TW546147B

TW546147B - Live attenuated RTX-procucing bacteria of the family pasteurellaceae

Info

Publication number: TW546147B
Application number: TW086118161A
Authority: TW
Inventors: Ruud Philip Antoon Mari Segers; Den Bosch Johannes Francis Van; Joachim Frey
Original assignee: Akzo Nobel Nv
Priority date: 1996-05-31
Filing date: 1997-12-03
Publication date: 2003-08-11
Also published as: HU9700975D0; KR970074928A; NZ314987A; ZA974809B; CA2206575A1; HUP9700975A3; AU2464397A; US6770275B1; HU226219B1; HUP9700975A2; MX9704061A; JPH1075774A; CN1117862C; AU720156B2; CN1173540A

Description

546147 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ----- B7 ----- -_五、發明説明（1 ) 本發明關於巴氏德菌科中製造R T X的減毒活菌，此種細菌的製造方法’含有此細菌的疫苗，製造此疫苗的方法和保δ蒦人類和動物抵抗由巴氏德菌中製造毒性R τ X的細菌所造成感染的方法。巴氏德菌科包括嗜血菌（ Haemophilus )屬’放線桿菌（Actin〇bacillus )屬和巴氏德菌科（Pasteurella )屬。此科的細菌時常被稱爲η a p群細菌。這些緊密相關屬中的許多種細菌，已知可表現同源錦依賴，孔形成細胞毒素，即所謂r T X毒素（R T X再次代表毒素）。此科的R T X毒素製造細菌，會造成包括人和動物的廣範圍感染疾病。其他與H A P群無關的細菌屬，如埃斯氏菌（ Eschenchia )和博德特氏菌（Bordetella )，也會製造 RTX毒素。這些RTX毒素在某些方面與HAP群的 R T X毒素相似。 RTX毒素已Braun等人廣泛地檢閱（Critical Rev. in Mkwbiol· 1 8(2):1 1 5 - 1 58( 1 99 1 ))。格蘭氏陰性菌也已被許多人檢閱（Welch，R.A·，Molecular Microbiology 513:521-5 28 ( 1 99 1 )和 Welch et al.，Inf. Agents and Disease 4:254-272(1995))。 R T X毒素是巴氏德菌中製造R τ X的細菌對人類和動物具有病原性的最主要原因。所有R Τ X毒素表現一些種類的細胞毒性或細胞溶解活性。然而，標的細胞和宿主專一性的不同，主要決定於毒素和酿化作用的差異（Me Whinney et al.; ]. Bact. 174: 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'乂297公犮） (請先閱讀背面之注意· 丨- 事項再填寫裝— ¾本頁) 訂 -4- 546147 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 _ B7五、發明説明（2 ) 291-297(1992)和 Hackett et al·; J. Biol. Chem. 270:20250-2025 3 ( 1 995 ))。由於標的細胞的差異，因此已知各種不同種類的R T X毒素，如溶血素，溶細胞素或細胞毒素。雖然許多H A P群的R T X製造細菌爲人所知，而其中一些細菌以它們造成的經濟損害而聲名狼藉。胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropnecmoniae )所製造的R T X毒素對於豬，馬，牛和人的紅血球，對免子和豬的嗜中性白血球和對豬的肺泡巨噬細胞具細胞毒性 / 溶細胞性（尺〇5611(1&161&1;八11.】.¥611^5.49:1 053-1 05 8( 1 988), Maudsley J.R. and Kadis S; Can. J. Microbiol. 32:801-805(1986), Frey. J and Nicolet. J; Inf. & Imm. 56 :2570-2575( 1 988), Bendixon et al; Inf. & Imm. 3 3:673-676( 1981)，Kamp. E.M. and van Leengoed，L. A.M.G.; J. Chin. Microbiol. 27:1187-1191(1989))。放線桿菌在豬隻中的感染會造成豬肉工業嚴重的經濟損失，其係由於它會造成年幼豬隻的急性死亡，並且使年長動物的體重降低。巴斯德氏菌溶血性R T X毒素活性主要會抵抗反芻動物的嗜中性白血球和單核球/巨隨細胞（S h e w e n a n d W i 1 i e ;Inf. & Immun. 35, 91-94(1982), Baluyut et al.; Am. J. Vet. Res. 4 2:1 920- 1 926(1 98 1 ), Himmel et al.; Am. J. Vet. Res. 43:764-767(1982))。巴斯德氏菌感染會造成反芻動物非常嚴重問題，特別是牛和羊。請先閱, 讀背 ιδ 之注意事項寫本頁本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -5- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 546147 A7 B7 五、發明説明（3 ) 在羊和牛身上可見到乳腺炎和肺炎，尤其是船運熱會造成牛隻的額外問題。由於巴氏德菌科感染造成的經濟損失是非常高。其他非HA P群細菌，已知也會製造RTX 毒素。大腸桿菌溶血素對於許多不同種的動物的許多種類細胞都具有毒性。它與許多種動物的紅血球接觸後，幾分鐘之內就會將其溶解（Cavalieri，S.J· and Snyder，I.S·; Inf. & Imm. 3 7:966-974( 1 982), Gadeberg et al; Inf & Imm. 41: 3 5 8-364( 1 983), Keane et al; Am. J. Pathol. 1 26:305-357( 1 987)，Bhadki et al; J. Exp. Med. 1 69-737-752( 1 989))。百日咳球桿菌（Bordetella pertussis)溶血素也在大範圍宿主細胞發揮作用（Shattuck，R.L. and Storm，D.R.; Biochemistry 24:6323-6328( 1 985), Hewlett et al, In Protein

Bacterial Toxin, Rappuoli, R. et al. (Eds), Stuttgart, Fisher-Verlag 249-25 7(1 990))。參與格蘭氏陰性菌R T X毒素合成，活化和運輸的操縱子的基因組織，目前已被Coote，J.G所回顧（FEMS Microbiology reviews 88:1 37- 1 62( 1 992))。一般來說，R T X操縱子含有四種基因：確實的毒素基因（A)，活化者基因（C )，和二種可編碼參與毒素分泌至周圍媒介物的蛋白質的基因（B和D )，（和在百日咳球桿菌的E )) 。毒素基因（A )的初級轉譯產物是一種無毒性的蛋白質〇活化者基因（C )的角色是最重要的，由此基因所編本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X；297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 訂 -6- 546147 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（4 ) 碼出的基因產物可藉者將R T X毒素經轉譯後修飾作用而活化R T X毒素的毒性。活化作用會造成毒素構造的修飾作用。如在百日咳球桿菌’ R T X毒素的轉譯後修飾作用是離胺酸殘基的醯胺連接棕櫚醯化所形成（Hackett et al.; Science 266:433-435 (1994)。大腸桿菌H勺R T X毒素可在試管中被活化，它是從醯基攜帶者蛋白質轉移一脂肪醯基至前溶血素而活化（ Issartel et al.; Nature 351:759-761(1991))。目前已知，R T X毒素對於屬於巴氏德菌科的細菌來說是重要的毒力因子（參見如·· Coote，J.G.; FEMS Microbiology reviews 88:137-162(1992))。此特性已被許多人證實，如以胸膜肺炎放線桿菌爲例，請參考Tascon等人 (Mol. Microbiol. 14:207-216(1994))和 Jansen et al. (inf. & Imm. 63:27-37( 1 995))所著。毒力因子已知是疫苗中重要的標的。因此，許多硏究者已嘗試使用R T X毒素做爲次單元疫苗。在生物體中，HAP群所合成的RTX毒素，在本質上是存在於R T X活化者蛋白質也存在的情況。因此， R T X毒素總是經過轉譯後的修飾作用而成爲極高毒性的蛋白質。由於它們具有高毒性’因此很明顯地’在使用它們做爲疫苗成份之前，R T X毒素必須經過去_毒性〆乍用。次單元疫苗的理論是’從胸膜肺炎放線桿菌所合成的讀先閲讀背 5 意

本頁本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 546147 A7 B7 五、發明説明（5 ) R τ X毒素已喪失它們的毒性。此原理先前已被描述’如於歐洲專利E P N 〇 · 〇 · 3 5 4 · 6 2 8，它是刊載根據胸膜肺炎放線桿菌的溶血素和細胞素素的次單元疫苗 ;在歐洲專利EP No · 〇 . 453 · 024它是刊載根據溶血素，細胞毒素和外層膜蛋白質的胸膜肺炎放線桿菌次單元疫苗。來自溶血巴氏德菌科（Pasteurella haemolytica) R Τ X毒素的次單之疫苗也已被刊載，如於11.3.?31.1^〇· 5,055,400，Canadian Pat. Appl. CA 2,014,033 和 Canadian Pat. Appl. CA 2,081，950。做爲疫苗中次單元之用的RTX毒素，非常容易從野生型菌珠的細菌培養物的上淸液得到。另外一個得到 RTX毒素以做爲次單元之用的方法已被提出，並刊載於 Canadian Patent Application CA 2,045,950，它是描述可編碼胸膜肺炎放線桿菌R T X毒素的基因在異質細菌株大腸桿菌中的異質表現。然而目前並沒有任何疫苗實驗顯示是利用此方法來獲得R Τ X毒素。經濟部中央標準局員工消費合作社印製一個可匹配製造次單元疫苗的方法已在歐洲專利E P 〇· 500 . 736中被提出。在此專利中，RTX毒素基因（A )和活化者基因（C )的序列被刊載。同時也發表毒素基因A在含有或不含有活化者基因C之下的異質表現系統。然而並未描述具有毒素次單元的接種實驗。然而，所有RTX毒素次單元疫苗有三毎重要的缺點本紙張尺度適用中國國家標準丨匚^^丨六料見格丨210/29'^^) -8 - 546147 A7 B7 五、發明説明（6 ) •爲了引發適當的免疫系統而需要高含量的抗原性材料。 •通常只有B細胞免疫作用被引發。 •一個活的病原性細菌有許多重要的免疫性分子，如外層膜蛋白質和莢膜多醣類，對於保護作用而言都很重要〇因此，爲了製造一有效率的次單元疫苗，我們必需儘可能額外包含許多其他重要的免疫性抗原。以上所提及的第一和二點是明顯的問題，而特別是第三點使其非常困難去製造一個有效率的次單元疫苗。以上述所提及的歐洲專利E P N 〇 . 〇· 4 5 3 · 0 2 4所發表的胸膜肺炎放線桿菌次單元疫苗爲例說明：在該專利中，它在一個疫苗中結合四種不同的次單元（三個R T X毒素和一個外層膜蛋白質）。很明顯地，爲了克服抵抗巴氏德菌科感染的次單元疫苗的缺點，一種活的減毒疫苗極受大家的期待。一種活的減毒疫苗有下列優點：經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •它可投予低的劑量（它可自我複製）。 •它十分模仿天然的/野生型感染。 •它同時提供所有可能的免疫重要抗原。然而，雖然它們明顯的優點，但以可製造較低活性 R Τ X毒素的H A P群的細菌爲主的活的疫苗在本發明之前卻無法獲得。缺乏活的減毒疫苗的理由，可由以下似是而非的議論淸楚說明：本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -9- 546147 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（7 ) •活的減毒疫苗菌株的第一個特徵是它無法產生有活性的R T X毒素，因爲如上述提及地，R T X毒素會使 H A P群菌株具有如此的毒力。 •活的減毒細菌經過減毒程序而無法表現R T X毒素，然而本質上缺乏最重要毒力因子，即RTX毒素，因此將無法引發一免疫反應以抵抗此毒素。因此，假如RTX基因從HAP群菌株中缺失，然後使用此減毒菌株做爲疫苗的基礎以抵抗因H A P群的毒性野生型菌珠所造成的疾病，只能達到部分保護作用；而無法得到保護性免疫作用以抵抗這些野生型菌珠的最重要毒力因子，即RTX毒素。因此，以含有R T X缺失毒素的細菌爲基礎的疫苗，無法如預期地提供保護作用以抵抗經野生型菌珠感染而產生的R T X毒素的損害效應。 Reimer 等人（Microbial Pathog. 1 8:1 97-209( 1 995))曾製造缺乏a p X I操縱子的菌株，他們將扮演胸膜肺炎放線桿菌A p X I毒素合成和運輸的所有基因都刪除。此種菌株如預期地是無毒力，因爲它們不再排泄最重要的毒力因子RTX毒素；但因此無抗體，更不用說保護性抗體將被誘發以抵抗r T X毒素。本申請案爲第一個提供巴氏德菌科中製造R T X之減毒活菌，此菌株可產生r T X毒素，但是無活性的型式。這些細菌有一明顯的特徵是一方面它們是減毒的，另一方面它們仍可製造RTX毒素。本紙張尺度適用巾關家縣（CNS Μ規格（2丨Qx 297公餐） -10- 546147 A7 __一_一_ B7 五、發明説明（8 ) " 我們利用修飾細菌而達成此一效果，它們無法製造一功能性的R T X活化者蛋白質。然而r τ X — A毒素的表現並不受損。如本發明的減毒活菌的優點將超過次單元疫苗以及 R Τ X毒素基因被缺的活的菌株，因爲： •它們會製造R Τ X毒素，因此抵抗此毒素的保護性抗體被誘發。 •然而它們在毒力上是減毒因爲它們製造無毒性型式的R Τ X毒素。 •此外它們擁有所有其他抗原，爲次於R Τ X毒素之外，但必需存在以獲得一有效率的免疫反應。非活化型式的R Τ X — A毒素被認爲是無毒性，即不具有與活化型毒素一樣相同的毒性。如上述，此種毒素是利用將細菌修飾而達成，依此方法所製造的細菌無法生產一功能性R Τ X活化者蛋白質。然而R Τ X — A毒素的表現並不受損。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一個功能性R Τ X活化者蛋白質被視爲是一種與在野生型菌珠所表現的R Τ X活化者蛋白質所有特徵相同的蛋白質，並且表現程度與野生型內一樣。因此，無功能性的R Τ X活化者蛋白質則被認爲是一種缺乏一些或所有如野生型細菌中表現的R Τ X活化者蛋白質特徵，和/或表現程度無法達到像野生型活化R T x 毒素相同程度的蛋白質。此處必需強調：假如非功能性R Τ X活化者蛋白質缺本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公釐） -11 - 546147 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（9 ) 乏如野生型菌珠內表現的R T X活化者蛋白質的所有特徵，則此細菌將無法製造有活性的R τ X毒素。然而，假如非功能性R τ X活化者蛋白質只缺少如野生型菌珠內表現的R T X活化者蛋白質的一些特徵，此細菌可產生一部分具活性，另一部分不具活性的R Τ X毒素。如這個例子，假如由於突變的活化者蛋白質被表現，但活化者蛋白質的活化效率降低。活化作用速度是指活化者蛋白質活化 RTX毒素的速度，即將不活化型的RTX毒素轉換成活化型。不用說，可製造部分無活性的R Τ X毒素和部分具活性旳R Τ X毒素的細菌也包括在本發明。無法獲得如野生型程度的活化型R Τ X毒素可能是由於R Τ X活化者蛋白質活性降低的結果。它也可能是 R Τ X活化者蛋白質表現程度降低或以上二種可能性組合的結果。因此，具有降低活性和/或降低表現程度的R Τ X活化者蛋白質也位於本發明範圍之內。或者，也可能修飾R Τ X活化者蛋白質的標的位置，即R Τ X毒素的醯化位置。假如此位置被修飾至醯化位置降低或缺少的程度，這也會造成一無活性的R Τ X毒素。此醯化作用的位置相當容易藉由重組D N A技術而將其突變。突變作用可利用下列方式而獲得，如將包含醯化位置的限制酶片段缺失，或醯化位置的位置直接突變法。具有非功能性活化者蛋白質的活的減毒細菌可利用許本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210'乂297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^衣·

、1T -12- 546147 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（1〇 ) 多方法獲得。一種可能性是將可編碼R τ X活化者蛋白質的基因導入一個突變，最好是使用重組D A N技術。我們知道，突變作用是將野生型細菌內我們提及的染色體區域的基因訊息做一改變。此突變，例如：核酸取代，缺失，嵌入或倒轉，或上述的組合式，因此造成一無法製造功能性R Τ X活化者蛋白質的細菌。目前對於HAP群中，RTX毒素製造菌株的RTX 活化者基因的位置，限制酶型式和通常甚至核苷酸序列有更多的了解。此訊息可從 Coote，J.G. (FEMS Microbiology reviews 88 :1 3 7- 1 62 ( 1 992))所著的評論中獲得。此文章將各種R Τ X毒素間的構造和功能關連做一總論。關於專一性 R Τ X毒素的非常詳細訊息可在U · S . P a t . N 〇 . 5，0 5 5 ，4 0 0發現，它是關於溶血巴斯德氏菌科的 R Τ X 基因。Frey et al·; J. Gen. Microbiol. 1 39:1 723-1728(1993)和 Frey et al·; Proceedings of the HAP· conference U.K., Edinburgh 1 994則關於在胸膜肺炎放線桿菌R Τ X毒素合成和運輸過程中扮演角色的所有基因。可編碼R Τ X活化者蛋白質的基因或參與該基因轉錄 /轉譯的序列的突變可利用許多方法獲得。一種可能性是將R Τ X活化者基因的相關序列選殖於載體內，使用限制酶將部分或全部R Τ X序列外切並以突變的序列取代野生型R Τ X毒素。此一種取代，如可使用爲人所知的同質重組技術進行。另一種可能性是使用位置直接突變法以獲得所想要的本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫裝-- ^本頁) 、1Τ -13- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 546147 A7 B7 五、發明説明（13 ) 有效免疫反應以抵抗毒力型式的R T X毒素製造細菌。投予時的有效劑量將取決於被接種動物的年齡，體重和種類，以及投予的方式和抵抗的病原種類。疫苗可包含任何足以透發免疫反應的細菌劑量，1〇3 一 1 0 1 ^細菌含量是非常適合的劑量。除了如上述的免疫有效含量的活的減毒R τ X毒素製造細菌之外，如本發明的疫苗也含有一藥學上可接受載體〇此一載體可簡單如水，但它可能也含有培養細菌的培養液。其他適合的載體是生理食鹽水。本發明可使用的其他藥學上可接受載體或稀釋劑包括安定劑如S P G A，多醣類（如：山梨糖醇，甘露醇，澱粉，蔗糖，葡萄糖，糊精），蛋白質如白蛋白或酪蛋白，含有蛋白質的試劑如牛血淸或脫脂乳和緩衝液（如：磷酸鹽緩衝液）。或者，具有佐劑活性的一或更多種化合物也可加至疫苗。佐劑是免疫反應的非專一性刺激物。它們可增強宿主對侵入病原的免疫反應。本技藝中爲人熟知的佐劑實例是 Freunds完全和不完全佐劑，維生素E，非離子性阻斷聚合物，胞壁質二胜肽，I S C〇M s (免疫刺激複合物， immune stimulating complexs，例如歐洲專利 Ε Ρ 1 0 9 9 4 2 )，皂素，礦物油，植物油和Carbopol ( — 種同聚物）。特別適合黏膜應用的佐劑是，如大腸桿菌熱不安定毒本纸張尺度適用中國國家標準'(CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） C請先閱讀背面之注意事項、再填寫本頁} 、-口 -16- 546147 經濟部中央標準局員工消費合作社印't Α7 Β7 五、發明説明（14 ) 素（E. coU heat-labile toxin，LT)或霍亂毒素（ C h ο 1 e r a t ο X i η，C T )。其他適合的佐劑是，例如氣氧化銘，磷酸鹽或氧化物，油乳化劑（如Bayol F®或Marcol 52® )，皂素或維生素E溶解鹽。因此，在一較佳型式，如本發明的疫苗包含一佐劑。爲了投予至動物，如本發明的疫苗尤其是可使用噴氣或經肌肉，鼻腔，皮內，皮下方式給予。在一較適宜旳具體實例，如本發明的疫苗額外含有一或更多種篩選自其他病原性微生物或病毒的抗原。此種疫苗可藉由添加一或更多種篩選自其他病原性微生物或病毒的抗原至如本發明的活的減毒R T X毒素製造細菌和藥學上可接受載體內而獲得。當然，也可能添加不只一或更多種抗原，但也可能是一或更多種不活化或活的型式的完整病原菌。我們可使用已知的重組D N A技術，將篩選自其他病原性微生物或病原的可編碼一*或更多種抗原的基因訊肩、_ 殖至活的減毒R T X毒素製造細菌內。如本發明的細菌是非常適合做爲基因訊息的攜帶者，即載體，因爲它們是M 有減毒特徵。以本發明爲基礎的細菌疫苗，由於它額％ _ 帶一或更多種可編碼篩選自其他病原性微生物或病毒β勺抗; 原的基因訊息，因此它可同時致免疫抵抗二或更多種g _ 。當然，基於醫學和理療學的觀點，此種接種對於動物_ 說，將比分別接種單一病原菌有較小的壓力。在一甚至更佳的具體實例，如本發明的疫苗含有屬於^ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） ' " —^~~— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} % 、11 546147 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（15) 胸膜肺炎放線桿菌的活的減毒R τ X毒素製造細囷。在一仍然其至更佳的型式’這些抗原是篩選自（但不限於）下列族群：豬生殖呼吸道徴候群（porcine Reproductive Respiratory Syndrome，PRRS )病毒’僞狂犬病毒（Pseudorabies virus)，豬流感病毒（Porcine Influenza virus )，豬小 D ΝΑ 病毒（Porcine parvo vinus )，傳染性胃腸炎病毒（Transmissible Gastroenteritis virus )，輪狀病毒（rotavirus )，大腸桿菌（Escherichia coli )，豬丹毒丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae )，多殺巴斯德氏菌（Pasteurella multocida )，支氣管炎博德特氏菌（Bordetella bronchiseptica)，副豬嗜血菌（ Haemophilus parasuis )和豬流感鏈球菌（Streptococcus suis ) 〇在甚至更佳具體實例的另一型式，如本發明的疫苗含有屬於溶血巴斯德氏菌的活的減毒R T X毒素製造細菌。在一仍然甚至更佳的型式，這些抗原是篩選自牛隻病原菌群的其他病原性微生物或病毒，包括牛輪狀病毒（ Bovine rotavirus )，牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Biral Diarrhoea virus ) ’ 副流感第 3 型病毒（Parainfluenza type 3 virus )，牛副黏病毒（Bovine Paramyxorirus ) ，口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease virus )，多殺巴斯德氏囷’睡眠嗜血囷（Haemophilus sommus )，流產布魯氏菌 (Brucella abortus)，金黃色葡萄球菌（Staphu〇c〇ccus aureus )，鏈球囷屬（Streptococcus spp.)，枝原體屬（本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱)--- ---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一SJ. ♦ 546147 A7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（16 ) Mycoplasma spp·)，和牛呼吸道合胞病毒（Bovine Respiratory Syncytial virus )。有許多方法可貯存活的微生物，如貯存在冰箱是一個爲人熟知的方法。通常也使用置於含甘油的緩衝液，然後存放在7 0 °C。細菌也可保存在液態氮。冷凍乾燥是另一保存方法。冷凍乾燥的細菌可貯存並保存生命力達許多年。冷凍乾燥細菌的貯存溫度最好超過零度，則不會破壞細菌的生存力。依照已知標準的冷凍乾燥程序，我們可進行冷凍乾燥。可選擇的有益添加物，如脫脂乳，海藻糖，明膠或牛血淸白蛋白可添加於冷凍乾燥程序。因此，在一較佳的具體實例，疫苗是以冷凍乾燥型式存在。本發明也關於使用如本發明的疫苗，以保護易感染的動物抵抗巴氏德菌科細菌的感染。在一較佳具體實例，使用如本發明的疫苗可保護易感染動物抵抗胸膜肺炎放線桿菌感染。而且’本發明也關於製備巴氏德菌科中製造RTX毒素的減毒活菌的製備方法。該方法包含將可編碼R T X活化者蛋白質的基因導入一突變。此方法的一較佳具體實例，其導入的突變是將R 丁 χ 活化者蛋白質基因缺失。最後，本發明也關於製備疫苗的方法，該疫苗可保護動物抵抗巴氏德菌科中製造R τ X毒素的細菌的感染。其本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公f ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -19- 546147 A7 B7 五、發明説明（17 ) 方法係將如本發明的細菌和藥學可接受載體相混合。實施例 :減毒活的胸膜肺炎放線桿菌株的製備 P_A卫X I — D 1 1的構築：如本發明的減毒活細菌的可行性例證，係利用胸膜肺炎放線桿菌△ a p X I C突變種的構築。爲了得到此突變種’首先需製造含有RTX-活化者基因缺失的質體。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 構築的大綱顯示於第1圖。胸膜肺炎放線桿菌的 a P X I操縱子的序列已存放於GenBank ，其接受號碼爲 X5 2 8 9 9 。MpJFF7 5〇（Gygietal.;Infect. Immun. 60:3059-3064，1 992 )，以酵素 B g 1 I 和 Pst I將含有apxIC，apxIA基因和啓動子區域的4481 bp Bgl ΙΙ/PstI片段切下，然後選殖至事先以B a m Η I和P s t I酵素水解的質體 p GEM3 Z ( Promega Co·，Leiden NL )。所形成的質體命名爲p A p X I — D 1。利用限制酶X h ο I將含有大部分ΑρχIC編碼區域的407bp DNA片段切下，然後以限制酶S s p I部分水解。將突出端S ·核酸酶水解使其轉變成鈍端，然後將約6 8 0 0 B P的片段從聚半乳糖凝膠分離並再連接。所形成的質體命名爲 ρΑρχ I - D2。橫越Xho I/Ssp I缺失而接合的序列係利用核苷酸序列分析法確認。然後，利用 Ail I I / S m a I水解作用將大部分的本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） -20- 546147 A7 _ _B7 五、發明説明（18 ) A p X I A編碼區域刪除，再利用S 1核酸酶的鈍端化作用，然後再連接。爲了進行對偶基因取代反應，將 1 4 5 4 b P 交換匣（exchange cassette.)利用限制酶 Pst I和Sac I從pApxI— D3切下，然後選殖至事先以相同酵素水解的載體PJQ2 0 0KS ( Quandt et a.; Gene 127:15-21，1 993 )。所形成的質體命名爲 pApx I— D4。利用 Hpa I 將 ΡΑρχ I— D4 中s a cB基因的3 >端去除，然後以來自pAP 1 3的 5 4 0 b p EcoRV片段的rpsL基因取代（

Prentki et al·; Gene 103:1 7-23, 1 99 1 )。所形成的質體命名爲 pApxI— D11。結果：所形成的質體p A p X I — D 1 1的構造以各種限制 _水解反應確認。水解的型態顯示確實得到我們所要的質體。此質體進一步做爲Aa p X I C突變種構築之用。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ▼裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 源ϋ匈喔炎放線桿菌株Η V 2 1 1的△ a p X I C突變種的構築使用質體p A p X I - D 1 1進行對偶基因取代反應。爲了此目的，我們利用標準濾紙配對技術，從大腸桿菌將質體P A p X I — D 1 1經接合作用送入胸膜肺炎放線 f干囷（De Lorenzo and Timmis，Methods Enzymol. 235:386 -405，1994 )。大腸桿菌捐贈者（η B Η P P 1 〇 1 )的構本纸張尺度適用中家標率（CNS ) A4規格（2iQx 297M ) 546147 A7 B7 五、發明説明（20 ) MBHPP 1 1 3菌株以S s p I水解的染色體DNA，只有一條與缺失區域側面的探針雜交的帶（band )(第2 圖，左邊方格）。帶的大小（約4 · 4 K B )相當於母株染色體DNA二個雜交帶的組合大小減去4 0 7 b p缺失區域。而且，它也顯示質體骨架不再存在於 MBHPP113 (第2圖，中間方格）。最重要地，它顯示含有a px I C基因的S s p I / X h ο I片段不再存在於MBHPP113 (第2圖，右邊方格）。實施例2 : △ a px I C突變種MBHPP 1 1 3的RTX —毒素的表現，排泄和缺失溶血活性的gjt 胸膜肺炎放線桿菌△ a p X I C突變種Μ Β Η P P 1 1 3 缺失溶血活性經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲了顯示MBHPP 1 1 3中Aa px I C缺失的影響，我們將Aa px I C菌株MBHPP 1 1 3和野生型母菌珠培養於血液培養皿，然後比較它們的溶血活性。屬於血淸型7的胸膜肺炎放線桿菌參考菌株（只製造 A p X I I )也列入比較範圍。中於A p X I I具有中度的溶血洁性，所以此菌株顯示一中間程度的溶血活性〇將各別的菌落以淸毒過的牙籤轉移至具有0 · 1 % 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -23- 546147 A7 ---- B7___ 五、發明説明（21 ) N A D和2 %羊紅血球細胞的Columbia瓊脂培養皿。結果 : 從第3圖結果我們可看到，經過培養於3 7 °C 8小時之後，正如預期地，HV211 (野生型）， Μ Β Η P P 1 〇 5 ( R，即具抗性菌株）和質體整合突變種（I )都被溶血區域所包圍。血淸型7的胸膜肺炎放線桿菌（只製造A ρ X I I ) 顯示中等程度的溶血。也正如預期地，在△ a p X I C Μ Β Η Ρ Ρ 1 1 3菌株的周圍並無偵測到任何溶血區域（桌3圖中以△表示）。此實驗淸楚顯示：△ a ρ X I C MBHPP113 菌株確實不會製造有活性的A ρ X -毒素。 Δ a ρ X I MBHPP113菌株的apxIA的表現和排泄如本發明的△ a ρ X I C菌株被認爲可表現和排泄無經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 溶血活性的R T X -毒素。本實驗即要測試其表現和排泄〇 A ρ X I A蛋白質排泄的測試係將來自各種胸膜肺炎放線桿菌菌株的濃縮培養物上淸液與單一專一抗-A ρ X I A 反應（如 Beck et al·，J Clin· Microbiol.，32; 2749-2754所述方法）。也測試抗一 A p x I I A血淸和其他血淸型的野生菌本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'/297公釐） -24- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 546147 A7 B7 五、發明説明（22 ) 株，以做比較。將胸膜肺炎放線桿菌從巧克力瓊脂培養皿取出，接種至含 0 · 1% NAD 的 5m 1 Columbia Broth (哥倫比亞培養物）培養基內，於3 7 °C，2 0 0 r p m振盪下培養6小時。然後於1 0 0 0 0 x g速度下，將培養物離心3 0分鐘，以收集'不含細胞的培養物上淸液。根據製造商的指示，利用 Centricon-100 (Millipore Co.，Etten-Leur， NL)濃縮濾紙將A p x I A蛋白質濃縮2 0倍。將蛋白質置於聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳，然後轉移至濾紙上並與單一專一抗一 Ap X I A血淸和抗一 Ap X I A血淸反應。巧克力瓊脂培養皿含有KH2P〇4(lg)， K 2 Η P 4 ( 4 g ) ，NaCl ( 5 g )，膘腺 N〇3( 1 5 g )，澱粉（lg) ，Bacot瓊脂（1 5 g )，消毒過的水（至總體積1 0 0 0 m 1 )，羊血（1 〇〇 m 1 )，馬血淸（1〇〇m 1 )和I s o v i t a 1 e x溶液（1 2 m 1 )。結果 · 濃縮的培養物上淸液於平行的聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳，然後利用通電轉移至Immobilon-P (顯示於第4圖）

I 。將所形成的點墨濾紙與單一專一抗一 A ρ X I A血淸（方格A)，單一專一抗一 ApxIlA血淸（方格B)反應。測試的菌株爲Η V 2 1 1 (野生型）， MBHPP105(R，即抗性菌株），質體整合突變種 (I) ’MBHPP113 (△)(參考上述，來自胸膜本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） ▼裝-- (讀先閱讀背面之注意事項再41寫本頁)

、1T -25- 546147 Α7 _ Β7 五、發明説明（23 ) 肺炎放線桿菌株Η V 2 1 1的△ A p X I C突變種構築）和血淸型6 ，5 a和5 b的野生型參考菌株。血淸型6的野生型參考菌株可製造Αρχ I IA，無法製造 A ρ X I Α 〇在第4A圖的WT’R，I和I凝膠道的i〇5kd 帶’我們可明顯發現’ W T -菌株以及R〜菌株，I 一菌株和MBHPP 1 1 3菌株會製造和輸出Ap X I A蛋白質。

在實施例2的實驗結果證明了，胸膜肺炎放線桿菌 MBHPP113菌株確實可表現並輸出無活性的RTX —母系0 實施例3 : 來自胸膜肺炎放線桿菌4 Π 7 4菌株的△ a υ X I C Δ a p x I I C突變種的構築經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 於4 Ο 7 4菌株的△ a p x I C突變種的構築方法如實施例1所述。將胸膜肺炎放線桿菌血淸型1參考菌株 4 0 7 4置於含鏈黴素的培養基內培養，然後再置於含鏈黴素和萘Π定酮酸的培養基內培養（Frey and Nicolet，J. elm. Microbiol. 28:232-236, 1 990 )，然後分離胸膜肺炎放線桿菌接受者菌株Μ Β Η P P 1 〇 4。經過 ΜΒΗΡΡ104與ΜΒΗΡΡ101 (敘述於實施例1 )的接合，我們可得到抗萘啶酮酸和慶大黴素的胸膜肺炎放線桿菌後體接合物。然後將此菌株平舖於含2 %羊紅血本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210Χ 297公釐） -26- 546147 kl B7 五、發明説明（24 ) 球，0 · 1% NAD和萘啶酮酸的CBN培養皿’經過一段時間後，我們可在培養皿上發現許多具有較小溶血區域的菌落。其中之一我們將其命爲MBHPP1 1 1 ，並利用南方點墨分析法確認其是胸膜肺炎放線桿菌4 0 7 4 菌株的陰性a p X I C突變種。Μ Β Η P P 1 1 1菌株中 a ρ X I I C缺失的製造法相同於a ρ x I C缺失製造法，其係使用含有p A p x I I - D 2構築法（取代 P A ρ x I— D1 1)的接合捐贈者ΜΒΗΡΡ142 菌株。ρΑρχ I I — D2的構築顯示於第5圖。質體 pJFFapx IICU15的構築主要是將含有 a ρ X IIC和apx IIA基因的4.3kb片段 (源自於4074菌株的染色體DNA經Sa u 3 A I 部分水解）嵌入載體λ ZAP Express (Stratagene CO.)並使用幫助者噬菌體將其外切進入載體pBK-CMV( S t r a t a g e n e C 〇 ·)。在a ρ X I I C編碼區域的框構內缺失（in-frame deletion )的製備係使用 p J F F apx I ICU15 做爲模版，寡 Apx I I C - 0 L ( 5 ^ 經滴部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -CAATACCTTAAGATCATTTTTTAG CATCATCCC)和 APXI IC-〇R(5^— A CATTTCTTAAGTATGAGCAAGAGTT AATAACAGC)爲引子進行PCR放大反應。所形成的8.5kb PCR片段以Afl I I水解並再連接。所形成的質體命名爲P A ρ x I I - D 1 ，橫越缺失位置的序列以序列分析法確認。p A ρ x I I - D 1 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） -27- 546147 B7 ___ 五、發明説明（25 ) 嵌入的部分以s p e I / B g 1 I I將其外切’然後連接至事先以Xb a I和B amH I水解的ρΑρρΕΧ —KG1。所形成的質體命名爲pA p X II—D2’ 並轉移至大腸桿菌S 1 7 — 1 λ p i r ( Simon et al., Biotechnology 1;784-79 1，1 9 83 )。此接合捐贈者菌株命名爲 MBHPP142。經過MBHPP1 1 1和MBHPP142的接合’ 我們可得到抗萘啶酮酸和慶大黴素的胸膜肺炎放線桿菌後體接合物。然後我們將其平舖於含0 · 1 % N A D ’ 2 %羊紅血球和2 0 // g / m 1萘啶酮酸的C B Μ瓊脂培養皿。在培養皿上我們並無發現任何具溶血性的胸膜肺炎放線桿菌菌落。我們將其中一個菌落命名爲 Μ Β Η Ρ Ρ 1 4 7，並利用南方點墨分析法確認它是胸膜肺炎放線桿菌4 0 7 4菌株的一個a ρ X IC a ρ x I I C缺失突變種。結果 · 經濟部中央標準局員工消費合作社印製經構築步驟所形成的Μ Β Η Ρ Ρ 1 4 7菌株，它在 apx IC和apx I IC基因上都有缺失。胸膜肺炎放線桿菌rfn淸型1 △ a ρ X C突變種的溶血活 -28 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） 546147 A7 B7 五、發明説明（26 ) 我們將Aapx IC MBHPP111菌株， Δ a p X 1C Δ a p X IIC雙重缺失突變種 MBHPP 1 4 7和野生型母菌株MBHPP 1 〇 4培養於血液培養皿（如實施例2所述方法），然後比較其溶血活性。個別的菌落以消毒過的牙籤將其轉移至含0 . 1 % N A D和2 %羊紅血球細胞的C B Μ培養皿。經過3 7 °C培養8小時，野生型Μ Β Η Ρ Ρ 1 0 4菌株被2 m m的 /3 —溶血區域所包圍。MBHP P 1 1 1菌株（仍可製造有活性的A ρ X I I A )可產生一更擴散約1 m m溶血的區域（其係與只區域A ρ X I I的血淸型7和1 2胸膜肺炎放線桿菌參考菌株所被包圍的溶血區域比較）。 Μ Β Η Ρ Ρ 1 4 7雙重缺失突變種無溶血性。結果： a ρ X I C缺失會造成嚴重的溶血活性喪失，而其溶血活性典型的A ρ X I溶血素所形成。接續的 a ρ X I I C缺失則會造成完全失去溶血活性。結果摘要於第1表。 ▼裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T I · 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -29- 546147 A7 B7 五、發明説明（27 經濟部中央標準局員工消費合作社印製菌株在血液瓊脂上的溶血區域 (mm) 西方點墨反應抗· A p X IA抗體抗-Αρχ IIA抗體 MBHPP104 2 + + MBHPP1 1 1 1(d) + + MBHPP147 0 + + 血淸型1 0 2 + 血淸型1 2 1(d) 一 + 第1表：溶血和西方點墨結果摘要。溶血區域以m m 表示，（d )表示擴散性溶血。'' + 〃表示在西方點墨法中，抗體與一約1 0 5 k D a的抗原反應乏此一反應。表不缺源自於血淸型1 4074菌株的Aapx C菌株的 A p X I A和A p X I I A的表現和排泄 A p A蛋白質排泄的測試，係將來自於各種胸膜肺炎放線桿菌株的濃縮培養物上淸液與單一專一抗-A p X I A和抗一 A p X I I A血淸，依照西方點墨法實驗（Beck et al·，J. Clin. Microbiol·，32;2749-2754， 1 994和實施例2 )。結果本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) it -30- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 546147 A7 _ B7 五、發明説明（28 ) 所有血淸型1菌株（MBHPP 1 04， MBHPP 1 1 1和MBHPP 1 47)仍可表現並排泄 Apx ΙΑ和Apx I ΙΑ二種蛋白質。以來自於血淸型1 0菌株（只表現A ρ X I )和血淸型1 2菌株（只表現A p X I I )的濃縮上淸液，做爲控制組。其結果摘要於第1表。實施例4 : △ apx C突變種的胸膜肺炎放線桿菌對小鼠毒力的影 w_ 爲了決定apx 1C和/或apx I 1C缺失對胸膜肺炎放線桿菌毒力的影響，我們將每組含7隻小鼠（約6 - 7週大）的實驗組，以腹腔注射法注入3種不同劑量的5種不同菌株（見第2表）。將菌株培養於含0 . 1 % NAD的新鮮CBM培養基，然後以〇 . 9% (w/ v ) N a C L溶液淸洗，然後再懸浮於相同緩衝液內直到〇D 6〇〇爲〇· 8 (代表約3xi〇9c fu/ml) 。然後以相同緩衝液進行1 0和1 〇〇倍稀釋。每一組的小鼠以腹腔法注入0 · 5 單一稀釋的單一菌株。剩餘系列稀釋的菌株則平舖於含0 · 1 % N A D的C B Μ培養皿，然後計算攻擊菌株培養物的真實c f u含量。 f吉果··

從資料我們可發現，由於a p X 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） C缺失 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) r裝· 訂 - -31 - 546147 Μ Β7 五、發明説明（29 ) HV21菌株的LD50至少增加20倍。而4074菌株，單一 Aapx I C缺失造成超過10倍的LD5〇 △ 少的至 Jr β, 夕咅額全。到加達增， a 9 加表增 2 的第倍於 9 示一顯另果成結造此變。突低 C 降 I 的 I 力毒 X倍 Ρ 〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T > 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） - 32- 546147 A7 B7 五、發明説明（30 ) 組菌株劑量（cfu) 死亡總數大槪的LD50(cfu) 1 ΜΒΗΡΡ105 0·4χ1〇7 7 <0.4xl07 2 ΜΒΗΡΡ105 0.4χ108 7 3 ΜΒΗΡΡ105 0.4χ109 7 4 ΜΒΗΡΡ1 13 〇·7χ107 0 0.8x10s 5 ΜΒΗΡΡ1 13 0·7χ108 2 6 ΜΒΗΡΡ1 13 0.7χ109 7 7 ΜΒΗΡΡ104 2χ107 7 <2xl07 8 ΜΒΗΡΡ104 2χ108 7 9 ΜΒΗΡΡ104 2χ109 7 10 ΜΒΗΡΡ1 1 1 2χ107 0 2xl08 11 ΜΒΗΡΡ1 1 1 2χ108 3 12 ΜΒΗΡΡ1 1 1 2χ109 7 13 ΜΒΗΡΡ147 1 · 8χ 1 Ο7 0 1.8xl09 14 ΜΒΗΡΡ147 1. 8χ 1 Ο8 0 15 ΜΒΗΡΡ147 1.8χ109 4 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T .-,. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製第2表：利用a p X C基因缺失製造胸膜肺炎放線桿菌的減毒作用。MBHP P 1 0 5菌株是血淸型1〇 Η V 2 1 1分離物的抗萘啶酮酸和鏈黴素的衍生物； ΜΒΗΡΡ 1 1 3是源自於ΜΒΗΡΡ1〇5的a ρχ I C缺失突變種；MBHPP104是血淸型，參考菌株 4〇7 4的抗萘啶酮酸和鏈黴素的衍生物；本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -33- 546147 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（31 ) MBHPP1 1 1 是源自於 MBHPP1Q4 的 apx IC缺失突變種；MBHPP147是源自於 MBHPP111 的 apx IC apx IIC 雙重缺失突變種。使用活的Μ Β Η P P 1 4 7做爲疫苗保護小鼠抵抗胸膜肺炎放線桿菌攻擊取4 0隻小鼠，隨機分成4組（見第3表）。二組小鼠在7週齡大時，以腹腔注射法接種含1 . 5 X 1 0 8細胞的Μ Β Η Ρ Ρ 1 4 7菌株。這些小鼠在4週後，以相同注射法加強接種。加強注射2週後，將一組接種組和一組非接種組以含有1 0 8 c ί u的Μ Β Η Ρ Ρ 1 〇 4菌株經由腹腔注射法攻擊（Μ Β Η Ρ Ρ 1 0 4是源自於 Μ Β Η Ρ Ρ 1 4 7的毒性血淸型/菌株）。其他二組則以 l〇6c f u的ΜΒΗΡΡ105菌株攻擊（ Μ Β Η Ρ Ρ 1 〇 5是毒性血淸型1 0菌株）。結果 . 在控制組中，所有小鼠都死亡。然而接種組中’以血淸型1菌株Μ Β Η Ρ Ρ 1 0 4同質攻擊的1 0隻小鼠’有 9隻存活（ρ = 〇 · 〇〇〇1 Fisher確實試驗），並且 1 0隻小鼠中，有4隻抵抗血淸型1 0菌株 MBHPP105 異質攻擊（P = 〇 · 0433 Fisher 確實試驗）。Μ Β Η Ρ Ρ 1 4 7菌株具有明顯的同質和異 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1Τ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -34- 546147 A7 B7 --------- . _______ - ---- -—---- ’一五、發明説明（32 ) 質保護作用，因此可做爲一活的疫苗。結果顯示於第3表組接種ΜΒΜΡ Ρ147(在 7 週齡）加強接種 MBHppl47( 在1 1週齡）攻擊 (在13週齡）存活數 (攻擊後7 天）有意義的保護作用 (P) 1 1.5xl08cfu 1.5 X 1 08cfu 108cfu MBHPP104 9 0.0001 2 - - 108cfu MBHPP104 0 3 1.5xl08cfu 1.5 X108cfu 106cfu MBHPP105 4 0.0433 4 - - 106cfu MBHPP105 0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第3表：接種Μ Β Η P P 1 4 7後，保護小鼠抵抗毒性血淸型1 ( Μ Β Η P P 1 ο 4 )和血淸型1 ο菌株（ MBHPP105)的攻擊。經濟部中央標準局員工消費合作社印製圖片說明：第1圖：pApx I— Dl 1的構築（請參考內文的說明）。顯示所使用的質體的主要基因特徵，以及所使用的所有限制酶位置。其中，則面X h ο I和S s p I接合位置以'、X / S 〃表示，A p X I操縱子的轉錄起始點以t s p 〃表示（由 Frey et al.，Gene 142; 97-10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -35- 546147 A7 --------- B7 五、發明説明（33 ) 2(1 994)決定轉錄起始點）。弟2圖.來自HVSli野生型菌珠（WT)，抗鏈黴素和萘啶酮酸菌株Μ Β η p p丄〇 5 ( R )，中間整合（1

)和最終缺失構築Μ Β η p p丄丄3 ( D )的染色體D N A經S s p I水解後的南方點墨分析。爲了比較，質體 ρΑρχ 1_" D1(D1)和 ΡΑρχ I - D 1 1 ( D 1 1 )也包括其中左邊方格，爲濾紙與來自p a ρ χ I 一 Dll 經 Sal I/Sac I 水解的 1.487 K B片段（含有缺失兩旁的區域）雜交的結果。中間方格 ’爲濾紙與ρΑρχ I— Dl 1載體骨架（爲一 5 0 0 4 b p Sal I/Sac I片段的分離物）雜交的結果。右邊方格，爲濾紙與位於a P x I c缺失部分之內的3 6 9 b p片段（由p CR放大反應產生）雜交的結果。弟3圖：溶血素培養皿試驗。利用消毒過的牙籤挑選各種菌株，平塗於含〇 . 1 % N A D和2 %羊紅血球細胞的C olumbw瓊脂培養皿。然後於3 7 t培養8小時。接種的菌株由左至右分別爲：野生型HV211菌株（Wt)，抗萘啶酮酸和鏈黴素菌株MBHPP105(R)，嵌入突變種（I )，缺失突變種Μ Β Η P P 1 1 3 ( D )，和胸膜肺炎放線桿菌血淸型7參考菌株。 ,—-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x 297公釐） -36- 546147 A7 ______B7 五、發明説明（34 ) 第4圖：A p X I和A p X I I A的表現。將濃縮培養物上淸液置於平行的聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳，然後利用通電點墨法將其轉移至ImmobUon-P。將此濾紙分別與單一專一抗—Ap X I A血淸（方格A)和單一專一抗一 A p X I I A血淸（方格B )反應。測試的菌株包括 HV211 (WT) ，MBHPP1〇5 (R)，質體整合突變種（I) ，MBHPP113(D)和血淸型6, 5 a和5 b的野生型參考菌株。血淸型6的野生型參考菌株會產生Αρχ ΙΙΑ，但無法製造Αρχ ΙΑ。第5圖：ρΑρχ I I— D2的構築。顯示所使用質體的主要基因特徵和所有限制酶位置。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -37-

Claims

546147 六、申請專利範圍附件2A

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製第8 6 1 1 8 1 6 1號專利申請案中文申請專利範圍替換本民國92年5月26日修正 1 · 一種製備巴氏德菌科之生產r T X毒素的減毒活細囷的方法’其包括在編碼R T X活化子蛋白質的基因之 a ρ χ Ϊ feg縱子內導入刪除或插入突變，或在控制r T X 、活化子m R N a轉譯的核糖體結合區域內導入刪除或插入突變’或生產R T X活化者反義（antlsense) r n a，導致g亥細菌製造無活性的r T X毒素。 2 .如申請專利範圍第1項之方法，其特徵爲該導入的突變是刪除。 3 ·如申請專利範圍第1或2項之方法，其特徵爲該斤田 _ 疋胸膜肺炎放線桿菌（Acti nobacillus P1 g u ι· ο p n e u in 〇 n i a e) ° 4 .如申請專利範圍第i或2項之方法，其特徵爲該糸田_是溶血巴氏德菌（Pasteurella haeηι ο 1 y tica )。 5 ·如申請專利範圍第i或2項之方法，其特徵爲該巴氏德菌科的生產R T X毒素之減毒活細菌係用於製造疫苗以保護動物免於巴氏德菌科之產生R T X毒素之細菌的感染。 6 .如申請專利範圍第5項之方法，其特徵爲該疫苗係經由冷凍乾燥處理。 ^ 7 .如申請專利範圍第5項之方法，其特徵爲該疫苗 Aw ------1T------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） _巧_ 546147 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍包含佐劑。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）