KR101108249B1

KR101108249B1 - 효모 세포 표면에 디스플레이되는 ＡｐｘＩＩＡ 단백질의 제조방법 및 사료 첨가제로서의 이의 용도

Info

Publication number: KR101108249B1
Application number: KR1020080138479A
Authority: KR
Inventors: 김대혁; 양문식; 장용석; 유한상
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2008-12-31
Filing date: 2008-12-31
Publication date: 2012-01-31
Anticipated expiration: 2028-12-31
Also published as: KR20100079886A

Abstract

본 발명은 효모 세포 표면에 디스플레이되는 ApxIIA 단백질의 제조방법 및 사료 첨가제로서의 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 유래의 ApxIIA 단백질을 발현하도록, 5'에서 3' 방향으로 순서대로 세포벽으로 ApxIIA 단백질을 타겟팅하는 신호 펩티드 서열, ApxIIA 단백질 코딩 서열 및 세포벽 부착서열을 포함하는 재조합 벡터로 효모를 형질전환시키는 단계를 포함하는, ApxIIA 단백질을 세포 표면에 디스플레이(display) 시키는 방법; 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 유래의 ApxIIA 단백질을 발현하는, 상기 재조합 벡터로 효모를 형질전환하는 단계를 포함하는, 효모 세포 표면에 디스플레이되는 ApxIIA 단백질의 제조방법; 및 상기 방법으로 제조된 ApxIIA 단백질을 포함하는 사료 첨가제에 관한 것이다.

ApxIIA, 단백질, 형질전환, 세포 표면, 디스플레이, 사료

Description

효모 세포 표면에 디스플레이되는 ＡｐｘＩＩＡ 단백질의 제조방법 및 사료 첨가제로서의 이의 용도{Method for producing ApxIIA protein which is displayed on yeast cell surface and use thereof as feedstuff additive}

본 발명은 효모 세포 표면에 디스플레이되는 ApxIIA 단백질의 제조방법 및 사료 첨가제로서의 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 ApxIIA 단백질을 디스플레이(display) 시키는 효모는 가축 사료첨가제로서 공급되어 돼지에게 돼지 흉막 페렴에 대한 면역원성 및 방어 면역 능력을 효과적으로 제공될 수 있는 내용에 관한 것이다.

파스퇴렐라세애(Pasteurellaceae) 과의 하나인 돼지 흉막 폐렴균 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae; APP)에 의해 발생하는 돼지 흉막 폐렴은 전염성, 섬유소성, 출혈성 그리고 괴사성의 폐 손상이 발생하는 질병이다. 또한, 급성으로 발생할 경우 돼지에서 이환율과 사망률이 매우 높으며, 출혈성, 괴사성 폐렴과 섬유소성 흉막염이 주특징인 질병이다.

악티노바실러스 속에 속하는 세균은 모두 소위 RTX 독소를 생산한다. 이러한 RTX 독소의 존재는 악티노바이러스 세균의 주요한 병원성 특징이다. RTX 독소는 문 헌(Braun et al., Critical Rev. in Microbiol. (1991) 18(2): 115-158)에 의해 검토된 바 있다. 또한, 그람 음성 균주들의 RTX 독소는 문헌(Welch, R.A., Molecular Microbiology (1991) 5/3: 521-528) 및 문헌(Welch et al., Inf. Agents and Disease (1995) 4: 254-272)에서 검토된 바 있다. 모든 공지된 RTX 독소는 몇가지 세포독성 또는 세포용해 활성을 갖는다. 하지만, 독소와 아실화의 차이에 따라 표적 세포 특이성 및 숙주 특이성이 달라지는 것으로 공지되어져 있다(McWhinney et al., J. Bact. (1992) 174: 291-297; and Hackett et al., J. Biol. Chem. (1995) 270: 20250-20253). 표적 세포의 차이에 따라, RTX 독소에 속하는 다양한 독소들이 알려져 있고, 헤모리신, 세포용해소 또는 세포 독소가 포함된다. 악티노바실러스 속에는 다수의 여러 종이 포함되며 예를 들면, 악티노바실러스 플루로뉴모니애, 에이. 악티노마이세템코미탄스(A. actinomycetemcomitans), 에이. 수스(A. suis), 에이. 로시(A. rossi), 에이. 에쿨리(A. equuli) 및 에이. 리그니에레시(A. lignieresii) 등이 있다. 이중에서 특히, 악티노바실러스 플루로뉴모니애는 돼지, 말, 소 및 인간의 적혈구에 대해서, 토끼와 돼지의 호중구에 대해서, 및 돼지의 폐포 대식세포에 대해 세포독성/세포용해성인 혈청형 의존적 RTX 독소를 생산하는 것으로 공지되어져 있다.

흉막 폐렴균의 병원성은 숙주 환경적 요인, 전염원과 관련된 여러요소의 다양한 특성을 포함하는 다인자에 의하여 발생하는 질병이다. 본 질병의 원인체인 APP는 RTX(Repeats in Toxins) 독소군에 속하는 Apx 독소를 포함한 많은 병원성 인자들을 생성한다. 흉막 폐렴의 병원성에 있어서 Apx 독소의 중요성은 자발적으 로(spontaneous) 또는 화학적으로(chemically) 유도되거나, 트랜스포존(transposon)을 이용한 돌연변이체 (mutants)등을 이용한 여러 가지 방법을 통하여 규명되어졌다(Anderson C et al., Infect. Immun. (1991) 59: 4110-4116). 현재까지, 이들 독소는 ApxI, ApXII, ApxIII 그리고 ApxIV의 네 가지가 밝혀져 있으며, 원인균은 협막 다당체(capsular polysacchride)에 따라서 15가지 혈청형이 밝혀졌으며, 이들 세포 독소의 생성은 혈청형에 따라서 다양하게 분비되며, 이들 혈청형의 분포는 지역에 따라 차이를 보이고 있다. 한국에서 가장 유행하는 혈청형은 2형, 5형 그리고 6형의 순서이다. 비록 흉막 폐렴균의 병원성이 다양하지만, 많은 연구들이 가장 강한 병원성을 나타내는 ApxI과 ApxII의 독소를 생산하는 혈청형과 밀접하게 연관되어 있음을 지적하고 있다. ApxI은 강한 용혈 작용을 나타내는 반면, ApxII는 상대적으로 낮은 용혈 작용을 보이나 두 독소 모두 다른 유형과 다른 종의 세포에 대하여 활발한 세포 독성을 가지고 있다. 이에 반하여, ApxIII는 용혈작용은 없으나 돼지 폐포 대식세포와 호중구를 포함한 세포에 세포독성을 가지고 있다. 그러나, 모든 혈청형에서 분비되는 ApxIV의 병원성과 관련된 역할은 아직까지도 명확하게 밝혀지지 않았다. 또한, 현재까지 Apx 독소들을 모두 분비하는 혈청형은 확인되지 않았으며 ApxII는 혈청형 10형을 제외한 모든 혈청형에서 생산된다.

한편, 대한민국 등록특허 제0465347호에서는 '효모에서 악티노바실러스 플루로뉴모니애의 재조합 ApxIIA 독소 단백질을 제조하는 방법 및 사료 첨가제로서의 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 재조합 ApxIIA 단백질을 효모 세포 표면에 디스플레이시켜 돼지 흉막 페렴에 대한 면역원성 및 방어 면역 능력을 향상시킨 경구백신의 개발방법에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명은 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 유래의 ApxIIA 단백질을 발현하는 재조합 벡터로 효모를 형질전환시키는 단계를 포함하는, ApxIIA 단백질을 세포 표면에 디스플레이(display) 시키는 방법을 이용하여 효모 세포 표면에 디스플레이되는 ApxIIA 단백질 및 이 단백질을 이용한 사료 첨가제를 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 유래의 ApxIIA 단백질을 발현하도록, 5'에서 3' 방향으로 순서대로 세포벽으로 ApxIIA 단백질을 타겟팅하는 신호 펩티드 서열, ApxIIA 단백질 코딩 서열 및 세포벽 부착서열을 포함하는 재조합 벡터로 효모를 형질전환시키는 단계를 포함하는, ApxIIA 단백질을 세포 표면에 디스플레이(display) 시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 유래의 ApxIIA 단백질을 발현하는 상기 재조합 벡터로 효모를 형질전환하는 단계를 포함하는, 효모 세포 표면에 디스플레이되는 ApxIIA 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 ApxIIA 단백질을 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명은 원핵 세균성 단백질인 ApxIIA 단백질을 단단한(rigid) 세포벽 구조를 갖는 세포 표면에 디스플레이(display) 시킨 효모를 제조함으로써, 디스플레이된 단백질의 구조를 유지시킬 수 있고, 고밀도 단백질 디스플레이를 가능하게 함으로써, 세포질 내에서 발현시킨 효모보다 효과적인 경구백신 개발을 가능하게 한다. 본 발명의 ApxIIA을 발현하는 효모는 가축 사료첨가제로서 공급되어 돼지에게 돼지 흉막 페렴에 대한 면역원성 및 방어 면역 능력을 보다 효과적으로 제공할 수 있을 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 유래의 ApxIIA 단백질을 발현하도록, 5'에서 3' 방향으로 순서대로 세포벽으로 ApxIIA 단백질을 타겟팅하는 신호 펩티드 서열, ApxIIA 단백질 코딩 서열 및 세포벽 부착서열을 포함하는 재조합 벡터로 효모를 형질전환시키는 단계를 포함하는, ApxIIA 단백질을 세포 표면에 디스플레이(display) 시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 사용된 바와 같은, 용어 '벡터'는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함하는 것으로 의도되며, 플라스미드, 파아지 또는 코스미드와 같은 레플리콘으로서, 이에 또 다른 DNA 절편이 부착되어 부착된 절편의 복제를 초래한다. 용어 '레플리콘'은 생체내에서 DNA 복제의 자가 단위로서 작용하는 모든 유전적 인자(예를 들면, 플라스미드, 염색체, 바이러스 등)를 의미한다.

본 발명에 사용된 바와 같은, 용어 '발현 벡터'는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 포함하는 DNA 분자를 가리킨다. 전형적으로, 유전자 발현은 프로모터, 조직 특이적 조절 요소 및 인핸서를 포함한 특정 조절 요소의 조절하에 위치하게 된다. 이러한 유전자는 조절 요소에 작동적으로 연결되는 것이다.

본 발명에 사용된 바와 같은, 용어 '형질전환된'이란, 외래 DNA가 세포막 내부로 도입되는 것을 의미한다. 외래 DNA는 염색체 DNA에 통합되어 세포의 게놈을 구성하거나 통합되지 않을 수 있다. 원핵생물 또는 효모에서, 예를 들면, 외래 DNA는 플라스미드 같은 에피좀 인자에서 유지될 수 있다. 진핵 세포에 있어서는, '안정하게 형질전환된' 세포는 외래 DNA가 염색체내에 통합되어 염색체 복제를 통해서 자손 세포로 유전되는 세포이다. 이러한 안정성은 진핵 세포가 외래 DNA를 함유하는 자손 세포의 집단으로 이루어진 세포주 또는 클론을 확립하는 능력에 의해서 입증된다. 상기된 바와 같이, 용어 '클론'은 단일 세포 또는 일반적인 선조세포로부터 유사분열에 의해서 유도된 세포의 집단을 의미한다. 예를 들면, '세포주'는 수많은 세대 동안 시험관내에서 안정하게 성장할 수 있는 1차 세포의 클론이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 신호 펩티드는 세포벽 타겟팅 신호 펩티드이면 이용 가능하고, 바람직하게는 아밀라제 1A 시그널 펩티드(amylase 1A (Ramy1A) signal peptide, ASP)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 세포벽 부착서열은 GPI((glycosylphosphatidylinositol)-엥커를 포함하는 서열이면 이용 가능하고, 바람직하게는 C-말단의 320 아미노산을 코딩하는 α-아글루틴 유전자(AGA1-C320)의 3' 절반을 포함하는 엥커 DNA 절편을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 발현 벡터는 pYEGAXA5이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae )이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 ApxIIA 단백질을 코딩하는 유전자는 총길이의 유전자(full gene)가 가능하나, 바람직하게는 ApxIIA 단백질의 439 -801번째 아미노산 잔기를 코딩하는 유전자로서 서열번호 1인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 유래의 ApxIIA 단백질을 발현하도록, 5'에서 3' 방향으로 순서대로 세포벽으로 ApxIIA 단백질을 타겟팅하는 신호 펩티드 서열, ApxIIA 단백질 코딩 서열 및 세포벽 부착서열을 포함하는 재조합 벡터로 효모를 형질전환하는 단계 를 포함하는, 효모 세포 표면에 디스플레이되는 ApxIIA 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 상기 방법으로 제조된 ApxIIA 단백질을 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 사료 첨가제에서, 상기 ApxIIA 단백질이 이를 발현하는 효모 그 자체, 효모 파쇄물 또는 부분 정제된 형태로 사용됨을 특징으로 한다.

재조합 ApxIIA 단백질을 발현하는 효모를 '사료첨가제'로서 사용한다는 것은 효모제의 일반적인 사료첨가제로서의 용도와 상응하며, 다만 상기 효모는 재조합 ApxIIA 단백질을 생산하여 함유하고 있다는 것을 의미한다. 본 발명에서는, 사료첨가제로서 재조합 ApxIIA 단백질을 함유하는 효모를 돼지에게 급식시키는 것은 재조합 ApxIIA 단백질이 비독성 면역원으로서 작용한다는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 재조합 ApxIIA 독소 단백질은 효모 그 자체, 효모 파쇄물 또는 부분적으로 정제된 형태로 사료첨가제로서 공급될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, '재조합 ApxIIA 단백질'은 효모에서 발현된 전체 ApxIIA 단백질 형태뿐만 아니라, 악티노바실러스 플루로뉴모니애에 대한 면역원성 및 방어 면역 활성을 갖는 한 이의 변이체 및 변형체를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 변이체에는 치환, 결실, 부가 변이체 등이 포함될 수 있지만, 이로 써 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 원핵 세균성 단백질인 ApxIIA 단백질을 단단한(rigid) 세포벽 구조를 갖는 세포 표면에 디스플레이(display) 시킨 효모를 제조하여 돼지에게 급여함으로써, 디스플레이된 단백질의 구조를 유지시킬 수 있고, 고밀도 단백질 디스플레이를 가능하게 하여 돼지 흉막 폐렴에 대한 면역원성을 돼지 체내에서 장시간 보전 가능하게 하고, 이는 세포질 내에서 발현시킨 효모보다 효과적인 경구백신 개발을 가능하게 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

재료 및 방법

시약 및 효소

제조사를 상세히 기재한 것을 제외하고, 본 발명에 사용된 모든 시약, 배지 및 효소는 시그마사(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 디프코 레보라토리스(Difco Laboratories, Detroit, MI), 또는 뵈링거 맨하임(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)에서 구입하였다. 올리고뉴클레오티드는 제노텍 회사(Genotech Inc., Yusung, Korea)에서 구입하였다.

균주 및 배양 조건

플라스미드는 대장균 Top10 또는 DH5a를 이용하여 Sambrook 등(Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)의 방법에 따라 증폭시켜 준비하였다. 한국 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)의 439 - 801번째 아미노산 잔기와 일치하는 중화 에피토프(neutralizing epitope)를 갖는 pApxIIA5 플라스미드를 사용하였고, 사카로마이세스 세레비지애 2805 (MATa pep4::HIS3 prb1-d Can1 GAL2 his3 ura3-52)은 ApxIIA-에피토프의 세포 표면 디스플레이(cell surface display)를 위한 수용자로 사용되었다. 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)는 YEPD 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 덱스트로스)에서 배양하였고, 형질전환체를 선별하기 위해 30℃에서 우라실 결핍 선별 배지(0.67% 아미노산이 결핍된 효모 질소 베이스, 0.003% 아데닌 및 트립토판, 0.5% 카자미노산, 2% 덱스트로스, 2% 아가)를 사용되었다. 1차 접종은 5 ml 우라실-선별배지로부터 준비하였고, 24시간동안 배양하였다. 그 중에서 1 x 10⁷ 세포를 40 ml YEPD 배지를 포함한 300-ml 삼각 플라스크에 접종하였다. 발현을 위한 배양은 30℃에서 계속된 교반(200 rpm)을 주면서 배양하였고, 그 후 세포를 모은 뒤 발현된 ApxIIA-에피토프의 세포 표면 디스플레이를 조사하였다.

벡터 구축과 효모의 형질전환

아밀라제 1A (Ramy1A) 시그널 펩티드(ASP) 및 상기 기재한 중화 에피토프를 위한 439 - 801번째 아미노산 잔기(유전자 은행 등록번호 AF363362)를 코딩하는 ApxIIA-에피토프 유전자는 다음과 같은 프라이머를 이용하여 5' 및 3'에 BamHI 및 EcoRI 제한 효소 자리를 만들기 위해 오버랩 연장 PCR(overlap extension PCR) 방법으로 연결시켰다: 정방향 프라이머(서열번호 2) 5' -GGATCCGCATGCAGGTGC-3' 및 역방향 프라이머(서열번호 3) 5-'GGGAATTCTGTAATAGAATCATTTCC-3' 및 오버랩 정방향 프라이머(서열번호 4) 5'-TCTAACTTGACAGCCGGGCAAGGTTATGATTCTCGT-3' 및 오버랩 역방향 프라이머(서열번호 5) 5' -ACGAGAATCATAACCTTGCCCGGCTGTCAAGTTAGA-3'. 증폭된 유전자는 pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI)에 클로닝 하였고, 제한 효소 절단으로 분석하였으며 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 효모 세포 표면에 ApxIIA-에피토프 엥커링을 위해, C-말단의 320 아미노산을 코딩하는 α-아글루틴 유전자(AGA1-C320)의 3' 절반을 포함하는 엥커 DNA 절편은 정방향 프라이머(서열번호 6) 5'-GGGAATTCGCCAAAAGCTCTTTTATC-3' 및 역방향 프라이머(서열번호 7) 5'-GGTCGACTTAGAATAGCAGGTAGGACA-3'을 이용한 PCR 증폭으로 수행하였다. AGA1-C320의 증폭된 PCR 절편은 pBluescript IISK (Stratagene, La Jolla, CA)의 EcoRI/SalI 자리에 클로닝한 후 제한 효소 절단으로 분석하였고, DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 세포 표면 디스플레이용 효모 벡터의 구축을 위해, ASP::ApxIIA-에피토프 융합 절편 및 AGA1-C320의 엥커링 파트너는 클로닝 벡터로부터 BamHI/EcoRI 및 EcoRI/SalI으로 각각 절단하였고, pYEGPD 벡터의 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GPD) 프로모터 및 갈락토스-1-P 유리딜 트란스퍼라제(galactose-1-P uridyl transferase, GAL7) 터미네이터 사이에 있는 BamHI/SalI 자리에 연결시켰다. 재조합 효모 벡터의 방향은 제한 효소 절단 및 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 결과적으로 만들어진 플라스미드는 pYEGAXA5으로 명명하였다(도 1). 구축된 재조합 벡터 pYEGAXA5은 리튬 아세테이트(lithium acetate)를 이용한 방법으로 사카로마이세스 세레비지애 2805에 도입시켰다. 효모에 도입된 플라스미드의 안정성은 김 등(Appl. Environ. Microbiol. 69 (2003) 1999-2005)의 방법으로 ura^-선별 및 비선별 플레이트에서 CFUs(colony-forming units)을 세어 측정하였다.

노던 블럿 분석

총 RNA는 김 등(Appl. Environ. Microbiol. 69 (2003) 1999-2005)의 방법으로 추출하였다. RNA 양은 UV-분광광도계로 측정하였고, 총 RNA(레인당 30 mg)는 1.2% 포름알데히드-아가로스 겔에서 분리하였다. 블럿팅 수행 전에, 겔은 RNA가 같은 양으로 로딩되었는지 확인하기 위해 에티디움 브로마이드로 염색하여 확인하였다. RNA는 제조사(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)의 지시대로 Hybond 막에 옮겼다. 혼성화는 Church buffer (7% SDS, 1% BSA, 1 mM EDTA, 250 mM NaPO₄, pH 7.2)로 65℃에서 수행하였다. 프로브는 random labeling kit (Amersham Pharmacia Biotech)으로 α-[³²P]-dCTP로 라벨링하였다.

면역염색 및 현미경

세포의 면역형광 라벨링은 박 등(Biotechnol. Bioprecess Eng. 12 (2007) 690-695)의 방법으로 수행하였다. 48h 배양한 효모 세포는 3,000 x g로 5분 동안 상온에서 원심분리를 한 후 PBS/BSA 용액으로 두번 세정하였다. 세포는 같은 용액 으로 현탁하고 100 ml 세포 현탁액(10⁷ cells/ml)을 글라스 슬라이드 위에 놓고 면역 염색 및 관찰을 위해 건조(air-dried)시켰다. 박 등(Biotechnol. Bioprecess Eng. 12 (2007) 690-695)의 방법으로 항-ApxIIA-에피토프 쥐 폴리클로날 항체(Anti-ApxIIA-epitope mouse polyclonal antibody)를 1:50으로 희석하여 1차 항체로 사용하였다. 세포 및 1차 항체는 상온에서 2시간동안 반응시켰다. 세포를 세정한 후, 2차 항체인 FITC(fluorescein isothiocyanate)-콘쥬케이트 염소 항-마우스 IgG (1:50; Sigma Chemical Co.)은 세포와 상온에서 2시간동안 반응시켰다. 세정 후, 세포는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.

웨스턴 블럿 분석

세포벽 분획의 준비는 Pitarch 등(Methods Mol. Biol. 425 (2008) 217-39)이 기술한 방법을 약간 변형시켜 수행하였다. 간단하게, 세포는 3일동안 배양 후 획득하여 용균 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드)로 두 번 세정하였고, 비드 비터(Biospec Products Inc., Bartlesville, OK)로 1분 동안 세 번 균일화하였고, 그 사이에 얼음 용균 버퍼로 3분씩 쿨링하였다. 세포가 깨졌는지 균질 현탁액을 현미경으로 관찰하였고, 원심분리하였다(10,000 x g, 10분). 결과적으로 얻어진 상층액은 CFE(cell-free extract)를 얻기 위해 셀룰로스 필터(직경 0.4 μm)로 여과시켰다. 원심분리 후 침전된 CWF는 얼음 물로 3회 세정하였고, 차가운 용액(5% NaCl, 2% NaCl, 1% NaCl 및 물)으로 3회 이상 헹구었다. 분리 한 세포는 추출버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% SDS, 10 mM DTT, 0.1 M EDTA)로 10분동안 끓인 후 추출하였다. 분리된 세포 벽 단백질(CWPs)의 농도는 Bradford assay (Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 결정하였고 SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리시킨 후 니트로셀룰로스 필터로 블럿팅하였다.

재조합 ApxIIA-에피토프 단백질의 ELISA 정량

CWPs에서 발현된 ApxIIA-에피토프의 정량은 Pitarch 등(Methods Mol. Biol. 425 (2008) 217-39)이 기술한 방법대로 정량적 ELISA으로 결정하였다. 간단하게, 10배 희석한 CWPs은 96-웰 미세역가 플레이트를 중탄산염 버퍼(15 mM Na₂CO₃ and 35 mM NaHCO₃)로 웰마다 100ml의 농도로 코팅하였고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 웰은 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS 버퍼(PBST)로 3회 세정하였고, 1% BSA을 포함하는 PBS 첨가 후, 25℃에서 5시간 블로킹시켰고, 다시 PBST로 3번 세정하였다. 플레이트는 1:5,000의 항-ApxIIA 항혈청으로 반응시켰고, 0.5% BSA을 포함하는 0.01 M PBS으로 25℃에서 2시간동안 반응시킨 후 PBST로 3회 세정하였다. 0.1% BSA를 포함하는 0.01 M PBS에서 horseradish peroxidise (Promega)으로 컨쥬케이트된 항-마우스 IgG을 1:5,000로 희석하여 반응시킨 후 PBST 버퍼로 3회 세정하였다. 플레이트는 퍼록시다제 반응을 관찰하기 위해 100 ml TMB 기질 키트를 첨가하여 상온에서 암조건으로 30분동안 반응시켰다. ELISA 리더 (MRA-006; Packard Instruments, Meriden, CT)에서 405 nm로 플레이트를 읽었고, 정제된 박테리아 ApxIIA-에피토프 의 알려진 정량의 비교를 통해 정량하였다. 박 등(Biotechnol. Bioprecess Eng. 12 (2007) 690-695)의 방법으로 정제된 박테리아 ApxIIA-에피토프는 8-30 ng 농도 범위로 연속 희석하였다.

<실시예 1. 세포 표면 발현 플라스미드를 이용한 사카로마이세스 세레비지애의 형질전환>

ApxIIA-에피토프의 세포 표면 발현을 위해, 플라스미드 pYEGAXA5은 상기 재료 및 방법에 기재한 바와 같이 제조하였다(도 1). 이 플라스미드는 ApxIIA-에피토프::AGA1-C320 융합 유전자의 발현을 위한 다중-카피 에피조멀 플라스미드(multi-copy episomal plasmid)로써 GPD 프로모터 조절하에 아밀라제 1A(Ramy1A)의 분비 신호 서열을 포함하고 있다. 플라스미드 pYEGAXA5로 사카로마이세스 세레비지애를 형질전환시킨 후, 20개 이상의 형질전환체를 ura^- 배지에서 임의로 선별하였고, pYEGAXA5 플라스미드를 추출하여 다시 대장균에 도입시킨 뒤 이 플라스미드를 추출하여 확인하였다. 선별된 형질전환체의 플라스미드 안정성은 양호하였고, 도말한 세포의 83% 이상은 비선별 액체 배지에서 72시간 배양 이후에도 플라스미드를 내포하였다. 게다가, 선별된 형질전환체에서 성장 결핍 또는 성장 특이성은 관찰되지 않았고, 이러한 점은 표적 유전자 산물의 발현 및 재조합 단백질의 세포 표면 엥커링은 세포 물질대사 및 구조에 해로운 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다. 형질전환체의 노던 블럿 분석은 ApxIIA-에피토프::AGA1-C320 융합 유전자 전사체의 존 재를 확인시켰고, 반면에 혼성화 밴드는 수용자(recipient strain)에서는 관찰되지 않았다. 고발현 수준을 보이는 TYEGAXA5-1 형질전환체는 재조합 ApxIIA-에피토프의 세포 표면 디스플레이를 확인하기 위해 선별 후 이용하였다(데이터 미제시).

<실시예 2. ApxIIA-에피토프의 세포 표면 디스플레이의 현미경 관찰>

YEPD 배지에서 대수기(exponential growth phase) 세포를 이용하여 세포 표면에서 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 FITC으로부터 유도된 형광을 관찰하였다(도 2). 형광은 형질전환 세포에서 관찰되었지만 같은 조건에서 자란 대조구 세포에서는 관찰되지 않았다. 수용자는 라벨되지 않았기 때문에, 이것은 쥐 및 염소 항체는 이와 같은 라벨링 조건하에서 효모 세포의 내부를 접근할 수 없다는 것을 의미하고, 이것은 효모 에피토프와 교차 반응(cross-react)을 하지 않는다는 것을 의미한다. 세포 벽 주변(세포 안쪽이 아닌)에 고리 모양으로 관찰되는 특이한 형광은 ApxIIA-에피토프가 항-ApxIIA-에피토프 항체를 이용하여 세포 외층에서 검출될 수 있다는 것을 암시한다. 따라서, ApxIIA-에피토프는 사카로마이세스 세리비지아 세포의 표면에서 엥커된 것을 확인할 수 있었다. 60℃에서 1시간 배양하여 가열 사멸 시킨 후의 면역 형광 현미경 결과는 세포가 아직 온전하고, 세포 표면 디스플레이된 ApxIIA-에피토프는 영향을 받지 않는다는 것을 나타내었다(데이터 미제시). 그러나, FITC-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG를 이용한 세포의 면역형광 라벨링은 세포에서 세포로 다양하게 ApxIIA-에피토프/α-아글루틴 융합 유전자가 발현되는 세포의 밀도를 나타내고, 이것은 각각의 세포 사이에서 발현 정도의 차이를 알 수 있게 한다. 에피조멀 2m ori-based plasmids를 사용하였을 때, 사카로마이세스에서 이종 유전자 발현(heterologous gene expression)의 다양한 범주는 특이하지 않다. 이것은 아마도 플라스미드 안정성은 개별 세포 사이에서 플라스미드 카피 수의 다양성에 기인되는 것으로 예측된다.

<실시예 3. 세포 표면 디스플레이된 ApxIIA-에피토프의 웨스턴 블럿 분석>

부영양배지(YEPD)에서 대수기 세포를 원심분리하여 분리하였고, CWF의 분리 후 CWPs을 추출하였다. ApxIIA-에피토프에 대한 항혈청을 사용한 웨스턴 분석은 pYEGAXA5을 갖는 CWPs이 대략 73 kDa 예상 크기를 갖는 융합 단백질과 일치하는 것으로 보였다. 그러나 형질전환 세포의 세포가 없는 추출물(cell-free extract)에서는 발견되지 않거나 대조구 세포의 세포 분획에서는 관찰되지 않았다(도 3). 그러나 가용성 세포질 분획이 아닌 CWPs의 항원-항체 반응은 ApxIIA-에피토프의 엥커된 발현을 확인시켰고, 이것은 현미경으로부터 얻은 결과와 동일하였다. 같은 발현 카세트를 사용하여 효모 세포 표면에 디스플레이된 다른 단백질의 경우와 비교한 결과(Mo et al., Biotechnol. Bioprocess Eng. 10 (2005) 576-581), 웨스턴 블럿 분석은 CWP 추출을 위해 더 적은 효모세포가 요구되었는데 이것은 양호한 면역 반응을 위해 ApxIIA-에피토프의 발현 정도가 충분히 높다는 것을 예측할 수 있게 한다.

<실시예 4. 재조합 ApxIIA-에피토프 단백질의 ELISA 정량>

정량적 ELISA는 재조합 ApxIIA-에피토프 단백질의 양을 측정하기 위해 수행 되었다. 효모-유도성 재조합 ApxIIA-에피토프의 정량은 효모 CWP의 알려진 양으로부터 방출하는 것과 박테리아 ApxIIA-에피토프 단백질-항체 복합체의 알려진 정량으로부터 상대적 빛의 단위(relative light units, RLUs)와 비교하여 측정하였다. 재조합 단백질 발현 수준은 CWP의 희석에 대해 플로팅(plotting) 되었을 때, ApxIIA-에피토프 단백질 발현 수준의 상관적인 증가는 총 단백질의 최적 농도 범주에서 관찰되었다(30-250 mg). 그러나, 이러한 범주에서 CWPs의 농도가 일탈되었을 때, 검출된 ApxIIA-에피토프 단백질의 양은 총 단백질의 농도 증가와 일치하지 않았고, 이것은 미세역가 플레이트(microtiter plates) 위의 CWPs의 혼합물에서 ApxIIA-에피토프 단백질의 결합 특이성 때문일 수 있다. 게다가, 박 등(Biotechnol. Bioprecess Eng. 12 (2007) 690-695)의 결과와 비교하여 ELISA의 최적 농도 범주는 매우 좁았다. 이것은 융합 구축물에서 AGA1 단백질의 C-말단 영역의 존재 때문에 항원-항체 반응의 입체적 가림 때문인 것으로 추측할 수도 있다. 정량적 ELISA은 세포표면 디스플레이된 ApxIIA-에피토프가 16% CWPs로 구성되거나 배양 세포 리터당 35 mg로 계산될 것으로 보여진다. 가열 사멸 과정 후에 단백질의 급격한 하락은 관찰되지 않았고, 이것은 세포 표면 디스플레이된 ApxIIA-에피토프는 세포벽 구조물은 잘 유지되었고 세포벽 구조에 영향을 끼치지 않는 것을 다시 확인할 수 있게 한다.

도 1의 (A)는 효모 발현 벡터 pYEGPD의 모식도이고, (B)는 pYEGPD 플라스미드에서 클로닝된 융합 벡터 pYEGAXA5의 모식도를 나타내고, GPD 프로모터::Rice Amy1A 신호서열::ApxIIA-에피토프::AGA1의 연결 부위의 서열을 보여준다.

도 2는 재조합 효모 세포의 면역 형광 마이크로그래프를 나타낸다. 왼쪽은 형광 현미경 이미지, 오른쪽은 광 현미경 이미지를 각각 나타낸다. (A)는 형광 현미경 관찰결과 세포 표면 주위가 고리모양으로 FITC 형광을 나타내고, (B)는 대조구 세포로 형광이 관찰되지 않았다.

도 3은 ApxIIA-에피토프 융합 벡터의 웨스턴 블럿 분석을 나타낸다. (A)는 가용성의 세포가 없는 추출물(CFE) 및 세포 벽 분획(CWF)의 쿠마시 염색한 SDS-PAGE이다. (B)는 동일한 겔의 항원-항체 반응을 나타낸 결과이다 (레인 2 : 0.1 mg 대장균 발현 ApxIIA-에피토프. 레인 3 및 4 : 30 ㎍ 수용자 및 형질전환체 각각의 가용성 세포질 단백질, 레인 5 및 6 : 30 ㎍ 수용자 및 형질전환체 각각의 CWF, 레인 1 :단백질 크기 마커, 왼쪽 숫자는 분자 크기(kDa), 별표는 ApxIIA-에피토프 융합 단백질을 나타낸다).

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for producing ApxIIA protein which is displayed on yeast cell surface and use thereof as feedstuff additive <130> PN08253 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1089 <212> DNA <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <400> 1 caaggttatg attctcgtca tttagctgat ttacaagaca atatgaagtt tcttatcaat 60 ttaaataaag aacttcaggc tgaacgcgta gtagctatta cccaacaaag atgggataac 120 caaattggag acctagcggc aattagccgt agaacggata aaatttccag tggaaaagct 180 tatgtggatg cttttgagga ggggcaacac cagtcctacg attcatccgt acagctagat 240 aacaaaaacg gtattattaa tattagtaat acaaatagaa agacacaaag tgttttattc 300 agaactccat tactaactcc aggtgaagag aatcgggaac gtattcagga aggtaaaaat 360 tcttatatta caaaattaca tatacaaaga gttgacagtt ggactgtaac agatggtgat 420 gctagctcaa gcgtagattt cactaatgta gtacaacgaa tcgctgtgaa atttgatgat 480 gcaggtaaca ttatcgaatc taaagatact aaaattatcg caaatttagg tgctggtaac 540 gataatgtat ttgttgggtc aagtactacc gttattgatg gcggggacgg acatgatcga 600 gttcactaca gtagaggaga atatggcgca ttagttattg atgctacagc cgagacagaa 660 aaaggctcat attcagtaaa acgctatgtc ggagacagta aagcattaca tgaaacaatt 720 gccacccacc aaacaaatgt tggtaatcgt gaagaaaaaa ttgaatatcg tcgtgaagat 780 gatcgttttc atactggtta tactgtgacg gactcactca aatcagttga agagatcatt 840 ggttcacaat ttaatgatat tttcaaagga agccaatttg atgatgtgtt ccatggtggt 900 aatggtgtag acactattga tggtaacgat ggtgacgatc atttatttgg tggcgcaggc 960 gatgatgtta tcgatggagg aaacggtaac aatttccttg ttggaggaac cggtaatgat 1020 attatctcgg gaggtaaaga taatgatatt tatgtccata aaacaggcga tggaaatgat 1080 tctattaca 1089 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggatccgcat gcaggtgc 18 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gggaattctg taatagaatc atttcc 26 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tctaacttga cagccgggca aggttatgat tctcgt 36 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 acgagaatca taaccttgcc cggctgtcaa gttaga 36 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gggaattcgc caaaagctct tttatc 26 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggtcgactta gaatagcagg taggaca 27

Claims

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악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 유래의 ApxIIA 단백질을 발현하도록, 5'에서 3' 방향으로 순서대로 세포벽으로 ApxIIA 단백질을 타겟팅하는 아밀라제 1A 시그널 펩티드(amylase 1A (Ramy1A) signal peptide, ASP) 서열, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 ApxIIA 단백질 코딩 서열 및 C-말단의 320 아미노산을 코딩하는 α-아글루티닌 유전자(AGA1-C320)의 3' 절반을 포함하는 엥커 DNA 절편을 포함하는 재조합 벡터로 효모를 형질전환시키는 단계를 포함하는, ApxIIA 단백질이 세포 표면에 디스플레이되는 효모의 제조방법으로 제조된 ApxIIA 단백질이 세포 표면에 디스플레이되는 효모를 포함하는 사료 첨가제.
제9항에 있어서, 상기 ApxIIA 단백질이 이를 발현하는 효모 그 자체, 효모 파쇄물 또는 부분 정제된 형태로 사용됨을 특징으로 하는 사료 첨가제.