ES2280758T5 - Vectores sitio-específicos de integración en listeria y procedimientos para la utilización de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Vector de integración capaz de integración sitio-específica del genoma de Listeria mediada por integrasa de listeriófago, comprendiendo dicho vector un sitio de unión de listeriófago.
Description
Vectores sitio-específicos de
integración en Listeria y procedimientos para la utilización
de los mismos.
El campo de la presente invención se refiere a
especies de Listeria, por ejemplo Listeria
monocytogenes, particularmente a cepas recombinantes de
especies de Listeria, y a procedimientos para su fabricación
y utilización.
Listeria monocytogenes es un patógeno
humano y animal Gram-positivo transportado en los
alimentos responsable de infecciones graves en individuos
inmunocomprometidos y en mujeres embarazadas. Las infecciones
severas por L. monocytogenes en el ser humano se caracterizan
por meningitis, meningoencefalitis, septicemia y muerte fetal.
L. monocytogenes es ubicuo en la naturaleza y, además, puede
aislarse a partir de una amplia diversidad de animales de sangre
caliente.
Los protocolos para la manipulación por
recombinación de especies de Listeria resultan de interés en
aplicaciones tanto de investigación como terapéuticas. Por ejemplo,
los protocolos de transformación de especies de Listeria
encuentran utilidad en la elucidación de los mecanismos responsables
del crecimiento y virulencia de estos tipos de bacterias. Además,
estos protocolos también encuentran utilidad en la preparación de
vacunas vivas de Listeria, las cuales resultan útiles en una
diversidad de aplicaciones médicas diferentes.
Hasta la fecha, se ha utilizado una diversidad
de protocolos diferentes para transformar especies de
Listeria, entre los que se incluyen: la recombinación
homóloga, la recombinación basada en trasposones, etc. Aunque en la
actualidad se encuentran disponibles diferentes protocolos para la
manipulación de especies de Listeria, estos procedimientos
no resultan totalmente satisfactorios. Entre las desventajas
experimentadas actualmente con uno o más de los protocolos
disponibles se incluyen: (1) inestabilidad del casete de expresión
en la especie transformada; (2) impacto variable sobe la virulencia
de la especie transformada; (3) restricción de tamaño del casete de
expresión que puede introducirse en la especie transformada,
etc.
Como tales, a pesar de la diversidad de
diferentes protocolos de transformación disponibles, sigue
existiendo interés en la identificación de más protocolos de
transformación que expandan el repertorio de herramientas genéticas
disponibles. Resultaría de particular interés desarrollar un vector
de integración específico de sitio eficiente que resulte adecuado
para la utilización con un amplio abanico de diferentes especies de
Listeria, en las que el vector no adolezca de una o más de
las desventajas anteriormente indicadas de los protocolos
disponibles actualmente.
Entre las patentes y solicitudes de patente
publicadas de interés se incluyen: patente US nº 5.830.702 y
solicitudes de patentes PCT publicadas nº de serie WO 99/25376 y nº
WO 00/09733.
Schaferkordt et al., en
Biotechniques 19(5):720-725,
1995, describen un vector que incluye una secuencia
complementaria del genoma de Listeria monocytogenes,
permitiendo de esta manera que el vector se integre en el genoma
mediante recombinación homóloga.
Fortineau et al., en Res.
Microbiol. 151:353-360, 2000, dan a
conocer un vector que es capaz de integrarse en el genoma de
Listeria monocytogenes mediante el trasposón Tn1545.
Se proporcionan vectores de integración en
especies de Listeria específicos de sitio y procedimientos
para su utilización. Entre los vectores de la invención se incluyen
un gen de integrasa de bacteriófago y un sitio de unión a
bacteriófago, en los que en muchas realizaciones el bacteriófago que
es la fuente de estos elementos es un listeriófago. En determinadas
realizaciones, los vectores de la invención incluyen además un
sitio de clonación múltiple, en los que el sitio de clonación
múltiple puede incluir además una secuencia codificante, por
ejemplo una secuencia codificante de un polipéptido heterólogo, etc.
Los vectores y procedimientos de la invención encuentran utilidad
en una diversidad de aplicaciones diferentes, incluyendo el estudio
de especies de Listeria y la preparación de vacunas de
especies de Listeria.
Fig. 1(A) Mapa del plásmido del vector de
integración pPL1. La SEC ID nº 24 proporciona la secuencia de pPL1.
Se muestran en gris los genes de resistencia al cloranfenicol y el
origen de replicación de E. coli, en blanco el origen de
transferencia RP4, en negro el gen de integrasa y el promotor p60 de
L. monocytogenes. Se muestra el sitio de clonación múltiple
en la parte inferior del plásmido, indicando los sitios de
restricción únicos debajo del MCS en una caja. Se muestran las
inserciones pPL24 y pPL25 esquemáticamente debajo de MCS y se
clonaron tal como se describe en la sección Materiales y Métodos. Se
indican los tamaños finales de los constructos de plásmido y los
sitios de restricción utilizados en la clonación en cada una de las
inserciones. (B) Mapa del plásmido del vector de integración pPL2.
La SEC ID nº 28 proporciona la secuencia de pPL2. El código de
colores y los genes son los mismos que en la fig. 1A excepto en que
la integrasa de PSA y los sitios PSAattPP tal como se indica. El
sitio de clonación múltiple con 13 sitios de restricción únicos se
muestra en la parte inferior del plásmido.
Fig. 2. Organización genómica de los sitios de
unión dentro del gen comK (A y B) y del gen ARN_{t}^{Arg} (C y
D). (A) Cepa no lisogénica de L. monocytogenes con un gen
comK intacto. Los cebadores PL60 y PL61 amplifican a través del
sitio de unión bacteriano comK-attBB'. (B) Cepa
lisogénica de L. monocytogenes (con aproximadamente 40 kb de
fago ADN insertado en el gen comK) o cepa integrada (con el
constructo pPL1 insertado en el gen comK). Los cebadores PL14 y
PL61 amplifican a través del sitio de unión híbrido
comK-attPB'. (C) Cepa serotipo 4b de L.
monocytogenes no lisogénica en ARNt Arg-attBB'.
Los cebadores NC16 y NC17 amplifican a través del sitio de unión
bacteriana ARNt Arg-attBB' en las cepas de serotipo
4b. El asterisco indica que los cebadores NC16 y NC17 se encuentran
sustituidos con PL102 y PL103 para amplificar a través del sitio de
unión bacteriana ARNt Arg-attBB' en las cepas de
serotipo 1/2. (D) Cepa lisogénica de L. monocytogenes (con
aproximadamente 40 kb de fago ADN o el vector ADN pPL2 de 6 kb
insertado en el extremo 3' del gen ARNt Arg. Los cebadores NC16 y
PL95 amplifican a través del sitio de unión híbrido ARNt
Arg-attBP' en las cepas de serotipo tanto 4b como
1/2.
Fig. 3. Expresión y complementación funcional de
ActA en SLCC-5764. (A) SDS-PAGE
teñido con azul de Coomassie de cepas derivadas de
SLCC-5764 cultivadas hasta la fase logarítmica
tardía. Se indica ActA con una flecha. Carril 1: marcador de tamaño
molecular; carril 2: DP-L3780; carril 3:
DP-L4083; carril 4: DP-L4086; carril
5: SLCC-5764; carril 6: DP-L4082;
carril 7: DP-L4084; carril 8:
DP-L4085; carril 9: DP-L4087. Se
describen las cepas en la Tabla 1. (B) Formación de cola de actina
y movimiento de DP-L4087 en extracto celular de
Xenopus. El panel superior es una imagen de fases; el panel
inferior es una imagen de fluorescencia del mismo campo.
Fig. 4. (A) Diagrama de trébol de
ARN_{t}^{Arg}, utilizado como sitio de unión de PSA. El
anticodón de la arginina se ha rodeado con un círculo. Se señala la
región con identidad de secuencia entre el gen de ARN_{t} y el
attPP' de PSA. Los límites del gen de ARN_{t}^{Arg} y la
puntuación Cove (82,37) se predijeron con el programa
tRNA-scan-SE (31). (B) Alineación de
la región ARN_{t}^{Arg}-attBB' de L.
monocytogenes WSLC 1042 (línea superior) y la región attPP' de
PSA corriente abajo del gen de integrasa. El gen ARN_{t}^{Arg}
de 74 nt de L. monocytogenes se señala con una caja y la
región solapante de 17 pb de identidad de secuencia (sitio central
de integración) se señala en gris. El anticodón del gen
ARN_{t}^{Arg} se muestra en negrita y subrayado. Se indican los
residuos nucleótidos idénticos con el símbolo (:). Los números
situados a la izquierda indican la posición del nucleótido en las
secuencias de ADN del sitio de unión de WSLC 1042 (AJ314913) y del
genoma de PSA (AJ312240).
Se proporcionan vectores de integración de
especies de Listeria específicos de sitio y procedimientos
para la utilización de los mismos. Entre los vectores de la
invención se incluyen un gen de integrasa de listeriófago y un
sitio de unión a listeriófago y una secuencia codificante
heteróloga. En determinadas realizaciones, entre los vectores de la
invención se incluye además un sitio de clonación múltiple, en el
que el sitio de clonación múltiple puede incluir además una
secuencia codificante, por ejemplo de un polipéptido heterólogo,
etc. Los vectores y procedimientos de la invención encuentran
utilidad en una diversidad de aplicaciones diferentes, incluyendo
el estudio de especies de Listeria y la preparación de
vacunas de especies de Listeria.
El alcance de la presente invención se establece
en las reivindicaciones adjuntas.
En la presente especificación y en las
reivindicaciones adjuntas, las formas del singular "un",
"una" y "el" o "la" incluyen la referencia en plural
a menos que el contexto indique claramente lo contrario. A menos
que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y
científicos utilizados en la presente invención presentan el mismo
significado que el entendido comúnmente por un experto ordinario en
la materia a la que pertenece la presente invención.
Donde se proporciona un intervalo de valores, se
entiende que cada valor intermedio, hasta el décimo de la unidad
del límite inferior a menos que el contexto indique claramente lo
contrario, entre los límites superior e inferior de ese intervalo,
y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo
indicado, se encuentra comprendido dentro de la invención. Los
límites superior e inferior de estos intervalos más estrechos
pueden encontrarse incluidos independientemente en los intervalos
más estrechos, y también se encuentran comprendidos dentro de la
invención, bajo la condición de cualquier límite excluido
específicamente en el intervalo indicado. En el caso de que el
intervalo indicado incluya uno o ambos límites, los intervalos que
excluyen cualquiera de los límites incluidos o ambos también se
encuentran incluidos en la invención.
A menos que se indique lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención
presentan el mismo significado que el entendido comúnmente por un
experto ordinario en la materia a la que pertenece la presente
invención. Aunque puede utilizarse cualquier procedimiento,
dispositivo y material similar o equivalente a los indicados en la
presente invención en la práctica o ensayo de la invención,
seguidamente se describen procedimientos, dispositivos y materiales
representativos.
En la descripción adicional de la invención, los
vectores de la invención en primer lugar se revisan en más detalle,
seguido de una revisión de los procedimientos de utilización de los
vectores de la invención, así como las aplicaciones representativas
en las que encuentran utilizados los vectores y procedimientos de
la invención.
Tal como se ha resumido anteriormente, la
invención proporciona vectores de integración en Listeria
específicos de sitio, es decir, vectores que se integran en genomas
de Listeria de una manera específica de sitio. Los vectores
de la invención se caracterizan porque se integran establemente en
un genoma de una especie de Listeria de una manera
específica de sitio, y no aleatoria. Debido a que los vectores de la
invención se integran de forma específica de sitio en un genoma
diana, los vectores de la invención típicamente se insertan en una
localización o secuencia (es decir, dominio, sitio) específicos del
genoma diana mediante un mecanismo mediado por una recombinasa,
específicamente una integrasa, en la que la integrasa es una que
utiliza dos sitios de reconocimiento diferentes como sustratos, uno
de los cuales se posiciona en el sitio de integración del genoma
diana (el sitio en el que debe integrarse un ácido nucleico) y otro
en posición contigua a un ácido nucleico de interés que debe
introducirse en el sitio de integración (es decir, un sitio en el
vector de la invención denominado en la presente invención "sitio
de unión a bacteriófago"). Por ejemplo, los sitios de
reconocimiento para las integrasas de fago se denominan
genéricamente attB, que se encuentra presente en el genoma
bacteriano (en el que debe insertarse un ácido nucleico) y attP (que
se encuentra presente en el ácido nucleico del fago en posición
contigua al ácido nucleico para la inserción en el genoma
bacteriano, que se denomina en la presente invención "sitio de
unión a bacteriófago"). Los sitios de reconocimiento pueden ser
nativos (endógenos a un genoma diana) o alterados respecto a una
secuencia nativa. La utilización del término "reconocer" en el
contexto de que una integrasa "reconoce" una secuencia de
reconocimiento, pretende referirse a la capacidad de la integrasa
de interaccionar con el sitio de reconocimiento y facilitar la
recombinación específica de sitio.
Los vectores de la invención son capaces de
integrarse en los genomas de una amplia diversidad de diferentes
especies de Listeria. La integración se determina con
facilidad mediante la utilización de cualquier ensayo conveniente,
incluyendo aquellos conocidos por los expertos en la materia, que
pueden identificar si se ha integrado o no ADN vector en el ADN
genómico de un organismo diana. Por ejemplo, puede introducirse ADN
vector en un organismo diana, por ejemplo mediante conjugación, y
después determinarse la integración mediante amplificación por PCR
de la secuencia integrada utilizando cebadores flanqueantes del
sitio diana, donde el tamaño del producto de amplificación
determinar si se ha producido la integración. Se proporciona un
ejemplo de este ensayo en la sección experimental, posteriormente.
Son características adicionales de muchas realizaciones de los
vectores de la invención que se replican autónomamente en una
célula huésped no Listeria, por ejemplo E. coli, y
que son estables e inocuos en estas células huésped no
Listeria.
Los vectores de interacción de la invención
típicamente son vectores plásmido de doble cadena, en los que los
vectores generalmente son de aproximadamente 3 kb, con frecuencia de
por lo menos aproximadamente 5 kb y pueden ser grandes, de 15 kb,
20 kb, 25 kb, 30 kb o mayores, en los que los vectores en ocasiones
presentan tamaños comprendidos entre aproximadamente
3-6 y aproximadamente 20 kb. Entre los vectores se
incluyen varias características estructurales que proporcionan a
los vectores las características funcionales anteriormente
indicadas.
Una característica estructural de los vectores
de la invención es un gen de integrasa de bacteriófago, es decir,
una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una integrasa de
bacteriófago, que se encuentra operablemente ligada a un promotor
específico de Listeria, de manera que el gen (la secuencia
codificante) se expresa en la célula de Listeria para la que
se ha diseñado que se utilice el vector. En la presente invención,
el gen de integrasa de bacteriófago es uno obtenido de un
listeriófago, es decir, es un gen de integrasa de listeriófago. Se
conocen de la técnica una diversidad de listeriófagos diferentes, en
los que cualquier listeriófago conveniente puede servir como fuente
del gen de integrasa, es decir, el ácido nucleico codificante de
integrasa. Entre las integrasas específicas de interés se incluyen,
aunque sin limitarse a ellas: la integrasa de U153, la integrasa de
PSA, y similares.
Tal como se ha indicado anteriormente, el gen de
integrasa se encuentra operablemente ligado a un promotor (así como
las secuencias reguladoras y/o de señal, si resulta necesario) que
controla la expresión del gen de integrasa cuando el vector se
encuentra presente en la célula de Listeria para la que se ha
diseñado el vector y en la que se desea la integración del vector.
Puede utilizarse cualquier promotor conveniente, donde en
determinadas realizaciones el promotor es un promotor específico de
Listeria. Entre los promotores representativos de interés se
incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el promotor p60 de
Listeria, el promotor actA de Listeria, el promotor
plcA de Listeria, el promotor mpI de Listeria, el
promotor plcB de Listeria, el promotor inlA de
Listeria; un promotor de choque térmico, y entre los
promotores similares también pueden incluirse determinados
promotores de bacteriófago, tales como los promotores de T7,
Q\beta, SP6 y similares si la cepa de Listeria también
expresa la ARN polimerasa de bacteriófago análoga. Además del
elemento gen/promotor de integrasa indicado anteriormente, los
vectores de la invención también incluyen un sitio de unión a
listeriófago, es decir, una secuencia o dominio de nucleótidos que
permite una integración específica de sitio en un genoma de
Listeria. Puede utilizarse cualquier sitio de unión a fago
conveniente, en el que la selección del sitio de unión a fago
dependerá, por lo menos en parte, de la localización de integración
deseada del vector. Entre los sitios de unión a fago representativos
se incluyen, aunque sin limitarse a ellos: el sitio de unión attPP'
de U153 (tal como se describe en mayor detalle en la sección
experimental, posteriormente); el sitio de unión attPP' de PSA (tal
como se describen en más detalle en la sección experimental,
posteriormente); y similares.
\newpage
Además, los vectores de la invención pueden
incluir un origen de replicación que permite la replicación del
vector en una célula huésped no Listeria, por ejemplo E.
coli. Este origen de replicación puede ser cualquier origen de
replicación o sitio ori conveniente, de los que se conocen de la
técnica varios sitios ori, incluyéndose entre los sitios de interés
particular, aunque sin limitarse a ellos: p15A, pSC101, ColEI, pUC,
pMB9 y similares.
Además, los vectores de la invención pueden
incluir un sitio o elemento de origen de transferencia en caso
conveniente, por ejemplo cuando el vector se introduce en la célula
Listeria diana utilizando un protocolo de conjugación, tal
como se describe en más detalle posteriormente. Puede utilizarse
cualquier origen de transferencia conveniente (oriT); entre los
orígenes de transferencia representativos de interés se incluyen,
aunque sin limitarse a ellos: oriT de RP4, oriT de RSF1010, y
similares.
Además, entre los vectores de la invención
típicamente se incluyen por lo menos un sitio reconocido por una
endonucleasa de restricción, es decir, un sitio de restricción, que
se encuentre localizado en el vector en un sitio que permita la
inserción de un gen heterólogo/casete de expresión. Se conocen de la
técnica una diversidad de sitios de restricción y pueden
encontrarse presentes en el vector, en el que dichos sitios
incluyen aquellos reconocidos por los enzimas de restricción
siguientes: HindIII, PstI, SalI, AccI, HincII, XbaI, BamHI, SmaI,
XmaI, KpnI, SacI, EcoRI, BstXI, EagI, NotI, SpeI y similares. En
muchas realizaciones, el vector incluye un polilínker o sitio de
clonación múltiple, es decir una serie o matriz de sitios dispuestos
próximos entre sí reconocidos por una pluralidad de diferentes
enzimas de restricción, tales como aquellos indicados
anteriormente.
Los vectores de la invención incluyen por lo
menos una secuencia codificante, por ejemplo una secuencia
codificante de polipéptido/proteína heterólogo presente en el sitio
de clonación múltiple, por ejemplo como resultado de la utilización
de un sitio de endonucleasa de restricción presente en el sitio de
clonación múltiple para insertar la secuencia codificante en el
vector, de acuerdo con protocolos de tecnología recombinante bien
conocidos. El término "heterólogo" se refiere a que la
secuencia codificante codifica un producto, por ejemplo una
proteína, péptido, polipéptido, glucoproteína, lipoproteína u otra
macromolécula, que no se expresa normalmente en Listeria. En
muchas realizaciones, esta secuencia codificante es parte de un
casete de expresión, que permite la expresión de la secuencia
codificante en la célula de Listeria para la que se ha
diseñado el vector. La expresión "casete de expresión" tal como
se utiliza en la presente invención se refiere a un módulo de
expresión o constructo de expresión que consta de una molécula de
ADN recombinante que contiene por lo menos una secuencia
codificante deseada y secuencias apropiadas de ácidos nucleicos
necesarias par ala expresión de la secuencia codificante
operablemente ligada en un organismo huésped particular, es decir,
la célula Listeria para la que se ha diseñado el vector,
tales como las secuencias de promotor/reguladoras/de señal
indicadas anteriormente, en el que el casete de expresión puede
incluir secuencias codificantes de dos o más polipéptidos
diferentes, o copias múltiples de la misma secuencia codificante,
según se desee. El tamaño de la secuencia codificante y/o casete de
expresión que incluye la misma puede variar, aunque típicamente se
encuentra comprendido dentro del intervalo de entre aproximadamente
25-30 y aproximadamente 6.000 pb, habitualmente de
entre aproximadamente 50 y aproximadamente 2.000 pb. Como tal, el
tamaño del producto codificado puede variar mucho, y pueden
encontrarse codificados un amplio espectro de productos diferentes
en los casetes de expresión presentes en los vectores de la
presente realización.
Puede variar la naturaleza de la secuencia
codificante y otros elementos del casete de expresión dependiendo
de la aplicación particular del vector, por ejemplo para estudiar
especies de Listeria, para producir vacunas de especies de
Listeria, para la administración citosólica de
macromoléculas, etc. Por ejemplo, en el caso de que los vectores se
utilicen en la producción de vacunas de Listeria, la
secuencia codificante puede codificar un antígeno heterólogo, en el
que los antígenos heterólogos representativos incluyen, aunque sin
limitarse a ellos: (a) antígenos víricos, por ejemplo proteína np de
influenza, proteína gag de VIH, proteína env de VIH o partes de la
misma, por ejemplo gp120 y gp41, proteína nef de VIH, proteínas pol
de VIH, transcriptasa inversa de VIH, proteasa de VIH, proteínas
del virus herpes, etc., (b) antígenos de la malaria, (c) antígenos
fúngicos, (d) antígenos bacterianos, (e) antígenos tumorales y
relacionados con tumores, y similares. Debido a la flexibilidad del
sistema de vector, puede insertarse prácticamente cualquiera
secuencia codificante de interés. En caso de que se desee la
secreción del producto codificado por el casete de expresión, éste
puede incluir una secuencia codificante para una proteína de fusión
de un antígeno foráneo seleccionado y una proteína reguladora de la
secreción, por ejemplo la listeriolisina O o la
PI-PLC, una secuencia de señal, tal como la
secuencia de señal hemolisina, etc. En el caso de que los vectores
de la invención se utilicen en la preparación de vehículos de
administración Listeria, por ejemplo tal como se describe en
la publicación de patente PCT nº WO 00/09733 y Dietrich et
al., Nature Biotechnology 16:181-185, 1998, la
secuencia codificante de polipéptido heterólogo puede ser una
citolisina, por ejemplo fosfolipasa, toxina formadora de poro,
listeriolisina O, estreptolisina O, perfringolisina O, citolisinas
activadas por ácido, lisinas de fago, etc. Entre otras secuencias
codificantes de interés se incluyen, aunque sin limitarse a ellas:
citoquinas, moléculas coestimulantes, y similares. Tal como se ha
indicado anteriormente, el vector pude incluir por lo menos una
secuencia codificante, en el que en determinadas realizaciones el
vector incluye dos o más secuencias codificantes, en el que las
secuencias codificantes pueden codificar productos que actúan
simultáneamente para proporcionar los resultados deseados.
En general, la secuencia codificante puede
codificar cualquiera de entre varios productos diferentes y puede
ser e una diversidad de diferentes tamaños, proporcionando el
comentario anterior meramente secuencias codificantes
representativas de interés.
Los vectores de la invención pueden producirse
utilizando cualquier protocolo conveniente, incluyendo mediante
procedimientos estándares de corte con enzimas de restricción,
ligación y clonación molecular. Un protocolo de construcción de
vectores de la invención incluye las etapas siguientes. En primer
lugar, se cortan con endonucleasas de restricción a partir de las
fuentes iniciales fragmentos purificados de ácidos nucleicos que
contienen secuencias de nucleótidos componentes deseados, así como
secuencias extrañas. A continuación, se separan de los fragmentos
no deseados de tamaño diferente los fragmentos que contienen las
secuencias de nucleótidos deseadas utilizando procedimientos de
separación convencionales, por ejemplo mediante electroforesis en
gel de agarosa. Los fragmentos deseados se extraen del gel y se
ligan entre sí en la configuración apropiada de manera que se
produce tal como se ha descrito anteriormente un ácido nucleico
circular o plásmido que contiene las secuencias deseadas, por
ejemplo secuencias que corresponden a los diversos elementos de los
vectores de la invención. Donde se desee, las moléculas circulares
construidas de esta manera seguidamente se amplifican en un
huésped, por ejemplo E. coli. Los procedimientos de corte,
construcción de plásmido, transformación celular y producción de
plásmido implicados en estas etapas son bien conocidos por el
experto en la materia y los enzimas requeridos para la restricción
y la ligación se encuentran disponibles comercialmente (ver, por
ejemplo, R. Wu, editor, Methods in Enzymology, vol. 68, Academic
Press, N.Y., 1979; T. Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; catálogo
1982-83, New England Biolabs, Inc.; catálogo
1982-83, Bethesda Research Laboratories, Inc. Se
proporciona un ejemplo de cómo construir un vector de la presente
invención en la sección experimental, posteriormente.
La invención también proporciona procedimientos
para utilizar los vectores de integración en Listeria
específicos de sitio anteriormente indicados para integrar un ácido
nucleico heterólogo en un genoma de Listeria. En la práctica
de los procedimientos de la invención, se introduce un vector de la
invención en una célula de Listeria diana bajo condiciones
suficientes para que se produzca la integración del vector en el
genoma celular diana. Puede utilizarse cualquier protocolo
conveniente para introducir el vector en la célula diana.
Entre los protocolos adecuados se incluyen: la
transfección mediada por fosfato de calcio; la fusión de
protoplasto, en la que los protoplastos que incluyen cantidades
amplificadas de vector se fusionan con la célula diana; la
electroporación, en la que se aplica un pulso breve de elevado
voltaje eléctrico a la célula diana para que la membrana celular de
la célula diana sea permeable al vector; la microinyección, en la
que el vector se inyecta directamente en la célula, tal como se
describe en Capechhi et al., Cell 22:479, 1980, y similares.
Los protocolos in vitro anteriores son bien conocidos de la
técnica y se revisan en más detalle en Sambrook, Fritsch y
Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Laboratory Press), páginas 16.30-16.55, 1989.
En determinadas realizaciones, por ejemplo en
las que la introducción directa en la célula de Listeria
diana no proporciona resultados óptimos, un procedimiento
representativo que puede utilizarse es un procedimiento de
conjugación, que comprende: (a) introducir el vector en una célula
huésped no Listeria, por ejemplo E. coli, seguido de
(b) la transferencia del vector desde la célula huésped no
Listeria a la célula huésped Listeria, por ejemplo
mediante conjugación. La introducción en la célula huésped no
Listeria puede conseguirse utilizando cualquiera de los
protocolos indicados anteriormente. Para la etapa de conjugación,
puede utilizarse cualquier protocolo conveniente, incluyendo
típicamente los protocolos adecuados combinar las células donantes
y aceptores en un medio adecuado y mantener bajo condiciones
adecuadas para que se produzca la conjugación y la transferencia
del vector. Se proporcionan las condiciones representativas
específicas en la sección experimental, posteriormente.
Los procedimientos anteriores resultan en la
integración estable del vector y cualquier casete de expresión
transportado por el mismo, por ejemplo que codifique una proteína
heteróloga/antígeno foráneo, en un genoma de célula Listeria
diana de una manera específica de sitio. Los procedimientos de la
invención encuentran utilidad con una amplia diversidad de especies
de Listeria diferentes.
Los vectores anteriormente indicados y
procedimientos de utilización de los mismos encuentran utilidad en
una diversidad de aplicaciones diferentes, en los que las
aplicaciones representativas incluyen, aunque sin limitarse a
ellas: (a) aplicaciones de investigación, (b) aplicaciones de
preparación de vacunas; (c) aplicaciones de preparación de vehículo
de administración Listerial, y similares.
Un tipo de aplicación en el que pueden
utilizarse los vectores y procedimientos de la invención es en la
investigación de las especies de Listeria. Por ejemplo, los
vectores y procedimientos de la invención permiten la construcción
simple y eficiente de cepas y resultan ampliamente útiles en
diversas cepas utilizadas para estudiar el ciclo vital intracelular
de L. monocytogenes. Además, los vectores y procedimientos de
la invención pueden utilizarse para producir cepas merodiploides
estables para permitir estudios refinados de número de copia y
estudios de interacciones dentro de una proteína a través de la
multimerización y ensayo de la naturaleza dominante o recesiva de
diferentes alelos de un gen en la misma cepa bacteriana.
\newpage
Los vectores y procedimientos de la invención
también encuentran utilidad en aplicaciones de preparación de
vacunas. Por ejemplo, los vectores de la invención encuentran
utilidad en la producción de cultivos de Listeria capaces de
expresar un antígeno heterólogo, es decir, vacunas de
Listeria, en las que las células de Listeria
utilizadas pueden encontrarse atenuadas. Las cepas atenuadas
utilizadas pueden ser capaces de invasión normal de una célula
huésped, aunque incapaces de sobrevivir o crecer normalmente en la
célula o de la propagación célula a célula, o puede presentar otras
alteraciones que impidan la patogenicidad normal.
Las vacunas producidas utilizando vectores de la
presente invención se administran a un vertebrado poniendo en
contacto el vertebrado con una dosis subletal de la vacuna de
Listeria manipulada genéticamente, en la que el contacto
típicamente incluye administrar la vacuna al huésped. De esta
manera, la presente invención proporciona vacunas manipuladas
genéticamente con el vector de integración y proporcionadas en una
formulación farmacéuticamente aceptable. La administración puede
ser oral, parenteral, intranasal, intramuscular, intravascular, la
vacunación directa de nódulos linfáticos, la administración mediante
catéter o uno o más cualesquiera de entre una diversidad de vías de
administración bien conocidas. En los animales de granja, por
ejemplo la vacuna puede administrarse oralmente mediante la
incorporación de la vacuna en pienso o líquido (tal como agua).
Puede suministrarse en forma de polvos liofilizados, en forma de
formulación congelada o en forma de componente de una cápsula, o
cualquier otra formulación conveniente farmacéuticamente aceptable
que conserve la antigenicidad de la vacuna. Puede utilizarse
cualquiera de entre varios diluyentes o excipientes
farmacéuticamente aceptables bien conocidos en las vacunas de la
invención. Entre los diluyentes adecuados se incluyen, por ejemplo,
agua destilada estéril, solución salina, solución tamponada con
fosfato y similares. La cantidad del diluyente puede variar
ampliamente, tal como apreciarán los expertos en la materia. Los
excipientes adecuados también son bien conocidos por los expertos
en la materia y pueden seleccionarse, por ejemplo, de A. Wade y P.J.
Weller, editores, Handbook of Pharmaceutical Excipientes, The
Pharmaceutical Press, London, 1994. La dosis administrada puede
depender de la edad, salud y peso del paciente, del tipo de
paciente, y de la existencia de tratamiento concurrente, en caso de
existir. Las vacunas pueden utilizarse en formas de dosificación,
tales como cápsulas, soluciones líquidas, suspensiones o elixires,
para la administración oral, o líquido estéril para formulaciones,
tales como soluciones o suspensiones para la utilización parenteral,
intranasal, intramuscular o intravascular. De acuerdo con la
invención, la vacuna puede utilizarse en combinación con un
diluyente farmacéuticamente aceptable, en forma de composición de
vacuna, útil en la inmunización de un paciente frente a la infección
por un organismo seleccionado o virus o con respecto a un tumor,
etc. Inmunizar a un paciente significa proporcionar al paciente por
lo menos algún grado de inmunidad terapéutica o profiláctica frente
a patógenos seleccionados, células cancerosas, etc.
Las vacunas de la invención preparadas con los
vectores de la invención encuentran utilidad en procedimientos para
inducir o reforzar una respuesta de células T ayudantes o células T
citotóxicas frente a un agente seleccionado, por ejemplo un
organismo patogénico, tumor, etc., en un vertebrado, incluyendo
dichos procedimientos la administración de una cantidad eficaz de
la vacuna de Listeria. Las vacunas de la invención preparadas
con los vectores de la invención encuentran utilidad en
procedimientos para inducir en un vertebrado una respuesta
inmunológica innata que incrementa la respuesta inmunológica
específica de antígeno. Además, las vacunas de la presente
invención pueden utilizarse para el tratamiento posterior a la
exposición o posterior al diagnóstico. En general, un experto en la
materia conocerá la utilización de vacunas para el tratamiento
posterior a la exposición para el tratamiento, por ejemplo, de la
rabia y el tétanos. La misma vacuna de la presente invención puede
utilizarse, por ejemplo, para la inmunización y para reforzar la
inmunidad tras la exposición. Alternativamente, puede utilizarse
una vacuna diferente de la presente invención para el tratamiento
posterior a la exposición, por ejemplo, una que resulte específica
para antígenos expresados en etapas posteriores de la exposición.
Como tales, las vacunas de la invención preparadas con los vectores
de la invención encuentran utilidad como vacunas tanto
profilácticas como terapéuticas para inducir respuestas
inmunológicas que son específicas para antígenos que son relevantes
en diversas condiciones de enfermedad.
El paciente puede ser cualquier animal humano o
no humano susceptible de infección por el organismo seleccionado.
Las vacunas de la invención encuentran particular utilización en
vertebrados, tales como el ser humano, y en animales domésticos.
Entre los animales domésticos se incluyen aves de corral, vacas,
cerdos, ovejas, caballos cabras, Leporidate (tales como conejos) u
otros animales que pueden mantenerse en cautividad.
En general, los vectores y procedimientos de la
invención encuentran utilidad en la producción de vacunas, tal como
se describe en la patente US nº 5.830.702, así como la publicación
de patente PCT nº WO 99/25376.
Los vectores de la invención también encuentran
utilidad en la producción de vehículos de administración
Listerial para la administración de macromoléculas en células
diana, por ejemplo tal como se describe en: publicación de patente
PCT nº WO 00/09733, y Dietrich et al., Nature Biotechnology
16:181-185, 1998. Puede administrarse una
diversidad de tipos diferentes de macromoléculas, incluyendo, aunque
sin limitarse a ellas: ácidos nucleicos, polipéptidos/proteínas,
etc., tal como se describe en estas publicaciones.
También se proporcionan kits y sistemas que
encuentran utilidad en la preparación de vectores de la invención
y/o la preparación de células de Listeria recombinantes
utilizando los vectores y procedimientos de la invención, tal como
se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, los kits y sistemas para
producir los vectores de la invención pueden incluir uno o más de
entre: un vector inicial con un sitio de clonación múltiple, una
endonucleasa de restricción para cortar un sitio en el sitio de
clonación múltiple, un vector que incluye un casete de expresión de
interés que debe insertarse en el sitio de clonación múltiple, etc.
En el caso de que los kits y sistemas se diseñen para la producción
de las células de Listeria recombinantes, los kits y
sistemas pueden incluir vectores o componentes para preparar los
mismos, tal como se ha descrito anteriormente, células de
Listeria diana, células huésped no Listeria y
similares. Los kits de la invención además pueden incluir otros
componentes que encuentren utilidad en los procedimientos de la
invención, por ejemplo tampones de reacción, medios de cultivo,
etc.
Los diversos componentes reactivos de los kits
pueden encontrarse presentes en recipientes separados, o todos
ellos pueden precombinarse en una mezcla de reactivos para la
combinación con el ADN de molde.
Además de los componentes anteriormente
indicados, los kits de invención pueden incluir además instrucciones
para poner en práctica los procedimientos de la invención. Estas
instrucciones pueden encontrarse presentes en los kits de la
invención en una diversidad de formas, una o más de las cuales puede
encontrarse presente en el kit. Una forma en la que estas
instrucciones puede encontrarse presentes es en forma de información
impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo un trozo o
trozos de papel sobre el que se ha impreso la información, en el
envoltorio del kit, en un impreso dentro del paquete, etc. Todavía
otros medios serían un medio legible por ordenador, por ejemplo
disquete, CD, etc. en el que se ha registrado la información. Otros
medios que pueden encontrarse presentes es una dirección de un sitio
de internet que puede utilizarse a través de internet para acceder
a la información desde un sitio alejado. Pueden encontrarse
presentes otros medios convenientes en los kits.
Los ejemplos siguientes se ofrecen a título de
ilustrativo y no en modo limitativo.
Se utilizaron técnicas moleculares estándares en
la construcción del vector de integración de 6.101 pb pPL1 (fig.
1A). Se proporciona la secuencia completa del vector pPL1 en SEC ID
nº 25. pPL1 es un plásmido de bajo número de copia que se replica
autónomamente en E. coli y que se integra de manera
específica de sitio en L. monocytogenes, y que se ensambla
partir de 6 fuentes de ADN independientes de la manera siguiente.
Los sitios de restricción en los cebadores de PCR utilizados para la
construcción se encuentran subrayados. Todas las reacciones de PCR
utilizadas en las etapas de clonación utilizaron ADN polimerasa Vent
(New England Biolabs).
El sitio de clonación múltiple (MCS) procedente
de pBluescript KS- (Alting-Mees, M.A. y J.M. Short,
pBluescript II: gene mapping vectores, Nucleic Acids Res. 17:9494,
1989) (pb 1 a 171) se clonó mediante PCR con los cebadores
5'-GGACGTCATTAACCCTCACTAAAGG-3'
y
5'-GGACGTCAATACGACTCACTATAGG-3'
(SEC ID nº 01 y nº 02). El origen de replicación
Gram-negativo de bajo número de copia y el gen de la
cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) de pACYC184 (Chang, A.C. y
S.N. Cohen, Construction and characterization of amplifiable
multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic
miniplasmid, J. Bacteriol. 134:1141-1156, 1978) (pb
172 a 2253) se clonaron mediante PCR con los cebadores
5'-GGACGTCGCTATTTAACGACCCTGC-3'
y 5'-GAGCTG
CAGGAGAATTACAACTTATATCGTATGGGG-3' (SEC ID nº 03 y nº 04). Para la conjugación directa de E. coli a L. monocytogenes, el origen de transferencia de RP4 (oriT) (Pansegrau, W., E. Lanka, P.T. Barth, D.H. Figurski, D.G. Guiney, D. Haas, D.R. Helinski, H. Schwab, V.A. Stanisich y C.M. Thomas, Complete nucleotide sequence of Birmingham IncP alpha plasmids. Compilation and comparative analysis, J. Mol. Biol. 239:623-663, 1994) (pb 2254 a 2624) se clonó a partir del plásmido pCTC3 (Williams, D.R., D.I. Young y M. Young, Conjugative plasmid transfer from Escherichia coli to Clostridium acetobutylicum, J. Gen. Microbiol. 136:819-826, 1990) tras PCR con los cebadores 5'-GCACTGCAGCCGCTTGCCCTCATCTGTACGCC-3' y 5'-CATGCATGCCTCTCGCCTGTCCCCTCAGT
TCAG-3' (SEC ID nº 05 y nº 06). El gen de integrasa del listeriófago U153 y el sitio de unión (attPP') (A. Nolte, P. Lauer y R. Calendar, no publicado, pb 2629 a 4127) (SEC ID nº 25 incluye las secuencias de estos sitios) que dirigen la integración específica de sitio del plásmido se clonaron tras PCR con los cebadores 5'-GTAGATCTTAACTTTCCATG
CAGAGGAG-3' y 5'-GGGCATGCGATAAAAAGCAATCTATAGAAAAACAGG-3' (SEC ID nº 07 y nº 08). Para la expresión del gen de integrasa de U153, el promotor p60 de L. monocytogenes (Lauer, P., J.A. Theriot, J. Skoble, M.D. Welch y D.A. Portnoy, Systematic mutational analysis of the amino-terminal domain of the Listeria monocytogenes ActA protein reveals novel functions in actin-based motility, Mol. Microbiol. 42:1163-1177, 2001) se amplificó por PCR con los cebadores 5'-CCTAAGCTTTCGATCATCATAATTCTGTC-3' y 5'-GGGCATGCA
GATCTTTTTTTCAGAAAATCCCAGTACG-3' (SEC ID nº 09 y nº 10) y se clonó corriente arriba del gen de integrasa. Los pares de bases 4570 a 6101 son un fragmento de restricción HindIII-AatII subclonado a partir de pUC18-Cat (cortesía de Nanci Freitag), y contienen el gen CAT Gram-positivo inducible procede de pC194 (Horinouchi, S. y B. Weisblum, Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance, J. Bacteriol. 150:815-825, 1982) (pb 4788 a 5850).
CAGGAGAATTACAACTTATATCGTATGGGG-3' (SEC ID nº 03 y nº 04). Para la conjugación directa de E. coli a L. monocytogenes, el origen de transferencia de RP4 (oriT) (Pansegrau, W., E. Lanka, P.T. Barth, D.H. Figurski, D.G. Guiney, D. Haas, D.R. Helinski, H. Schwab, V.A. Stanisich y C.M. Thomas, Complete nucleotide sequence of Birmingham IncP alpha plasmids. Compilation and comparative analysis, J. Mol. Biol. 239:623-663, 1994) (pb 2254 a 2624) se clonó a partir del plásmido pCTC3 (Williams, D.R., D.I. Young y M. Young, Conjugative plasmid transfer from Escherichia coli to Clostridium acetobutylicum, J. Gen. Microbiol. 136:819-826, 1990) tras PCR con los cebadores 5'-GCACTGCAGCCGCTTGCCCTCATCTGTACGCC-3' y 5'-CATGCATGCCTCTCGCCTGTCCCCTCAGT
TCAG-3' (SEC ID nº 05 y nº 06). El gen de integrasa del listeriófago U153 y el sitio de unión (attPP') (A. Nolte, P. Lauer y R. Calendar, no publicado, pb 2629 a 4127) (SEC ID nº 25 incluye las secuencias de estos sitios) que dirigen la integración específica de sitio del plásmido se clonaron tras PCR con los cebadores 5'-GTAGATCTTAACTTTCCATG
CAGAGGAG-3' y 5'-GGGCATGCGATAAAAAGCAATCTATAGAAAAACAGG-3' (SEC ID nº 07 y nº 08). Para la expresión del gen de integrasa de U153, el promotor p60 de L. monocytogenes (Lauer, P., J.A. Theriot, J. Skoble, M.D. Welch y D.A. Portnoy, Systematic mutational analysis of the amino-terminal domain of the Listeria monocytogenes ActA protein reveals novel functions in actin-based motility, Mol. Microbiol. 42:1163-1177, 2001) se amplificó por PCR con los cebadores 5'-CCTAAGCTTTCGATCATCATAATTCTGTC-3' y 5'-GGGCATGCA
GATCTTTTTTTCAGAAAATCCCAGTACG-3' (SEC ID nº 09 y nº 10) y se clonó corriente arriba del gen de integrasa. Los pares de bases 4570 a 6101 son un fragmento de restricción HindIII-AatII subclonado a partir de pUC18-Cat (cortesía de Nanci Freitag), y contienen el gen CAT Gram-positivo inducible procede de pC194 (Horinouchi, S. y B. Weisblum, Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance, J. Bacteriol. 150:815-825, 1982) (pb 4788 a 5850).
Se subclonó el gen hly a partir del plásmido
pDP-906 (Jones, S. y D.A. Portnoy, Characterization
of Listeria monocytogenes pathogenesis in a strain
expressing perfringolysin O in place of listeriolysin O. Infect.
Immun. 62(12):5608-5613, 1994) mediante
digestión de restricción con BamHI y XbaI, purificando en gel un
fragmento de 2,9 kb y ligándolo en pPL1 cortado con BamHI y SpeI. El
plásmido resultante se denominó pPL24 (fig. 1A). El gen actA se
amplificó por PCR a partir de ADN genómico 10403S con los cebadores
5'-GGTCTAGATCAAGCACATACCTAG-3'
y
5'-CGGGATCCTGAAGCTTGGAAGCAG-3'
(SEC ID nº 11 y nº 12). El producto PCR de 2220 pb se purificó en
gel con BamHI y XbaI, y se clonó en pPL1 cortado con BamHI y SpeI.
El plásmido resultante se denominó pPL25 (fig. 1A).
Se consiguió el curado de los fagos adaptando
metodologías históricas (Cohen, D., A Variant of Phage P2
Originating in Escherichia coli, strain B, Virology
7:112-126, 1959; Six, E., Prophage substitution and
curing in lysogenic cells superinfected with
hetero-immune phage, J. Bacteriol.
80:728-729, 1960). Se cultivaron derivados de L.
monocytogenes 10403S que portaban un profago en
comK-attBB' (integrado en el ORF comK tal como ha
sido descrito (Loessner, M.J., R.B. Inman, P. Lauer y R. Calendar,
Complete nucleotide sequence, molecular analysis and genome
structure of bacteriophage A118 of Listeria monocytogenes:
implications or phage evolution, Mol. Microbiol.
35(2):324-340, 2000)) en BHI a 37ºC hasta
10^{8} CFU/ml y se infectaron con listeriófago U153 (Hodgson,
D.A., Generalized transduction of serotype 1/2 and serotype 4b
strains of Listeria monocytogenes, Mol. Microbiol.
35(2):312-323, 2000) a una multiplicidad de
infección de 20:1 en presencia de CaCl_{2} 5 mM. Los cultivos se
incubaron mediante agitación a 37ºC durante 75 minutos y se realizó
un seguimiento de la inhibición del crecimiento mediante comparación
de la DO_{600} del cultivo infectado con un cultivo de control no
infectado. El cultivo infectado se diluyó 10^{-2} y 10^{-4} en
BHI, y ambas diluciones se cultivaron a 37ºC hasta que la dilución
10^{-2} había incrementado su densidad óptica en 100 veces. A
continuación, la dilución 10^{-4} se diluyó 10^{-2}, y se
sembraron 3 \mul en placa de BHI. Se sometieron a ensayo
cincuenta colonias para la liberación de fagos inicialmente mediante
la extracción individual de colonias a 0,25 ml de caldo LB y
replicación en placa a 30ºC en un cultivo confluyente de
Mack-4R (DP-L862), una cepa rugosa
no lisogénica de L. monocytogenes particularmente susceptible
a la formación de placas. Los candidatos que no formaron placas
seguidamente se sometieron a ensayo mediante cultivo de puntos de
10 \mul de cultivo en un cultivo confluyente de
Mack-4R para detectar la formación de placas. Si
este segundo ensayo era negativo, el candidato se ensayaba para
comprobar si podía soportar la formación de placas por parte del
fago de la cepa parental 10403S (\Phi10403, Hodgson, D.A.,
Generalized transduction of serotype 1/2 and serotype 4b strains of
Listeria monocytogenes, Mol. Microbiol.
35(2):312-323, 2000). Se confirmó el curado
molecularmente mediante PCR con el par de cebadores PL60/PL61
específico de comK-attBB' (secuencias a
continuación) para la ausencia de un fago en
comK-attBB'. Se curó aproximadamente el 10% de las
colonias utilizando este procedimiento.
Se convirtieron en resistentes a la
estreptomicina cepas receptoras de L. monocytogenes
(SLCC-5764, DP-L1169 y
DP-L1172) para la contraselección en experimentos de
selección mediante selección de placas en BHI suplementado con 200
\mug/ml de antibiótico.
Se electroporaron constructos de plásmido pPL1
en la cepa SM10 de E. coli (Simon, R., U. Priefer y A.
Pühler, A broad host range mobilization system for in vitro
genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram negative
bacteria, Bio/Technology 1:784-791, 1983) utilizando
técnicas estándar (Sambrook, J., T. Maniatis y E.F. Fritsch,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, ed. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Se
cultivaron cepas bacterianas hasta la fase semilogarítmica
(DO_{600} \sim 0,55) bajo agitación a 30ºC. Las cepas donantes
de E. coli se cultivaron en LB que contenía 25 \mug/ml de
cloranfenicol, las cepas receptoras de L. monocytogenes se
cultivaron en BHI. Se mezclaron 2,5 ml de cultivo donante con 1,5
ml de cultivo receptor y se filtraron sobre filtros de tipo HA de
0,45 \mum de 47 mm prelavados (Millipore). El filtro se lavó una
vez con 10 ml de BHI, se transfirió a una placa de BHI sin
antibióticos y se incubó durante 2 horas a 30ºC. Las células
bacterianas se resuspendieron suavemente en 2,5 ml de BHI y se
sembraron en placa alícuotas de 25 \mul y de 50 \mul en 3 ml de
top ágar LB en placas de BHI suplementadas con 7,5 \mug/ml de
cloranfenicol y 200 \mug/ml de estreptomicina. Las placas se
incubaron a 30ºC durante la noche y se trasladaron a 37ºC durante 2
a 3 días. Se recogieron colonias individuales y se cribaron
mediante PCR para la integración en el sitio de unión de fago
utilizando los cebadores PL14
(5'-CTCATGAACTAGAAAAATGTGG-3') (SEC
ID nº 13), PL60
(5'-TGAAGTAAACCCGCACACGATG-3') (SEC
ID nº 14) y PL61
(5'-TGTAACATGGAGGTTCTGGCAATC-3')
(SEC ID nº 15). Se llevaron a cabo reacciones de PCR en partes
reducidas de colonias bacterianas individuales recogidas con puntas
de pipeta P200 estériles a partir de las placas de BHI e
introducidas directamente en 20 \mul para reacción de PCR. El par
de cebadores PL14/PL61 amplifica específicamente attBP' en una
reacción de PCR, resultando en un producto de 743 pb en las cepas
integradas (derivadas tanto de profago como de pPL1). El par de
cebadores PL60/PL61 amplifica específicamente
comK-attBB' en una reacción de PCR, resultando en
un producto de 417 pb sólo en cepas no lisogénicas (es decir,
DP-L4056). Se llevaron a cabo ensayos de PCR en un
termociclador Hybaid Omn-E con una temperatura de
hibridación de 55ºC durante 30 ciclos. Surgieron integrantes a una
frecuencia de aproximadamente 2x10^{-4} por célula donante.
Se puntuó la hemólisis en placas de ágar sangre
utilizando placas de ágar de soja tríptica suplementada con 5% de
sangre de oveja desfibrinada (HemoStat, Davis, CA). Los ensayos
hemolíticos se llevaron a cabo tal como ha sido descrito con
anterioridad (Portnoy, D.A., P.S. Jacks, y D.J. Hinrichs, Role of
hemolysin for the intracellular growth of Listeria
monocytogenes, J. Exp. Med.
167(4):1459-1471, 1988). La actividad
hemolítica se expresa como el recíproco de la dilución del
sobrenadante de cultivo requerida para lisar el 50% de los
eritrocitos de oveja.
Se determinaron los tamaños de las placas tal
como ha sido descrito con anterioridad (Lauer, P., J.A. Theriot, J.
Skoble, M.D. Welch y D.A. Portnoy, Systematic mutational analysis of
the amino-terminal domain of the Listeria
monocytogenes ActA protein reveals novel functions in
actin-based motility, Mol. Microbiol.
42(5):1163-1177). Se sembró cada cepa en 6 a
8 experimentos independientes y se comparó con 10403S en cada
experimento.
Se preparó proteína ActA expresada en superficie
a partir de cultivos bacterianos en fase logarítmica tardía
cultivados en caldo LB (D0600 \sim 0,7) mediante la resuspensión
de cantidades equivalentes en tampón de SDS-PAGE y
mediante ebullición durante 5 minutos, lo que extrae las proteínas
expresadas en superficie pero no altera la pared celular. Se
cargaron cantidades equivalentes en SDS-PAGE al 7% y
se visualizaron con azul de Coomassie.
Se preparó extracto citoplasmático de huevos de
X. laevis tal como ha sido descrito con anterioridad
(Theriot, J.A., J. Rosenblatt, D.A. Portnoy, P.J.
Goldschmidt-Clermont y T.J. Mitchison, Involvement
of profilin in the actin-based motility of L.
monocytogenes in cells and in cell-free
extracts, Cell 76(3):505-517, 1994) y se
suplementó con actina marcada con tetrametilrodamina yodoacetamida
(Theriot, J.A. y D.C. Fung, Listeria monocytogenes-based
assays for actin assembly factors, Methods Enzymol.
298:114-122, 1998). Se cultivaron cepas derivadas
de SLCC-5764 cultivadas durante la noche hasta la
fase estacionaria, se lavaron 1X, se añadieron a extractos
celulares y se incubaron durante 45 minutos previamente a la
observación microscópica.
Se llevaron a cabo determinaciones limitadas de
LD_{50} en ratones BALB/c tal como ha sido descrito con
anterioridad (Portnoy, D.A., P.S. Jacks y D.J. Hinrichs, Role of
hemolysin for the intracellular growth of Listeria
monocytogenes, J. Exp. Med.
167(4):1459-1471, 1988). Se llevaron a cabo
experimentos animales en el laboratorio de Archie Bouwer en el
Oregon Health Sciences Center, Portland, OR.
Se obtuvo la secuencia de ADN del sitio de unión
de PSA (ARNt^{Arg}-attBB') mediante una
combinación de PCR inversa y paseo genómico. Se llevó a cabo PCR
inversa en ADN de DP-L4061 (WSLC 1042 lisogénico
para PSA) digerido con Sau3 Al (SEC ID nº 26 es la secuencia de
2.072 pb circundante a WSLC 1042
ARNt^{Arg}-attBB') utilizando los cebadores
divergentes PL95 (5'-ACATAATCAGTCCAAAGTAGATGC) (SEC
ID nº 16) y PL97 (5'-ACGAATG
TAAATATTGAGCGG) (SEC ID nº 17) que hibridan dentro del gen int de PSA. La secuencia de ADN resultante se utilizó para diseñar oligonucleótidos adicionales y estos se utilizaron con el kit Genome Walker (Clontech) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se realizó el análisis de secuencia de ADN y del ARNt utilizando MacVector (Accelrys), DNAsis (Hitachi), algoritmo BLAST (2) y tRNAscan-SE (Lowe, T.M. y S.R. Eddy, tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence, Nucleic Acids Res. 25(5):955-964, 1997).
TAAATATTGAGCGG) (SEC ID nº 17) que hibridan dentro del gen int de PSA. La secuencia de ADN resultante se utilizó para diseñar oligonucleótidos adicionales y estos se utilizaron con el kit Genome Walker (Clontech) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se realizó el análisis de secuencia de ADN y del ARNt utilizando MacVector (Accelrys), DNAsis (Hitachi), algoritmo BLAST (2) y tRNAscan-SE (Lowe, T.M. y S.R. Eddy, tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence, Nucleic Acids Res. 25(5):955-964, 1997).
Se modificó pPL1 para utilizar un sitio de unión
diferente en el cromosoma de L. monocytogenes mediante la
sustitución del gen de integrasa de U153 y el sitio de unión en el
plásmido. El int y attPP' de PSA se amplificaron por PCR a partir
del ADN genómico de PSA con los cebadores PL100
(5'-GAAGATCTCCAAAAATAAACAGGTGGTGG) (SEC ID
nº 18) y PL101
(5'-CATGCATGCGTGGAGGGAAAGAAGAACGC) (SEC ID nº
19) con ADN polimerasa Vent, se digirió con BgI II y SphI, y se
ligó en pPL1 que había sido digerido con los mismos enzimas. El
plásmido resultante se denominó pPL2 (fig. 1B). Se proporciona la
secuencia de pPL2 como SEC ID nº 28.
La secuencia de ADN del
ARNt^{Arg}-attBB' de PSA de cepas de L.
monocytogenes de serotipo ½ se obtuvo mediante una estrategia
de plásmido-trampa. Se digirió ADN genómico de
DP-L4211 (pPL2 integrado en 10403S) con NsiI y
NheI, que no cortan dentro del vector, y se ligó bajo condiciones
diluidas para estimular la autoligación. Las ligaciones se
transformaron en XL1-blue y se seleccionaron las
colonias resistentes al cloranfenicol. Los plásmidos obtenidos se
secuenciaron con los cebadores convergentes PL94
(5'-GGAGGGAAAGAAGAACGC) (SEC ID nº 20) y PL95
(secuencia proporcionada anteriormente) para attPB' y attBP',
respectivamente, que flanquean attPP' en la secuencia genómica de
ADN de PSA. Además, debido a la divergencia entre las secuencias más
abajo del gen ARNt^{Arg} entre serotipos, se desarrolló un ensayo
de PCR específico de serotipo 1/2 a través de
ARNt^{Arg}-attBB' a partir de la secuencia de ADN
de 10403S y se utilizó para determinar el estatus de profago de
diversas cepas de L. monocytogenes. Los cebadores PL102
(5'-TATCAGACCTAACCCAAACCTTCC) (SEC ID nº 21) y
PL103 (5'-AATCGCAAAATAAAAATCTTCTCG) (SEC ID nº 22)
amplifican específicamente un producto de PCR de 533 pb en cepas de
serotipo 1/2 no lisogénicas. El par de cebadores NC16
(5'-GTCAAAACATACGCTCTTATC) (SEC ID nº 23) y PL95
amplifican específicamente un producto de PCR de 499 pb en cepas que
son lisogénicas o que contienen un vector de integración en
ARNt^{Arg}-attBB' (SEC ID nº 27 proporciona las
643 pb circundantes a ARNt^{Arg}-attBB' de
10403S).
pPL1 es el primer vector lanzadera que
construyeron los presentes inventores para facilitar la construcción
de cepas en L. monocytogenes. Con el fin de someter a ensayo
el vector pPL1, resultaba necesaria una cepa de L.
monocytogenes que no presentase un fago en el sitio de unión
bacteriano comK. Se adaptaron procedimientos históricos para curar
cepas de L. monocytogenes de sus profagos y se descubrió que,
tras la superinfección con fago U153, que presenta el mismo sitio
de unión que el profago endógeno 10403S, resultaba posible aislar
cepas libres de profago (ver Materiales y procedimientos). La cepa
10403S curada de profago se denominó DP-L4056 y se
utilizó en experimentos posteriores.
Se seleccionó la conjugación como procedimiento
para introducir el vector en las células diana, debido a que muchas
especies de Listeria se transforman con eficiencia reducida.
La conjugación de pPL1 de E. coli en L. monocytogenes
tuvo éxito. Surgieron transconjugantes resistentes a fármaco a una
frecuencia reproducible de \sim 2x10^{-4} por célula donante de
E. coli, aproximadamente tres veces menos que en la
conjugación con plásmidos de replicación autónoma, indicando una
eficiencia de integración del \sim30% para las cepas que reciben
el plásmido por conjugación. Toda las colonias resistentes al
cloranfenicol resultaron positivas en el ensayo de PCR con los
cebadores PL14 y PL61, y negativas al utilizar un ensayo de PCR a
través de attPP' en pPL1 (PL14 apareado con un cebador en el oriT
de RP4) indicando que eran integrantes verdaderos y que el
complemento genético completo del plásmido pPL1 se había integrado
en el cromosoma de Listeria. Además, este experimento
demostró que pPL1 no se mantiene en forma de plásmido episómico y
que el vector no se integra como concatámero.
Los presentes inventores sometieron a ensayo la
estabilidad de los integrantes bajo condiciones de cultivo no
selectivas. Se subcultivaron en medio BH durante 100 generaciones
tres cepas integrantes, DP-L4074 y las cepas
merodiploides DP-L4076 y DP-L4078
(descritas en las secciones siguientes) y se sembraron para obtener
colonias individuales. A continuación, se expusieron noventa y seis
colonias a 0,1 \mug/ml de cloranfenicol (para inducir la
expresión del gen CAT) y se sembraron en parche en placas que
contenían 7,5 \mug/ml de antibiótico. Todas las colonias
conservaron la resistencia a fármaco. Se sometieron a ensayo treinta
colonias de cada experimento de cultivo no selectivo mediante
ensayo de PCR PL14/PL61 y todas las reacciones de PCR resultaron en
el producto de 743 pb, indicando que todos los transconjugantes
conservaban integrado el plásmido.
Además, los presentes inventores investigaron si
el vector de integración resultaría útil de manera general para
cualquier cepa de L. monocytogenes con un sitio de unión
disponible. Se han aislado más de 320 listeriófagos, y muchos
presentan rangos de huésped restringidos. No resultaba claro si
existía una barrera biológica a la función del gen de integrasa
U153 en cepas huésped que no soportan la infección por U153. Por lo
tanto, se seleccionaron tres cepas que no contenían un profago en el
sitio de unión comK; dos aislados clínicos de serotipo 4b y
SLCC-5764, una cepa de serotipo 1/2a que expresa
constitutivamente los factores de virulencia conocidos de una
manera no regulada y ha resultado útil para estudiar estos factores
de virulencia in vitro. En primer lugar, cada una de estas
cepas se hizo resistente a la estreptomicina para la contraselección
en experimentos de conjugación (tal como se describe en Materiales
y métodos). Los derivados resistentes a la estreptomicina se
seleccionaron si presentaban la misma tasa de crecimiento que la
cepa parental para evitar complicaciones experimentales
relacionadas con la viabilidad. Las cepas resultantes,
DP-L4088, DP-L4089 y
DP-L4082, todas resultaron receptores adecuados para
la integración de pPL1 a una frecuencia similar a
DP-L4056.
Finalmente, los presentes inventores llevaron a
cabo un estudio de los aislados de L. monocytogenes para
identificar las cepas adecuadas que no portaban un profago en el
sitio de unión comK, utilizando los ensayos de PCR a través de
comK-attBB'(cebadores PL60/PL61) y attPB' híbrido
(cebadores PL14/PL61). Los resultados de estos experimentos (Tabla
2) indicaron que muchas de las cepas utilizadas con frecuencia para
estudiar la biología y la patogénesis de L. monocytogenes,
incluyendo 10403S, L028 y EGDe, presentaban un profago en comK.
A continuación, los presentes inventores
compararon DP-L4056 y DP-L4074 con
10403S de tipo salvaje en ensayos de virulencia estándar para
determinar si la presencia de un profago en comK, la falta de
profago, o el vector de integración alteraba los fenotipos de
virulencia. Estas tres cepas se sometieron a ensayo para la
actividad de LLO, la capacidad para formar placas en monocapas de
células L2, y para virulencia en el ensayo de LD_{50} de ratón
(Tabla 3). Ninguno podía distinguirse de los demás, sugiriendo
fuertemente que la integridad del ORF comK y la presencia de pPL1
no presentó ningún impacto medible sobre la virulencia.
La listeriolisina-O (LLO), el
producto génico de hly, es una citolisina secretada formadora de
poro que es responsable de la fuga de la vacuola unida a membrana
cuando L. monocytogenes entra por primera vez en una célula
huésped. LLO resulta absolutamente necesaria para el ciclo celular
intracelular de L. monocytogenes y la virulencia. Puede
medirse la actividad de LLO mediante la actividad hemolítica en los
glóbulos rojos. Los mutantes hly no consiguen formar placas en
monocapas de células L2 y son 5 logaritmos menos virulentas en el
ensayo de LD_{50} de ratón.
Los presentes inventores clonaron el gen
estructural hly en pPL1 y conjugaron este plásmido de E.
coli en L. monocytogenes derivados de tipo salvaje curado
de fago y \Deltahly, resultando en DP-L4076 (un
merodiploide para hly) y DP-L4075 (hly únicamente en
el sitio comK-att de fago). Estas cepas se
sometieron a ensayo para actividad hemolítica en placas de ágar
sangre para la cantidad relativa de unidades hemolíticas
segregadas, la capacidad deformar una placa en una monocapa de
células L2, y virulencia en el ensayo de LD_{50} de ratón (Tabla
3). La complementación cuantitativa de hly en el fondo de la cepa de
deleción y el doblado de las unidades hemolíticas producidas en la
cepa merodiploide indica dos cosas. En primer lugar, la expresión
génica no resulta afectada de facto por la expresión ectópica en la
posición cromosómica comK. En segundo lugar, el promotor de hly es
autocontenido. Además, un incremento de dos veces en la cantidad de
LLO no perjudica la virulencia ni el ciclo vital intracelular de
L. monocytogenes, por lo menos según se mide mediante ensayo
de formación de placas.
ActA, un segundo factor de virulencia importante
de L. monocytogenes, es responsable de regular la
actina-factores citoesqueléticos de la célula
huésped utilizadas para la motilidad bacteriana intracelular. ActA
también resulta absolutamente necesaria para la patogénesis
bacteriana debido a que los mutantes en actA son incapaces de
extenderse de célula a célula y formar una placa en una monocapa
celular y son 3 logaritmos menos virulentas que el tipo salvaje.
Además, la expresión de actA aparentemente resulta más compleja que
la de LLO: existen dos promotores que regulan la expresión de actA.
Uno se encuentra inmediatamente corriente arriba del ORF de actA y
el segundo se encuentra delante del gen mpI corriente arriba de
actA.
Los presentes inventores construyeron varias
cepas para evaluar la complementación de actA en el sitio de unión
de fago. En el primer grupo se incluía la preparación de una cepa
complementada en un segundo sitio (DP-L4077) y una
cepa merodiploide (DP-L4078) en un fondo de 10403S.
Estas cepas se sometieron a ensayo para formación de placas en una
monocapa de L2 (Tabla 3). El actA integrado no complementó
totalmente en este ensayo (tamaño de placa del 86%) y la cepa
merodiploide formó una placa incluso más pequeña (72% del tipo
salvaje). Estos resultados se interpretan como indicativos de que
podía existir una pequeña contribución del segundo promotor
corriente arriba del gen mpI para la expresión óptima de actA.
Además, aparentemente existe una concentración crítica de actA en
la superficie de la bacterias intracelulares debido a que dos copias
de actA (con 3 promotores reguladores de la expresión) reducen
adicionalmente la capacidad de extenderse de célula a célula,
presumiblemente porque existe un exceso de ActA en la superficie
bacteriana para una motilidad óptima.
Los presentes inventores ensayaron además la
complementación de ActA en la cepa SLCC-5764
sobreexpresante del gen de la virulencia. ActA se expresa
efectivamente en esta cepa desde el sitio
comK-attBB' (fig. 3A, carril 9). Considerando los
datos de formación de placas de cepas actA complementadas por
10403S, podría predecirse que la cepa merodiploide
DP-L4085 produciría más ActA que la cepa parental.
Sin embargo, esto no se observó: la cepa parental, la cepa
complementada y la cepa merodiploide expresaron niveles similares de
ActA (fig. 3A, carriles 5, 8 y 9). Esta observación probablemente
se debe a la completa falta de regulación y al elevado nivel de
expresión constitutiva de ActA en SLCC-5764. Además,
DP-L4087 soporta la nucleación de la actina en la
superficie bacteriana, la formación de colas de actina y la
motilidad bacteriana en extractos celulares (fig. 3B). Los
resultados de estos experimentos en extractos celulares indican que
el sistema de vector de integración para la complementación
resultaría útil en estudios in vitro de motilidad de L.
monocytogenes, facilitando la construcción de cepas y la
introducción de diversos constructos moleculares en diferentes cepas
huésped para el estudio en un conjunto deseado de ensayos. En
particular, varios alelos de actA que presentan fenotipos de
motilidad no habituales han sido transferidos a la cepa
SLCC-5764 \DeltaActA utilizando pPL1 y en la
actualidad se están evaluando en extractos celulares. El estudio de
estos mutantes en el sistema simplificado de extracto celular
probablemente llevará a un conocimiento más profundo de las
actividades de regiones poco comprendidas de la proteína ActA.
Las cepas indicadas anteriormente se
proporcionan en la Tabla 1 a continuación.
La integración de pPL1 en cepas de L.
monocytogenes que portan un profago en el sitio de unión comK
se ve dificultada por la obligación de curar en primer lugar el
profago de la cepa huésped. Con el fin de evitar la necesidad de la
etapa de curado de fago, se modificó la especificidad de la
integración de pPL1 a la del profago PSA. PSA (Phage from
ScottA) es el profago de L. monocytogenes cepa
ScottA, una cepa de serotipo 4b que se aisló durante una epidemia
de listeriosis humana. Utilizando la secuencia de ADN genómico de
PSA, los presentes inventores identificaron una ORF similar a
integrasa con una secuencia no codificante contigua que los
presentes inventores predijeron que contenía las secuencias attPP'.
A continuación, se utilizó la secuencia de integrasa de PSA para
obtener la secuencia de ADN de PSA-attBB' de la cepa
lisogénica para PSA DP-L4061 (ver Materiales y
Métodos). Se descubrió que PSA se integraba en un gen ARNt^{Arg}
que es idéntico al 88% a un gen ARNt^{Arg}
(trnSL-ARG2) de B. subtilis. El anticodón del
gen ARNt^{Arg} es 5'UCU, el anticodón de arginina utilizado más
frecuentemente en L. monocytogenes. Los sitios de unión de
PSA y bacteriano comparten 17 pb de identidad de ADN, y el
ARN_{t}^{Arg}-attBB' contiene una corta
secuencia de nucleótidos que completa la secuencia de
ARN_{t}^{Arg} que resulta interrumpida por la integración de
PSA (fig. 4). El sitio de unión gen ARN_{t}^{Arg} se encuentra
presente únicamente una vez en el genoma de L. monocytogenes
cepa EGDe y aparentemente sólo una vez en el serotipo 4b. Esto
indica que no sólo es único el sitio de integración de PSA, sino
que también la reconstitución precisa del gen tras la integración
(o excisión) probablemente resulta necesario para la supervivencia
de la célula.
Se construyó pPL2 sustituyendo el gen de
integrasa del listeriofago U153 y sitio de unión en pPL1 con el gen
de integrasa del listeriófago PSA y el sitio de unión. Se transformó
pPL2 en SM10 y la cepa resultante se cruzó en 10403S, EGDe (que
porta una mutación de resistencia a la estreptomicina) y la cepa
DP-L4088 de serotipo 4b. Surgieron transconjugantes
resistente al cloranfenicol de cada uno de estos cruzamientos a una
frecuencia de aproximadamente 2x10^{-4} por célula donante, la
misma tasa que la integración de pPL1. Se sembraron nuevamente dos
recombinantes de cada cruzamiento bajo selección farmacológica y se
sometieron a ensayo mediante PCR para la presencia de
PSA-attBP' utilizando los cebadores NC16 y PL95. Se
obtuvo el producto PCR de 499 pb esperado en cada una de las
colonias sometidas a ensayo, indicando que pPL2 se integra en
ARN_{t}^{Arg}-attBB' en las cepas tanto de
serotipo 1/2 como 4b. Los presentes inventores sometieron a ensayo
la estabilidad del pPL2 integrado en las cepas tanto EGDe como
DP-L4088 con el mismo experimento no selectivo de
100 generaciones descrito para pPL1. Se sometieron a ensayo
cuarenta y nueve colonias de cada uno de los cultivos amplificados
para resistencia al cloranfenicol. Las cepas derivadas de EGDe
conservaron colonias 100% resistentes a fármaco, indicando
estabilidad completa de los integrantes. En el caso del integrante
DP-L4088, dos de las 49 colonias eran sensibles al
cloranfenicol, indicando que puede existir un nivel reducido de
excisión en esta cepa de serotipo 4b. Con el fin de someter a
ensayo si se había producido excisión exacta, los presentes
inventores amplificaron por PCR a través de
ARNt^{Arg}-attBB' y secuenciaron los productos de
PCR. Se obtuvo la secuencia de ADN de tipo salvaje, indicando que
se había producido un suceso de excisión exacta.
Durante el curso de los experimentos de PCR de
los presentes inventores, se observó una divergencia entre los
sitios ARN_{t}^{Arg}-attPB' de serotipo 4b y de
serotipo 1/2 de L. monocytogenes. Con el fin de determinar
la naturaleza de esta divergencia, los presentes inventores aislaron
y secuenciaron el sitio ARN_{t}^{Arg}-attBB' de
10403S (tal como se describe en Materiales y Métodos). Los presentes
inventores descubrieron que la secuencia de attPB' en 10403S (3'
del gen ARN_{t}^{Arg}) no se encuentra relacionada con la de la
cepa WSLC 1042 de serotipo 4b. Por el contrario, la secuencia de
attBP' (5' del gen ARN_{t}^{Arg}) en 10403S es idéntica al
96%-97% a las regiones correspondientes en L. monocytogenes
serotipo 4b cepa WSLC 1042, la cepa de serotipo 4b secuenciada por
TIGR, y la cepa EGDe de serotipo 1/2a secuenciada por el European
Listeria Consortium. De esta manera, las secuencias
bacterianas de attBB' reconocidas por la integrasa PSA
probablemente abarcan más de la secuencia de ADN de attB que la
secuencia de ADN de attB'. Además, los presentes inventores
sometieron ensayo la disponibilidad de
ARN_{t}^{Arg}-attBB' en las cepas de laboratorio
comunes de L. monocytogenes con un ensayo de PCR utilizando
los cebadores PL102 y PL103. Los presentes inventores descubrieron
que el sitio de unión de ARN_{t}^{Arg} se encontraba disponible
en las cepas 10403S, EGEe y L028, indicando que pPL2 podría ser
fácilmente utilizado en estos contextos para la construcción de
cepas, complementación y estudios genéticos sin curar previamente de
profagos endógenos.
Una secuencia codificante de GFP tal como se
describe en la patente estadounidense nº 5.777.079 se clona en el
plásmido pPL1 y se transfiere al genoma de L. monocytogenes.
La secuencia codificante de GFP se amplifica mediante la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) y el fragmento de PCR se clona en
el sitio de clonación múltiple de pPL1. Se clonan un promotor
adecuado, que contiene elementos transcripcionales apropiados y una
secuencia líder traduccional para expresar la GFP en L.
monocytogenes, en el extremo 5' de la secuencia codificante de
GFP, de manera que inducen la expresión de la proteína GFP. Los
constructos de plásmido pPL1 modificado se electroporan en E.
coli cepa SM10 utilizando técnicas estándar, y el constructo de
plásmido pPL1 modificado se conjuga en L. monocytogenes tal
como se ha descrito anteriormente. Los L. monocytogenes
recombinantes se seleccionan en placas de BHI suplementadas con 7,5
\mug/ml de cloranfenicol y 200 \mug/ml de estreptomicina. Se
recogen colonias individuales y se criban mediante PCR para la
integración en el sitio de unión de fago utilizando los cebadores
PL14 (5'-CTCAT
GAACTAGAAAAATGTGG-3') (SEC ID nº 13), PL60 (5'-TGAAGTAAACCCGCACACGATG-3') (SEC ID nº 14) y PL61 (5'-TGTAACATGGAGGTTCTGGCAATC-3') (SEC ID nº 15). Se cultivaron cultivos de L. monocytogenes recombinante, se prepararon y se cribaron para GFP.
GAACTAGAAAAATGTGG-3') (SEC ID nº 13), PL60 (5'-TGAAGTAAACCCGCACACGATG-3') (SEC ID nº 14) y PL61 (5'-TGTAACATGGAGGTTCTGGCAATC-3') (SEC ID nº 15). Se cultivaron cultivos de L. monocytogenes recombinante, se prepararon y se cribaron para GFP.
La construcción y caracterización de los
primeros vectores de integración específicos de sitio en una etapa
en L. monocytogenes supone un avance en las herramientas
genéticas disponibles para el estudio de este patógeno. Estos
vectores permiten una construcción más fácil de cepas que los
procedimientos históricos y resultan ampliamente útiles en diversas
cepas utilizadas para estudiar el ciclo vital intracelular de L.
monocytogenes. Además, pueden construirse cepas merodiploides
estables, permitiendo estudios refinados de número de copia y
estudios de interacciones dentro de una proteína a través de
multimerización y ensayo de la naturaleza dominante o recesiva de
diferentes alelos de un gen en la misma cepa bacteriana.
pPL1 y pPL2 también resultan útiles para el
desarrollo de vacunas, por ejemplo para por lo menos mejorar,
incluyendo tanto inducir como reforzar, una respuesta inmunológica
contra una o más células diana, por ejemplo un patógeno foráneo,
etc. Se han utilizado varios sistemas de L. monocytogenes
recombinante para inducir respuestas inmunológicas mediadas por
células en ratones (Frankel, F.R., S. Hegde, J. Lieberman y Y.
Paterson, Induction of cell-mediated immune
responses to human immunodeficiency virus type 1 Gag protein by
using Listeria monocytogenes as a live vaccine vector, J.
Immunol. 155(10):4775-4782, 1995; Goossens,
P.L., G. Milon, P. Cossart y M.F. Saron, Attenuated Listeria
monocytogenes as a live vector for induction of CD8+ T cells
in vivo: a study with the nucleoprotein of the lymphocytic
choriomeningitis virus, Int. Immunol.
7(5):797-805, 1995; Ikonomidis, G., Y.
Paterson, F.J. Kos y D.A. Portnoy, Delivery of a viral antigen to
the class I processing and presentation pathway by Listeria
monocytoenes, J. Exp. Med. 180(6):2209-2218,
1994; Shen, H., M.K. Slifka, M. Matloubian, E.R. Jensen, R. Ahmed y
J.F. Miller, Recombinant Listeria monocytogenes as a live
vaccine vehicle for the induction of protective
anti-viral cell-mediated immunity,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(9):3987-3991),
1995). Una limitación de la expresión basada en plásmidos de
proteínas recombinantes en L. monocytogenes es la
estabilidad de los plásmidos in vivo (es decir, en el animal
huésped) sin selección. Además, la construcción cromosómica de
cepas que expresan antígenos foráneos resulta laboriosa. pPL1 y
pPL2 resuelven ambas cuestiones.
Resulta evidente a partir de los resultados y
comentario anteriores que la invención proporciona varias ventajas.
La construcción y caracterización de los primeros vectores de
integración específicos de sitio en una etapa para la utilización
en L. monocytogenes tal como se describe en la presente
invención supone un avance para las herramientas genéticas
disponibles para el estudio de este patógeno. Por ejemplo, los
vectores y procedimientos de la invención permiten una construcción
más fácil de las cepas que los procedimientos históricos y resultan
ampliamente útiles en diversas cepas utilizadas para estudiar el
ciclo vital intracelular de L. monocytogenes. Además, la
invención proporciona importantes nuevas herramientas para la
producción de preparaciones de vacuna. Una limitación de la
expresión basada en plásmidos de proteínas recombinantes en L.
monocytogenes es la estabilidad de los plásmidos in vivo (es
decir, en el animal huésped) sin selección. Además, la construcción
cromosómica de cepas que expresan antígenos foráneos resulta
laboriosa. Los vectores de la invención y los procedimientos de
utilización resuelven ambas cuestiones. Como tal, la presente
invención representa una contribución significativa a la
técnica.
La citación de cualquier publicación es por su
exposición previa a la fecha de presentación y no debe
interpretarse como una admisión de que la presente invención no
presenta derecho de prioridad sobre dicha publicación en virtud de
que es invención de fecha prioritaria.
<110> The Regents of the University of
California
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VECTORES ESPECÍFICOS DE SITIO DE
INTEGRACIÓN EN LISTERIA Y PROCEDIMIENTOS PARA LA UTILIZACIÓN
DE LOS MISMOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BERK-017WO
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<150> 10/136.860
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<151>
2002-04-30
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<160> 28
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<170> FastSEQ para Windows versión 4.0
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<210> 1
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<212> ADN
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcatgcag atctttttt cagaaaatcc cagtacg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtctagatcaagcacatac ctag
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggatcctg aagcttggga agcag
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcatgaact agaaaaatgt gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaagtaaac ccgcacacga tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtaacatgg aggttctggc aatc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacataatcag tccaaagtag atgc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgaatgtaa atattgagcg g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagatctcc aaaaataaac aggtggtgg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgcatgcg tggagggaaa gaagaacgc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagggaaag aagaacgc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatcagacct aacccaaacc ttcc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatcgcaaaa taaaaatctt ctcg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcaaaacat acgctcttat c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vector lanzadera de integración
pPL1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3676
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3897
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago U153
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 695
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2702
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria monocytogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 643
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria monocytogenes
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vector lanzadera de integración
pPL2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
Claims (15)
1. Vector de integración capaz de la
integración en el genoma de Listeria específica de sitio
mediada por integrasa de listeriófago, comprendiendo dicho vector
un sitio de unión a listeriófago, un gen de integrasa de
listeriófago y una secuencia codificante heteróloga.
2. Vector de integración según la
reivindicación 1, en el que dicho vector de integración es un
plásmido.
3. Vector de integración según la reivindicación
1, en el que dicho listeriófago es una integrasa U153 o una
integrasa de PSA.
4. Vector de integración según la reivindicación
1, en el que dicho sitio de unión permite la integración en un
sitio de integración seleccionado de entre el grupo que consiste en:
el sitio de integración comK y el sitio de integración de
ARN_{t}^{Arg}.
5. Vector de integración según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho vector de integración es el
vector pPL1 de 6101 pb tal como se muestra en la figura 1.
6. Vector de integración según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho vector de integración es
pPL2 obtenido mediante la sustitución de la integrasa U153 de pPL1 y
el sitio de unión por la integrasa de PSA y el sitio de unión
attPP'.
7. Procedimiento de transformación de una
Listeria, comprendiendo dicho procedimiento:
poner en contacto dicha Listeria con un
vector de integración según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
6 bajo condiciones suficiente para que dicho vector de integración
se integre en dicho genoma de Listeria.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Listeria transformada con un vector
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Células de Listeria según la
reivindicación 8 para la utilización en un procedimiento de
inducción o refuerzo de una respuesta inmunológica celular frente a
un antígeno en un sujeto.
10. Vacuna que comprende una cepa de células de
Listeria según la reivindicación 8, en la que dichas células
de Listeria expresan un antígeno heterólogo.
11. Cultivo recombinte de células de
Listeria según la reivindicación 8.
12. Kit que comprende:
- un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y
- por lo menos una nucleasa que corta dicho vector en un sitio de clonación
- para la utilización en la inducción o refuerzo de una respuesta inmunológica celular frente a un antígeno en un sujeto.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Kit según la reivindicación 12, en el que
dicho kit comprende además una célula huésped.
14. Vector de integración según la
reivindicación 5, en el que dicho vector de integración permite la
integración en un sitio de integración comK.
15. Vector de integración según la
reivindicación 6, en el que dicho vector de integración permite la
integración en un sitio de integración de ARN_{t}^{Arg}.
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