KR20030034178A

KR20030034178A - 알레르기 반응을 발달시키는 개인의 경향을 감소시킬 수있는 젖산 박테리아

Info

Publication number: KR20030034178A
Application number: KR10-2003-7003576A
Authority: KR
Inventors: 제르몽쟈끄에두아르; 코르테시브레즈; 모에비아; 프릿슈로돌프
Original assignee: 소시에떼 데 프로듀이 네슬레 소시에떼아노님
Priority date: 2000-09-25
Filing date: 2001-09-21
Publication date: 2003-05-01
Also published as: CN1479788A; HUP0302585A3; AR033574A1; AU2002220561B2; MXPA03001673A; WO2002024883A3; NO20031159D0; ZA200301244B; US7498162B2; BR0114105A; US20040071714A1; WO2002024883A2; AU2002220561C1; CA2420160A1; JP2004514424A; IL154284A0; CZ2003749A3; NZ524527A; CN1246456C; EP1379635A2

Abstract

본 발명은 알레르기 반응을 일으키는 개인의 경향을 감소시킬 수 있는 신규한 종의 젖산 박테리아에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 면역허용원 펩티드를 포함하는 단백질을 발달시키는 젖산 박테리아 종의 발생 및 알레르기 반응을 일으키는 개인의 경향을 감소시키는 그 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 미생물 또는 그 활성 분획을 포함하는 음식 또는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

알레르기 반응을 발달시키는 개인의 경향을 감소시킬 수 있는 젖산 박테리아{LACTIC ACID BACTERIA CAPABLE OF REDUCING AN INDIVIDUAL'S TENDENCY TO DEVELOP ALLERGIC REACTIONS}

알레르기는 다양한 기질(알레르겐)에 대한 면역시스템의 부적절한 반응이다. 일반적으로, 개인들은 꽃가루 또는 음식물 같이 환경에서 정기적으로 마주치는 물질들에 대해 중요한 면역 반응을 일으키진 않으며, 상기 비 반응성은 주로 면역시스템 자체의 억제 기작 때문이라고 간주된다. 그러나, 손상된 조건에서는 면역시스템은 상기 억제 활성(의도된 내성)을 달성하지 못하여 알레르겐에 대해 특이 면역반응 - 알레르기 반응을 일으킨다. 알레르기 반응은 특정 세포(주로 비만 세포(Mast cell) 및 호염기성 과립백혈구)로부터 염증 중개자 히스타민, 류코트리엔 및 효소같은 생물학적으로 활성인 화합물의 주변 조직 및 혈관조직으로의 방출을 포함한다. 비만세포는 개인의 조직내에 분산되며, 호염기구는 혈관 시스템 내에서 순환한다. IgE 항체가 관여되는 일련의 사건이 발생하면 화합물/중개자들은 타겟 비만 세포로부터 방출되어 약리학적 반응을 일으킨다.

과거로부터 알레르기로부터 고통받는 개인들의 수가 증가하고 있는데, 이는 종종 예를들어 배기가스에 의해 야기된 대기오염의 증가의 탓이다. 또한, 단백질성 물질의 증가된 섭취가 상기 발현, 즉 음식 알레르기 발생의 증가의 탓으로 간주된다. 게다가, 선진국들에서 직면하는 미생물 감염에서의 결손이 아토피 질환의 또다른 가능한 원인으로 제안되고 있다.

음식 알레르기 및 약간의 종류의 음식 과민증은 매우 흔하다. 대다수의 질환의 개인들은 음식의 특정 성분에 과민증을 나타내는 것으로 나타났으며, 인구의 약 5 % 의 사람들이 의학적 주의를 요할 만큼 충분히 심각하게 섭취된 물질에 반응을 나타낸다.

최근 음식 과민증의 주된 원인이 신체에 의해 보통 배출되는 물질의 흡수(민감한 개인의 위장관에서의 흡수)에 있다는 증거가 제기되었다. 이러한 불량한 흡수는 소화 경로 조직의 결손으로 부터 유도되는 것으로 간주된다(Peters 등, Can. J. of Gastroenterol. 2, 127, 1988; Olaison 등, Scand. J. of Gastroenterol. 25, 321, 1990; Hollander 등, Ann. of Int. Med. 105, 883, 1986). 최근에 동정된 GI 관에 정렬한 상피세포의 항원 처리 및 제시 능력이 염증 및 알레르기 결과를 야기하는 부적절한 면역 반응의 촉발을 설명할 수 있을 것이다(Campbell 등, Immunol. Rev. 172, 315, 1999).

음식 알레르기의 표현은 신체내의 실제로 임의의 조직에 영향을 미칠 수 있다. 거대한 흡수 면적 때문에, 위장관이 해로운 물질의 주된 흡수 지역인 것 같다. 음식 알레르기의 많은 증후가 소화관 자체에 분명하나, 피부 및 기도를 포함하는 다른 조직에 영향을 미칠 수 있다.

공지 기술에서 다른 접근이 알레르기, 특히 음식 알레르기의 치료에 제안되었다.

한가지 그러한 접근은 알레르기 물질원 자체를 개질하여 알레르기 잠재성을 감소시키려한다. 이는 그러한 문제의 원인일 수 있는 음식 또는 구성성분 각각을 제한하거나 억제하는 것으로 성취될 수 있다. 문제는 종종 각 음식물중 특이 항원 물질(알레르겐)이 알려져 있지 않아 대부분의 경우 어떤 구성성분이 선택적으로 제거되어야 하는지가 불분명하다는 데 있다.

US 5,480,660 에 밀가루에서 30,000 Da 이하의 분자량의 단백질 및 50,000 Da 내지 70,000 Da 의 분자량의 단백질을 제거하거나 감소시킴으로서 밀에 알레르기를 갖는 환자에서 알레르기의 발병이 완화될 수 있다는 것이 보고되었다.

JP 11 046,721 에 음식물을 밀가루와 혼합하고 혼합물을 180 ℃ 에서 3 분 이상 굽는, 음식물을 함유하는 단백질의 알레르기성을 감소시키는 방법이 개시되어 있다.

US 4,293,571 에 저알레르기성 조성물의 제조가 개시되어 있는데, 여기서 단백질성 물질을 가수분해 처리하고, 잔류하는 가수분해되지 않은 단백질을 열처리로응고시키고, 응고된 물질 및 알레르겐을 구성하는 매크로펩티드를 제거하기 위해 초여과 단계를 수행한다.

US 5,039,532에 저알레르기성 음식물의 제조를 위한 또 다른 방법이 개시되어있는데, 유장 산물을 효소 가수분해 처리하는 것이다.

그러나, 음식물을 처리 또는 매일 음식에서 이를 제거하는 이러한 모든 방법은 통상 엄격한 제한 방법을 포함하는 음식 교정을 요구하고, 결과 삶의 질에 영향을 미치거나 개인의 기대 성장을 억제할 수 있기 때문에 결국 실용화되기 어려운 것이다.

음식 알레르기 및 음식 과민증의 치료의 다른 접근은 장의 완전성을 회복 및 유지시켜 음식 알레르겐을 필수적으로 통과시키지 않게 하는 것이다. 이러한 점에서, US 5,192,750는 점막이 음식 알레르겐의 통과에 대한 필요한 장벽을 형성하게 하고, 정상적 기능을 유지할 수 있게 하는 N-아세틸 글루코사민의 용도를 개시하고 있다.

알레르기 치료의 또다른 접근에 따라, 비만 세포 및 호염기성 세포의 촉발을 억제하는, IgE 분자에 대한 개인의 백신 접종이 제안되었다. 상기 목적을 위해, WO97/31948 은 알레르기 및 염증 반응의 조절에 관여하는 중개자의 방출에 관련된 면역글로블린인 IgE 분자, 3 차원적인 구조와 유사한 백신 접종을 위한 특이 펩티드를 제안하고 있다. 개인의 자가 면역 시스템은 결국 상기 IgE 분자에 관련된 항체를 형성하여 상기 IgE 면역글로블린을 제거하는 것으로 생각된다. 그러나, 상기 방법은 형성된 항체가 다른 면역글로블린 종류와의 교차반응성을 나타내어 개인의 자연방어 기작에 불리한 영향을 끼칠 수 있는 단점을 내포하고 있다.

미공개된 본 출원인의 특허출원 EP 99,200,130.5 에 또다른 방법이 개시되어 있다. 비알레르기성, 광범위하게 가수분해된 단백질 물질 및/또는 유리 아미노산 기초 및 각 알레르기성 단백질의 하나 이상의 면역허용원 펩티드를 함유하는 저알레르기성 조성물이 제안되었다. 이 조성물은 공지 기술에 비해 많은 장점이 있지만, 각 신규한 뱃치를 위해 새로 생산되어야 하는 면역허용원 펩티드를 수득하기가 여전히 곤란하다.

그러므로, 알레르기를 치료하기 위한 개선된 수단의 제공이 본 기술분야에서 요구되고있다.

본 발명은 알레르기 반응을 발달시키는 개인의 경향을 감소시킬 수 있는 신규한 젖산 박테리아 종에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 면역허용원(tolerogenic) 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 신규한 젖산 박테리아 종 및 알레르기 반응을 발달시키는 개인의 경향을 감소시키는 그 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 미생물 또는 그 활성 분획을 포함하는 음식 또는 약학 조성물에 관한 것이다.

도 1 은 β-락토글로블린 가수분해물의 각 분획에 포함된 펩티드의 일차 서열을 보여준다; 수직 선은 2 황화물 결합을 나타낸다;

도 2 는 다양한 실험에서 면역허용원 펩티드/펩티드 분획으로 수득된 결과를 보여준다.

본 발명의 목적은 그러므로 그러한 수단을 제공하는데 있다.

상기 목적은 알레르기 반응을 발달시키는 개인의 경향을 감소시킬 수 있는 신규한 젖산 박테리아 종을 제공함으로서 해결되었다. 신규한 젖산 박테리아는 특정 서열 및 가능하게는 면역허용원 펩티드의 배치가 유지되고, 안정성이 보존되고, 따라서 개인의 면역시스템에 의해 인지되고 가공될 수 있는 면역허용원 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 발현시킨다.

젖산 박테리아, 특히 락토바실리(Lactobacilli) 및 비피도박테리아(Bifidobacteria)가 그 내강 서식지를 떠남없이 면역시스템의 조절에 관여되는 메신저(시토킨)를 생산함으로써 면역시스템을 조절함이 밝혀졌다. 젖산 박테리아는 IL-8, TNF-α, MCP-1 및 GM-CSF 같은 항염증성 시토킨의 생산을유발하지 않고, 오히려 장 면역 항상성 및 상피 장벽 완전성(Planchon 등, J. Cell Physiol. 181, 55, 1999) 양자의 유지에 관하여 중요한 관련을 가지는 TGF-β(Blum 등, Antonie van Leeuwenhoek 76, 199, 1999)같은 염증 억제 시토킨의 생산을 촉발한다. 락토바실리 균등질의 경구 투여가 단핵세포의 미토겐 유도 증식에 일관적인 억제 효과를 발휘함이 알려졌다(Pessi 등, Appl. Environ. Microbiol. 65, 4725, 1999).

젖산 박테리아(LAB)는 염색체 융합 또는 에피솜 플라스미드 요소(예를 들어 Kuipers 등, Tibtech 15, 140, 1997 참고) 기재 외부 유전자의 발현을 허용하는 시스템으로 단백질 및 펩티드의 이종 (과)생산을 위해 사용된다. 또한, 젖산 박테리아는 점막 표면에 콜로니를 형성하는 잠재성을 가지며, 펩티도글리칸 분해에서 비롯된 무라밀 펩티드와 관련된 본질적인 보조성을 나타낸다.

또한, 특정 락토바실러스 종이 항원 특이 면역반응(특히 IgA 종에서)을 촉발시키는 것이 알려 졌다(Majamaa 등, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 20, 333, 1995). 항원에 복합된 인간 IgA의 보체 활성화 불능이 점막 표면 완전성의 유지에 중요할 수 있다. 이는 조직손상으로 점막 멤브레인 투과성을 향상시키는 면역학적 작용자의 방출 및 백혈구의 유입을 포함하는 지역 염증 반응을 억제할 수 있다. 또한, 이러한 면역 배제 메카니즘을 통해 IgA가 방관자 항원의 추가 흡착을 제한하여, IgE 및 IgG 아이소타입의 항체 매개 과민 반응을 폐기할 수 있다.

게다가, 락토바실리가 분리된 T-세포에 의해 IFN-감마의 생산을 증진시킴이 알려져있다(Halpern 등, Int. J. Immunother. 7. 205, 1991). 최근에 IFN-감마가 장 점막 비만 세포의 TNF-알파의 방출을 억제함이 알려져있다(Bissonnette 등, Int. Arch. Allergy Immunol. 107, 156, 1995). 증가된 IFN-감마 분비가 TNF-알파의 불리한 효과를 방지하고(Hernandez-Pando 등, Immunology, 82, 591, 1994), 그 결과 음식 알레르기와 관련된 투과 질환을 억제할 수 있다. 예를 들어, 아토피성 습진에서 항원의 흡취에 대한 장벽의 손상이 일반적 식이 및 환경 알레르겐에 대한 과장된 면역반응에 결정 요소일 수 있다.

본 발명에 이르게 한 광범위한 연구 동안, 본 발명자들은 젖산 박테리아의 유리한 특성과 면역허용원 펩티드를 조합하여 알레르기 반응에 대한 개인의 경향을 감소시키거나 최소화하는 강력한 시약을 제조하는 수단을 고안하였다.

본 발명에서 사용되는 젖산 박테리아는 바람직하게는 락토바실러스 그룹 또는 비피도박테리아 그룹 또는 락토코쿠스 그룹에 속하며, 또한 더욱 바람직하게는 인간 또는 동물기원의 모든L.acidophilus, L. johnsonii, L. gasseri, L. casei, L. paracasei또는L. reuteri각각의 군에서 얻어진다.

개인에서 알레르기를 야기하는 주어진 단백질에서 얻어지는 펩티드인 면역허용원 펩티드는 일반적으로 약 200 내지 6000 Da 의 크기를 가지며, 적어도 유래되는 단백질에 내성을 유도할 수 있는 펩티드이다. 또한, 내성은 또한 특이 면역허용원 펩티드에 의해 나타내어지는 것보다 동일한 항원 결정체를 가지는 임의의 물질에 유도될 것이다. 본 발명에 따라 이 펩티드는 재조합 수단에 의해 젖산 박테리아에서 합성된 폴리펩티드에 삽입되는데, 이 폴리 펩티드는 박테리아에 외생 또는 내생일 수 있다. 면역허용원 펩티드는 면역시스템에 의해 인지될 수 있도록 생성 재조합 폴리펩티드 표면에 발현되도록 삽입된다.

폴리펩티드는 당업계의 공지기술에 따라 젖산 박테리아에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 시판되는 벡터 pNZ124(Platteuw 등, Appl. Env. Microbiol. 60, 587, 1994), pGK12(Walke 등, FEMS Microbiol. 138, 233, 1996)또는 pG + host9(Maguin 등, J. Bacteriol 178, 931, 1996)이 에피솜성 발현을 위해 사용될 수 있다. 그러나, 염색체 통합의 우수한 안정성을 고려해 볼때, 이러한 방법이 각 폴리펩티드의 재조합 유전자 코딩에 바람직할 수 있다. 염색체로의 통합을 위해, 예를들어 젖산 박테리아로부터 수득되며 면역허용원 펩티드를 포함하고 내생 유전자를 교환한 재조합유전자를 사용하는 상동 재조합이 이용될 수 있다. 그러나, 숙주 염색체로의 재조합 유전자의 도입 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

폴리펩티드는 보통 세포내에 존재하도록 발현된 단백질일 수 있으나, 젖산 박테리아에 의해 분비된 폴리펩티드 또는 세포밖 부분에 위치하는 면역허용원 펩티드를 함유하는 부분을 가진 세포벽에 삽입된 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 사용되는 폴리펩티드의 예들은 pepN, pepX, 락테이트 디히드로제나아제 또는 β-갈락토시다아제, 또는 박테리오신 종류의 일원 또는 S-층 단백질 또는 세포벽 고정 프로테아제이다.

폴리펩티드의 특성은 면역시스템에 접근 가능하게 삽입된다면 중요하지 않다. 그러나, 일단 적당한 면역허용원 펩티드가 확인되면 면역허용원 펩티드를 그러한 지역에 위치시키는 것은 당업계에 주지된 기술이다. 결국, 당업자라면 면역허용원 펩티드를 삽입하는 폴리펩티드의 3 차원적 모델을 찾고, 상기 정보에근거하여 상응하는 재조합 단백질을 고안할 것이다.

바람직한 구현예에서, 재조합 폴리펩티드는 면역허용원 펩티드가 항상 주위에 존재하도록 분비되거나 박테리아의 세포벽에 배열된다.

면역허용원 폴리펩티드가 알레르기 반응을 야기하는 음식물에서 유래된다. 그러나, 그 아미노산 서열이 본래 단백질에서 발견된 것에 대응하는 것이 필수적이지 않으나, 필수적으로 동일한 아미노산 서열 및 가능하게는 출발 펩티드로서 3 차원적 구조를 가지는 임의의 펩티드 서열 또는 본질적으로 동일한 결과를 나타내는 유래 폴리펩티드(즉, 알레르기 반응 감소를 유도)가 주어진 목적을 위해 적당할 것이다.

예를 들어 β-락토글로블린, 소 혈청 알부민 또는 카세인 같은 면역허용원 폴리펩티드를 위한 바람직한 원료로서, 우유, 소자, 땅콩, 크러스타신, 물고기, 고기, 참깨 또는 유장이 언급될 수 있다.

면역허용원 펩티드를 동정하기 위해, 목적 알레르기성 재료를 먼저 약 10 내지 50 % 정도로 효소가수분해하고, 단백질 혼합물 내에 잔류 효소 활성을 예를 들어 열처리로 불활성화한다. 단백질 가수분해물 용액을 정화하고, 필요하다면 추가 정제한다. 이렇게 수득된 펩티드는 예를 들어 용액을 침전 처리 또는 크로마토그래피 칼럼을 통과시킴으로 분리된다.

그 후, 다른 펩티드를 함유하는 분획을 동물 모델으로 실험하여 그 면역허용 특성을 시험한다. 상기 목적을 위해, 생쥐와 같은 동물에 각 펩티드 분획을 복용시키고 그후 알레르겐으로 면역시키고 외부 외관에서의 변화 또는 동물내 IgE 수준의 특이적 측정으로 그 반응을 측정한다. 그 결과, 면역허용원 펩티드 분획이 알레르겐에 대해 반응하는 동물의 경향을 감소시키고, 각 펩티드(분획)이 결정될 것이다.

면역허용원 펩티드 및 그 아미노산 서열이 확인되면, 젖산 박테리아에서 발현되는 폴리페티드의 DNA 서열을 유전공학을 이용하여 박테리아 단백질 수송체를 코딩하는 유전자에 삽입한다. DNA 서열을 조작하고, 단백질을 미생물에서 발현하는 방법 및 기술은 문헌[Sambrook 등, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor, 1992]에 개시되어있다.

본 발명은 또한 상기 재조합 젖산 박테리아 중 하나 이상을 포함하는 음식 및 약학 조성물에 관한 것이다.

박테리아 종은 재료의 g 당 10⁵내지 10¹²cfu(콜로니 형성 단위) 범위의 양으로 조성물에 포함될 수 있다. 또한, 젖산 박테리아의 배양의 상청액 또는 그 활성 분획이 조성물에 포함될 수 있다.

음식 조성물은 우유, 요구르트, 굳은 우유, 치즈, 발효유, 우유 기재 발효품, 아이스크림, 발효 시리얼 기재 산물, 우유 기재 파우더, 유아용 유동식 또는 동물의 경우 애완동물 음식일 수 있다.

약학 조성물은 정제, 액체 박테리아 현탁액 또는 박테리아 세포를 용해하고 그 세포벽 성분을 수집함으로써 수득되는 단지 세포벽 분획같은 박테리아의 일부를 함유하는 제제, 건조 경구 보충제, 습윤 경구 보충제, 건조 튜브 피딩 또는 습윤 튜브 피딩의 형태일 수 있다.

약학 조성물 투약을 위한 경로는 경구 또는 비강일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 박테리아 또는 그 일부를 함유하는 백신을 포함할 수 있다. 박테리아는 살아있는 형태이거나, 필요시 약독화(즉 생장 잠재력의 약화)될 수 있다. 박테리아의 일부로서, 목적 항원을 보유하는 세포벽이 사용될 수 있다. 세포벽은 세포를 용해하고 그 다른 성분을 분리함으로서 용이하게 수득될 수 있다.

하기 실시예들은 본 발명을 제한함 없이 추가로 설명한다.

실시예 1

면역허용원 펩티드 분리

a) 펩티드 분리

β-락토글로블린(시그마) 220 g 를 5 % 농도(w/w)의 이차 증류수에 용해시켰다. 생성 용액에 TPCK 처리 트립신을 효소/기질(E/S)비 1/100(w/w)로 첨가하고, 용액을 40 ℃, pH 7.6 에서 일정한 교반중에 배양하였다. 1 시간 후 동일한 양의 효소를 첨가하여 2/100의 최종 (E/S) 비를 수득하였다. 4 시간 추가 배양하고, 효소를 열처리(85 ℃, 5 분)로 불활성화하여 반응을 종결시켰다. 그 후 전체 트립신 가수분해물을 동결 건조하고, 생성 펩티드 산물을 양이온 수지의 준비 크로마토크래피로 분리하였다.

약 2 내지 23 아미노산을 갖는 15 개의 상이한 펩티드 분획(약 240 내지 2720 Da)이 수득되었다. 각 분획은 나노필터(nanofilter), 다이어필터(diafilter), 투석처리하고, 다시 동결 건조하고 사용할 때까지 상온에서 건조 보관하였다. 그 펩티드 양에 대해 분획은 또한 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 특징을 분석하였다.

지적된 펩티드(T)를 주 성분으로 함유하는 전체 15 분획(F1 ~ F15)이 수집되었다.

분획

F1

F2

F3

F4

F5

F6

F7

F8

F9

F10

F11

F12

F13

F14

F15

질량(g)

52

13.9

11

11.8

2.57

1.94

4.37

13.1

5.01

6.53

1.05

3.46

1.9

2.67

28.8

농축펩티드

-

T6T17T18

T23

-

T7T9

T20T21T24

T9T12T24

T12T21

T10T21

T11

T10

T10T11

-

펩티드는 단리하고 서열 분석 하였다. 그 서열은 도 1 에 도시되어 있다.

Pecquet R, Bovetto L, Maynard F, Fritsche R 에 상세히 개시된 다른 실험들에서 다양한 펩티드가 면역허용원으로 입증되고, 보빈 B-락토글로블린의 트립신 가수분해에 의해 수득된 펩티드들이 생쥐에서 특이 경구 내성을 유도하였다(J. Allergy Clin Immunol, 105: 514-21, 2000; 본 명세서에 참고로 혼입됨).

b) 면역허용원 펩티드 합성

하기 리스트와 같은 대조군 펩티드 T13 뿐만 아니라 상기 참고자료에 확인된β-락토글로블린(BLG) T6, T17 및 T6/T17의 3 개의 면역허용원 펩티드를 잉여 Cys 잔기 뿐만아니라 BLG 서열의 측면 잔기와 함께 화학적으로 합성하였다:

c) 동물 실험

다양한 펩티드의 면역허용원 특성의 평가를 위해, IFFA-Credo(L'Abresle France)로부터 수득된 암컷 Balb/c 생쥐가 사용되었다. 동물들은 모두 우유가 없는 음식을 공급하여 생장시켰다. 실험 초기에 동물들은 생후 3 주였다. 위관 영양법으로 천연 β-락토글로블린(체중 1g 당 5 mg), 다양한 양의 분해된 β-락토글로블린 및 다양한 양의 상기 a)에 따라 수득된 다른 펩티드를 공급하였다. 대조군 생쥐는 식염수를 섭취시켰다. 상기 음식으로 5 일 후, 모든 생쥐를 면역 시스템의 특이성을 평가하기 위해 비관련 항원으로서 β-락토글로블린 및 난백 알부민(등급 V, Sigma)로 면역접종하였다. 전신 감작 21 일 후에 지연된 형태의 과민증 측정 (DTH)을 면역 전후에서 왼쪽 뒷다리부의 두께를 비교함으로써 수행하였다. 면역 24 시간후에 동물의 다리부의 두께를 측정하였다(Δ두께(mm)로 표현). 그 후, 혈액을 모든 생쥐로부터 취하고, 비장을 취하여 그룹 처리에 따라 저장하였다. 각 그룹의 비장세포 특이 증식 분석을 수행하였다. 장 내용을 각각 수집하였다. 혈청 및 장 샘플을 각 분석 수행전까지 각각 -80 ℃ 에서 동결시켰다. 항-β-락토글로블린 IgE 및 항-난백 알부민 IgE 수준을 혈청 및 장 샘플 둘다에서 측정하였다.

d) IgE 항체 분석

혈청 및 장액을 희석한 후 ELISA를 사용하여 항-β-락토글로블린 및 항-난백 알부민 IgE 항체를 두번 분석하였다. 20 마리의 비 면역 생쥐의 저장된 샘플을 음성 대조군으로 사용하였다. 샘플의 희석도를 계산함으로써 역가를 측정하여, 음성 대조군의 흡광도의 두배를 얻어었다. 역가는 희석도의 역수의 log10으로 표현하였다.

e) 세포 배양

비장세포 용액을 PBS로 균질화하고 정제하였다. 세포를 β-락토글로블린 또는 식물적혈구응집소 A(phytohemagglutinin A)의 존재하에서 공 배양하였다. 삼중수소로 표지된 티미딘([³H]-Thy(Amersham, Zuerich)을 배양 마지막 6 시간 동안 첨가하고, 플레이트를 수확하고 신틸레이션 카운팅으로 분석하였다. 자극 지표를 3회 배양에 의해, 혼입된 [³H]-Thy의 평균 cpm으로 표현된 블랭크를 뺀 시험 및 대조군의 비로 계산하였다.

f) 합성 펩티드의 경구투여에 의해 유도된 내성

그 면역허용원성에 대해 합성 펩티드를 비경구 생쥐 모델에서 분석하였다. 하기의 결과가 얻어졌다:

	IgE 역가(log)(시험군/대조군)	비장 림포사이트 SI(시험군/대조군)	MLN 림포사이트 SI(시험군/대조군)
T6	3.24/3.39	0.53	0.29
T17	2.67/3.39	0.31	0.41
T6 / T17	3.40/3.39	0.92	0.81
T13	3.20/3.39	1.70	0.87
SI: 자극 지표MLN: 창자간막림프절

합성 펩티드 T17이 IgE 생산 및 T 세포 증식 둘다를 감소시켰으나, 펩티드 T6 은 단지 T 세포 반응만을 억제하였음을 알 수 있다. 반대로, 펩티드 T13(대조군 펩티드)는 BLG 에 경구 내성을 유도하지 않았다.

실시예 2

재조합 폴리펩티드의 구성

실시예 1 에서 면역허용원 특성이 존재함이 확인된 펩티드 T6 및 T17를 세포 표면 부착 프로테아제에 융합시켜 박테리아의 표면에 나타나게 하였다. 음성 대조군으로 β락토글로블린의 N-말단의 일부를 구성하는 펩티드 T13을 사용하였다.

세포 표면 부착 프로테아제(상기)는 락토바실러스 불가리쿠스의 단백질로서 그 서열은 Gilbert 등 J. Bacteriol, 178, 3059-3065에 공개되었다. 이 단백질은 효소의 세포 방출을 위한 33 아미노산의 리더 펩티드(전-지역), 이어서 절단시 효소의 단백질 분해 활성의 활성화를 위한 일련의 154 아미노산(후-지역) 그리고 활성 부위를 위한 700 - 800 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로하는 2000 아미노산 단백질이다. 후 지역(약 1000 아미노산)이 절단의 특이성과 생성된 펩티드의 세포내 수송 및 세포벽에 고정되는데 역할을 한다는 것이 제안되어왔다. 이 프로테아제는 세포벽 펩티도글리칸 구조에 특이 공유결합하는 말단의 200 아미노산의 그 카르복실 말단으로 세포벽에 고정된다.

이 프로테아제 유전자를 하기 두 프라이머를 사용하여 그 프로모터와 1차 증폭하였다:

5'-TTTTGTGGATCCTTAACTTCATAGCACG-3'

(BamHI 자리를 지니는 유전자의 프로모터 상류)

5'-ATATTATCTAGAATTGAATAGATTGCC-3'

(XbaI 자리를 지니는 유전자의 rho-독립 터미네이터 하류)

증폭 산물을 BamHI 및 XbaI로 절단하고, 동일한 제한 효소로 절단한 젖산 박테리아 벡터 pNZ124로 클로닝하고 전기영동으로 플라스미드 없는 (베타-갈락토시다아제 및 프로테아제 음성)락토코쿠스 락티스내로 도입하였다.

클로닝된 프로테아제의 활성사이트 지역을 목적 펩티드/폴리펩티드 서열로 교체하였다. 이를 달성하기 위해, 클로닝된 프로테아제를 리더 펩티드의 절단부위 서열의 50 bq 하류에 위치한 NheI 및 하류로 추가 800 bp에 위치한 PvuI으로 절단하였다. 목적 펩티드(10 아미노산 이하)를 코딩하는 DNA 서열을 두개 올리고뉴클레오티드로서 두 제한 효소 부위 사이에 삽입하였다. 이는 잡종되었을 때 그 말단에 두 제한효소 자리를 만들도록 고안된 것이다. 올리고뉴클레오티드의 고안은 프로테아제 유전자에의 결합시 재조합 단백질의 리딩 프레임이 개방되어 유지되는 것을 고려하였다.

보다 큰 폴리펩티드의 삽입은 두 제한효소 부위를 함유하는 프라이머를 사용하는 DNA 증폭으로 달성되었다. 증폭산물을 그 제한효소로 절단하였다. 두 경우에서, DNA 절편을 프로테아제 유전자와 연결하고,락토코쿠스 락티스및락토바실러스 존소니에 전기영동으로 도입하였다.

펩티드 T6 및 T17를 각각 포함하는 재조합 플라스미드 구성을 부다페스트 조약에 따라 2000 년 9 월 22 일자에 Institute Pasteur 에 기탁하였고, 기탁증 no. CNCM I-2563 및 CNCM I-2564를 각각 수령하였다.

실시예 3

락토코쿠스 락티스및락토바실러스 존소니의 형질전환

형질전환 목적을 위해,락토코쿠스 락티스종(MG1363, 플라스미드 없음) 및락토바실러스 존소니종 La1(액세스 번호 CNCM I-1225로 Institute Pasteur에서 구할 수 있음)를 GasPak 혐기성 시스템에서 37 ℃ 에서 MRS 배양액에서 밤동안 성장시켰다. 이 배양액의 부분 표본을 0.5 M 수크로오스를 함유하는 또다른 배양액(MRS)을 접종하는데 사용하였다. 2 % 에서 200 ml MRS + 0.5 M 수크로오스로의 추가적 재 접종후 배양액을 0.6의 OD₅₉₅까지 성장시켰다. 세포를 4 ℃ 에서 5000 rpm으로 10 분동안 원심분리하여 수집하고, 펠릿을 1/2 부피의 1 M 수크로오스 및 2.5 mM CaCl₂를 함유하는 용액으로 한번, 그리고 1/4 부피의 1 M 수크로오스 및 2.5 mM CaCl₂를 함유하는 용액으로 한번 세척하고, 원심분리후 수득된 펠릿을 1 M 수크로오스, 3.5ml의 2.5 mM CaCl₂+ 0.459 ml 87 % 글리세롤(10 % 최종농도)의 용액에 재현탁하였다. 세포를 형질전환에 바로 사용하거나 또는 -80 ℃에서 냉동하였다.

전기 영동을 위해 40 ㎕ 세포를 10 - 100 ng DNA( < 5 ㎕ 부피)와 혼합하여빙냉 0.2 cm 전기영동 큐베트에 이전시켰다. 빙냉 0.2 cm 전기영동 큐베트중 200 Ω, 25 ㎌, 2.5 ㎸에서의 펄스가 사용되었다. 큐베트에 1 ml의 MRS + 20mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂를 첨가하고, 현탁액을 적당한 온도(락토코쿠스 락티스는 30℃ 및락토바실러스 존소니는 37 ℃에서) 2 - 3 시간 동안 배양하였다. ts 플라스미드(pG+host9)를 사용할때 배양 온도는 30 ℃이다. 10 ㎕ 및 100 ㎕ 부분 표본을 각각 플라스미드 DNA의 형질전환에 적절한 항생제를 함유하는 MRS 아가 플레이트에 평판배양하고, 100 ㎕ 및 500 ㎕ 각각을 연결 믹스와 함께 형질전환 하였다. 플레이트를 상기와 동일한 온도에서 24 - 48 시간동안 혐기적으로 배양하였다.

선택 배지로서 에리트로마이신(2.5 ㎍/ml) 을 갖는 MRS 또는 카나마이신(5 ㎍/ml)을 갖는 MRS를 사용하였다.

실시예 4

면역허용원 BLG 펩티드에 대한 쥐 항혈청 및 모노클로날 항체의 발생

BLG 펩티드 T6, T17, T6/T17 및 T13(실시예 1 참조)를 말레이미드 활성화된 KLH에 연결하고 Titermax 보조제와 함께 사용하여 젖산 단백질 없는 음식으로 기른 쥐를 면역하였다. 최초 면역후 2 주 간격으로 115 일까지 채취한 혈액 샘플이 BLG 펩티드에 특이 항체를 함유하는 것이 ELISA에 의해 보여졌다.

또한 항 T6 및 항 T13 항혈청을 BLG의 천연(ELISA) 또는 변성 (SDS-PAGE + Western blot) 형과 반응시켰다. 항 T6 및 항 T17이 특이적으로 재조합L.라틱스의 표면에 발현된 BLG 펩티드를 인식함이 보여졌다. 그 결과는 표 I에 나타내어진다.

항-BLG 펩티드 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생산하기 위해, 비장을 면역된 쥐에서 회수하였다. 비장 세포를 표준 기술에 따라 골수종 세포와 융합하였고, 1 회 선별에서 이미 항 T6 또는 항 T7 항체중 어느 하나를 생산하는 세포 집단을 확인하였다. 웰당 1개 단일 세포의 존재를 보장하는 세포 선별기를 사용하여 이들 세포의 클로닝을 성취하였다.

실시예 5

항체에 의한 면역허용원 펩티드의 검출

항체에 의해 접근가능하고 인지되는 방식으로 젖산 박테리아가 면역허용원펩티드를 발현하는지 아닌지를 확인하기위해, 재조합 유전자를 함유하는 박테리아를 50 ml 배양액에 생장시키고, 세포를 원심분리로 수집하였다. 그후 세포를 50 ml TBS로 2 회 세척하고, 6ml TBS에 현탁하였다. 현탁액 75 ㎕를 웰에 넣고(하프 웰 편평 바닥 ELISA 플레이트), 플레이트를 뚜껑없이 37 ℃ 에서 24 시간 동안 방치하여 웰을 건조시켰다. 플레이트를 비결합 박테리아가 씻겨나갈 때까지 TBS/PBS로 3 회 세척하고, 그 후 웰을 TBS 카세인(1.5g/l)로 2 시간동안 37 ℃ 에서 블러킹 처리하였다. 웰에 특이 펩티드에 관한 항체를 함유하는 쥐 항혈청을 첨가하였다. 웰을 RT에서 0.2 % Tween 20을 함유하는 TBS-카세인 중 희석액을 사용하여 밤동안 배양하였다. 그 후, 웰을 TBS로 3 회 세척하고, 발달 항체(HRP-접합 염소 항-쥐 IgG)를 웰에 첨가하고, 0.2 % Tween 20을 함유하는 TBS-카세인 용액에서 희석하여 37 ℃ 에서 배양하였다. 웰을 TBS로 3 회 세척하고, OPD/H₂O₂로 발색시키고 490 nm 에서 측정하였다.

락토코쿠스 락티스및락토바실러스 존소니두종 모두 면역허용원 펩티드가 항체에 의해 인식되었음을 시사하는 양성 반응을 나타냄이 관찰될 수 있었다.

실시예 6

L. 불가리쿠스prtB 단백분해효소의 아미노산 잔기 472 - 659 에 관한 토끼 항혈청의 제조

아미노산 잔기 472 - 659(아미노산 번호 1 은 개시 메티오닌임)를 코딩하는 prtB 타겟 서열(bp 1414 - 1977)은 주형으로서 pMD114 및 하기 서열

5'-GCGGATCCGGCTTGGGCGGTGCAGATG-3'(5'-BamHI 자리 포함)

의 상류 프라이머(prtB 5'-1414) 및 하기 서열

5'-CGCAAGCTTGTGCGAAGTGTTCATGGC-3'(5'-HindIII 자리 포함)

의 하류 프라이머(prtB 3'-1977)을 사용하여 증폭되었다.

Taq DNA 중합효소(Perkin-Elmer)를 사용하여 95 ℃ 에서 30 초 동안 변성 단계, 56 ℃ 에서 30 초 동안 프라이머 결합 단계 그리고 72 ℃ 에서 45 초동안 신장하는 단계로 구성된 3 사이클, 그 후 60 ℃ 에서 결합단계를 갖는 27 사이클로 특이 PCR 산물을 수득하였다.

탈염, 프라이머 및 dNTP의 제거(고순도 PCR 산물 정제 키트, Roche) 후, 샘플을 BamHI 및 HindIII로 소화하고, 그 후 아가로스 겔 전기영동하여, 목적 DNA 밴드를 겔로부터 회수하였다(E.Z.N.A. 겔 추출 키트, Peqlab).

정제된 증폭 산물을 pQE-9E.coli발현 벡터 (Qiagen)의 BamHI 및 HindIII 부위 사이의 6-히스티딘 택을 코딩하는 서열 하류에 연결하였다.

E.coli종 M15[pREP4]를 상기 벡터로 형질전환하고 이종 단백질의 발현을 배양액의 1mM IPTG-매개 유도로 얻었다.

1 리터 배양액의 세포를 펠릿화하고 변성 조건(8M 요소)하에서 용해시켰다. 맑은 용해질을 원심분리로 수득하고 Ni²⁺-NTA 아가로스 비드(Qiagen)에 로딩하고, pH 8.0 에서 평형을 맞추고, 6-히스티딘 표지 단백질을 결합하게 하였다. pH 6.3 에서의 세척단계 후, 재조합 단백질을 pH 4.5에서 용출시켰다.

상기 물질을 100 mM 트리스-Cl(pH 7.5)로 중화하고, 비신콘산(bicinchoninic acid) 단백질 분석(Pierce)으로 정량하고, 그 농도를 동일한 버퍼를 사용하여1mg/ml로 조절하였다.

항원을 완전한 Freund 보조제 중에 유화하고, 다중 진피주사로 두마리 토끼에 투여하였다. 주사는 0, 14, 28 및 56 일에 수행하였다. 최후 채혈은 80 일에 수행하였다.

놀랍게도 강한 항혈청 반응성이 세포표면상L. 불가리쿠스prtB 단백분해효소를 발현하는 재조합 Lc 에서 ELISA으로, 그리고 단백분해 효소의 분비형을 발현하는 재조합 Lc의 배양 상청액에서 면역블로팅으로 확인되었다.

본 발명은 특정 서열 및 가능하게는 면역허용원 펩티드의 배치가 유지되고, 안정성이 보존되고, 따라서 개인의 면역시스템에 의해 인지되고 가공될 수 있는 면역허용원 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 신규한 젖산 박테리아 종을 제공하며 이로써 알레르기 반응을 발달시키는 개인의 경향을 감소시킬 수 있다.

Claims

폴리펩티드에 이종인 면역허용원 펩티드를 함유하는 폴리펩티드를, 펩티드가 위/십이지장 효소들에 의한 분해에 안정성 있고, 면역허용원 특성을 유지하며 폴리펩티드 표면에 표현되도록 발현하는 젖산 박테리아 그룹의 박테리아 종.
제 1 항에 있어서, 락토바실러스 또는 비피도박테리움에서 선택되는 박테리아 종.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 폴리펩티드가 표면 단백질, 세포내 단백질 또는 박테리아에 의해 분비된 단백질에서 선택되는 박테리아 종.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역허용원 펩티드가 음식물에서 유래되는 박테리아 종.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 박테리아 종 또는 그 상청액을 포함하는 음식 조성물.
제 5 항에 있어서, 우유, 요구르트, 굳은 우유, 치즈, 발효유, 우유기재 발효품, 아이스크림, 발효 시리얼 기재 산물, 우유 기재 파우더, 유아용 유동식 또는애완동물 음식으로 구성된 군으로부터 선택되는 음식 조성물.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 박테리아 종이 10⁷내지 10¹¹cfu/투약 형 범위의 양으로 그 안에 함유되는 음식물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 박테리아 종 또는 그 상청액을 함유하는 약학 조성물.
제 8 항에 있어서, 박테리아 종이 10¹⁰내지 10¹²cfu/투약 형 범위의 양으로 그 안에 함유되는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 박테리아 종 또는 그 상청액의 알레르기 치료용 섭취성 담체 제조를 위한 용도.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 음식 또는 약학 조성물의 알레르기 치료용 섭취성 담체 제조를 위한 용도.
제 11 항에 있어서, 상기 조성물이 경구 또는 비강 경로로 투여되는 용도.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 박테리아 종 또는 그 일부를 포함하는 백신.
제 13 항에 있어서, 용해된 박테리아의 세포막 분획을 이용하는 백신.