
WO2016148562A1 (en) * 2015-03-18 2016-09-22 N.V. Nutricia Method for inducing oral tolerance via administration of beta-lactoglobulin derived peptide in combination with probiotic
CN105362296A (zh) * 2015-11-27 2016-03-02 成都吉氧屋科技有限公司 乳酸菌洗鼻液
WO2019212329A1 (en) * 2018-04-30 2019-11-07 N.V. Nutricia Formula with specific beta-lactoglobulin peptides
WO2019212330A1 (en) * 2018-04-30 2019-11-07 N.V. Nutricia Formula with a specific beta-lactoglobulin peptide
CN114149486B (zh) * 2021-05-28 2023-05-12 中国科学院大连化学物理研究所 一种抗菌肽mamp-01及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9302855D0 (sv) * 1993-09-06 1993-09-06 Martin Lindberg Method and means for producing plasmaproteinase inhibitor binding proteins
US5817308A (en) 1994-02-14 1998-10-06 University Of Rochester Tolerogenic fusion proteins of immunoglobulins and methods for inducing and maintaining tolerance
AU2149495A (en) * 1995-04-11 1996-10-30 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast- Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Method for the construction of vectors for lactic acid bacte ria like lactobacillus such that the bacteria can efficientl y express, secrete and display proteins at the surface
FI104465B (fi) 1995-06-14 2000-02-15 Valio Oy Proteiinihydrolysaatteja allergioiden hoitamiseksi tai estämiseksi, niiden valmistus ja käyttö
GB9518323D0 (en) 1995-09-07 1995-11-08 Steidler Lothar Materials and methods relating to the attachment and display of substances on cell surfaces
US6100388A (en) * 1998-03-16 2000-08-08 Biogaia Biologies Ab Lactobacilli harboring aggregation gene as a vaccine delivery vehicle
MY129566A (en) 1999-01-19 2007-04-30 Nestle Sa A hypoallergenic composition containing tolerogenic peptides inducing oral tolerance

Also Published As

Publication number Publication date
NO20031159L (no) 2003-05-20
HUP0302585A2 (hu) 2003-10-28
JP2004514424A (ja) 2004-05-20
HUP0302585A3 (en) 2007-05-02
US20040071714A1 (en) 2004-04-15
AR033574A1 (es) 2003-12-26
IL154284A0 (en) 2003-09-17
US7498162B2 (en) 2009-03-03
NZ524527A (en) 2005-05-27
AU2002220561C1 (en) 2002-04-02
KR20030034178A (ko) 2003-05-01
EP1379635A2 (en) 2004-01-14
AU2056102A (en) 2002-04-02
SK3642003A3 (en) 2003-08-05
WO2002024883A2 (en) 2002-03-28
ZA200301244B (en) 2004-05-14
AU2002220561B2 (en) 2007-01-11
RU2294366C2 (ru) 2007-02-27
BG107657A (bg) 2003-12-31
PL365246A1 (en) 2004-12-27
CN1479788A (zh) 2004-03-03
BR0114105A (pt) 2003-07-29
WO2002024883A3 (en) 2003-11-06
NO20031159D0 (no) 2003-03-13
MXPA03001673A (es) 2003-06-09
CN1246456C (zh) 2006-03-22
CA2420160A1 (en) 2002-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ2003749A3 (cs) Kmen bakterií mléčného kvašení, potravinářský výrobek, farmaceutický prostředek a vakcína
AU2002220561A1 (en) Lactic acid bacteria capable of reducing an individual&#39;s tendency to develop allergic reactions
Ouwehand et al. Probiotics: an overview of beneficial effects
Prioult et al. Stimulation of interleukin-10 production by acidic β-lactoglobulin-derived peptides hydrolyzed with Lactobacillus paracasei NCC2461 peptidases
AU2002256639B2 (en) Lactic acid bacteria as agents for treating and preventing allergy
SA08290392B1 (ar) سلالة جديدة من البكتيريا الشقية وببتيدات فعالة ضد الإصابة بالفيروس العجلي
EP2391641B1 (en) Lactobacillus rhamnosus pili and pilus polypeptides
AU2002256639A1 (en) Lactic acid bacteria as agents for treating and preventing allergy
Collins et al. A randomised controlled trial of a probiotic Lactobacillus strain in healthy adults: assessment of its delivery, transit and influence on microbial flora and enteric immunity
Havenith et al. Gut-associated lactobacilli for oral immunisation
De Ambrosini et al. Immunostimulating activity of cell walls from lactic acid bacteria and related species
US8445426B2 (en) Peptides and methods for producing them
JP6376417B2 (ja) 腸管における物質取り込み促進剤
Deng et al. Construction and expression of a recombinant plasmid containing the porcine epidemic diarrhea virus S1 gene delivered by Lactobacillus
Kiseleva et al. METHODOLOGICAL APOPROACH EXEMPLIFIED BY LACTOCOCCI: OPTIMIZATION OF BIOTECHNOLOGICAL PROCESSES BY MEANS OF ELISA VIA LOCALIZATION OF THE TARGET BIOPOLYMER AND SELECTION OF DURATION OF CULTURE GROWTH AND MEDIA COMPOSITION PROVIDING MAXIMUM YEALD
Kaya Molecular cloning, expression and characterization of bile salt hydrolase enzymes from Lactobacillus rhamnosus KPB7 and E9