本発明は、異種抗原および代謝酵素を発現するリステリア菌株およびそのリステリア菌株を作成する方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、組込み核酸分子を有する組換えリステリア株を提供し、この組込み核酸分子は、(a)目的とするタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第1の翻訳領域と、(b)代謝酵素をコードする第2の翻訳領域と、(c)A118またはU153インテグラーゼ遺伝子をコードする第3の翻訳領域とを有する。
一実施形態において、この核酸分子は抗生物質耐性遺伝子をもたない。別の実施形態において、この核酸分子は、前記栄養要求性バクテリア株中で機能する複製領域をもたない。別の実施形態において、この核酸分子は転写因子をコードする遺伝子をさらに有する。別の実施形態において、この組換えリステリア菌株は、前記転写因子をコードするこの内在性遺伝子中で、不活性化変異(inactivating mutation)を有する。別の実施形態において、このポリペプチドは前記タンパク質抗原、さらにはポリペプチドを有する融合タンパク質であり、このさらに含まれるポリペプチドは、前記タンパク質抗原の免疫原性を高める。別の実施形態において、このさらに含まれるポリペプチドは、非溶血性LLOタンパク質またはその断片、PEST様アミノ酸配列、またはActA断片である。別の実施形態において、この組込み核酸分子はファージ組込みベクターである。別の実施形態において、この代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態において、この代謝酵素は、前記組換えリステリア株における細胞壁剛性に使用されるアミノ酸の生成に触媒作用を及ぼす。別の実施形態において、この代謝酵素はアラニンラセミ化酵素である。別の実施形態において、この代謝酵素はD−アミノ酸転移酵素である。別の実施形態において、この組換えリステリア菌株は、動物宿主を通して継代培養されている。別の実施形態において、このポリペプチドは、hlyプロモーター、ActAプロモーター、またはp60プロモーターの制御下で発現する。各可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明は、検体中の目的とするタンパク質抗原に対する免疫応答誘発する方法を提供し、この方法は、組込み核酸を有する組換えリステリア菌株を検体に投与するものであり、この核酸分子は、(a)目的とするタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第1の翻訳領域と、(b)代謝酵素をコードする第2の翻訳領域と、(c)A118またはU153インテグラーゼ遺伝子をコードする第3の翻訳領域とを有するものであり、これにより検体中で目的とするタンパク質抗原に対する免疫応答を誘発する。
一実施形態において、本発明は、組込み核酸分子を有する組換えバクテリア株を提供し、この核酸分子はポリペプチドをコードする第1の翻訳領域を有し、このポリペプチドはタンパク質抗原を有し、核酸分子はさらに代謝酵素をコードする第2の翻訳領域を有する。別の実施形態においてこの組込み核酸分子は、染色体に組込まれる。別の実施形態においてこの組換えバクテリア株は、組換えリステリア菌株である。別の実施形態において、この株はリステリアワクチン菌株である。別の実施形態において、この代謝酵素は、組換えバクテリア株の染色体の残部で欠如している内在性代謝遺伝子を補完する。別の実施形態において、この核酸分子は、抗生物質選択のない条件下でこの組換えバクテリア株中で安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
一実施形態において、本発明は組込み核酸分子を有する組換えリステリア菌株を提供し、この組込み核酸分子は、(a)目的とするタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第1の翻訳領域と、(b)代謝酵素をコードする第2の翻訳領域と、(c)A118またはU153attPP´遺伝子とを有するものである。
一実施形態において、本発明は組込み核酸分子を有する組換えリステリア菌株を提供し、この組込み核酸分子は、(a)目的とするタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第1の翻訳領域と、(b)代謝酵素をコードする第2の翻訳領域とを有し、前記組込み核酸分子はファージ組込みベクターである。
一実施形態において、不活性変異とは、当該技術分野で既知のように、欠失、置換、または挿入である。
「代謝酵素」とは、別の実施形態において、宿主バクテリアにより要求される栄養素の合成に関与する酵素を意味する。別の実施形態において、この用語は宿主バクテリアにより要求される栄養素の合成に必要な酵素を意味する。別の実施形態において、この用語は、宿主バクテリアが利用する栄養素の合成に関与する酵素を意味する。別の実施形態において、この用語は宿主バクテリアの持続的な増殖に必要な栄養素の合成に関与する酵素を意味する。別の実施形態において、この酵素はこの栄養素の合成に必要である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明は検体中の目的とするタンパク質抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供し、この方法は組込み核酸分子を有する組換えバクテリア株を検体に投与する工程を含み、この核酸分子は、タンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第1の翻訳領域を有し、この核酸分子はさらに代謝酵素をコードする第2の翻訳領域を有し、これにより検体中の目的とするタンパク質抗原に対する免疫応答を誘発する。別の実施形態において、この組込み核酸分子は、この染色体に組み込まれる。別の実施形態において、この組換えバクテリア株は組換えバクテリア株である。別の実施形態において、この株はバクテリアワクチン株である。別の実施形態において、この代謝酵素は、組換えバクテリア株の染色体の残部に欠如している内在性代謝遺伝子を補完する。別の実施形態において、この核酸分子抗生物質選択のない条件下でこの組換えバクテリア株に安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明は検体中の目的とする腫瘍に対する免疫応答を誘発する方法を提供し、この方法は組込み核酸分子を有する組換えバクテリア株を検体に投与する工程を含み、この核酸分子は、ポリペプチドをコードする第1の翻訳領域を有し、このプリペプチドは目的とするタンパク質抗原を有し、これにより該腫瘍が該抗原を発現し、該核酸分子はさらに代謝酵素をコードする第2の翻訳領域を有し、これにより検体中の目的とするタンパク質抗原に対する免疫応答を誘発する。別の実施形態において、この組込み核酸分子は染色体中に組込まれる。別の実施形態において、この組換えバクテリア株は 組換えバクテリア株である。別の実施形態において、この株はバクテリアワクチン株である。別の実施形態において、この代謝酵素は、組換えバクテリア株の染色体の残部に欠如している内在性代謝遺伝子を補完する。別の実施形態において、この核酸分子抗生物質選択のない条件下でこの組換えバクテリア株に安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明は検体内の癌を治療する方法を提供し、この方法は組込み核酸分子を有する組換えバクテリア株を検体に投与する工程を含み、この核酸分子はタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第1の翻訳領域を有し、癌は目的とするタンパク質抗原を発現するものであり、この核酸分子はさらに代謝酵素をコードする第2の翻訳領域を有し、これにより検体内の癌を治療する。別の実施形態において、この組込み核酸分子は染色体中に組込まれる。別の実施形態において、この組換えバクテリア株は組換えバクテリア株である。別の実施形態において、この株はバクテリアワクチン株である。別の実施形態において、この代謝酵素は、組換えバクテリア株の染色体の残部に欠如している内在性代謝遺伝子を補完する。別の実施形態において、この核酸分子抗生物質選択のない条件下でこの組換えバクテリア株に安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明は検体内での癌の発生率を低減する方法を提供し、この方法は組込み核酸分子を有する組換えバクテリア株を検体に投与する工程を含み、この核酸分子はタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第1の翻訳領域を有し、癌は目的とするタンパク質抗原を発現するものであり、この核酸分子はさらに代謝酵素をコードする第2の翻訳領域を有し、これにより検体中の癌の発生率を低減する。別の実施形態において、この組込み核酸分子は染色体中に組込まれる。別の実施形態において、この組換えバクテリア株は組換えバクテリア株である。別の実施形態において、この株はバクテリアワクチン株である。別の実施形態において、この代謝酵素は、組換えバクテリア株の染色体の残部に欠如している内在性代謝遺伝子を補完する。別の実施形態において、この核酸分子抗生物質選択のない条件下でこの組換えバクテリア株に安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明は検体中で感染症を治療する方法を提供し、この方法は組込み核酸分子を有する組換えバクテリア株を検体に投与する工程を含み、この核酸分子はタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第1の翻訳領域を有し、感染症病原体は目的とするタンパク質抗原を発現し、この核酸分子はさらに代謝酵素をコードする第2の翻訳領域を有し、これにより検体中で感染症を治療する。別の実施形態において、この組込み核酸分子は染色体中に組込まれる。別の実施形態において、この組換えバクテリア株は組換えバクテリア株である。別の実施形態において、この株はバクテリアワクチン株である。別の実施形態において、この代謝酵素は、組換えバクテリア株の染色体の残部に欠如している内在性代謝遺伝子を補完する。別の実施形態において、この核酸分子抗生物質選択のない条件下でこの組換えバクテリア株に安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明は検体内での感染症の発生率を低減する方法を提供し、この方法は組込み核酸分子を有する組換えバクテリア株を検体に投与する工程を含み、この核酸分子はタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第1の翻訳領域を有し、この感染症病原体は目的とするタンパク質抗原を発現し、この核酸分子は代謝酵素をコードする第2の翻訳領域をさらに有し、これにより検体中での感染症の発生率を低減する。別の実施形態において、この組込み核酸分子は染色体中に組込まれる。別の実施形態において、この組換えバクテリア株は組換えバクテリア株である。別の実施形態において、この株はバクテリアワクチン株である。別の実施形態において、この代謝酵素は、組換えバクテリア株の染色体の残部に欠如している内在性代謝遺伝子を補完する。別の実施形態において、この核酸分子抗生物質選択のない条件下でこの組換えバクテリア株に安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
「核酸分子」とは、別の実施形態において、プラスミドを意味する。別の実施形態において、この用語は組込みベクターを意味する。別の実施形態において、この用語は組込みベクター有するプラスミドを意味する。別の実施形態において、この組込みベクターは部位特異的な組込みベクターである。別の実施形態において、本発明の方法および組成物の核酸分子は当該技術分野で既知の各種ヌクレオチドで構成できる。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
本発明の他の実施形態において、「核酸」または「ヌクレオチド」とは、少なくとも2つの塩基−糖−リン酸の組み合わせの連なりを意味する。この用語は、一実施形態において、DNAおよびRNAを含む。「ヌクレオチド」とは、一実施形態において、これらの核酸ポリマーのモノマー単位を意味する。RNAは一実施形態において、tRNA(転移RNA)、snRNA(核内低分子RNA)、rRNA(リボソームRNA)、m‐RNA(メッセンジャーRNA)、アンチセンスRNA、抑制性小分子RNA(siRNA)、ミクロRNA(miRNA)およびリボザイムの形態をとる。このsiRNAおよびmiRNAの使用はCaudy AAらによりGene&Devel 16:2491-96に記載されている(本文献および参考文献をここで本願明細書に引用する)。DNAはプラスミドDNA、ウイルスDNA、直鎖DNA、または染色体DNAまたはこれらの群の誘導体の形態である。さらに、DNAおよびRNAのこれらの形態は、一重、二重、三重、または4重らせんである。この用語はまた、別の実施形態において、別の種の主鎖であるが同一塩基を有する人工核酸も含む。一実施形態において、この人工核酸はPNA(ペプチド核酸)である。PNAはペプチド主鎖およびヌクレオチド塩基を有し、一実施形態において、DNAおよびRNA分子の双方に結合できる。別の実施形態において、このヌクレオチドは変性されたオキセタンである。別の実施形態において、このヌクレオチドはは1またはそれ以上のホスホジエステル結合のホスホロチオエート結合への置換により変性されている。別の実施形態において、この人工核酸は、当該技術分野で既知の未変性核酸のホスフェート主鎖のその他の各種変異体を含む。このホスホチオレート核酸およびPNAの使用は当業者に既知であり、例えば、Neilsen PE、Curr Opin Struct Biol 9:353-57;およびRaz NKらのBiochem.Biophys.Res.Commun.297:1075-84に記載されている。このおよび核酸の生成および利用は当業者に既知であり、例えば、Molecular Cloning(2001)、SambrookおよびRussell、eds.、およびMethods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic細胞 2003)PurchioおよびG.C.Fareedに記載されている。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
「安定維持」とは、別の実施形態において、10世代について選択(例えば、抗生物質選択)のない条件下で、核酸分子またはプラスミドを検出可能な損失なく維持できることを意味する。別の実施形態において、この期間は15世代である。別の実施形態において、この期間は20世代である。別の実施形態において、この期間は25世代である。別の実施形態において、この期間は30世代である。別の実施形態において、この期間は40世代である。別の実施形態において、この期間は50世代である。別の実施形態において、この期間は60世代である。別の実施形態において、この期間は80世代である。別の実施形態において、この期間は100世代である。別の実施形態において、この期間は150世代である。別の実施形態において、この期間は200世代である。別の実施形態において、この期間は300世代である。別の実施形態において、この期間は500世代である。別の実施形態において、この期間は世代を超える。別の実施形態において、この核酸分子またはプラスミドは生体外で(例えば、培養液中で)安定に維持される。別の実施形態において、この核酸分子またはプラスミドは生体内で安定に維持される。別の実施形態において、この核酸分子またはプラスミドは生体外および生体内の両者で安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明は異種抗原を発現させるために栄養要求性バクテリア株を操作する方法を提供し、この方法はこの栄養要求性バクテリア株を核酸分子に接触させる工程を含み、核酸コンストラクトは異種抗原を有するポリペプチドをコードする第1の核酸配列であり、核酸コンストラクトはさらに代謝酵素をコードする第2の核酸配列を有し、これにより異種抗原を発現する栄養要求性バクテリア株を操作する。別の実施形態において、この組込み核酸分子は染色体中に組込まれる。別の実施形態において、この組換えバクテリア株は組換えリステリア菌株である。別の実施形態において、この株はリステリアワクチン株である。別の実施形態において、この代謝酵素は、組換えバクテリア株の染色体の残部に欠如している内在性代謝遺伝子を補完する。別の実施形態において、この核酸分子抗生物質選択のない条件下でこの組換えバクテリア株に安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明は異種抗原を発現させるためにリステリアワクチン株を操作する方法を提供し、この方法は栄養要求性リステリア菌株をプラスミドに接触させる工程を含み、このプラスミド異種抗原を有するポリペプチドをコードする第1の核酸配列を有し、このプラスミドはさらに代謝酵素をコードする第2の核酸配列を有し、これにより栄養要求性リステリア菌株はプラスミドを取り込み、これにより代謝酵素は栄養要求性リステリア菌株の代謝不全を補完し、これにより異種抗原を発現させるためにリステリアワクチン株を操作する。
別の実施形態において、本発明は異種抗原を発現するリステリアワクチン株を操作する方法を提供し、この方法は栄養要求性リステリア菌株をこの異種抗原をコードする第1の核酸および代謝酵素をコードする第2の核酸を有するプラスミドで形質転換する工程を含み、これによりこの代謝酵素はこの栄養要求性リステリア菌株の代謝不全を補完し、これにより異種抗原を発現するリステリアワクチン株を操作する。
「形質転換」の語は、一実施形態において、「形質移入」と全く同様に使用され、プラスミドまたは別の異種DNA分子を取込むようにバクテリア細胞を操作することを意味する。別の実施形態において「形質転換」とは、プラスミドまたは別の異種DNA分子の遺伝子を発現させるためにバクテリア細胞を操作することを意味する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、接合は遺伝子材料および/またはプラスミドをバクテリアに導入するのに用いられる。接合の方法は、当該技術分野で既知の方法であり、例えば、Nikodinovic Jらの"A secondgeneration snp-derived Escherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation."Plasmid.2006 Nov;56(3):223-7、およびAuchtung JMらの"Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellular signaling and the global DNA damageresponse."Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2005 Aug 30;102(35):12554-9)に記載されている。各方法は本発明の個々の実施形態を示す。
別の実施形態において、本発明の方法および組成物のプラスミドまたは核酸分子は、転写因子をコードする遺伝子をさらに有する。別の実施形態において、この転写因子は、栄養要求性リステリア菌株、または本発明のリステリア菌株のバクテリア染色体で欠如している。一実施形態において、この転写因子はprfA(本願明細書記載の実施例)である。別の実施形態において、この転写因子は当該技術分野で既知のその他各種の転写因子である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
一実施形態において、この代謝遺伝子、転写因子をコードする遺伝子等はこのバクテリア株の染色体で欠如している。別の実施形態において、この代謝遺伝子、転写因子等は、この染色体およびバクテリア株のエピソームの遺伝子要素のいずれにおいても欠如している。別の実施形態において、この代謝遺伝子、転写因子等は、このバクテリアのゲノム株で欠如している。
一実施形態において、前記転写因子をコードする遺伝子は染色体中で変異する。別の実施形態において、この遺伝子はこの染色体から除去されている。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
一実施形態において、前記転写因子は染色体中で変異する。別の実施形態において、この転写因子は染色体から除去されている。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の組込みベクターまたはプラスミドは、リステリアワクチン株に抗生物質耐性を付与しない。別の実施形態において、組込みベクターまたはプラスミドは抗生物質耐性遺伝子を含んでいない。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の第1の核酸配列はプロモーター/制御配列に操作可能に結合している。別の実施形態において、この第2の核酸配列はプロモーター/制御配列に操作可能に結合している。別の実施形態において、この核酸配列の各々はプロモーター/制御配列に操作可能に結合している。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、第2の核酸配列機能のプロモーター/制御配列は大腸菌において機能し、これにより大腸菌株におけるプラスミドまたは核酸分子の安定な維持を可能にする。別の実施形態において、この第2の核酸配列は、大腸菌株を本発明のプラスミドまたは核酸分子で形質移入することで大腸菌株中で発現され、これによりこの大腸菌株でそれらの安定維持が可能になる。
プロファージをLMに導入する方法は、当該技術分野で既知である。別の実施形態においては、接合が利用される。別の実施形態においては、電気穿孔法が利用される。別の実施形態において、当該技術分野で既知のその他各種の方法が利用される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明はリステリアワクチン株を提供し、このリステリアワクチン株はプラスミドを有し、このプラスミドはポリペプチドをコードする第1の核酸配列を有し、このポリペプチドはタンパク質抗原を有し、このプラスミドは代謝酵素をコードする第2の核酸配列をさらに有し、これによりこの代謝酵素はこのリステリアワクチン株の染色体中で欠如している内在性代謝遺伝子を補完し、これによりプラスミドは抗生物質の選択なく、このリステリアワクチン株中で安定に維持される。
一実施形態において、前記内在性代謝遺伝子は染色体中で変異する。別の実施形態において、この内在性代謝遺伝子は染色体から除去されている。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明は異種抗原を発現するためにリステリアワクチン株を操作する方法を提供し、この方法は、栄養要求性リステリア菌株を核酸コンストラクトに接触させる工程を含み、この核酸コンストラクトは異種抗原を有するポリペプチドをコードする第1の核酸配列を有し、この核酸コンストラクトは代謝酵素をコードする第2の核酸配列をさらに有し、これによりこの核酸コンストラクトはこの栄養要求性リステリア菌株のゲノムに組み込まれ、これによりこの代謝酵素はこの栄養要求性リステリア菌株の代謝不全を補完し、これにより異種抗原を発現するようにリステリアワクチン株を操作する。
一実施形態において、前記核酸コンストラクトはリステリア複製領域に欠如している。別の実施形態において、ゲノムに組み込まれた核酸コンストラクトの複製を有するリステリアのみが、LB培地での増殖時に選ばれる。別の実施形態において、この核酸コンストラクトはリステリア複製領域を有する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
一実施形態において、この核酸コンストラクトは組込み部位を有する。一実施形態において、この部位はPSA(Scott Aのファージ)attPP´組込み部位である。PSAは別の実施形態において、ヒトリステリア症蔓延時に分離された血清型4b株、L. monocytogenes strain Scott A(Loessner, M. J、I. B. Krause, T. Henle, and S. Scherer.1994)である。Structuralproteins and DNA characteristics of 14 Listeria typing bacteriophages.J.Gen.Virol.75:701-710)のプロファージである。別の実施形態において、この部位は当該技術分野で既知のその他各種の組込み部位である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、この核酸コンストラクトはインテグラーゼ遺伝子を有する。別の実施形態において、このインテグラーゼ遺伝子はPSAインテグラーゼ遺伝子である。別の実施形態において、このインテグラーゼ遺伝子は当該技術分野で既知のその他各種のインテグラーゼ遺伝子である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
一実施形態において、この核酸コンストラクトはプラスミドである。別の実施形態において、この核酸コンストラクトはシャトルプラスミドである。別の実施形態において、この核酸コンストラクトは組込みベクターである。別の実施形態において、この核酸コンストラクトは部位特異的な組込みベクターである。別の実施形態において、この核酸コンストラクトは当該技術分野で既知のその他各種の核酸コンストラクトである。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
本発明の方法および組成物の組込みベクターは、別の実施形態において、ファージベクターである。別の実施形態において、この組込みベクターは部位特異的な組込みベクターである。別の実施形態において、このベクターはインテグラーゼ遺伝子をさらに有する。別の実施形態において、このベクターはattPP´部位をさらに有する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、この組込みベクターはU153ベクターである。別の実施形態において、この組込みベクターはA118ベクターである。別の実施形態において、この組込みベクターはPSAベクターである。
別の実施形態において、前記ベクターはA511ベクター(例えば、GenBankアクセッション番号:X91069)である。別の実施形態において、前記ベクターはA006ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはB545ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはB053ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはA020ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはA500ベクター(例えば、GenBankアクセッション番号:X85009)である。別の実施形態において、前記ベクターはB051ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはB052ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはB054ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはB055ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはB056ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはB101ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはB110ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはB1llベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはA153ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはD441ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはA538ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはB653ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはA513ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはA507ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはA502ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはA505ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはA519ベクターである。別の実施形態において、このベクターはB604ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはC703ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはB025ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはA528ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはB024ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはB012ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはB035ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはC707ベクターである。
別の実施形態において、前記ベクターはA005ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはA620ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはA640ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはB021ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはHSO47ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはH10Gベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはH8/73ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはH19ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはH21ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはH43ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはH46ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはH107ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはH108ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはH110ベクターである。別の実施形態において、このベクターはH163/84ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはH312ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはH340ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはH387ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはH391/73ベクターである。別の実施形態において、このベクターはH684/74ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはH924Aベクターである。別の実施形態において、前記のベクターはfMLUP5ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはsyn(=P35)ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは00241ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは00611ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは02971Aベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは02971Cベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは5/476ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは5/911ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは5/939ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは5/11302ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは5/11605ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは5/11704ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは184ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは575ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは633ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは699/694ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは744ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは900ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは1090ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは1317ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは1444ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは1652ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは1806ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは1807ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは1921/959ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは1921/11367ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは1921/11500ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは1921/11566ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは1921/12460ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは1921/12582ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは1967ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは2389ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは2425ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは2671ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは2685ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは3274ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは3550ベクターである。別の実施形態において、このベクターは3551ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは3552ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは4276ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは4277ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは4292ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは4477ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは5337ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは5348/11363ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは5348/11646ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは5348/12430ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは5348/12434ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは10072ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは11355Cベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは11711Aベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは12029ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは12981ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは13441ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは90666ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは90816ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは93253ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは907515ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは910716ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはNN‐リステリアベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはO1761ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは4211ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは4286ベクターである。
別の実施形態において、前記組込みベクターは、リステリア菌を感染させることのできる、当該技術分野で既知のその他の各種部位特異的な組込みベクターである。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
本発明の方法および組成物の代謝酵素は、別の実施形態において、アミノ酸代謝酵素である。別の実施形態において、前記代謝酵素はアラニンラセマーゼ(dal)酵素である。別の実施形態において、前記代謝酵素はD−アミノ酸転移酵素(dat)である。LMdalおよびdat遺伝子は、Thompsonら(Infec.Immun.66:3552-3561,1998)に記載されるように、クローン化されLMから単離される。
別の実施形態において、前記代謝酵素はバクテリア増殖工程に使用されるアミノ酸(AA)を代謝する。別の実施形態において、この生成物AAは複製工程に使用される。別の実施形態において、前記生成物AAは細胞壁合成に使用される。別の実施形態において、生成物AAはタンパク質合成に使用される。別の実施形態において、生成物AAは脂肪酸の代謝に使用される。別の実施形態において、生成物AAは、当該技術分野で既知のその他各種の増殖または複製工程に使用される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記代謝酵素は細胞壁合成に使用されるAAの形成を触媒する。別の実施形態において、前記代謝酵素は細胞壁合成に使用されるAAの合成を触媒する。別の実施形態において、前記代謝酵素は細胞壁合成に使用されるAAの合成に関与する。別の実施形態において、前記AAは細胞壁生合成に使用される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記代謝酵素は、細胞壁成分であるD−グルタミン酸のシンテターゼである。
別の実施形態において、前記代謝酵素は、アラニンラセマーゼ遺伝子(dal)遺伝子によりコードされる。D−グルタミン酸合成はD−glu+pyrのα−ケトグルタル酸+D−alaへの変換およびその逆反応に関与するdal遺伝子により部分的に制御される。
本発明の方法および組成物のdal遺伝子は、別の実施形態において、以下の配列によりコードされる。すなわち、
atggtgacaggctggcatcgtccaacatggattgaaatagaccgcgcagcaattcgcgaaaatataaaaaatgaacaaaataaactcccggaaagtgtcgacttatgggcagtagtcaaagctaatgcatatggtcacggaattatcgaagttgctaggacggcgaaagaagctggagcaaaaggtttctgcgtagccattttagatgaggcactggctcttagagaagctggatttcaagatgactttattcttgtgcttggtgcaaccagaaaagaagatgctaatctggcagccaaaaaccacatttcacttactgtttttagagaagattggctagagaatctaacgctagaagcaacacttcgaattcatttaaaagtagatagcggtatggggcgtctcggtattcgtacgactgaagaagcacggcgaattgaagcaaccagtactaatgatcaccaattacaactggaaggtatttacacgcattttgcaacagccgaccagctagaaactagttattttgaacaacaattagctaagttccaaacgattttaacgagtttaaaaaaacgaccaacttatgttcatacagccaattcagctgcttcattgttacagccacaaatcgggtttgatgcgattcgctttggtatttcgatgtatggattaactccctccacagaaatcaaaactagcttgccgtttgagcttaaacctgcacttgcactctataccgagatggttcatgtgaaagaacttgcaccaggcgatagcgttagctacggagcaacttatacagcaacagagcgagaatgggttgcgacattaccaattggctatgcggatggattgattcgtcattacagtggtttccatgttttagtagacggtgaaccagctccaatcattggtcgagtttgtatggatcaaaccatcataaaactaccacgtgaatttcaaactggttcaaaagtaacgataattggcaaagatcatggtaacacggtaacagcagatgatgccgctcaatatttagatacaattaattatgaggtaacttgtttgttaaatgagcgcatacctagaaaatacatccattag(配列番号50;GenBankアクセッション番号:AF038438)である。別の実施形態において、dalをコードするヌクレオチドは配列番号50と相同である。別の実施形態において、前記dalをコードするヌクレオチドは配列番号50の変異体である。別の実施形態において、前記dalをコードするヌクレオチドは配列番号50の断片である。別の実施形態において、前記dalタンパク質は当該技術分野で既知のその他の各種dal遺伝子でコードされる。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、このdalタンパク質は以下の配列を有する。すなわち、
MVTGWHRPTWIEIDRAAIRENIKNEQNKLPESVDLWAVVKANAYGHGIIEVARTAKEAGAKGFCVAILDEALALREAGFQDDFILVLGATRKEDANLAAKNHISLTVFREDWLENLTLEATLRIHLKVDSGMGRLGIRTTEEARRIEATSTNDHQLQLEGIYTHFATADQLETSYFEQQLAKFQTILTSLKKRPTYVHTANSAASLLQPQIGFDAIRFGISMYGLTPSTEIKTSLPFELKPALALYTEMVHVKELAPGDSVSYGATYTATEREWVATLPIGYADGLIRHYSGFHVLVDGEPAPIIGRVCMDQTIIKLPREFQTGSKVTIIGKDHGNTVTADDAAQYLDTINYEVTCLLNERIPRKYIH(配列番号51;GenBankアクセッション番号:AF038438)である。別の実施形態において、前記dalタンパク質は配列番号51と相同である。別の実施形態において、前記dalタンパク質は配列番号51の変異体である。別の実施形態において、前記dalタンパク質は配列番号51の異性体である。別の実施形態において、前記dalタンパク質は配列番号51の断片である。別の実施形態において、前記dalタンパク質は配列番号51の相同体の断片である。別の実施形態において、前記dalタンパク質は配列番号51の異性体の変異体の断片である。別の実施形態において、前記dalタンパク質は配列番号51の異性体の断片である。
別の実施形態において、前記dalタンパク質は、当該技術分野で既知のその他の各種リステリアdalタンパク質である。別の実施形態において、前記dalタンパク質は、当該技術分野で既知のその他の各種グラム陽性dalタンパク質である。別の実施形態において、前記dalタンパク質は、当該技術分野で既知のその他各種のdalタンパク質である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
「グラム陽性」および「グラム陽性バクテリア」とは、別の実施形態において、当該技術分野で既知の各種グラム陽性バクテリアを意味する。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアは枯草菌バクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアは大腸菌バクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアはストレプトマイセスバクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアはブドウ球菌(例えば、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌)バクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアは腸球菌(例えば、大便連鎖球菌)バクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアはストレプトコッカス・アガラクチアバクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアは肺炎球菌バクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアはラクトコッカス・ラクティスバクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアはバチルス・チューリンゲンシスバクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアは当該技術分野で既知のその他各種のグラム陽性バクテリアである。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明の方法および組成物のdalタンパク質は、その酵素活性を保持している。別の実施形態において、前記dalタンパク質は野生型活性の90%を維持している。別の実施形態において、前記dalタンパク質は野生型活性の80%を維持している。別の実施形態において、前記dalタンパク質は野生型活性の70%を維持している。別の実施形態において、前記dalタンパク質は野生型活性の60%を維持している。別の実施形態において、前記dalタンパク質は野生型活性の50%を維持している。別の実施形態において、前記dalタンパク質は野生型活性の40%を維持している。別の実施形態において、前記dalタンパク質は野生型活性の30%を維持している。別の実施形態において、前記dalタンパク質は野生型活性の20%を維持している。別の実施形態において、前記dalタンパク質は野生型活性の10%を維持している。別の実施形態において、前記dalタンパク質は野生型活性の5%を維持している。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記代謝酵素はD−アミノ酸アミノ転移酵素遺伝子(dat)によりコードされる。D−グルタミン酸合成はD−glu+pyrのα−ケトグルタル酸+D−alaへの変換およびこの逆反応に関与するdat遺伝子に一部制御されている。
別の実施形態において、本発明に使用されるdat遺伝子は、GenBankアクセッション番号:AF038439に示される配列を有する。別の実施形態において、このdat遺伝子は、当該技術分野で既知その他各種のdat遺伝子でもよい。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
本発明の方法および組成物のdat遺伝子は、別の実施形態において、以下の配列によりコードされる。すなわち、
atgaaagtattagtaaataaccatttagttgaaagagaagatgccacagttgacattgaagaccgcggatatcagtttggtgatggtgtatatgaagtagttcgtctatataatggaaaattctttacttataatgaacacattgatcgcttatatgctagtgcagcaaaaattgacttagttattccttattccaaagaagagctacgtgaattacttgaaaaattagttgccgaaaataatatcaatacagggaatgtctatttacaagtgactcgtggtgttcaaaacccacgtaatcatgtaatccctgatgatttccctctagaaggcgttttaacagcagcagctcgtgaagtacctagaaacgagcgtcaattcgttgaaggtggaacggcgattacagaagaagatgtgcgctggttacgctgtgatattaagagcttaaaccttttaggaaatattctagcaaaaaataaagcacatcaacaaaatgctttggaagctattttacatcgcggggaacaagtaacagaatgttctgcttcaaacgtttctattattaaagatggtgtattatggacgcatgcggcagataacttaatcttaaatggtatcactcgtcaagttatcattgatgttgcgaaaaagaatggcattcctgttaaagaagcggatttcactttaacagaccttcgtgaagcggatgaagtgttcatttcaagtacaactattgaaattacacctattacgcatattgacggagttcaagtagctgacggaaaacgtggaccaattacagcgcaacttcatcaatattttgtagaagaaatcactcgtgcatgtggcgaattagagtttgcaaaataa(配列番号52;GenBankアクセッション番号:AF038439)である。別の実施形態において、前記datをコードするヌクレオチドは配列番号52と相同である。別の実施形態において、前記datをコードするヌクレオチドは配列番号52の変異体である。別の実施形態において、前記datをコードするヌクレオチドは配列番号52の断片である。別の実施形態において、このdatタンパク質は当該技術分野で既知のその他各種のdat遺伝子でもコードされる。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記datタンパク質は以下の配列を有する。すなわち、
MKVLVNNHLVEREDATVDIEDRGYQFGDGVYEVVRLYNGKFFTYNEHIDRLYASAAKIDLVIPYSKEELRELLEKLVAENNINTGNVYLQVTRGVQNPRNHVIPDDFPLEGVLTAAAREVPRNERQFVEGGTAITEEDVRWLRCDIKSLNLLGNILAKNKAHQQNALEAILHRGEQVTECSASNVSIIKDGVLWTHAADNLILNGITRQVIIDVAKKNGIPVKEADFTLTDLREADEVFISSTTIEITPITHIDGVQVADGKRGPITAQLHQYFVEEITRACGELEFAK(配列番号53;GenBankアクセッション番号:AF038439)である。別の実施形態において、前記datタンパク質は配列番号53と相同である。別の実施形態において、datタンパク質は配列番号53の変異体である。別の実施形態において、前記datタンパク質は配列番号53の異性体である。別の実施形態において、前記datタンパク質は配列番号53の断片である。別の実施形態において、前記datタンパク質は配列番号53の相同体の断片である。別の実施形態において、前記datタンパク質は配列番号53の変異体の断片である。別の実施形態において、前記datタンパク質は配列番号53の異性体の断片である。
別の実施形態において、前記datタンパク質は、当該技術分野で既知のその他各種のリステリアdatタンパク質である。別の実施形態において、前記datタンパク質は、当該技術分野で既知のその他各種のグラム陽性datタンパク質である。別の実施形態において、前記datタンパク質は、当該技術分野で既知のその他各種のdatタンパク質である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明の方法および組成物のdatタンパク質はその酵素 活性を維持する。別の実施形態において、このdatタンパク質は野生型活性の90%を維持している。別の実施形態において、このdatタンパク質は野生型活性の80%を維持している。別の実施形態において、このdatタンパク質は野生型活性の70%を維持している。別の実施形態において、このdatタンパク質は野生型活性の60%を維持している。別の実施形態において、このdatタンパク質は野生型活性の50%を維持している。別の実施形態において、このdatタンパク質は野生型活性の40%を維持している。別の実施形態において、このdatタンパク質は野生型活性の30%を維持している。別の実施形態において、このdatタンパク質は野生型活性の20%を維持している。別の実施形態において、このdatタンパク質は野生型活性の10%を維持している。別の実施形態において、このdatタンパク質は野生型活性の5%を維持している。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記代謝酵素はdgaによりコードされる。D−グルタミン酸合成はdga遺伝子にも一部制御され、D−グルタミン酸合成のための栄養要求性変異体はD−グルタミン酸の非存在下では増殖しない(Pucciら、1995,J Bacteriol.177:336-342)。さらに実施例として、ジアミノピメリン酸の合成に関与する遺伝子が挙げられる。このような合成遺伝子はβ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードし、不活性化されると、この合成経路に対して栄養要求性である変異体を与える(Sizemoreら,1995,Science270:299-302)。別の実施形態において、このdgaタンパク質は、当該技術分野で既知のその他各種のリステリアdgaタンパク質である。別の実施形態において、前記dgaタンパク質は、当該技術分野で既知のその他各種のグラム陽性dgaタンパク質である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記代謝酵素はalr(アラニンラセマーゼ)遺伝子によりコードされる。別の実施形態において、前記代謝酵素は、アラニン合成に関与する、当該技術分野で既知のその他各種の酵素である。別の実施形態において、前記代謝酵素はL−アラニン合成に関与する当該技術分野で既知のその他各種の酵素である。別の実施形態において、前記代謝酵素は、D−アラニン合成に関与する、当該技術分野で既知のその他各種の酵素である。アラニン合成に関して栄養要求性のバクテリアは、当該技術分野でよく知られており、例えば、大腸菌(Strychら、2002,J.Bacteriol.184:4321-4325)、コリネバクテリウム・グルタミクム(Tauchら、2002,J.Biotechnol.99:79-91)、およびリステリア・モノサイトゲネス(Frankelら、米国特許第6,099,848号)、ラクトコッカス属菌種、およびラクトバチルス菌種、(Bronら、2002,Appl.Environ.Microbiol.68:5663-70)である。別の実施形態において、当該技術分野で既知のD−アラニン合成遺伝子はいずれも不活性化されている。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記代謝酵素はアミノ酸アミノ転移酵素である。
別の実施形態において、前記代謝酵素は、リン酸化セリンアミノ転移酵素であるserCによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はasd(アスパラギン酸塩β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ)によりコードされ、細胞壁構成成分であるジアミノピメリン酸の合成に関与する。別の実施形態において、前記代謝酵素は(S)−4−アミノ−5−オキソペンタペンタノエートからの5−アミノレブリネートの生成を触媒するgsaB−グルタミン酸−1−セミアルデヒドアミノ転移酵素によりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素は、(S)−4−アミノ−5−オキソペンタノエートからの5−アミノレブリネートの生成を触媒するHemLによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素は、アスパラギン酸塩、L−アスパラギン酸塩、および2−オキソグルタル酸塩からのオキサロ酢酸塩およびL−グルタミン酸塩の生成を触媒する、アスパラギン酸アミノ転移酵素aspBによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素は、アルギニン生合成に関与するargF−1によりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はアミノ酸生合成に関与するaroEによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素は、3−デヒドロキナ酸塩の 生合成に関与するaroBによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素は、アミノ酸生合成に関与するaroDによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はアミノ酸生合成に関与するaroCによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はヒスチジン生合成に関与するhisBによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はヒスチジン生合成に関与するhisDによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はヒスチジン生合成に関与するhisGによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はメチオニン生合成に関与するmetXによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素は、プロリン生合成に関与するproBによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はアルギニン生合成に関与するargRによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はアルギニン生合成に関与するargJによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はチアミン生合成に関与するthiIによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はトリプトファン生合成に関与するLMOf2365_1652によりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はトリプトファン生合成に関与するaroAによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はバリンおよびイソロイシン生合成に関与するilvDによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はバリンおよびイソロイシン生合成に関与するilvCによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はロイシン生合成に関与するleuAによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はリジン生合成に関与するdapFによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はスレオニン生合成(これらすべてGenBankアクセッション番号:NC_002973)に関与するthrBによりコードされる。
別の実施形態において、この代謝酵素はt−RNAシンテターゼである。別の実施形態において、この代謝酵素はトリプトファンylt−RNAシンテターゼをコードするtRPS遺伝子によりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はその他各種のt−RNAシンテターゼ当該技術分野で既知の。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、この宿主株バクテリアはΔ(tRPS aroA)であり、両マーカーはこの組込みベクターに含まれている。
別の実施形態において、この代謝酵素はジアミノピメリン酸(GenBankアクセッション番号:NC_003485)の合成に関与するmurEによりコードされる。
別の実施形態において、この代謝酵素は、タイコ酸生合成に関与するLMOf2365_2494によりコードされる。
別の実施形態において、この代謝酵素はWecE(リポ多糖生合成タンパク質rffA;GenBankアクセッション番号:AE014075.1)によりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はN−アセチルムラモイル−L−アラニンアミダーゼamiAによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はアスパラギン酸アミノ転移酵素である。別の実施形態において、この代謝酵素はヒスチジノール−リン酸アミノ転移酵素(GenBankアクセッション番号:NP_466347)である。別の実施形態において、この代謝酵素は細胞壁タイコ酸グリコシル化タンパク質GtcAである。
別の実施形態において、この代謝酵素はペプチドグリカン成分または前駆体に対する合成酵素である。別の実施形態において、この成分はUDP−N−アセチルムラミル−ペンタペプチドである。別の実施形態において、前記成分はUDP−N−アセチルグルコサミンである。別の実施形態において、前記成分はMuRNAc−(ペンタペプチド)−ピロホスホリル−ウンデカプレノール。別の実施形態において、前記成分はGlcNAc−β−(1,4)−MuRNAc−(ペンタペプチド)−ピロホスホリル−ウンデカプレノールである。別の実施形態において、前記成分は当該技術分野で既知のその他各種のペプチドグリカン成分または前駆体である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記代謝酵素はmurGによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はmurDによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はmurA−1によりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はmurA−2によりコードされる(これらすべてGenBankアクセッション番号:NC_002973)。別の実施形態において、この代謝酵素はペプチドグリカン成分または前駆体に対するその他各種の合成酵素である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記代謝酵素はトランス−グリコシラーゼである。別の実施形態において、この代謝酵素はトランス−ペプチダーゼである。別の実施形態において、この代謝酵素はカルボキシ−ペプチダーゼである。別の実施形態において、この代謝酵素は当該技術分野で既知のその他各クラスの代謝酵素である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記代謝酵素は当該技術分野で既知のその他各種のリステリア・モノサイトゲネス代謝酵素である。
別の実施形態において、前記代謝酵素は当該技術分野で既知のその他各種のリステリア代謝酵素である。
別の実施形態において、前記代謝酵素は当該技術分野で既知のその他各種のグラム陽性バクテリア代謝酵素である。
別の実施形態において、前記代謝酵素は当該技術分野で既知のその他各種の代謝酵素である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記代謝酵素をコードする遺伝子はリステリアp60プロモーターの制御下で発現する。別の実施形態において、(インターナリンをコードする)inlAプロモーターが使用される。別の実施形態において、hlyプロモーターが使用される。別の実施形態において、ActAプロモーターが使用される。別の実施形態において、インテグラーゼ遺伝子はその他各種のグラム陽性プロモーターの制御下で発現する。別の実施形態において、前記代謝酵素をコードする遺伝子はリステリア中で機能するその他各種のプロモーターの制御下で発現する。当業者は、別のプロモーターまたは多シストロン性の発現カセットが前記遺伝子の発現を引き起こすのに使用できると考えるであろう。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
本発明のプラスミド上で発現する前記遺伝子は、一実施形態において、栄養要求性変異体を補完するタンパク質をコードする単離核酸を有する。別の実施形態において、この栄養要求性バクテリアがバクテリア増殖に必要なビタミン合成遺伝子(例えば、パントテン酸)をコードする遺伝子で欠損すると、このプラスミドDNAは、パントテン酸合成のためのタンパク質をコードする遺伝子を有する。従って、この栄養要求性バクテリアがプラスミド上で前記遺伝子を発現する場合パントテン酸の非存在下で増殖できるのに対し、プラスミド上で前記遺伝子を発現しない栄養要求性バクテリアはパントテン酸の非存在下では増殖できない。
別の実施形態において、本発明の方法および組成物に使用される栄養要求性バクテリアは本発明の方法および組成物の代謝酵素に欠乏している。別の実施形態において、この代謝酵素をコードする遺伝子はこのバクテリアのゲノムで変異する。別の実施形態において、この代謝酵素をコードする遺伝子はこのバクテリアのゲノムから消去されている。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
本発明の方法および組成物のattPP´は、別の実施形態において、U153attPP´部位である。別の実施形態において、このattPP部位は配列番号26中に含まれる配列を有する。すなわち、
aagctttaaagaaattcaagaagaaacatcggtaactagccataaattaaccaaagttctaatctcgcttgaagagaacaaactgattgaaaaaattggacaatctagagcaacaaaatacaaattaattgaatctacagaggaatatctaaccaatcttcaacacacatttcgaaaaattgttcaattttatgttgaaaatgataaataaaaatatgaatgtttttttatttgttagtagtgtaactttccatgcgagaggagaacggaaatgaaggcagctatttatatacgcgtatctactcaagaacaaatagagaattactctatacaagctcaaactgaaaagctaacagccttgtgccgctcgaaggattgggacgtatacgatattttcatagacggcggatacagcggttcaaacatgaatcgccccgcactaaatgaaatgctaagtaaattacatgaaattgatgctgttgttgtatatcgcttagatagactttcccgctcacaaagagatacgataacgcttattgaagaatacttcttaaaaaacaatgtagaatttgttagtttgtctgaaactcttgacacctctagcccatttgggcgcgcgatgattggtatattatccgtatttgctcaattagagcgcgaaactatacgtgatcgtatggtgatggggaaaattnagcgtattgaagcaggtcttcctttaacgactgcaaaaggtagaacattcggctatgatgttatagatactaaattatatattaatgaagaagaagcaaaacaattacaaatgatttatgatatttttgaggaagaaaaaagcattaccactttacagaagagactaaaaaaattaggattcaaagtgaaatcatatagcagttacaacaattggctaactaatgatttatactgtggttatgtatcttatgcggataaagtgcatacaaaaggtgttcatgagcctattatttcagaggaacaattttatcgagttcaagaaattttttctcgcatgggtaaaaatccaaatatgaatagagattcagcatcgttgctaaataatttggtagtgtgtggaaaatgtgggttgggttttgttcatcggagaaaagatactgtttcccgcggaaaaaaatatcattatagatattatagttgcaagacttacaaacatactcatgaactagaaaaatgtggaaataaaatttggagagctgacaaactcgaggaattaattattgatcgcgtgaataactatagtttcgcttctaggaatgtagataaagaagacgaattagatagcttaaatgaaaaacttaaaacagaacacgtaaaaaagaaacggctatttgatttatatatcagcggttcttacgaagtttcagaacttgatgctatgatggctgatatcgatgctcaaattaattattatgaagcacaaatagaagctaacgaagaattgaagaaaaataaaaagatacaagaaaatttagctgatttagcaacagttgattttgactctttagagttccgagaaaagcaactttatttaaaatcactaattaataaaatttatattgacggtgaacaagttactattgaatggctctagtagcttgtttatttagattgtttagttcctcgttttctctcgttggacggaaacgaatcgagaaactaaaattataaataaaaagtaacctgtttttctatagattgctttttatcaattatatagaagaaagccgctttttattagattataattgatgttttttgatttatatttcactccctgtgcaaataatgatataacagcaacctcgaactttttagttcggggtatttttttgaaattaatttataaaaacacttgcaattatataatacatgtattataatataaatatagaaaggagttgagaaagtgaaagacatcttagaggaaataaaaacagtccttgaaattgtaactcttgcagtagcgctgataacattacgcaagatagacaaaaacaaggacaagtaaccagaggggtgaaactcccctccctctataaaagtatatcacgtctttcataaattatgaataaatatatctgggttatattaattgttatatgcgttaacggactcgctagttactttcagaacacagcattgaccatcattgctatactgactacattagcttgtttagtatatttaataaaaaataggaagtgattaattatgacgaaaaaaacgacctctgacgcgcagttgaaagcaaataaggaatggcaaagcaagaacaaagaacatgcaaactatttaaaatctcgttcagctgcgcgttcttttataaagaataaagctacgttggaagatttgaaggaacttgaaaaattaattatagagggaaaaattaatcataagggaatgattaaggataaatgatgcacgctaagcacatgcttggcgttttttgcataaaaaaagccctaacgttgaagttagggactgacatatataaaaaatagaagttgacaactttaaggcgactaccacgacaggcagcttacaagctatgactagccttgactaatcatttatgcgacactcaaagaattattatctaacttcttaatcaagaataacaaaaatcaaacaagttagcaagtatttcaggcattttatttataacaaatatctagatcacaaaaatgtcgcggaaaataatggtcacaaccaatattacataaacttaaaagttctctatttctcttatcaggtttatgtgctgttacgtgatttctacatactctaaaaactgtattagcgaataagtctacaacttgaattaaatctttattttgtgaatccttatatgatgtttcaacagaagagaaaattggatgttccattgtaaatttaatagttaaatattcttgtaagctatttaatgattcaattgcggtatttctatcatctatttgcattttcaaatagttatttgctgggttaattggtattttagaaatttcatttaccgttagataaataaaataattaaaagacaaagatgtattattcaaaagatgattgactagttggtggttatcgactatcttaaaatgaaatttagcatctgattttgttgaaagcatattaaatattaattttttcatttcaaaaggcatctccgaaccttttatctcttttgtaatatctaacttactagatggataccttttaagatattttaattttgcatctctgaactgtctaattacattatatggtttctctgtttctaaaaaagcaataacaaaatatctgttattaaaatttttatttttagttatagttcctgattcatctacaaaaagtctcatcccagttcctccacttttttacttaaattatattatactaattaagtttgaggaagtggaacgtatgtacttataattcgaagttatgaaaaatccccccatcaatataaaacaaaaaagcccccgaaataataatcgagggcattaaactaaatctttttaacaaacttcggtgttagcagtgagatagtaaccagatttcgttttcaagcgaggtgttccgccttttgttttcgccattcctgtaatcgtgaagatagtgcctaccggatatgtgccaccggttttatgcttctcagtaaagtctactgaattgtatagatcacactgtactagtgttttaacttttcgcggattttctgtgtagtatgtgtttttgcttgctggtgtgtgtggttttcctgcttttaacttcgctaataatgttgtgttctgcgttgctgttcctttataatccttaattccgtattgatttgctagttttttacgattcgcaaagctt(配列番号26;att部位を下線で示す)である。別の実施形態において、このattPP´部位、コア組込み部位、および/または周囲配列は、配列番号26に相同である。別の実施形態において、このattPP´部位、コア組込み部位、および/または周囲配列は配列番号26の変異体である。別の実施形態において、このattPP´部位はその他各種のU153attPP´部位 当該技術分野で既知の。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、このattPP´部位はA118attPP´部位である。別の実施形態において、この部位の配列は以下のとおりである。すなわち、
tttagtttctcgtttcttcttcttccaacgagagaaaacgaggaactaa(配列番号42;att部位は下線で示す;GenBankアクセッション番号:AJ242593)である。別の実施形態において、このattPP´部位、コア組込み部位、および/または周囲配列は配列番号42に相同である。別の実施形態において、このattPP´部位、コア組込み部位、および/または周囲配列は配列番号42の変異体である。別の実施形態において、このattPP´部位は、GenBankアクセッション番号:NC_003216に示す部位である。別の実施形態において、このattPP´部位は当該技術分野で既知のその他各種のA118attPP´部位である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、このattPP´部位はPSAattPP´部位である。別の実施形態において、この部位の配列は、
ttacataaaatgtttgtggtattatttgtggtatatatatcctaaatggctttatatcagtgtgtgttaatccctctcaggacgttaaatagtaa(配列番号43;att部位は下線で示す;GenBankアクセッション番号:AJ312240)である。別の実施形態において、このattPP´部位、コア組込み部位、および/または周囲配列は、配列番号43と相同である。別の実施形態において、このattPP´部位、コア組込み部位、および/または周囲配列は配列番号43の変異体である。別の実施形態において、このattPP´部位は当該技術分野で既知のその他各種のPSAattPP´部位である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、このattPP´部位は当該技術分野で既知のその他各種のattPP´部位である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
本発明の方法および組成物のattBB´部位は、別の実施形態において、A118に対するattBB´部位である。別の実施形態において、このattBB´部位は以下の配列を有する。すなわち、
ttacataaaatgtttgtggtattatttgtggtattccaaaaaaacttaagaaggttcttacnattcttagtttttcatatattcttactccaaaaagctaggcatttccctgtgaattttattcattttttctgtaagtttcataaattccgctttgttcctattatcgagagctttatcaatttcagctctaagttgttctaattttctctcttctaggagcatcgtcaggaagcattcgataaaaacgtttgttaattctttttcacccttaaggacacccacctgattcatcaacgaattagaaaaatcacgcatttccacgactaccactccttcactcatatttattacaatcttaaaaaattgtaatatgccaagaaaaaacagaaaacagcttgaaaatacaactttactaatatctaatgacttgcaaattaccatgtgctataatgacaaaaaataactcataactaactttgatgcttagtcgttacttagaagttttgcttattaggcaataactctaggtttcttcttagacataaatacaaacatagaggagttgaatgaaatgaaaaaagaacaaatcagtactcagttttatgaagtaaacccgcacacgatgattatttttccaaaaaaatctggaagtatagtctattcagaaatttatgaagttgattctcattatacttctaaatttaccccgtttgagctaattaaaaccagctgtaactttttcggatcaagctatgaaggacgcaaagagggaactaaacacttaattggtgttacccataagccacccattatcattgacccagtcacttctacttatgtatttccaactgtagcaccaagttcaacagaatgcatttggattttcccacaacatattaaagattatcatgcaattggatttaaccacactttaataacattttctaatatggaaacctttgagattgatatgtctttagcatcttttaataatcagattgccagaacctccatgttacatatgaaattttctcaaaaaatgcgtatgatggagagtaatttcccttcaatgaataggtttttcccaccaaccactcttgctgctgaacctaagacgttattacagcaccatgcttccaaataatgaagaacctaatgatcctcaagatcccgagcaataaatttaaaactaaataaaagccagctacgtaatagtagctggcttttccttaaaatcattttttattctcaatcgcatctgcaattcgttttaacattaataactcatcctctgagtatgtataaggtagttctaaataccatttctcgagttcaggatttccaattaaaggaaaggcgtttaccgaattcttttctcgcaaaccagctacatcatctaataagaaatcggttgttgttccaagaatttctgctaatttagccaaaataaaaattggcggtcggtggttatcattttcatacttgcttattgtggatgcagttgtcccgattttcgccgccagttgttttntgtgttaacctatttttctttcgtaaatgaattaatttttctccaaattccaatacgcccacctcacttccttccagtatagcaatttttcggaaagaattcgagaaattctaaaaagaaatcgctttttaggtttcaaaagacattttcccgtatttatacag(配列番号:44;att部位は下線で示す;GenBankアクセッション番号:AF174588)である。別の実施形態において、このattBB´部位は、配列番号:44に相同である。別の実施形態において、このattBB´部位は、配列番号:44の変異体である。別の実施形態において、このattBB´部位は、当該技術分野で既知のその他各種のA118attBB´部位である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、このattBB´部位はPSAに対するattBB´部位である。別の実施形態において、このattBB´部位は、以下の配列を有する。すなわち、
tgtcctgatagctcagctggatagagcaacggccttctaagccgtcggtcgggggttcgaatccctctcaggacgtaaatagctatatta(配列番号45;att部位を下線で示す;GenBankアクセッション番号:AJ314913)である。別の実施形態において、このattBB´部位は、配列番号45に相同である。別の実施形態において、このattBB´部位は、配列番号45の変異体である。別の実施形態において、このattBB´部位は当該技術分野で既知のその他各種のPSA attBB´部位である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、このattBB´部位はU153に対するattBB´部位である。
別の実施形態において、このattBB´部位は、t−RNAArgに対するこの遺伝子内にある。別の実施形態において、このattBB´部位は、t−RNAArgに対するこの遺伝子の近傍にある。別の実施形態において、このattBB´部位は、comKに対するこの遺伝子内にある。別の実施形態において、このattBB´部位は、comKに対するこの遺伝子の近傍にある。別の実施形態において、このattBB´部位は、当該技術分野で既知のその他各種のLM遺伝子の範囲内である。別の実施形態において、このattBB´部位は、当該技術分野で既知のその他各種のLM遺伝子の近傍にある。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、このattBB´部位は当該技術分野で既知のその他各種のattBB´部位である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
本発明の方法および組成物のインテグラーゼタンパク質は、別の実施形態において、U153インテグラーゼである。別の実施形態において、このインテグラーゼタンパク質は配列番号26の残基272−1630に示す配列を有するヌクレオチド分子によりコードされる。別の実施形態において、このインテグラーゼをコードするヌクレオチドは配列番号26に相同である。別の実施形態において、このインテグラーゼをコードするヌクレオチドは配列番号26の変異体である。別の実施形態において、このインテグラーゼをコードするヌクレオチドは配列番号26の断片である。別の実施形態において、このインテグラーゼタンパク質は当該技術分野で既知のその他各種のU153インテグラーゼ遺伝子によりコードされる。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記インテグラーゼタンパク質は以下の配列を有する。すなわち、
MKAAIYIRVSTQEQIENYSIQAQTEKLTALCRSKDWDVYDIFIDGGYSGSNMNRPALNEMLSKLHEIDAVVVYRLDRLSRSQRDTITLIEEYFLKNNVEFVSLSETLDTSSPFGRAMIGILSVFAQLERETIRDRMVMGKIXRIEAGLPLTTAKGRTFGYDVIDTKLYINEEEAKQLQMIYDIFEEEKSITTLQKRLKKLGFKVKSYSSYNNWLTNDLYCGYVSYADKVHTKGVHEPIISEEQFYRVQEIFSRMGKNPNMNRDSASLLNNLVVCGKCGLGFVHRRKDTVSRGKKYHYRYYSCKTYKHTHELEKCGNKIWRADKLEELIIDRVNNYSFASRNVDKEDELDSLNEKLKTEHVKKKRLFDLYISGSYEVSELDAMMADIDAQINYYEAQIEANEELKKNKKIQENLADLATVDFDSLEFREKQLYLKSLINKIYIDGEQVTIEWL(配列番号27)である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号27に相同である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは 配列番号27の変異体である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号27のアイソフォームである。別の実施形態において、前記インテグラーゼは 配列番号27の断片である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは、当該技術分野で既知のその他各種のU153インテグラーゼである。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記インテグラーゼはPSAインテグラーゼである。別の実施形態において、前記インテグラーゼは、以下の配列を有する遺伝子によりコードされる。すなわち、
ttattccgttgtttttgtggcatttgtggtaaaatttgtggtattttcatctgtttttagtgtgaaaaaagcatctactttggactgattatgttgtcttaaattagagcttagatgactatagtattttaatgttgtattaatgtcatcatgaccaagcctatcagctacataaataatatccatacccgcttctacacataagcctgtatgcgtatgtcgtagcttgtgtaatgtcactggttcagaattgattgtactacatatcttcttcaaagctttattacaagacgcgttgtctactggcttattgtggtaagtgatgaataataacatcaatggattcttaatagcatgttccttcatataatcagtatgccaatttaaatacgaatgtaaatattgagcggtagagttatcaatatagatcactcgtgatttttttgttttggtatcaatgaatgtattagtgtacttgtaatcccaagctttattcacagttattgaacgtttagtgaaattaatatccttctttgttagtgcaataatttcttcgaacctcatgcctgtctggacagctagaaagataactgctcgtgatatagaatgaaattttgcaagttcttctaatagtaaatgaactttgtctgtttccataaattgtgctttatttttcgctacgtcctgtccgcttatatgagcccctatagtggggtttttcttcatgtaacctaaatgaacagccttgttaaaaatcgctctaattttgcggtgtctggtgtctacagtggatattgcatagtctacagataaatgattaataaattgttgatattgaaccgcatcaatcgaattaagtttaattttttcatcgaaataatcaacgaattgattataagcaagatcgtataaattaatagtagattgactacttttcccatctttaaatgttttcatgaatagcgtataaaattctttgaagttccattctttcagagaactactatcatgctgaacttgttttaataatttagatgctttatacattaagtttgtttcacttgtatctgtcaaacgcttttctttccattcaccatcgacttttatacgtaggcgaacacaatatttaccgtttgctaatttttttatcttcat(配列番号46;GenBankアクセッション番号:AJ312240)である。別の実施形態において、前記インテグラーゼをコードするヌクレオチドは、配列番号46に相同である。別の実施形態において、前記インテグラーゼをコードするヌクレオチドは配列番号46の変異体である。別の実施形態において、前記インテグラーゼをコードするヌクレオチドは配列番号46の断片である。別の実施形態において、このインテグラーゼタンパク質は当該技術分野で既知のその他各種のPSAインテグラーゼ遺伝子によりコードされる。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記インテグラーゼの配列は以下のとおりである。すなわち、
MKIKKLANGKYCVRLRIKVDGEWKEKRLTDTSETNLMYKASKLLKQVQHDSSSLKEWNFKEFYTLFMKTFKDGKSSQSTINLYDLAYNQFVDYFDEKIKLNSIDAVQYQQFINHLSVDYAISTVDTRHRKIRAIFNKAVHLGYMKKNPTIGAHISGQDVAKNKAQFMETDKVHLLLEELAKFHSISRAVIFLAVQTGMRFEEIIALTKKDINFTKRSITVNKAWDYKYTNTFIDTKTKKSRVIYIDNSTAQYLHSYLNWHTDYMKEHAIKNPLMLLFITYHNKPVDNASCNKALKKICSTINSEPVTLHKLRHTHTGLCVEAGMDIIYVADRLGHDDINTTLKYYSHLSSNLRQHNQSKVDAFFTLKTDENTTNFTTNATKTTE(配列番号47;GenBankアクセッション番号:AJ312240)である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号47に相同である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号47の変異体である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号47のアイソフォームである。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号47の断片である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは当該技術分野で既知のその他各種のPSAインテグラーゼである。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記インテグラーゼはA118インテグラーゼである。別の実施形態において、前記インテグラーゼは、以下の配列を有する遺伝子によりコードされる。すなわち、
caagctactagagccattcaatagtaacttgttcaccatcaatataaattttgtttattagtgattttaaataaagttgcttttctctgaactctaaagagtcaaaatcaactgttgctaaatcagctaaattttcttgtatctttttgtttttcttcaattcttcgttagcttctatttgtgattcataataattaatttgagcatcaatatcattcatcatagaatcaagttctgaaacttcatacgagccatttatatataaatcaaataatcgttttttctttgcatgttctattttaagcttttcatttaagctatctaattcatcttctttatctacatttctggaagcgaaactataattattcacacgattaataattaattcttcaagtttgtcagctctccaaattttattcccgcatttttcgagttcatgagtatgtttataagtcttgcaactataatatctataatgatattttttaccacgcgacattgtatcttttctacgatgaacaaagcctaacccgcatttactacaaactactaaattatttagcaacgatgctgaatctctattcatgttcggatttttacccatacgagtaaatatttcttgaactctatagaattgctcttcactgatgataggttcatgaataccttttacatgaactttatctttatatgaaacataaccacaatacaaatcattagttagccagttgttatagcgattatatgttctaactttaaagcctaatttttttagtcttttctgtaaaaaagttatactttgttcttcttcgaaaatatcataaatcagttgtaactgttttgcttcttcttcattaatgtataattttgtatctataacatcatagccgaacgttctacctttcgcagttgttaacggaagacctgcttcaatacgcttaattttccccatcaccatacgatctcggattgtttcgcgctctagctgtgcgaatactgataatataccaatcattgcacgaccgaaaggggaactagtatcaagcgtttcagacaaactaacaaactctacattgttttttaagaagtattcttcaataagcgttattgtgtctctttgtgagcgggatagtctgtctaatcgatatacgactacagcatcaatttcgtgtagtttacttagcatttcatttaatgcgggacgattcatatttgagccggagtatccgccgtcaatgaaaatatcgtatacgtcccagtccttcgagcggcacaatgctgttagtttttcagtttgagcttgtattgaataattttctacttgctcttgagtagaaacacgtatataaatagctgccttcatttcc(配列番号48;GenBankアクセッション番号:AJ242593)である。別の実施形態において、前記インテグラーゼをコードするヌクレオチドは、配列番号48に相同である。別の実施形態において、前記インテグラーゼをコードするヌクレオチドは配列番号48の変異体である。別の実施形態において、前記インテグラーゼをコードするヌクレオチドは配列番号48の断片である。別の実施形態において、前記インテグラーゼタンパク質は、当該技術分野で既知のその他各種のA118インテグラーゼ遺伝子によりコードされる。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記インテグラーゼの配列は以下のとおりである。すなわち、
MKAAIYIRVSTQEQVENYSIQAQTEKLTALCRSKDWDVYDIFIDGGYSGSNMNRPALNEMLSKLHEIDAVVVYRLDRLSRSQRDTITLIEEYFLKNNVEFVSLSETLDTSSPFGRAMIGILSVFAQLERETIRDRMVMGKIKRIEAGLPLTTAKGRTFGYDVIDTKLYINEEEAKQLQLIYDIFEEEQSITFLQKRLKKLGFKVRTYNRYNNWLTNDLYCGYVSYKDKVHVKGIHEPIISEEQFYRVQEIFTRMGKNPNMNRDSASLLNNLVVCSKCGLGFVHRRKDTMSRGKKYHYRYYSCKTYKHTHELEKCGNKIWRADKLEELIINRVNNYSFASRNVDKEDELDSLNEKLKIEHAKKKRLFDLYINGSYEVSELDSMMNDIDAQINYYESQIEANEELKKNKKIQENLADLATVDFDSLEFREKQLYLKSLINKIYIDGEQVTIEWL(配列番号49;GenBankアクセッション番号:AJ242593)である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは、配列番号49に相同である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号49の変異体である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号49のアイソフォームである。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号49の断片である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは、当該技術分野で既知のその他各種のA118インテグラーゼである。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記インテグラーゼ遺伝子は当該技術分野で既知のその他各種のインテグラーゼ遺伝子である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記インテグラーゼ遺伝子はリステリアp60プロモーターの制御下で発現する。別の実施形態において、(インターナリンをコードする)inlAプロモーターが使用される。別の実施形態において、hlyプロモーターが使用される。別の実施形態において、ActAプロモーターが使用される。別の実施形態において、前記インテグラーゼ遺伝子は、その他各種のグラム陽性プロモーターの制御下で発現する。別の実施形態において、前記インテグラーゼ遺伝子は、リステリア中で機能するその他各種のプロモーターの制御下で発現する。当業者は、別のプロモーターまたは多シストロン性の発現カセットがこの遺伝子の発現を引き起こすのに使用できると考えるであろう。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明の核酸コンストラクトの栄養要求性リステリア菌株のゲノムへの組込みの工程は、2段階の対立遺伝子交換を利用している。別の実施形態において、この組込み工程は、ファージベースの組込みベクターを利用する。別の実施形態において、この組込み工程は当該技術分野で既知のその他各種の組込み方法を利用する。
別の実施形態において、この核酸コンストラクトの組込み工程は、栄養要求性リステリア菌株のプロファージ組込み部位を利用する。別の実施形態において、この組込み工程は、当該技術分野で既知のその他各種の組込み部位を利用する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明は、生体外および生体内で代謝遺伝子を欠損している変異体株の相補性により保持されているリステリア菌−大腸菌シャトルプラスミドを提供する。一実施形態において、前記代謝遺伝子は、D−アラニンラセマーゼ遺伝子である。別の実施形態において、前記代謝遺伝子は、当該技術分野で既知のその他各種の代謝遺伝子である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明は、(a)変異代謝酵素をコードする遺伝子中で菌株に導入する工程と、(b)代謝酵素をコードするヌクレオチド配列を有するプラスミドでこの株に形質移入し、これによりバクテリアワクチン株を弱毒化する工程とを含む、バクテリアワクチン株を弱毒化する方法を提供する。
別の実施形態において、本発明はリステリアワクチン株を弱毒化する方法を提供し、該方法は(a)代謝酵素をコードする遺伝子中での変異を菌株に導入する工程と、(b)およびこの株にこの代謝酵素コードするヌクレオチド配列を有する組込みベクターで形質移入し、これにより代謝酵素ワクチン株を弱毒化する工程とを含む。
一実施形態において、本発明の方法および組成物の代謝遺伝子は、誘導性プロモーターのもとで発現する。別の実施形態において、このプロモーターは、構成的プロモーターである。別の実施形態において、このプロモーターは当該技術分野で既知のその他各種のプロモーターである。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明は、本発明の方法により構築されるバクテリアワクチン株を提供する。
別の実施形態において、本発明は、本発明の方法により構築されるリステリアワクチン株を提供する。
各種実施形態において、本発明の方法および組成物の抗原として、これらには限らないが、以下の感染症由来の抗原が挙げられる。すなわち、別の肝炎ウイルス、A型インフルエンザ、別種のインフルエンザ、アデノウイルス(例えば、4および7型)、狂犬病(例えば、GenBankアクセッション番号:M34678)、黄熱、日本脳炎(例えば、GenBankアクセッション番号:E07883)、デング熱(例えば、GenBankアクセッション番号:M24444)、ハンタウイルス、およびHIV(例えば、GenBankアクセッション番号:U18552)はもとより、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、灰白髄炎、A型およびB型肝炎(例えば、GenBankアクセッション番号:E02707)、およびC型肝炎(例えば、GenBankアクセッション番号:E06890)が挙げられる。バクテリア抗原および寄生虫抗原は、これらには限られないが、以下の疾患の既知の原因物質から誘導される。すなわち、ジフテリア、百日咳(例えば、GenBankアクセッション番号:M35274)、破傷風(例えば、GenBankアクセッション番号:M64353)、結核、バクテリアおよび真菌性肺炎(例えば、ヘモフィリスインフルエンザやニューモシスチスカリニ肺炎等)、コレラ、腸チフス、ペスト、細菌性赤痢、サルモネラ症(例えば、GenBankアクセッション番号:L03833)、レジオネラ病、ライム病(例えば、GenBankアクセッション番号:U59487)、マラリア(例えば、GenBankアクセッション番号:X53832)、鉤虫、オンコセルカ症(例えば、GenBankアクセッション番号:M27807)、住血吸虫症(例えば、GenBankアクセッション番号:L08198)、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、ジアルジア症(例えば、GenBankアクセッション番号:M33641)、アメーバ症、フィラリア症(例えば、GenBankアクセッション番号:J03266)、ボレリア症、および旋毛虫症が挙げられる。
別の実施形態において、この抗原は、この以下の腫瘍抗原の1つであり:これらの多様なMAGE(黒色腫随伴抗原E)のいずれでもよく、例えば、MAGE1(例えば、GenBankアクセッション番号:M77481)、MAGE2(例えば、GenBankアクセッション番号:U03735)、MAGE3、MAGE4等;各種チロシナーゼ;変異体ras;変異体p53(例えば、GenBankアクセッション番号:X54156およびAA494311);およびp97黒色腫 抗原(例えば、GenBankアクセッション番号:M12154)が挙げられる。別の腫瘍特異抗原として、進行癌に伴うRasペプチドおよびp53ペプチド、子宮頚癌に伴うHPV16/18およびE6/E7抗原、乳癌癌腫随伴MUC1抗原(例えば、GenBankアクセッション番号:J0365 1)、結腸直腸癌に伴うCEA(癌胎児性抗原)(例えば、GenBankアクセッション番号:X983 11)、黒色腫に伴うgp100(例えば、GenBankアクセッション番号:S73003)またはMART1抗原、および前立腺癌に伴う前立腺癌特異抗原(KLK3)(例えば、GenBankアクセッション番号:X14810)が挙げられる。このp53遺伝子配列は既知であり(例えば、Harrisら.(1986)Mol.Cell.Biol.,6:4650-4656を参照)、GenBankにアクセッション番号:M14694として登録されている。本発明に包含される腫瘍抗原はさらに、これらに限らないが、Her−2/Neu(例えば、GenBankアクセッション番号:M16789.1、M16790.1、M16791.1、M16792.1)、NY−ESO−1(例えば、GenBankアクセッション番号:U87459)、hTERT(akaテロメラーゼ)(GenBankアクセッション番号:NM003219(変異体1)、NM198255(変異体2)、NM198253(変異体3)、およびNM198254(変異体4)、プロテアーゼ3(例えば、GenBankアクセッション番号:M29142、M75154、M96839、X55668、NM00277、M96628およびX56606)HPV E6およびE7(例えば、GenBankアクセッション番号:NC001526)およびWT−1(例えば、GenBankアクセッション番号:NM000378(変異体A)、NM024424(変異体B)、NM024425(変異体C)、およびNM024426(変異体D))、Her−2/Neu(例えば、GenBankアクセッション番号:M16789.1、M16790.1、M16791.1、M16792.1)、NY−ESO−1(例えば、GenBankアクセッション番号:U87459)、hTERT(akaテロメラーゼ)(GenBankアクセッション番号:NM003219(変異体1)、NM198255(変異体2)、NM198253(変異体3)、およびNM198254(変異体4)、プロテアーゼ3(例えば、GenBankアクセッション番号:M29142、M75154、M96839、X55668、NM00277、M96628およびX56606)HPV E6およびE7(例えば、GenBankアクセッション番号:NC001526)、WT−1(例えば、GenBankアクセッション番号:NM000378(変異体A)、NM024424(変異体B)、NM024425(変異体C)、およびNM024426(変異体D))、および角質層キモトリプシン酵素(SCCE;GenBankアクセッション番号:NM_005046およびNM_139277))を含む。従って、本発明は、これらには限らないが、子宮頚癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肺癌、等の癌および黒色腫に対する免疫療法として使用することができる。
これらの上記抗原の各々は、本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、この抗原をコードする遺伝子はリステリアp60プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態において、inlA(インターナリンをコードする)プロモーターが使用される。別の実施形態において、このhlyプロモーターが使用される。別の実施形態において、ActAプロモーターが使用される。別の実施形態において、このインテグラーゼ遺伝子はその他各種のグラム陽性プロモーターの制御下で発現する。別の実施形態において、前記抗原をコードする遺伝子はリステリア中で機能するその他各種のプロモーターの制御下で発現する。当業者は、別のプロモーターまたは多シストロン性の発現カセットがこの遺伝子の発現を引き起こすのに使用できることがわかるだろう。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
本発明の方法および組成物の他の実施形態において、その核酸配列によりコードされるポリペプチドは、その異種抗原およびさらにポリペプチドを有する融合タンパク質である。一実施形態において、このさらに含まれるポリペプチドは、非溶血性LLOタンパク質またはその断片(本願明細書に記載の実施例)である。別の実施形態において、このさらに含まれるポリペプチドは、PEST配列である。別の実施形態において、このさらに含まれるポリペプチドは、ActAタンパク質またはその断片である。ActAタンパク質およびその断片は、抗原の提示および免疫をLLOに同様の様態で増強する。
本発明の方法および組成物における前記のさらに含まれるポリペプチドは、別の実施形態において、リステリオリシン(LLO)ペプチドである。別の実施形態において、前記のさらに含まれるポリペプチドはActAペプチドである。別の実施形態において、前記のさらに含まれるポリペプチドはPEST様配列ペプチドである。別の実施形態において、前記のさらに含まれるポリペプチドは抗原ペプチドの免疫原性を高めることのできるその他各種のペプチドである。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
本発明のコンストラクトワクチンに使用されるLLOタンパク質は、別の実施形態において、以下の配列を有する。すなわち、
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE(GenBankアクセッション番号:P13128;配列番号56;核酸配列はGenBankアクセッション番号:X15127に示す)である。この配列に対応するプロタンパク質の最初の25個のアミノ酸は、シグナル配列であり、バクテリアにより分泌されるとLLOから切断される。従って、本実施形態において、この全長活性LLOタンパク質は504残基の長さを有する。別の実施形態において、このLLOタンパク質は配列番号56の相同体である。別の実施形態において、このLLOタンパク質は配列番号56の変異体である。別の実施形態において、このLLOタンパク質は配列番号56の異性体である。別の実施形態において、このLLOタンパク質は配列番号56の断片である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、「LLOペプチド」および「LLO断片」とはLLOタンパク質のN末端断片を意味する。別の実施形態において、この語は全長ではあるが、非溶血性のLLOタンパク質を意味する。別の実施形態において、これらの用語は配列番号56のシステイン484中の点変異を含む非溶血性タンパク質または相同LLOタンパク質中で対応する残部を意味する。別の実施形態において、このLLO断片は、この全長529AAのLLOタンパク質のおよそ最初の400−441AAを有する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明の組成物および方法に使用されるLLOタンパク質のN末端断片は、以下の配列を有する。すなわち、
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD(配列番号57)である。別の実施形態において、このLLO断片は配列番号57の相同体である。別の実施形態において、このLLO断片は配列番号57の変異体である。別の実施形態において、このLLO断片は配列番号57の異性体である。別の実施形態において、このLLO断片は配列番号57の断片である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、このLLO断片は以下の配列を有する。すなわち、
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTD(配列番号58)である。別の実施形態において、このLLO断片は配列番号58の相同体である。別の実施形態において、このLLO断片は配列番号58の変異体である。別の実施形態において、このLLO断片は配列番号58の異性体である。別の実施形態において、このLLO断片は配列番号58の断片である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、このLLO断片は、当該技術分野で既知のその他各種のLLO断片である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
「ActAペプチド」とは、別の実施形態において、全長ActAタンパク質を意味する。別の実施形態において、この語はActA断片を意味する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
本発明の方法および組成物のActA断片は、別の実施形態において、N末端ActA断片である。別の実施形態において、この断片は、当該技術分野で既知のその他各種のActA断片である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、ActAタンパク質のN末端断片は以下の配列を有する。すなわち、
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIPTEEELNGRGGRP(配列番号59)である。別の実施形態において、このActA断片は配列番号59を有する。別の実施形態において、このActA断片は配列番号59の相同体である。別の実施形態において、このActA断片は配列番号59の変異体である。別の実施形態において、このActA断片は配列番号59の異性体である。別の実施形態において、このActA断片は配列番号59の断片である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、ActAタンパク質のN末端断片は以下の配列を有する。すなわち、
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNN(配列番号60)である。別の実施形態において、このActA断片は配列番号60の相同体である。別の実施形態において、このActA断片は配列番号60の変異体である。別の実施形態において、このActA断片は配列番号60の異性体である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明の方法および組成物のActA断片は、PEST様配列を有する。別の実施形態において、このPEST様配列は、配列番号64−67から選ばれるActA断片に含まれる。別の実施形態において、このActA断片は、配列番号64−67に示すPEST様配列の少なくとも2つを有する。別の実施形態において、このActA断片は配列番号64−67に示すPEST様配列の少なくとも3つを有する。別の実施形態において、このActA断片は配列番号64−67に示す4PEST様配列を有する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、このN末端ActA断片は以下の配列を有するヌクレオチド分子によりコードされる。すなわち、
atgcgtgcgatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattctagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcaaccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattaaagaactagaaaaatcgaataaagtgagaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagaaaaagcagaaaaaggtccaaatatcaataataacaacagtgaacaaactgagaatgcggctataaatgaagaggcttcaggagccgaccgaccagctatacaagtggagcgtcgtcatccaggattgccatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaaggaaagccatagcatcatcggatagtgagcttgaaagccttacttatccggataaaccaacaaaagtaaataagaaaaaagtggcgaaagagtcagttgcggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagatgagtcttcaccacaacctttaaaagcaaaccaacaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaaagcgattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacaccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcagaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcgttcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaatcatccgggaaacagcatcctcgctagattctagttttacaagaggggatttagctagtttgagaaatgctattaatcgccatagtcaaaatttctctgatttcccaccaatcccaacagaagaagagttgaacgggagaggcggtagacca(配列番号:61)である。別の実施形態において、このActA断片は配列番号61を有するヌクレオチド分子によりコードされる。別の実施形態において、このActA断片は配列番号61の相同体であるヌクレオチド分子によりコードされる。別の実施形態において、このActA断片は、配列番号61の変異体であるヌクレオチド分子によりコードされる。別の実施形態において、このActA断片は配列番号61の異性体ヌクレオチド分子によりコードされる。別の実施形態において、このActA断片は配列番号61の断片であるヌクレオチド分子によりコードされる。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明の組換えヌクレオチドは、ActAタンパク質の断片をコードするその他各種の配列を有する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、このActA断片は当該技術分野で既知のその他各種のActA断片である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
本発明の方法および組成物の他の実施形態において、PEST様AA配列は抗原ペプチドに融合する。別の実施形態において、このPEST様AA配列は、配列番号62−70から選ばれる配列を有する。別の実施形態において、このPEST様配列は当該技術分野で既知のその他各種のPEST様配列である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、このPEST様AA配列はKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(配列番号62)である。別の実施形態において、このPEST様配列は、KENSISSMAPPASPPASPK(配列番号63)である。別の実施形態において、本願明細書で列挙するこのPEST様AA配列の1つを含むいずれのLLO配列への抗原ペプチドの融合は、抗原に対する細胞性免疫を高めるのに有効である。
本発明はまた、高免疫原性を有する細胞媒介性および抗腫瘍免疫を高める方法、および抗原に融合した原核生物から誘導されるPEST様アミノ酸配列を有する、増強された免疫原性を有する組成物を提供する。別の実施形態において、このPEST様配列は、抗原内に包埋される。別の実施形態において、このPEST様配列はこの抗原のアミノ終端のいずれかに融合する。別の実施形態において、このPEST様配列はこのカルボキシ終端に融合する。本願明細書中で実証されているように、この抗原のLMのPEST様配列への抗原の融合は、細胞介在性および抗腫瘍免疫を増強した。従って、別の原核生物由来のPEST様配列への抗原の融合は、抗原の免疫原性も高めるであろう。別の原核生物のPEST様配列は、例えばRechsteinerおよびRogers(1996,Trends Biochem.Sci.21:267-271)らのLMに関する方法に従って、日常的に同定できる。別の実施形態において、別の原核生物由来のPEST様AA配列は、この方法に基づき同定される。別の実施形態において、このPEST様AA配列は別のリステリア菌種由来である。例えば、このLMタンパク質ActAは、このような配列を4つ有する。
別の実施形態において、このPEST様AA配列はリステリアActAタンパク質由来のPEST様配列である。別の実施形態において、このPEST様配列はKTEEQPSEVNTGPR(配列番号64)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(配列番号65)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(配列番号66)、またはRGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(配列番号67)である。別の実施形態において、このPEST様配列はリステリア・シーリゲリイ細胞溶解素由来であり、このlso遺伝子によりコードされる。別の実施形態において、このPEST様配列はRSEVTISPAETPESPPATP(配列番号68)である。別の実施形態において、このPEST様配列は連鎖球菌属のストレプトリジンOタンパク質に由来する。別の実施形態において、このPEST様配列は、ストレプトコッカス・ピオゲネス・ストレプトリジンO由来、例えば、AA35−51でのKQNTASTETTTTNEQPK(配列番号69)である。別の実施形態において、このPEST様配列はストレプトコッカス・エクイシミリス・ストレプトリジンO由来、例えば、AA38−54でのKQNTANTETTTTNEQPK(配列番号70)である。別の実施形態において、このPEST様配列は、配列番号62−70から選ばれる配列を有する。別の実施形態において、このPEST様配列は、配列番号64−70から選ばれる配列を有する。別の実施形態において、このPEST様配列は原核生物由来の別のPEST様AA配列である。
別の原核生物のPEST様配列は、別の実施形態において、例えば、RechsteinerおよびRogers(1996,Trends Biochem.Sci.21:267-271)によるLMに関する方法に従って同定できる。あるいは、別の原核生物由来のPEST様AA配列もこの方法に基づき同定できる。PEST様AA配列を有すると期待できる別の原核生物は、これらに限らないが、別のリステリア菌種である。別の実施形態において、このPEST様配列はこの抗原タンパク質内に包理されている。従って、別の実施形態において、「融合」とは、この抗原ペプチドおよびこの抗原ペプチドの1端で結合またはこの抗原ペプチド内に包理されているこのPEST様アミノ酸配列の両者を有する抗原タンパク質を意味する。
別の実施形態において、このPEST様配列は、このPESTFindプログラムにより同定できる。別の実施形態において、PEST様配列は、プロリン(P)、アスパラギン酸塩(D)、グルタミン酸塩(E)、セリン(S)、および/またはスレオニン(T)残基を局所的に高濃度に含む少なくとも12AAの長さを有する親水性のストレッチと定義される。別の実施形態において、PEST様配列は、正に荷電したAA、つまりアルギニン(R)、ヒスチジン(H)およびリジン(K)を含まない。
別の実施形態において、PESTモチーフの同定は、この特定されたタンパク質配列内で正に荷電したAAR、H、およびKを初期走査することでできる。正に荷電した隣接部間の全てのAAがカウントされ、これらのモチーフのみがこのウィンドウサイズパラメータ以上の数のAAをさらに有すると考えられる。別の実施形態において、PEST様配列は少なくとも1P、1DまたはE、および少なくとも1SまたはTを有していなければならない。
別の実施形態において、PESTモチーフの質は、このモチーフの疎水性はもとより、この重要なAAの局所的な濃縮に基づいたスコアパラメータを用いることで高められる。D、E、P、SおよびTの濃縮は、質量%(w/w)で表され、DまたはEの1当量、Pの1当量およびSまたはTの1当量について補正される。別の実施形態において、疎水性の計算は、原則として、J.KyteおよびR.F.Doolittle(Kyte,JおよびDootlittle,RF.J.Mol.Biol.157,105(1982))の方法に従う。簡略化した計算として、Kyte‐Doolittle疎水性親水性指標は、もともとアルギニンの−4.5からイソロイシンの+4.5の範囲であるが、この以下の線形変換を用いて正の整数に変換し、アルギニンの0からソロイシンの90の値となる。
疎水性親水性指標インデックス=10×Kyte−Doolittle疎水性親水性指標インデックス+45
別の実施形態において、潜在的PESTモチーフの疎水性は、これらの生成物のモル%および疎水性インデックスを各AA菌種について加算することで計算される。この望ましいPESTスコアは、局所的な濃縮の項および疎水性の項の組み合わせとして得られ、以下の式で表される。
PESTスコア=0.55×DEPST−0.5×疎水性インデックス
別の実施形態において、「PEST様配列」または「PEST様配列ペプチド」とは、上記のアルゴリズムによるスコアが少なくとも+4であるペプチドを意味する。別の実施形態において、この用語はスコアが少なくとも4.7のペプチドを意味する。別の実施形態において、このペプチドのスコアは少なくとも5である。別の実施形態において、このペプチドのスコアは少なくとも6である。別の実施形態において、このペプチドのスコアは少なくとも7である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも8である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも9。別の実施形態において、このスコアは少なくとも10である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも11である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも12である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも13である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも14である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも15である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも16である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも17である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも18である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも19である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも20である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも21である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも22である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも22である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも24である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも24である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも25である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも26である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも27である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも28である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも29である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも30である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも32である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも35である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも38である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも40である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも45である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、前記PEST様配列は、当該技術分野で既知のその他各種の方法またはアルゴリズム、例えばこのCaSPredictor(Garay-Malpartida HM,Occhiucci JM,Alves J,Belizario JE.Bioinformatics.2005 Jun;21 Suppl 1:i169-76)を用いて同定できる。別の実施形態において、以下の方法が使用される。
PESTインデックスは、このAA Ser、Thr、Pro、Glu、Asp、Asn、またはGlnに値1を代入することで、適当な長さの(例えば、30−35AAストレッチ)の各ストレッチについて計算される。各PEST残部に対するこの係数値(CV)は、各々について1であり、別のAA(非PEST)の各々については0である。
PEST様配列を同定する各方法は、本発明の個々の実施形態を表す。
「PEST様配列への融合」とは、別の実施形態において、PEST様配列を有するタンパク質断片への融合である。別の実施形態において、この用語はこのタンパク質断片がこのPEST様配列とは別の周囲配列を有する場合を含む。別の実施形態において、このタンパク質断片はこのPEST様配列を有する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
一実施形態において、本発明のAベクターは、生命体中での抗生物質耐性を亢進させる恐れなく、リステリアワクチンベクターバクテリアの長所を提供する。
別の実施形態において、本発明のワクチン株の利点は、それに含有されるこれらの組換え核酸分子またはプラスミドが、そのgutでの別のバクテリアへの潜在的移行の際に保持される可能性が低いことである。別の実施形態において、この利点は、これらの核酸分子またはプラスミドが正常細胞では進化的な利点を与えないことである。別の実施形態において、この利点は、これらの核酸分子またはプラスミドが分割配列のような能動的保持システムを有さないことである。従って、これらの欠損宿主細胞の外側で、これらの核酸分子またはプラスミドは、この集団から希釈されて、究極的には時間の経過と共に除去される可能性が高いであろう。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明は提供するキットは、本発明の抗生物質耐性のないバクテリア株、薬学的に許容可能な担体、アプリケータ、およびその使用に関する説明書を含む。
別の実施形態において、本発明は提供するキットは、本発明の抗生物質耐性のない菌株、アプリケータ、およびその使用に関する説明書を含む。
「アラニンラセマーゼ」とは、一実施形態において、このアミノ酸アラニンのL−異性体をそのD−異性体に変換する酵素を意味する。別の実施形態において、そのような酵素は、このEC番号5.1.1.1で知られている。
「アミノ酸代謝酵素」とは、一実施形態において、アミノ酸を一形態から別の形態に変換する機能的役割を有するペプチドまたはタンパク質を意味し、例えばこれらには限らないが、このアミノ酸の立体化学を変化させたり、アミノ酸の加水分解または置換基付加や、アミノ酸の切断等を意味する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
「栄養要求性バクテリア」の語は、一実施形態において、そのような増殖または複製を可能にするような因子の補給無しには、増殖または複製のできないバクテリア下部を意味する。各因子は本発明の個々の実施形態を表す。
「融合タンパク質」とは、一実施形態において、2つまたはそれ以上の共に結合したタンパク質を含むタンパク質を意味する。一実施形態において、このタンパク質は、ペプチド結合により結合している。別の実施形態において、このタンパク質は、別の化学結合により結合している。別の実施形態において、これらのタンパク質は、スペーサと呼べるような、この2つまたはそれ以上のタンパク質間において1つまたはそれ以上のアミノ酸で結合している。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明の方法および組成物が標的とする腫瘍は乳癌である。別の実施形態において、この癌は黒色腫である。別の実施形態において、この癌は神経膠腫腫瘍である。別の実施形態において、この癌は卵巣腫瘍である。別の実施形態において、この癌は乳腺癌である。別の実施形態において、この癌は上衣細胞腫である。
別の実施形態において、この癌は黒色腫である。別の実施形態において、この癌は肉腫である。別の実施形態において、この癌は癌腫である。別の実施形態において、この癌はリンパ腫である。別の実施形態において、この癌は白血病である。別の実施形態において、この癌は中皮腫である。別の実施形態において、この癌は神経膠腫である。別の実施形態において、この癌は胚細胞腫瘍である。別の実施形態において、この癌は絨毛癌である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、この癌は膵臓癌である。別の実施形態において、この癌は卵巣癌。別の実施形態において、この癌は胃癌である。別の実施形態において、この癌はこの膵臓の癌性病変である。別の実施形態において、この癌は肺腺癌である。別の実施形態において、この癌は結腸直腸腺癌である。別の実施形態において、この癌は肺扁平上皮腺癌である。別の実施形態において、この癌は胃腺癌である。別の実施形態において、この癌は卵巣表面上皮性腫瘍(例えば、それらの良性、増殖性または悪性型)である。別の実施形態において、この癌は口腔扁平上皮細胞癌腫。別の実施形態において、この癌は非小細胞肺癌腫である。別の実施形態において、この癌は子宮内膜癌腫である。別の実施形態において、この癌は膀胱癌である。別の実施形態において、この癌は頭頸部癌である。別の実施形態において、この癌はa前立腺癌の癌腫である。
別の実施形態において、この癌は急性骨髄性白血病(AML)である。別の実施形態において、この癌は骨髄異形成症候群(MDS)である。別の実施形態において、この癌は非小細胞肺癌(NSCLC)である。別の実施形態において、この癌はウイルムス腫瘍である。別の実施形態において、この癌は白血病である。別の実施形態において、この癌はリンパ腫である。別の実施形態において、この癌は繊維形成性小円形細胞腫瘍である。別の実施形態において、この癌は中皮腫(例えば、悪性中皮腫)である。別の実施形態において、この癌は胃癌である。別の実施形態において、この癌は結腸癌である。別の実施形態において、この癌は肺癌である。別の実施形態において、この癌は乳癌である。別の実施形態において、この癌は胚細胞腫瘍である。別の実施形態において、この癌は卵巣癌である。別の実施形態において、この癌は子宮癌である。別の実施形態において、この癌は甲状腺癌である。別の実施形態において、この癌は肝細胞癌腫である。別の実施形態において、この癌は甲状腺癌である。別の実施形態において、この癌は肝臓癌である。別の実施形態において、この癌は腎臓癌である。別の実施形態において、この癌はカポージ肉腫である。別の実施形態において、この癌は肉腫である。別の実施形態において、この癌は、別の癌腫または肉腫である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の抗原は、これら上記癌の1つに関連している。
別の実施形態において、この癌は当該技術分野で既知のその他各種の癌である。各種の癌は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の抗原は、病原真菌、バクテリア、寄生虫、蠕虫、またはウイルスから誘導される。別の実施形態において、この抗原は、破傷風の類毒素、インフルエンザウイルス由来の赤血球凝集素分子、ジフテリアの類毒素、HIVgp120、HIVgagタンパク質、IgAプロテアーゼ、インスリンペプチドB、スポンゴスポスラ・サブテラニア抗原、ビブリオ感染症抗原、サルモネラ菌抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器多核体ウイルス抗原、ヘモフィリスインフルエンザ外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、またはHPV−16、−18、−31、−33、−35または−45型ヒト乳頭種ウイルス由来のヒト乳頭種ウイルス抗原E1およびE2から選ばれる。
別の実施形態において、この抗原は以下の疾病の1つと関連している。すなわち、コレラ、ジフテリア、ヘモフィリス、肝炎A、肝炎B、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、流行性耳下腺炎、単純ヘルペス1、単純ヘルペス2、帯状疱疹、エプスタイン‐バーウイルス、サイトメガロウイルス、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳3黄熱、アジソン病由来の免疫原および抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルトン症候群、固形および血液媒介腫瘍を含む癌、湿疹、アルツハイマー病、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、I型真性糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、膵臓、肺、骨、および肝臓移植等の移植拒絶反応、グレーブス病、多内分泌腺自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発性動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、セリアック病、抗体介在性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、血清反応陰性脊椎関節炎、鼻炎、シェーグレンの症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑症、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン‐バレー症候群、重症筋無力症、ランバート‐イートン症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんま疹、乳児期の一過性低ガンマグロブリン、骨髄腫、X連鎖高IgM症候群、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、血管拡張性失調症、自己免疫性溶血性貧血症、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ワルデンストロームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ球性白血病、非ホジキン・リンパ腫、マラリア・スポロゾイド周囲タンパク質、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、リステリア症、および炭疸病である。
別の実施形態において、本発明の方法が標的とする感染症は、上記疾病または症状の1つである。
一実施形態において、「変異体」とは、アミノ酸または核酸配列(あるいは別の実施形態においては、生命体または組織)は当該集団の多数とは異なるが、これらの1つであると考えられる共通モードに十分類似している、例えばスプライス変異体を意味する。
一実施形態において、「アイソフォーム」とは分子の型、例えば、タンパク質で同じタンパク質の別のアイソフォームあるいは型と比べて少しだけ異なる型を意味する。アイソフォームは、一実施形態において、異なるが関連する遺伝子から産生でき、または別の実施形態においては、同一遺伝子から代替プライシングにより生ずることができる。別の実施形態において、アイソフォームは、単一のヌクレオチド多型から生じる。
一実施形態において、「断片」とは、その全長タンパク質またはポリペプチドより短い、または有するアミノ酸が少ないタンパク質またはポリペプチドを意味する。別の実施形態において、断片とは、その全長核酸より短い、または有するヌクレオチドが少ない核酸を意味する。別の実施形態において、この断片はN末端断片。別の実施形態において、この断片はC末端断片である。一実施形態において、この断片はこのタンパク質、ペプチド、または核酸の配列内(intrasequential)部分である。一実施形態において、この断片は機能性断片である。別の実施形態において、この断片は免疫原断片である。一実施形態において、断片は10−20個の核酸またはアミノ酸を有し、別の実施形態においては、断片は5つを超える核酸またはアミノ酸を有し、別の実施形態において、断片は100−200個の核酸またはアミノ酸を有し、別の実施形態において、断片は100−500個の核酸またはアミノ酸を有し、別の実施形態において、断片は50−200個の核酸またはアミノ酸を有し、別の実施形態において、断片は10−250個の核酸またはアミノ酸を有する。
一実施形態において、「免疫原性」または「免疫原」は、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体を動物に投与するとその動物における免疫応答を誘発する、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体の生得能力を意味するのに使用している。従って、一実施形態において、「免疫原性を増強する」とは、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体が動物に投与された場合に、動物において免疫応答を誘発するタンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体の能力を増強することを意味する。タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体の免疫応答を誘発する増強能力は、一実施形態において、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体に対してより多い抗体、抗原または生命体に対してより多様な抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体に対しより多くの特異なT細胞、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体に対してより強力な細胞障害性またはヘルパーT細胞応答等により測定できる。
一実施形態において、「治療」とは治療処置または予防的または予備的防御手段を意味し、その目的は上記の対象とする病態または障害を予防または軽減することである。従って一実施形態において治療とは、この疾患、障害、または病状、またはこれらの組み合わせに伴う症状に直接働きかけるまたは治療、抑制、阻害、その重篤度の軽減、発症の遅延、低減を含む。従って、一実施形態において、「治療」とは、とりわけ進行を遅らせ、寛解を促進し、寛解を誘発し、寛解を増進し、回復を早め、別の治療の有効性を増加または耐性を減少させたり、あるいはこれらの組み合わせを意味する。一実施形態において「予防」とは、とりわけ、症状発生の遅延、疾患の再発防止、再発症数または頻度の低減、症候性発作間の潜伏の増進、またはこれらの組み合わせを意味する。一実施形態において「抑制」または「阻害」とは、とりわけ、症状の重篤度の低減、急性発作の重篤度の低減、症状数の低減、疾患関連症状の発生率の低減、症状潜伏の低減、症状の改善、2次的症状の低減、2次感染の低減、患者の延命、またはこれらの組み合わせを意味する。
いくつかの実施形態においては、「〜を含む/有する」とい表現は、当該技術分野で既知の別のポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸 配列はもとより、別の組換えポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列を含むことを意味し、一実施形態においては、抗原またはリステリアポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態においては、「〜からなる」という表現は、本発明の方法で使用する、具体的な組換えポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列、またはその断片を含む組成を意味する。しかしながら、この(これらの)組換えポリペプチドの有用性に直接含まれていない別のポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、「〜を含む/有する」という表現は、特定の組換えポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列、あるいは断片または組換えポリペプチドの組み合わせ、アミノ酸配列、あるいは本発明の核酸配列または断片を有し、本願明細書に記載のどのような形態または実施形態にて本発明の方法で使用する組成を意味する。
別の実施形態において、本発明の配列は、本願明細書中に開示されている配列に相同である。各種タンパク質、ペプチド、またはヌクレオチド配列に対する「相同性」、「相同」等の表現は、一実施形態において、最大百分率で相同性を達成するために配列を整列させ必要に応じてギャップを導入した後の対応する未変性ポリペプチドの残基と同一である候補配列中でのアミノ酸残基の百分率を意味する。別の実施形態において、保存的置換は、配列同一性の一部とし見なしていない。別の実施形態において保存的置換を考慮している。アラインメントに関する方法およびコンピュータプログラムは当該技術分野でよく知られている。
相同性は、別の実施形態において、当該技術分野でよく記載される方法による配列アラインメントに関するコンピュータアルゴリズムにより決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピュータアルゴリズム解析、例えば、BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility)、GENPEPTおよびTREMBLパッケージ等の市販のソフトウェアパッケージのいくつかを利用することを含む。
別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70を70%を超えて選択された配列に対する同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70を72%を超えて選択された配列に対する同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70の1つに対して75%を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70から選ばれる配列に78%を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70から選択される配列に対する80%を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70から選択される配列に対する82%を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70から選択された配列に対する83%を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70の1つに対する85%を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70の1つに対する87%を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70から選択された配列に対する88%を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70の1つに対する90%を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70の1つに対する92%を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70から選択された配列に対する93%を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70の1つに対する95%を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70から選択された配列に対する96%を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70の1つに対する97%を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70の1つに対する98%を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70の1つに対する99%を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同性」とは、配列番号19、26−27、32、および42−70の1つに対して100%の同一性であること意味する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という表現は、本発明のポリペプチドをコードする翻訳領域を有する核酸分子を意味する。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、所定の遺伝子のヌクレオチド配列で、通常1〜5%で変動する。代替対立遺伝子は、目的とする遺伝子を多くの異なる個体または生命体で配列決定することで同定できる。このことは、様々な個体または生命体で同じ遺伝子座を同定するハイブリッド形成プローブを用いることで容易に実施できる。天然の対立遺伝子変異の結果生じ、その機能活性を変えない、このようなヌクレオチドの変種および得られるアミノ酸多型または変種のいずれもが、本発明の範囲内である。
別の実施形態において、2つのポリヌクレオチドを「操作可能に連結されている」と表現している場合、一重らせんまたは二重らせん核酸の部分が、この2つのポリヌクレオチドの少なくとも1つが、特徴的な生理学的効果を他方に及ぼすことのできるように、核酸の部分内に配置された2つのポリヌクレオチドを有することを意味する。例として、遺伝子のコード領域に操作可能に連結したプロモーターは、このコード領域の転写を促進できる。
「プロモーター/制御配列」とは、一実施形態において、プロモーター/制御配列に操作可能に連結した遺伝子産物の発現に必要または発現を促進する核酸配列を意味する。別の実施形態において、この配列はコアプロモーター配列である。別の実施形態において、この配列は、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および別の制御要素も有する。
リステリアワクチン株
本発明の方法および組成物のリステリア菌株は、別の実施形態において、リステリア・モノサイトゲネス(ATCC番号:15313)である。別の実施形態において、このリステリア菌株は組換えリステリア・シーリゲリイ株である。別の実施形態において、このリステリア菌株は組換えリステリア・グレイ株である。別の実施形態において、このリステリア菌株は組換えリステリア・イヴァノビイ株である。別の実施形態において、このリステリア菌株は組換えリステリア・ムラレイ株である。別の実施形態において、このリステリア菌株は組換えリステリア・ウェルシュメリー株である。別の実施形態において、このリステリア菌株は、当該技術分野で既知のその他各種のリステリア菌種の組換え株である。
別の実施形態において、LMδ−ActA変異体(Brundage et al., 1993,Proc.Natl.Acad.Sci., USA,90:11890-11894)、リステリア・モノサイトゲネスδ−plcA(Camilli et al., 1991,J.Exp.Med.,173:751-754)、またはδ−acta、δ−INL−b(Brockstedtet al., 2004,PNAS,101:13832-13837)等の弱毒化リステリア菌株が本発明で用いられる。別の実施形態において、弱毒化リステリア菌株は、この本願明細書の開示を参照すれば当業者なら理解できるように、1つまたはそれ以上のを弱毒化する変異を導入することで構築される。このような株の例として、これらに限らないが、芳香族アミノ酸類に対して栄養要求性であるリステリア菌株(Alexander et al.,1993,Infection and Immunity 61:2245-2248)やリポタイコ酸類の生成に対する変異体(Abachin et al.,2002,Mol.Microbiol.43:1-14)が挙げられる。
別の実施形態において、本発明の組換えリステリア菌株は、動物宿主を通して継代されてきた。別の実施形態において、この継代は、この株のワクチンベクターとしての有効性を最大にする。別の実施形態において、この継代は、このリステリア菌株の免疫原性を安定化する。別の実施形態において、この継代は、このリステリア菌株の病原性を安定化する。別の実施形態において、この境内は、このリステリア菌株の免疫原性を増加させる。別の実施形態において、この継代は、このリステリア菌株の病原性を増加させる。別の実施形態において、この継代は、このリステリア菌株の不安定な亜株を除去する。別の実施形態において、この継代は、このリステリア菌株の不安定な亜株の蔓延を低減する。別の実施形態において、このリステリア菌株は、抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入を有する。別の実施形態において、このリステリア菌株は、この抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子を有するプラスミドを保持する。別の実施形態において、この継代は、本願明細書に記載されるように実施される(例えば、実施例1)。別の実施形態において、この継代は、当該技術分野で既知のその他の方法により実施される。別の実施形態において、本発明の方法は、組換えバクテリア、一実施形態において、リステリアを動物宿主を通して掲題させる工程を含む。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
当業者は、本開示および本願明細書を参照することで、異なる転写プロモーター、ターミネータ、担体ベクターまたは具体的な遺伝子配列(例えば、市販のクローニングベクター)が本発明の方法および組成物にうまく使用できることが容易にわかるであろう。本発明において考えられるように、これらの機能性は、例えば、pUCシリーズとして知られる市販のベクターに提供されている。別の実施形態において、非必須DNA配列(例えば、抗生物質耐性遺伝子)は除去されている。
別の実施形態において、市販のプラスミドが本発明で使用される。このようなプラスミドは各社により販売されており、例えば、Invitrogen社(米国カリフォルニア州La Jolla)、Stratagene社(米国カリフォルニア州La Jolla)、Clontech社(米国カリフォルニア州Palo Alto)、あるいは当該技術分野でよく知られる方法を用いて構築できる。別の実施形態は、、原核生物の複製起点および原核生物での発現を促進するプロモーター/制御要素を有する原核生物発現ベクターであるpCR2.1(米国カリフォルニア州La JollaのInvitrogen社)等のプラスミドである。別の実施形態において、外来性のヌクレオチド配列は、プラスミドのサイズを小さくし、そのなかに配置されるカセットのサイズを大きくするために、除去される。
そのような方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、Sambrookら(1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)およびAusubeiら(1997,Current Protocols in Molecular Biology,Green&Wiley,New York)に記載されている。
抗生物質耐性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製に利用される従来の選択およびクローニング工程に用いられる。本発明において抗生物質耐性遺伝子として、これらに限らないが、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、Iストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール(CAT)、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシン、および当該技術分野でよく知らせるその他のものに耐性を付与する遺伝子産物。各遺伝子が挙げられる。本発明の別の実施形態を表す。
バクテリアを形質転換する方法は当該技術分野でよく知られており、塩化カルシウムを用いたコンピテントセル系方法、電気穿孔法、バクテリオファージ介在形質導入、化学、および物理的形質転換法(de Boer et al,1989、Cell 56:641-649;Miller et al,1995、FASEB J.、9:190-199; Sambrookら.1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York; Ausubelら、1997,Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York;Gerhardtら、eds.,1994,Methods for general and Molecular Bacteriology,American Society for Microbiology,Washington,DC; Miller,1992、A Short Course In Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)を含む。別の実施形態において、本発明のリステリアワクチン株は、電気穿孔法により形質転換される。各方法は本発明の個々の実施形態を表す。
本発明で有用なプラスミドおよび別の発現ベクターは本願明細書中いたる箇所に記載されており、プロモーター/制御配列、グラム陰性およびグラム陽性バクテリアに対する複製起点、融合タンパク質をコードする単離核酸およびアミノ酸代謝遺伝子をコードする単離核酸のような特徴を有することができる。さらにまた、融合タンパク質およびアミノ酸代謝遺伝子をコードする単離核酸は、そのような単離核酸の発現を進行させるのに適したプロモーターを有することになる。バクテリアシステムにおける発現を進行させるのに有用なプロモーターは当該技術分野でよく知られており、バクテリオファージλ、pBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子のblaプロモーター、およびpBR325のクロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子のCATプロモーターを含む。原核生物プロモーターのさらなる例として、バクテリオファージλの主要右および左プロモーター(PLおよびPR)、大腸菌のtRP、recA、lacZ、lad、およびgalプロモーター、このαアミラーゼ(Ulmanen et al.,1985.J.Bacteriol.162:176-182)および枯草菌のS28特異性プロモーター(Gilman et al.,1984 Gene 32:11-20)、桿菌のバクテリオファージのプロモーター(Gryczan,1982,In:The Molecular Biology of the Bacilli,Academic Press,Inc.,New York)、およびストレプトマイセスプロモーター(Ward et al.,1986,Mol.Gen.Genet.203:468-478)が挙げられる。本発明におけるさらなる原核生物プロモーターは、例えば、Glick(1987,J.Ind.Microbiol.1:277-282);Cenatiempo(1986,Biochimie,68:505-516);およびGottesman(1984,Ann.Rev.Genet.18:415-442)に概説されている。本発明におけるプロモーター/制御要素のさらなる例として、これらに限らないが、リステリアprfAプロモーター、リステリアhlyプロモーター、リステリアp60プロモーターおよびリステリアActAプロモーター(GenBankアクセッション番号NC_003210)またはその断片が挙げられる。
別の実施形態において、本発明のプラスミドの方法および組成物は、融合タンパク質をコードする遺伝子を有する。別の実施形態において、部分配列をクローニングされ、適切な制限酵素を用いて切断した適切な部分配列である。別の実施形態において、この断片はその後連結し、望ましいDNA配列を産生する。別の実施形態において、抗原をコードするDNAは、DNA増幅法、例えばポリメラーゼ鎖反応(PCR)を用いて産生される。まず、この未変性DNAのいずれかの新しい終端側のセグメントを別々に増幅する。この一方の増幅配列の5´末端はこのペプチドリンカーをコードするのに対し、他方の増幅配列の3´末端はこのペプチドリンカーもコードする。第1の断片の5´末端はこの第2の断片の3´末端に相補的であるので、これらの2つの断片(部分精製後、例えば、LMPアガロース上で)は、第3のPCR反応における重複鋳型として使用できる。この増幅配列は、コドンと、開放部位(アミノ配列を形成)のカルボキシ側のセグメントと、リンカーと、開放部位(カルボキシル配列を形成)のアミノ側の配列とを有するようになる。この抗原はプラスミドに連結される。各方法は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、本発明は、臨床用途用のファージベースの染色体組込みシステムをさらに含む。必須酵素について栄養要求性である宿主株、これらには限らないが、D−アラニンラセマーゼ、例えばLmdal(−)dat(−)が使用できるだろう。別の実施形態において、「ファージ治療工程」を避けるため、PSAに基づいたファージ組込みシステムが使用される(Lauer,et al.,2002 J Bacteriol,184:4177-4186)。このことは、別の実施形態において、組込み遺伝子を維持するために、抗生物質による継続的な選択を必要とする。従って別の実施形態において、本発明により、抗生物質での選択を必要としないファージベースの染色体組込みシステムの構築を可能にする。それに代わり、栄養要求性宿主株は補完されることになる。
本発明の組換えタンパク質は、別の実施形態において、組換えDNA方法論を用いて合成される。このことは、一実施形態において、この融合タンパク質をコードするDNA配列を作成し、このDNAを本発明のプラスミド等の発現カセットに特定のプロモーター/制御要素の制御下で配置し、このタンパク質を発現させることを含む。別の実施形態において、本発明の融合タンパク質(例えば、非溶血性LLO/抗原)のDNAは、何らかの適切な方法、例えば、クローニングおよび適切な配列の制限または直接的化学合成、Narangらのリン酸三エステル法(1979,Meth.Enzymol.68:90-99)、Brownらのリン酸二エステル法(1979,Meth.Enzymol68:109-151)、Beaucageらのジエチルホスホルアミダイト法(1981,Tetra.Lett.,22:1859-1862)、および米国特許第4,458,066号の固体保持法等の方法等により調製される。
別の実施形態において、化学合成が1重らせんオリゴヌクレオチドを産生するために用いられる。様々な実施形態において、この1重らせんオリゴヌクレオチドは、相補的配列を用いたハイブリッド形成により、あるいは1重らせんを鋳型として用いたDNAポリメラーゼによる重合により、2重らせんDNAに変換する。当業者なら、DNAの化学合成は約100塩基の配列に限られ、これより長い配列は短い配列の連結により得られることがわかるであろう。別の実施形態において、部分配列はクローニングされ、適切な制限酵素を用いて切断した適切な部分配列である。これらの断片は、その後この望ましいDNA配列を産生するため連結される。
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質またはこの組換えタンパク質をコードするDNAは、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)等のDNA増幅方法を用いてクローニングされる。従って、非溶血性LLOに対する遺伝子は、適切な制限部位を有するセンスプライマーおよび別の制限部位、例えば、クローニングを促進する非同一制限部位を有するアンチセンスプライマーを用いて、PCR増幅される。同じことを、抗原をコードする単離核酸に対して繰り返す。非溶血性LLOと抗原配列の連結およびプラスミドまたはベクターへの挿入は、この抗原の終端に結合した非溶血性LLOをコードするベクターを産生する。これらの2つの分子は、直接またはこの制限部位により導入された短いスペーサにより連結される。
別の実施形態において、これらの分子は、1つまたはそれ以上のアミノ酸からなるペプチドスペーサーにより分離され、このスペーサは一般に、タンパク質を連結したり、それらの間の最低限のいくらかの距離または空間関係を維持する以外は、特定の生物学的活性をもたないことになる。別の実施形態において、このスペーサの構成成分AAは、折りたたみ、正味電荷、または疎水性等のある特性に影響するように選択される。別の実施形態において、融合または組換えタンパク質をコードする核酸配列は、大腸菌等の様々な宿主細胞、別のリステリアや酵母等のバクテリア宿主、酵母、COSやCHO等の様々な高等真核細胞、およびHeLa細胞株および骨髄腫細胞株に形質転換される。この組換え融合タンパク質 遺伝子は、各宿主に対して適切な発現制御配列に操作可能に連結することになる。プロモーター/制御配列は、本願明細書のいたるところに詳細に記載されている。別の実施形態において、このプラスミドは、リボソーム結合部位および転写終結シグナルはもとより、プロモーター制御要素をさらに含む。真核細胞については、この制御配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウイルス等由来のプロモーターおよびエンハンサー、およびポリアデニル化配列を有することになる。別の実施形態において、この配列はスプライスドナーおよびアクセプター配列を有する。
これらおよびその他の疾病の抗原は当該技術分野でよく知られており、当業者なら、本開示および本願明細書に記載の方法および手法を参考にすれば、本発明で使用するための非溶血性LLOタンパク質および抗原を有する融合タンパク質を容易に構築できるであろう。別の実施形態において、プラスミドを有する栄養要求性バクテリアを選択するため、形質転換した栄養要求性バクテリアをアミノ酸代謝遺伝子の発現について選択する培地で増殖させる。別の実施形態において、D−グルタミン酸合成について栄養要求性のバクテリアは、D−グルタミン酸合成のための遺伝子を有するプラスミドで形質転換され、この栄養要求性バクテリアは、D−グルタミン酸の非存在下で増殖するが、このプラスミドで形質転換しなかった、またはD−グルタミン酸合成についてタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性バクテリアは増殖しない。別の実施形態において、D−アラニン合成についてバクテリア栄養要求性は、D−アラニン合成のためにアミノ酸代謝酵素をコードする単離核酸を有する場合、形質転換時および本発明のプラスミド発現時、D−アラニンの非存在下では増殖しない。必要な増殖因子、補助剤、アミノ酸類、ビタミン類、抗生物質等を含むまたは欠如している適切な培地を作成する方法は当該技術分野でよく知られており、市販されている(Becton-Dickinson,米国ニュージャージー州Franklin Lakes)。各方法は本発明の個々の実施形態を表す。
別の実施形態において、この本発明のプラスミドを有する栄養要求性バクテリアが適切な培地上で選択されると、このバクテリアは、選択的な圧力下で繁殖する。このような繁殖は、この栄養要求性因子のない培地中でバクテリアを増殖させることを含む。栄養要求性バクテリア中のアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドの存在は、プラスミドがこのバクテリアと共に複製し、従ってそのプラスミドを抱えるバクテリアについて継続的に選択することを確実にする。当業者ならば、本開示と本願明細書に記載の方法を参照すれば、プラスミドを有する栄養要求性バクテリアを増殖している培地の体積を調節することで、用意にリステリアワクチンベクターの産生がスケールアップできるであろう。
一実施形態において、本発明は、抗原、代謝酵素およびインテグラーゼ遺伝子を含む融合タンパク質を提供する。別の実施形態において、本発明は、本発明の核酸分子を含むプラスミドを提供し、一実施形態において、(a)目的とするタンパク質抗原を含むポリペプチドをコードする第1の翻訳領域と、(b)代謝酵素をコードする第2の翻訳領域と、(c)A118またはU153インテグラーゼ遺伝子をコードする第3の翻訳領域とを含む。別の実施形態において、本発明は、本発明の融合タンパク質、ペプチド、プラスミド、核酸分子、または組換えリステリアを有する細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、本発明の融合タンパク質、ペプチド、プラスミド、核酸分子、または組換えリステリアを含む組成物を提供する。別の実施形態において、当該技術分野で既知のような、本発明の組換えリステリアおよびアジュバントを含む組成物を提供する。
一実施形態において、本発明は組換えリステリア菌株を提供し、この組換えリステリア菌株は組込み核酸分子を有し、この組込み核酸分子は、(a)目的とするタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第1の翻訳領域と、(b)代謝酵素をコードする第2の翻訳領域と、(c)ファージ付着部位、第3の翻訳領域をコードするインテグラーゼ遺伝子、またはこれらの組み合わせとを有する。一実施形態において、このファージ付着部位はA118ファージ付着部位であり、あるいは別の実施形態において、U153付着部位である。一実施形態において、このインテグラーゼ遺伝子はA118であり、あるいは別の実施形態において、U153インテグラーゼ遺伝子である。
当業者は、別の実施形態において、別の栄養要求性株および相補性システムが、本発明での使用に採用できることは理解できるであろう。
(実施例1)抗生物質耐性遺伝子の代わりにアミノ酸代謝酵素を含有するプラスミドは生体外および生体内で大腸菌およびLM中に維持される
材料および実験方法
バクテリア株、形質転換、および選択
大腸菌株MB2159を標準プロトコルに従って形質転換に用いた。バクテリア細胞をH2Oで洗浄して電気穿孔法に調製した。
大腸菌株MB2159(Strych Uら、FEMS Microbiol Lett.2001 Mar 15 196(2):93-8)はD−アラニンラセマーゼを合成できないalr(−)/dadX(−)欠損変異体である。リステリア菌株LMdal(−)/dat(−)(Lmdd)は同様に、このdalおよびこのdat遺伝子の部分欠失のため、D−アラニンラセマーゼを合成できない。
Lmddの構築
染色体遺伝子と、もともとの850bpのdal遺伝子PCR産物の5´末端から450bpの断片とそのdal遺伝子PCR産物の3´末端から450bpの断片との間でエリスロマイシン耐性遺伝子を保有する温度感受性シャトルプラスミドpKSV7(Smith Kら、Biochimie.1992 Jul-Aug;74(7-8):705-11)との間におけるダブル対立遺伝子交換により、dal遺伝子をまず最初に不活性化する。続いて、望ましい欠失の周辺の無処置の遺伝子(この遺伝子の配列上流および下流を含む)の5´および3´末端からの相同領域を保持するpKSV7を用いて同様の交換反応により、この遺伝子の82%を占めるdal欠失変異体を構築した。この染色体欠失の構造を確認するのにPCR分析を利用した。
この染色体dat遺伝子を同様の対立遺伝子交換反応により不活性化した。pKSV7を無処置のdat遺伝子(この遺伝子の配列上流および下流を含む)の5´および3´末端からPCRにより誘導した450bpの断片を保持するように改質した。これらの2つの断片を適切なPCRにより連結した。このコンストラクトの染色体への交換は、dat遺伝子の中央塩基の30%の欠失をもたらし、このことはPCR分析により確認した。
バクテリア培養およびリステリアの生体内継代
大腸菌を以下の標準的な方法により培養した。リステリアを37℃250rpmの振とう条件で、LB培地(Difco社、米国ミシガン州Detroit)に+50μg/mlのストレプトマイシンを加えた培地中で増殖させ、対数増殖期に収集した。Lm−LLOE7については、37μg/mlのクロラムフェニコールを前記培地に添加した。増殖動力学については、バクテリアを16時間10mlのLB+抗生物質中で増殖させた。このOD600nmを測定し、培養密度をこれらの株間で規格化した。この培養物をLB+適切な抗生物質および妥当な場合D−アラニンで1:50に希釈した。
マウスにおけるLMの継代
1x108CFUをC57BL/6マウスの腹腔内に注射した。3日目に、脾臓を単離し、PBS中で均質化した。一定分量の脾臓懸濁液をLBプレート、妥当な場合抗生物質添加LBプレート上に蒔いた。いくつかのコロニーを拡張し、注入原液を作るため混合した。
抗生物質耐性因子遊離プラスミドpTV3の構築
p60−dalカセットの構築
この抗生物質耐性遺伝子を含まないベクターの構築の第1段階は、切断型p60プロモーターのdal遺伝子への融合である。このLMアラニンラセマーゼ(dal)遺伝子(順方向プライマー:5´−CCA TGG TGA CAG GCT GGC ATC−3´;配列番号1)(逆方向プライマー:5´−GCT AGC CTA ATG GAT GTA TTT TCT AGG−3´;配列番号2)およびミニマルp60プロモーター配列(順方向プライマー:5´−TTA ATT AAC AAA TAG TTG GTA TAG TCC−3´;配列番号3)(逆方向プライマー:5´−GAC GAT GCC AGC CTG TCA CCA TGG AAA ACT CCT CTC−3´;配列番号4)をLM株10403SのゲノムからPCR増幅により分離した。その後のスプライス・オーバーラップ・エクステンション(SOE)‐PCR法によるp60とdalの融合のため、これらのプライマーは、p60配列の上流にPacI部位を、dal配列(制限部位を太字で示す)の下流にNheI部位を、p60プロモーターの下流に重複dal配列(この第1の18bp)を導入した。この切断型p60プロモーターの配列は、CAAATAGTTGGTATAGTCCTCTTTAGCCTTTGGAGTATTATCTCATCATTGTTTTTTAGGTGAAAACTGGGTAAACTTAGTATTATCAATATAAAATTATTCTCAAATACTTAATTACGTACTGGGATTTTCTGAAAAAAGAGAGGATTTTCC(配列番号5、Kohler et al,J Bacteriol 173:4668-74、1991)である。SOE−PCRを用いて、このp60とdalPCR産物を融合し、クローニングベクターpCR2.1(Invitrogen社、米国カリフォルニア州La Jolla)にクローンニングした。
pGG55からの抗生物質耐性遺伝子の除去
クロラムフェニコールアセチル転移酵素(CAT)遺伝子をpGG55から除去し、p60−dalカセットに導入するために引き続いて行なわれるクローニング手法はまた、このグラム陽性複製領域(oriRep;Brantl et al, Nucleic ACid Res 18:4783-4790,1990)を断続的にもたらした。グラム陽性oriRepを再導入するために、NarI/EheI部位を配列(GGCGCCACTAACTCAACGCTAGTAG、配列番号6)の上流に加えた5´−プライマーとNheI部位を配列(GCTAGCCAGCAAAGAAAAACAAACACG、配列番号7)の下流に加えた3´−プライマーとを用いて、oriRepをpGG55からPCR増幅した。このPCR生成物をベクターpCR2.1にクローン化し、配列を確認した。
p60−dal配列をpGG55ベクターに組み入れるため、PacI/NheI2重消化により、p60−dal発現カセットをpCR−p60dalから切除した。EheIおよびNheIに対してさらなる制限部位を導入するために、pGG55におけるグラム陽性バクテリアに対する複製領域をpCR−oriRepからPCR(プライマー1、5´−GTC GAC GGT CAC CGG CGC CAC TAA CTC AAC GCT AGT AG−3´;配列番号8);(プライマー2、5´−TTA ATT AAG CTA GCC AGC AAA GAA AAA CAA ACA CG−3´;配列番号9)により増幅した。このPCR生成物をpCR2.1−TOPO(Invitrogen社、米国カリフォルニア州Carlsbad)に連結し、配列を確認した。この複製領域をEheI/NheI消化により切除し、ベクターpGG55をEheIおよびNheIで2重消化し、プラスミドから両CAT遺伝子を同時に除去した。これらの2つの挿入部分、p60−dalおよびoriRep、とpGG55断片を連結し、pTV3を得た。pTV3は、prfA(病原性制御因子A)遺伝子も有する。この遺伝子はpTV3の機能には必要ないが、さらなる選択されたマーカーが必要または望ましい場合に使用できる。
リアルタイムPCRのためのDNAの調製
全リステリアDNAをMasterPure(登録商標)トータルDNAキット(Epicentre社、米国ウィスコンシン州Madison)を用いて調製した。リステリアを24時間37℃で培養し、25mlのLuria-Bertoniブロス(LB)中で250rpmで振とうした。バクテリア細胞を遠心分離でペレット上にし、5mg/mlのリゾチームを添加したPBS中に再懸濁して、20分間37℃でインキュベートした後、DNAを分離した。
リアルタイムPCRのための標準標的DNAを得るため、このLLO−E7遺伝子をpGG55(5´−ATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTAC−3´(配列番号10);5´−GCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGTGGTTTCTGAGAACAGATG−3´(配列番号11))からPCR増幅し、ベクターpETblue1(Novagen社、米国カリフォルニア州San Diego)にクローン化した。同様にして、このplcA単位複製配列をpCR2.1にクローン化した。大腸菌をpET−LLOE7およびpCR−plcAでそれぞれ形質転換し、精製プラスミドDNAをリアルタイムPCRで使用するために調製した。
リアルタイムPCR
Taqmanプライマー−プローブセット(Applied Biosystems社、米国カリフォルニア州Foster City)をABIプライマーエクスプレスソフトウェア(Applied Biosystems社)を用い、E7をプラスミド標的とし、以下のプライマー:5´−GCAAGTGTGACTCTACGCTTCG−3´(配列番号12);5´−TGCCCATTAACAGGTCTTCCA−3´(配列番号13);5´−FAM−TGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTAC−TAMRA−3´(配列番号14)およびこの1複製遺伝子plcA(TGACATCGTTTGTGTTTGAGCTAG−3´(配列番号15)、5´−GCAGCGCTCTCTATACCAGGTAC−3´(配列番号16);5´−TET−TTAATGTCCATGTTATGTCTCCGTTATAGCTCATCGTA−TAMRA−3´;配列番号17)をリステリアゲノム標的として設計した。
0.4μMプライマーおよび0.05mMプローブをPure Taq RTG PCRビーズ(Amersham社、米国ニュージャージー州Piscataway)で製造会社が勧める方法で混合した。標準曲線を精製プラスミドDNA、pET−LLOE7、およびpCR−plcA(内部標準)を用いて各標的を作成し、未知のサンプル中の遺伝子コピー数を計算するのに用いた。E7複製物/plcA複製物の平均比を標準曲線に基づいて計算し、Lmdd−TV3およびLm−LLOE7に関する結果を、Lm−E7、ゲノムに組み込まれたE7遺伝子組込の単一複製物でリステリア菌株の結果で割り算することで較正した。3回繰り返して行なった各qPCR分析において、すべてのサンプルについて3回分析した。サンプル間の差異をKyPlotソフトウェアを使用して、二元配置分散分析(Two-Way ANOVA)で分析した。結果はp<0.05の場合に統計的に有意であると見なす。
増殖測定
バクテリアを37℃250rpm振とう下でLuria Bertani(LB)培地+/−100μgs(μg)/mlD−アラニンおよび/または37μg/mlクロラムフェニコール中で増殖させた。この出発接種材料をすべての株に対して同じとなるようにOD600nm測定に基づいて調節した。
結果
D−アラニンラセマーゼに基づく栄養要求性相補システムを抗生物質耐性遺伝子を用いずにLM中でのプラスミド維持を媒介するのに使用した。大腸菌株MB2159はD−アラニンラセマーゼを合成できないalr(−)/dadX(−)欠損変異体である。リステリア菌株LMdal(−)/dat(−)(Lmdd)は同様に、dalおよびdat遺伝子の部分欠失のためD−アラニンラセマーゼが合成できない。、大腸菌−リステリアシャトルベクターpAM401に基づくプラスミドpGG55は、両CAT遺伝子を除去しこれらをpTV3を産生するためにリステリアp60プロモーターの制御下でp60−dal発現カセットと置換する(図1)。DNAをいくつかのコロニーから精製した(図2)。
生体外におけるプラスミド安定性を決定するため、LM−LLO−E7およびLmdd(pTV3)を選択的圧力の存在下および非存在下で70世代培養した。CFUを、各培養物について選択的および非選択的プレート上で毎日決定した。このシステム、プラスミド損失は、選択的プレート(Lmdd(pTV3)についてはBHIのみ、LM−LLO−E7についてはクロラムフェニコール添加BHI)に比べて、非選択的プレート(Lmdd(pTV3)についてはD−アラニン添加BHI、LM−LLO−E7についてはBHIのみ)で増殖するコロニー数が多い結果となった。非選択的および選択的プレートでCFUに違いは検出されず(図3A)、本実験を終結した少なくとも70世代についてこの培養物のいたるところでプラスミドの安定維持を示した。
さらに、生体内におけるプラスミド安定性を、C57BL/6マウスにて、注入後の異なる時点における生バクテリアを分離することで試験した。今回もまた、選択的および非選択的プレートでのCFUカウントを、この分離されたバクテリア間でのプラスミド維持を決定するのに用いた(図3B)。各コンストラクトについて選択的および非選択的プレートでCFUに違いは検出されず、すべての分離されたバクテリア中の組換えプラスミドの安定な存在を示した。生Lmdd(pTV3)バクテリアを少なくとも5日まで脾臓から分離したので、注入バクテリアの早期排除へと続く、生体内でのプラスミド損失は、Lmdd(pTV3)バクテリアについて観測されるレベルの病原性を説明することで除外することができる(実施例2)。
要約するとpTV3は、Listeriaはもちろん大腸菌内でも生体外および生体内の両者において安定に維持された。さらなるD−アラニンを添加していないLB培地上でのバクテリア増殖は、dal発現カセットがグラム陰性大腸菌中でも活性であることを示した。大腸菌−pTV3およびLmdd−pTV3の両者がクロラムフェニコールに対する感受性を維持し、プラスミドからの両CAT遺伝子がうまく除去されたことを示した。代表的なプレートを図4〜7に示す。
細胞あたりのpTV3コピー数を、Lm−LLOE7の存在下のクロラムフェニコールとクロラムフェニコールの非存在下のLmdd−TV3とで、E7配列のリステリアおよび大腸菌の両者におけるリアルタイムPCRにより比較した。Lm−LLOE7はLLO/E7融合タンパク質をpGG55から発現した。Lmdd−TV3およびLm−LLOE7のプラスミドコピー数は互いに有意な差がなく、プラスミドpTV3のリステリアおよび大腸菌の両者における安定維持を示した。
バクテリア機能の相補性を確認するため、生体外増殖動力学をLmdd、Lmdd−TV3、およびLm−LLOE7で比較した。非補完LmddではなくLmdd−TV3は、アラニンを含まない培地中で増殖することができた(図8)。実際、Lmdd−TV3は、Lm−LLOE7および外因性D−アラニンで補完されたLmddの両者よりも早く対数増殖期に達した。このLm−LLOE7の増殖減衰は、CAT発現の代謝負担に一部よるものであった。しかしながら、クロラムフェニコールの非存在下でも、Lm−LLOE7は依然として生体外でLmdd−TV3よりもかなりゆっくりと増殖した。
(実施例2)代謝酵素を含有するプラスミドはバクテリアの病原性を増大させない
材料および実験方法
溶血分析
4x109CFUのリステリアを解凍し、遠心分離(1分間、14000rpm)でペレット状にして、1Mシステイン添加pH5.5の100μlのPBSに再懸濁した。バクテリアを1:2に連続的に希釈し、分泌されたLLOを活性化するために、45分間37℃でインキュベートした。脱繊維素された全ヒツジ血液(Cedarlane社、加国オンタリオ州Hornby)を5体積のPBSで2回、6体積のPBS−システインで上澄みが透明になるまで3〜4回洗浄し、洗浄工程間で細胞を8分間3000xgでペレット状にし、その後PBS−システイン中に最終濃度10%(v/v)となるように再懸濁した。100μlの10%洗浄済み血球細胞を100μlのリステリア懸濁液と混合し、さらに45分間37℃でインキュベートした。非溶解血球細胞をその後遠心分離(10分間、1000xg)によりペレット状にした。100μlの上澄みを新しいプレートに移し、OD530nmを決定して、このサンプル希釈に対してプロットした。
結果
病原性はLLO機能に結びつけられるので、Lmdd−TV3とLm−LLOE7とで溶血性溶解活性を比較した。この分析は、LLO機能を赤血球細胞の溶解により試験し、培養液上澄み、精製LLO、またはバクテリア細胞実施できる。Lmdd−TV3は、Lm−LLOE7よりも高い溶血性溶解活性を示した。
生体内病原性はまた、直接的に従って正確な病原性測定手段であるLD50値の決定により測定した。Lmdd−TV3(0.75x109)のLD50はLm−LLOE7(1x109)の値に大変近く、代謝酵素を含むプラスミドはバクテリアの病原性を増大させないことを示している。
(実施例3)代謝酵素を有するプラスミドを保持するワクチン株は抗原発現を介在する
この代謝酵素含有プラスミドからの抗原発現を生体外でウェスタンブロット法により試験した。バクテリア培養液上澄みからの総タンパク質の等量を分析したとき、Lmdd−TV3培養液はLm−LLOE7培養液に比べて全抗原量の約2倍含んでいた。この差は、プラスミド(12.8kB)がLmdd−TV3(7.6kB)よりも大きなサイズのため、Lm−LLOE7における全体的な代謝負荷がより高い結果であるかもしれない。
従って、代謝酵素は、抗生物質耐性遺伝子の代わりに、栄養要求性バクテリアにおけるプラスミド維持を介在するのに使用できる。さらに、このようなプラスミドは、バクテリアにおける異種タンパク質の発現における有用性を有する。
(実施例4)代謝酵素を有するプラスミドによる抗腫瘍免疫の誘発
材料および実験方法
実験設計
105TC−1(ATCC社、米国ヴァージニア州Manassas)をC57BL/6マウス(n=8)の皮下移入し、約7日間増殖させ、腫瘍を触知可能にした。TC−1は、HPVE6およびE7で不死化し皮下移入時に腫瘍を形成する活性化rasで形質転換したおよび形質転換したC57BL/6上皮細胞株である。腫瘍細胞移入の後、マウスを適切なリステリア菌株の0.1LD50で7日目および14日目免疫化した。非免疫化対照群(無処置)も含めた。腫瘍増殖を電子ノギスで測定した。
結果
癌ワクチンとしての代謝酵素含有プラスミドの有効性を腫瘍退縮モデルにおいて決定した。HPVワクチン開発のためによく特性決定され、Lmdd−TV3またはLm−LLOE7で免疫化した後、同様の大きさに樹立した腫瘍の退縮の対照比較を可能にする、TC−1細胞株モデルを用いた。2つの別個の実験において、Lmdd−TV3およびLm−LLOE7によるマウスの免疫化は、ワクチン接種したグループでは統計的に顕著な差(p<0.05)のない、同様の腫瘍退縮(図9)をもたらした。すべての免疫化マウスは、63日間後も生存していたのに対し、非免疫化マウスは、これらの腫瘍が直径20mmに達したときに屠殺しなければならなかった。治療マウスは、この実験を終えるまで腫瘍のない状態を維持した。
従って、代謝酵素含有プラスミドは、治療用癌ワクチンとして効果的である。治療用癌ワクチンに要求される免疫応答は予防用癌ワクチンに要求されるものよりも強力なので、これらの結果は、予防用癌ワクチンとしても同様に有用であることを実証している。
(実施例5)代謝酵素を有するプラスミドは抗原特異性、腫瘍湿潤性T細胞を誘発する
材料および実験方法
T細胞分析
脾臓由来のT細胞および腫瘍湿潤性T細胞をCD8およびCD4表面マーカーおよびE7特異度を標準プロトコル(Gunnら(2001,J.Immunol,167:6471-6479)に従って分析した。C57BL/6マウスは免疫化ipであった。Lmdd−TV3またはLm−LLOE7で腫瘍移入から7および14日後に腹腔内注射で免疫化した。脾細胞および腫瘍を第2の注入5日後に収集し、E7ペプチド(RAHYNIVTF、配列番号18)を添加したH−2Db四量体または1:200で希釈した対照(HIV−Gag)ペプチドで室温にて染色した。四量体は、米国立アレルギー感染症研究所四量体研究コア施設(Tetramer Core Facility)および米国立衛生研究所AIDS研究および参照試薬プログラム(AIDS Research and Reference Reagent Program)により提供された。
CD8(53−6.7、PE共役)およびE7H−2Db四量体に関する3色フローサイトメトリをFACSCalibur(登録商標)フローサイトメータとCellQuest(登録商標)ソフトウェア(Becton Dickinson社製、米国カリフォルニア州MountaIn View)を用いて行なった。細胞内γインターフェロン(IFN−)染色を細胞の第2のサブセットに対して行なった。この細胞表面抗原およびIFN−生成について染色する前に、ゴルジ体中で細胞内IFN−αを蓄積するためにモネンシン(BD Biosciences)の存在下で培養して、リンパ球を生体外で刺激した。1mlにつきインターロイキン−2(50U/ml)および1μlのブレフェルジンA(モネンシン)を添加したRP−10中で5時間培養後、これらの細胞を、フィコエリトリン共役抗CD8(PharMingen)および抗原提示細胞共役MEL−14(抗CD62リガンド)を用いて4℃で20分間エフェクターマーカーについて、表面染色を行なった。CD8+IFN−γ+集団を分析する前に活性化細胞の選択を可能にするCD62リガンドに細胞をゲートした(選択した)。
結果
ワクチンの抗腫瘍有効性は、抗原特異性、腫瘍−浸潤性リンパ球を誘導する能力と結びつけられることが多い。このためLmdd−TV3有効性をさらに特徴づけるため、E7抗原特異度に対する腫瘍湿潤性細胞障害性T細胞(CTL)を分析した。Lmdd−TV3およびLm−LLOE7の両者は、この腫瘍湿潤性E7四量体特異性T細胞のかなりの割合を誘導する(表1)。リステリア・モノサイトゲネスLLO−E7−免疫化マウスとLmdd(pTV3)−処理マウスとの間でIFN−α−産生CD8+T細胞の割合に大きな差はみられない。従って、Lmdd−TV3とLm−LLOE7の両者が、腫瘍湿潤性、腫瘍増殖を制御した抗原特異性CTLを誘導した。
細胞を抗CD8抗体およびE7四量体で染色し、FACS分析を行なった。CD8+/E7四量体+/CD62−をゲーティング(選択)後、全生細胞からCD8+/E7四量体+/CD62−細胞の百分率を計算した。
(実施例6)抗生物質耐性遺伝子を用いない組込み異種遺伝子を含むリステリアワクチンベクターの産生
材料および実験方法
GG−L74の産生
Gunnらにより記載の温度感受性のシャトルプラスミド(2001,J.Immunology 167:6471-6479)を用いて、このorfZドメインにおけるダブル対立遺伝子交換によりリステリア菌株10403SからGG−L74を作成した。このhly−E7融合遺伝子を含む発現カセットをこのリステリア・モノサイトゲネスゲノムのorfZドメイン中に導入してGG−L74を産生した。このhlyプロモーターは、Xho1部位によりこのE7遺伝子に連結しているhly遺伝子産生物の第1の441AAの発現を進行させる。この結果として、転写されLLO−E7として分泌されたhly−E7融合遺伝子が得られる。このhly−E7遺伝子は、このhly遺伝子への組込みを避けるため、逆配向でpKSV7シャトルベクター連結された。この結果得られるプラスミドであるGG−L74は、このリステリア・モノサイトゲネスゲノムのorfX、Y、Zドメインに対応する1.6Kb配列の中間に挿入された前述の発現カセットを有する発現システムである。リステリア・モノサイトゲネス株10403SをpGG−74で形質転換した。これらの相同ドメインは、Gunnらにより記載されるように(2001,J.Immunology 167:6471-6479)、相同組換えによりLLO−E7遺伝子カセットのこのorfZドメインへの挿入を可能にする。クローンをこのLLO−E7遺伝子カセットのorfZドメインへの組み込みについてスクリーニングした。
結果
リステリア染色体からヒト乳頭種ウイルスのE7抗原への非溶血性LLO断片の融合を発現するリステリアワクチンベクターGG−L74を、p60−dalを選択可能なマーカーとして用いて、hly−E7融合発現カセットでLmddを形質移入することで生成した。GGL74のマウスLD50は、106CFUである。
(実施例7)ファージ組込みシステムに基づく組換え遺伝子の染色体組込み
材料および実験方法
pTV6−11の構築
pTV6−11は、以下に示すpPL1またはpPL2から構築される。
pPL1
pPL1(図10、左図)は以下の配列を有する。すなわち、
gacgtcattaaccctcactaaagggaacaaaagctgggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatcgataagcttgatatcgaattcctgcagcccgggggatccactagttctagagcggccgccaccgcggtggagctccaattcgccctatagtgagtcgtattgacgtcgctatttaacgaccctgccctgaaccgacgaccgggtcgaatttgctttcgaatttctgccattcatccgcttattatcacttattcaggcgtagcaccaggcgtttaagggcaccaataactgccttaaaaaaattacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcattctgccgacatggaagccatcacagacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacggaattccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgataactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttcccggtatcaacagggacaccaggatttatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtatttattcggcgcaaagtgcgtcgggtgatgctgccaacttactgatttagtgtatgatggtgtttttgaggtgctccagtggcttctgtttctatcagctgtccctcctgttcagctactgacggggtggtgcgtaacggcaaaagcaccgccggacatcagcgctagcggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagatttcagtgcaatttatctcttcaaatgtagcacctgaagtcagccccatacgatataagttgtaattctccgccgcttgccctcatctgttacgccggcggtagccggccagcctcgcagagcaggattcccgttgagcaccgccaggtgcgaataagggacagtgaagaaggaacacccgctcgcgggtgggcctacttcacctatcctgcccggctgacgccgttggatacaccaaggaaagtctacacgaaccctttggcaaaatcctgtatatcgtgcgaaaaaggatggatattccgaaaaaatcgctataatgaccccgaagcagggttatgcagcggaaaagcgctgcttccctgctgttttgtggaatatctaccgactggaaacaggcaaatgcaggaaattactgaactgaggggacaggcgagaggcatgcgataaaaagcaatctatagaaaaacaggttactttttatttataattttagtttctcgattcgtttccgtccaacgagagaaaacgaggaactaaacaatctaaataaacaagctactagagccattcaatagtaacttgttcaccgtcaatataaattttattaattagtgattttaaataaagttgcttttctcggaactctaaagagtcaaaatcaactgttgctaaatcagctaaattttcttgtatctttttatttttcttcaattcttcgttagcttctatttgtgcttcataataattaatttgagcatcgatatcagccatcatagcatcaagttctgaaacttcgtaagaaccgctgatatataaatcaaatagccgtttcttttttacgtgttctgttttaagtttttcatttaagctatctaattcgtcttctttatctacattcctagaagcgaaactatagttattcacgcgatcaataattaattcctcgagtttgtcagctctccaaattttatttccacatttttctagttcatgagtatgtttgtaagtcttgcaactataatatctataatgatatttttttccgcgggaaacagtatcttttctccgatgaacaaaacccaacccacattttccacacactaccaaattatttagcaacgatgctgaatctctattcatatttggatttttacccatgcgagaaaaaatttcttgaactcgataaaattgttcctctgaaataataggctcatgaacaccttttgtatgcactttatccgcataagatacataaccacagtataaatcattagttagccaattgttgtaactgctatatgatttcactttgaatcctaatttttttagtctcttctgtaaagtggtaatgcttttttcttcctcaaaaatatcataaatcatttgtaattgttttgcttcttcttcattaatatataatttagtatctataacatcatagccgaatgttctaccttttgcagtcgttaaaggaagacctgcttcaatacgcttaattttccccatcaccatacgatcacgtatagtttcgcgctctaattgagcaaatacggataatataccaatcatcgcgcgcccaaatgggctagaggtgtcaagagtttcagacaaactaacaaattctacattgttttttaagaagtattcttcaataagcgttatcgtatctctttgtgagcgggaaagtctatctaagcgatatacaacaacagcatcaatttcatgtaatttacttagcatttcatttagtgcggggcgattcatgtttgaaccgctgtatccgccgtctatgaaaatatcgtatacgtcccaatccttcgagcggcacaaggctgttagcttttcagtttgagcttgtatagagtaattctctatttgttcttgagtagatacgcgtatataaatagctgccttcatttccgttctcctctcgcatggaaagttaagatctttttttcagaaaatcccagtacgtaattaagtatttgagaattaattttatattgattaatactaagtttacccagttttcacctaaaaaacaaatgatgagataatagctccaaaggctaaagaggactataccaactatttgtaataattctgtaacagttgaaaagcgaacgtgtattcttagggcttgagatgtattgctgggtaaacctttatagtgtaagtgggatgtgaacgttaatcaacaactttcgctatgggaaacctattgttttttgttaatagaaaaacttaatacatttgtaatataaaaaccggcagtttttccgttcttcgtgactcgaaatgaattgccagatgagtttatggtattctataatagaaggtatggaggatgttatataatgagacagaattatgatgatcgaaagctagcttggcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatgatcccggatctggagctgtaatataaaaaccttcttcaactaacggggcaggttagtgacattagaaaaccgactgtaaaaagtacagtcggcattatctcatattataaaagccagtcattaggcctatctgacaattcctgaatagagttcataaacaatcctgcatgataaccatcacaaacagaatgatgtacctgtaaagatagcg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pPL1のbp1〜171は、pBluescript KS(Alting-Mees,MA,and Short JM.1989.pBluescript II:gene mapping vectors.Nucleic Acids Res.17:9494)由来のマルチクローニングサイトを有し、このプライマー5´−GGACGTCATTAACCCTCACTAAAGG−3´(配列番号20)および5´−GGACGTCAATACGACTCACTATAGG−3´(配列番号21)を用いて、サブクローン化した。
bp172〜2253は、pACYC184(Chang,ACら,1978.Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid.J.Bacteriol.134:1141-1156)由来の、この低コピー数のグラム陰性複製起点およびクロラムフェニコールアセチル転移酵素(CAT)遺伝子を有し、プライマー5´−GGACGTCGCTATTTAACGACCCTGC−3´(配列番号22)および5´−GAGCTGCAGGAGAATTACAACTTATATCGTATGGGG−3´(配列番号23)を用いたPCR後クローニングした。
bp2254〜2624は、(大腸菌からリステリア・モノサイトゲネスへの直接合に使用するために)RP4伝達起点(oriT)(Pansegrau,WE et al,1994.Complete nucleotide sequence of Birmingham IncP alpha plasmids.Compilation and comparative analysis.J.Mol.Biol.239:623-663)を有し、プライマー5´−GCACTGCAGCCGCTTGCCCTCATCTGTTACGCC−3´(配列番号24)および5´−CATGCATGCCTCTCGCCTGTCCCCTCAGTTCAG−3´(配列番号25)を用いたPCR後、プラスミドpCTC3(Williams,DR et al,1990.Conjugative plasmid Transfer from Escherichia coli to Clostridium acetobutylicum.J.Gen.Microbiol.136:819-826)からクローニングした。
bp2629〜4127は、このリステリオファージU153インテグラーゼ遺伝子と、このプラスミドの部位特異的組込みを導く付着部位(attPP´)(GenBankアクセッション番号:AJ417489)とを有し、プライマー5´−GTAGATCTTAACTTTCCATGCGAGAGGAG−3´(配列番号28)および5´−GGGCATGCGATAAAAAGCAATCTATAGAAAAACAGG−3´(配列番号29)を用いたPCR後クローン化される。
bp4134〜4563は、このU153インテグラーゼ遺伝子の発現の進行に使用される(Kohler,SM et al,1990.The gene coding for protein p60 ofListeria monocytogenes and its use as a specific probe for Listeria monocytogenes.Infect.Immun.58:1943-1950)LMp60プロモーターを有し、プライマー5´−CCTAAGCTTTCGATCATCATAATTCTGTC−3´(配列番号30)および5´−GGGCATGCAGATCTTTTTTTCAGAAAATCCCAGTACG−3´(配列番号31)およびこのインテグラーゼ遺伝子のクローン化上流でPCR増幅される。
bp4570〜6101は、pUC18−Cat(Nancy Freitag, University of Washingtonより入手)からサブクローンニングされたHindIII−AatII制限断片を有し、従ってpC194(Horinouchi,S,and Weisblum,B,1982.Nucleotide sequence and functional map of pC194,a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance.J.Bacteriol.150:815-825)由来の(bp4788〜5850)誘導型グラム陽性CAT遺伝子を有する。
hlyおよびactA遺伝子のpPL1へのクローニング
hly遺伝子を、BamHIおよびXbaIで制限消化し、2.9−kb断片をゲル精製し、BamHIおよびSpeI(pPL24;図10左下)で切断したpPL1に結合させることで、プラスミドpDP−906(Jones,S et al.1994.Characterization of Listeria monocytogenes pathogenesis in a strain expressing perfringolysin O In place of listeriolysin O.Infect Immun.62:5608-5613)からサブクローニングした。このactA遺伝子をプライマー5´−GGTCTAGATCAAGCACATACCTAG−3´(配列番号54)および5´−CGGGATCCTGAAGCTTGGGAAGCAG−3´(配列番号55)を用いて、10403SゲノムDNAからPCR増幅した。この2220bpのPCR生成物をゲル精製し、BamHIおよびXbaIで切断し、BamHIおよびSpeI(pPL25;図10左下)で切断したpPL1にクローニングする。
pPL2
pPL2(図10右)は以下の配列を有する。すなわち、
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pPL2を構築するため、このPSA付着部位(t−RNAArg−attBB´)DNA配列を逆PCRおよびゲノム歩行の組み合わせにより得た。逆PCRを、このPSAint遺伝子内でアニールする、Sau3AI消化DP−L4061DNA(WSLC1042、PSAに対し溶原性;GenBankアクセッション番号:AJ314913)についてこの発散性プライマーPL95(5´−ACATAATCAGTCCAAAGTAGATGC;配列番号33)およびPL97(5´−ACGAATGTAAATATTGAGCGG;配列番号34)を用いて行なった。この結果得られるDNA配列をさらにオリゴヌクレオチドを設計するのに使用し、これらをこのゲノムWalker(登録商標)kit(Clontech)と共に用いた。
pPL1をこのU153インテグラーゼ遺伝子およびこのプラスミド中の付着部位を置き換えることでこのリステリア・モノサイトゲネス染色体上で異なる付着部位を用いて改質した。このPSAintおよびattPP´をPSAゲノムDNA(GenBankアクセッション番号:AJ312240)からプライマーPL100(5´−GAAGATCTCCAAAAATAAACAGGTGGTGG;配列番号71)およびPL101(5´−CATGCATGCGTGGAGGGAAAGAAGAACGC;配列番号35)、VentDNAポリメラーゼを用いてPCR増幅し、BglIIおよびSphIで消化し、この同じ酵素で消化されたpPL1に結合し、pPL2を得た。
血清型1/2リステリア・モノサイトゲネス株由来のPSAt−RNAArg−attBB´のDNA配列をプラスミド捕捉法により得た。DP−L4211(10403SにおけるpPL2組込み)ゲノムDNAを、このベクター内で切断しないNsiIおよびNheIで消化し、自己環状化を促進するように希釈条件下で連結する。この連結を大腸菌XL1−Blueに形質転換し、およびクロラムフェニコール耐性コロニーを選択した。この得られたプラスミドを、このPSAゲノムDNA配列中でattPP´に隣接するattPB’およびattBP´に対して収束性プライマーPL94(5´−GGAGGGAAAGAAGAACGC;配列番号36)およびPL95(配列番号33)をそれぞれ用いて、配列決定した。t−RNAArg−attBB´を隔てた血清型1/2特異性PCR分析をこの10403SDNA配列から展開し、様々なLM株のプロファージ状態を決定するのに用いた。プライマーPL102(5´−TATCAGACCTAACCCAAACCTTCC;配列番号37)およびPL103(5´−AATCGCAAAATAAAAATCTTCTCG;配列番号38)は、非溶原性血清型1/2株中の533−bpのPCR生成物を特に増幅する。このプライマー対NC16(5´−GTCAAAACATACGCTCTTATC;配列番号39)およびPL95は溶原性であるか、あるいは組込みベクターをt−RNAArg−attBB´で有するかのいずれかである株中で、499−bpのPCR生成物を特に増幅する。
pTV6−7の構築
このU153インテグラーゼ遺伝子およびpPL1からのU153attPP´組込み部位を、PCRにより、これらの核酸のシャトルプラスミドpTV3へのクローニングと連結可能な(compatibleな)この5´末端およびこの3´末端で制限部位を有するように改質する。pTV3由来のこのリステリア複製領域を除去すると、プラスミドpTV6(図11A)が得られる。このプラスミドは、大腸菌中での増幅のための複製機能、dal栄養要求性大腸菌およびリステリアの相補性のためのdal遺伝子、およびこのプラスミドをこのリステリアゲノム中に取込むための取込み機能(U153インテグラーゼ、attPP´部位)を有する。pTV6は、prfA(病原性制御因子A)遺伝子も有する。この遺伝子はpTV6の機能には必要ではないが、このプラスミド中にさらに含まれる選択されたマーカーまたはこの組込みベクターが必要な場合または望ましい場合に用いることができる。別の実験において、同様のプラスミド 欠如しているこのprfA遺伝子を利用する(pTV7;図11B)。
pTV8−9の構築
このPSAインテグラーゼ遺伝子およびpPL2由来のattPP´組込み部位は、これらの核酸のシャトルプラスミドpTV3へのクローニングと連結可能な(compatibleな)5´末端およびこの3´末端で制限部位を有するように改質し、pTV3由来のリステリア複製領域を除去すると、プラスミドpTV8(図12)が得られる。pTV8は、U153配列の代わりにPSA配列を有する以外は、pTV6と同様である。pTV6について上述したように、pTV8はまた機能には必要ないがprfA遺伝子も有し、除去できる(pTV9;図13)。
pTV10−11の構築
このA118インテグラーゼ遺伝子およびA118DNA(GenBankアクセッション番号:NC_003216)由来のattPP´組込み部位を、これらの核酸のシャトルプラスミドpTV3へのクローニングに連結可能な5´末端およびこの3´末端で制限部位を有するようにPCRにより改質し、pTV3由来のリステリア複製領域を除去すると、プラスミドpTV10(図14)が得られる。pTV10は、このU153配列の代わりにA118配列を有することを除き、上記のTV6と同様である。pTV6について上述したように、pTV10はまた機能には必要ないがprfA遺伝子も有し、除去できる(pTV11;図15)。
ファージ療法、接合、およびプラスミド組込みの分子的確認
ファージ療法として、プロファージをcomK〜attBB´(このcomK翻訳領域での組込み)で保有するリステリア・モノサイトゲナス(LM)10403S誘導体をBHI中37℃で108CFU/mlまで増殖し、5mMCaCl2の存在下で20:1にてリステリオファージU153に感染させる。培養物を振とうさせながら37℃で75分間インキュベートし、この感染培養液の600nmにおける光学濃度(OD600)を無感染の対照培養液と比較することにより増殖阻害をモニターする。この感染培養液をBHI中10−2および10−4に希釈し、両希釈培養液をこの10−2希釈培養液が100倍の光学濃度になるまで37℃で増殖する。その後、この10−4倍の希釈培養液を10−2に希釈し、3μl(mcl)をBHI上に蒔く。
コロニーを0.25mlのLBブロスにまず移し、30℃において、特にプラーク形成しやすいリステリア・モノサイトゲネスの非溶原性ラフ型株であるMack−4R(DP−L862)の菌叢上でレプリカ平板を行なうことで、50個のコロニーをファージ放出について試験する。その後、Mack−4Rの菌叢上に10mclの培養液をスポットして、プラーク形成能について候補を試験する。プラークを形成しないコロニーをこの親10403S株(Φ10403[Hodgson,DA.2000.Generalized transduction of serotype1/2 and serotype 4b strains of Listeria monocytogenes.Mol.Microbiol.35:312-323])由来のファージによりプラーク形成に役立つ能力について試験した。comK〜attBB特異性プライマー対PL60およびPL61(以降の配列)をcomK〜attBBに対してファージの非存在下で用いたOCRにより、治癒を分子的に確認した。約10%のコロニーがこの手順により治癒する。
1mlにつき200μg(mcg)の抗生物質を供給したBHI上でプレート選択することで、レシピエントLM株を接合実験における対抗選択に対するストレプトマイシン耐性にした。
pPL1プラスミドコンストラクトを大腸菌株MB2159に電気穿孔し、バクテリア株を30℃で振とうさせながら中長期(OD600が0.55)に増殖させた。大腸菌ドナー株を25mcg/mlのクロラムフェニコール含有LB中で増殖し、LMレシピエント株をBHI中で増殖した。ドナー培養液(2.5mL)を1.5mLのレシピエント培養液と混合し、洗浄済みのポアサイズ0.45ミクロンのHA型フィルター(ミリポア社製47mm)にろ過した。このフィルターは10mlのBHIで1度洗浄し、無抗生物質のBHIプレートに移し、30℃で2時間インキュベートした。バクテリア細胞を緩やかに2.5mLのBHI中に再懸濁し、25−および50−mclの一定分量を1mlにつき7.5mcgクロラムフェニコールと200mcgストレプトマイシンとを供給したBHIプレート上の3mLのLB最上寒天中に蒔く。プレートを30℃で一晩、そして37度で2〜3日間インキュベートした。
個々のコロニーを取り出し、2対のプライマーを用いてファージ付着位置での組み込みをPCRでスクリーンニングする。この第1のプライマー対はattBP´を特異的に増幅し、これにより(エピソームのプラスミドとしてこのベクターを含むものを除く)組込み 株を検出する。この第2のプライマー対は、特異的にcomK−attBB´を増幅し、これにより非溶原性株を検出する。PCR検査をHybaid Omn−E(商標)サーモサイクラー中でアニーリング温度55℃で30サイクル行う。組込み体は、ドナー細胞あたり約104の頻度で起こる。
結果
第1の実験において、シャトルプラスミドは構築され、(1)大腸菌に対する複製遺伝子と、(2)U153attPP´組込み部位と、(3)その天然のプロモーターの制御下でのリステリアdal遺伝子と、(4)このリステリアp60プロモーターの制御下でU153インテグラーゼ遺伝子とを有する。このU153インテグラーゼ遺伝子およびattPP´組込み部位は、シャトルプラスミドpTV3にサブクローニングされ、およびpTV3からのこのリステリア複製領域は除去され、プラスミドpTV6を生成する。このプラスミドはdal栄養要求性大腸菌株MB2159中で増幅(実施例1)、単離、および続いてリステリアに抱合される。このプラスミドはリステリア複製領域を有さないので、このゲノムに組み込まれた副生物を含むリステリアのみがLB培地での増殖時に選択される。別の実験において、さらに選択的措置として、無アラニン培地が使用される。
別の実験において、プロファージ組込みを促進するため、ファージ療法は接合の前に行なう。別の実験において、ファージ療法を必要としない組込みベクター(例えば、PSAベクター)を使用する。
別の実験において、同様のシャトルプラスミド、pTV8が構築されるが、代わりにPSAattPP´組込み部位およびインテグラーゼ遺伝子を使用する。pTV6について記載したように、このプラスミドは増幅され、リステリアに抱合される。
別の実験において、同様のシャトルプラスミド、pTV10は構築されるが、代わりにA118attPP´組込み部位およびインテグラーゼ遺伝子を使用する。pTV6について記載したように、このプラスミドは増幅されリステリアに抱合される。
(実施例8)pTV6,8、およびllに基づく一般的シャトル組込みベクターの作成
pTV6、8、および11は、このprfA遺伝子、このLLO−E7融合遺伝子、およびこのLLOプロモーターのほとんどを除去して、KasIまたはEheIおよびAatII、および/または別の適切な制限酵素により消化される。BamHI、XhoI、XbaI、NotI、SpeI、SmaI、およびSacIからなるマルチクローニングサイトは、以下の対オリゴヌクレオチドのベクター主鎖への結合により誘発される。すなわち、
AGT CCC GGG GAG CTC G(配列番号40)
CG CTC TGA GCT CGA GGG ATC CGA CGT(配列番号41;イタリック体で示すAatIおよびSalIで制限されるベクター部位に適合する末端のオーバーハング)である。
続いて、目的とする抗原カセットはこのマルチクローニング部位に結合する。このプラスミドは、そこでコードされた抗原を発現するワクチン株を作成するように使用される。