CN104387491B - 一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，通过溶解、除杂、精提、浓缩，得到b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的精糖溶液。该制备工艺安全有效，对人体及环境无害。本发明制备的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖精糖溶液中精糖的各项指标均符合药典要求，且纯度高；避免了苯酚的使用，使用的非离子表面活性剂均为低毒或无毒，且用量少，对人体及环境友好；能同时去除杂蛋白及氯化血红素对荚膜多糖的干扰，操作简便，工艺稳定，重现性好，且对设备要求低，成本低廉，适于大规模的生产。
Description
技术领域
本发明属于革兰氏阴性细菌荚膜多糖技术领域，具体涉及一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法。
背景技术
b型流感嗜血杆菌(Hib)不仅是我国小儿化脓性脑膜炎的首要原因，而且是小儿肺炎的主要病因之一。近年来的研究表明，Hib已成为我国儿童呼吸道的首位致病菌，主要引起下呼吸道感染，以肺炎为主，2岁以下幼儿感染率较高，据估计，每年Hib在全球可引起至少300万严重病例和大约38.6万死亡，加之抗生素耐药性菌株的不断增加，接种疫苗成为预防绝大多数Hib严重病例的唯一公共卫生措施。WHO已经证明Hib结合疫苗的安全性和有效性，应将该疫苗纳入全球儿童常规免疫规划。
有荚膜的b型流感嗜血杆菌是致病的罪魁祸首，其荚膜上的b型荚膜多糖与致病力有很大关系。因此在Hib结合疫苗制备过程中其荚膜多糖的质量直接关系到疫苗最终的免疫原性及副作用的产生。根据2010版中国药典可以知道，现行国内大部分的细菌类疫苗的荚膜多糖从粗多糖到精糖提纯过程中普遍使用的是冷酚抽提法。该方法的主要缺点是苯酚的大量使用，苯酚属高毒类物质，可通过皮肤、消化道、呼吸道吸收而出现全身中毒症状，短期接触大量苯酚能引起中枢神经系统、肝肾、心肌、血液等多器官系统急性损害。苯酚对皮肤黏膜有强烈的腐蚀作用，皮肤接触者除引起局部皮肤严重烧伤使皮肤肿胀、变黑坏死外，也可通过皮肤吸收进入体内而引起心、肝、肾、神经系统毒性作用。同时，含苯酚的废液对自然环境的危害非常严重，如长期饮用苯酚污染的水，亦可引起慢性中毒反应，因此，要严格控制这些废水进入环境。为此，人们正在寻找新方法来替代传统工艺中这些危险有毒试剂的使用，这对于人类健康及自然环境的保护具有重要的现实意义。
传统工艺中Hib荚膜多糖的制备参照公开文献[Anderson et. al., INFERCTIONAND IMMUNITY. 1977, 15(2):472-477]，采用CY培养基对Hib菌株37℃进行发酵，发酵液经甲醛灭活，离心取上清后，利用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）进行沉淀，同时，在沉淀过程中有大量带有负电荷的蛋白也被沉淀下来。然后用0.5～1M的NaCl对复合物沉淀进行解离，添加冰乙醇至终浓度25%（v/v），沉淀核酸，然后加冰乙醇至终浓度75%（v/v），沉淀得到粗多糖。粗多糖用醋酸钠溶液溶解后，用冷酚抽多次抽提进行杂蛋白的去除，同时也去掉发酵过程中没有被利用掉的氯化血红素。最后超滤浓缩去除苯酚残留，经75%（v/v）乙醇沉淀得到精糖。
目前主要是利用柱层析对多糖进行纯化，2006年，Pato等人（Purification ofcapsular polysaccharide from Neisseria meningitides serogroup C by liquidchromatography, Journal of Chromatography B, 832, 262–267）利用柱层析法对C群流脑荚膜多糖进行了纯化研究，而国内研究人员[解红艳 等, 层析法去除Ａ群流脑多糖疫苗粗糖中杂蛋白. 中国生物工程杂志, 2010, 30(8):88-92]对A群流脑荚膜多糖也进行了纯化研究。虽然柱层析方法所得精糖检测指标均符合要求，但此方法受层析柱载样量的限制，大规模生产时花费时间较长，而且在Hib粗多糖中常含有大量的未被利用的氯化血红素，其中的铁离子容易与阴离子交换填料结合造成死吸附，填料的活化处理麻烦费时长，填料浪费较大。
因此，有必要研发一种不使用苯酚且工艺简便的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法。
发明内容
为克服目前纯化技术所存在的上述缺点，本发明提供了一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，该制备工艺安全有效，对人体及环境无害。
本发明通过以下技术方案实现：一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a、将Hib粗多糖溶于体积浓度为3～30%的曲拉通X-100水溶液、曲拉通X-114水溶液、吐温-80水溶液或乙基苯基聚乙二醇水溶液中，使Hib粗多糖的最终浓度为5～30mg/mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液；
b、在步骤a所得粗糖溶解液中添加(NH4)2SO4使使其质量浓度为20%～饱和，搅拌20～30分钟后，在8000～10000rpm下进行离心分离20～40分钟，取下层溶液；
c、在步骤b所得下层溶液中添加曲拉通X-100、曲拉通X-114、吐温-80或乙基苯基聚乙二醇，使其体积浓度为3～30%，再搅拌30～60分钟后，在8000～10000rpm下进行离心分离20～40分钟，取下层溶液；
d、在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为2～20%，搅拌20～40分钟后，在8000～10000rpm下进行离心分离20～40分钟，取下层溶液；
e、将步骤d所得下层溶液用生理盐水稀释至所含荚膜多糖的浓度为10～4000mg/L，再用100KD膜包进行超滤，所得浓缩液体即为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液。
所述步骤a中曲拉通X-100生理盐水溶液、曲拉通X-114水溶液、吐温-80水溶液、乙基苯基聚乙二醇水溶液的pH为5.5～7.5。
所述步骤b、c、d均分别重复1～3次，收集下层溶液后再继续下一步骤。
所述步骤e中的超滤重复3～5次。
经过大量的实践摸索和反复验证，非离子表面活性剂不但是良好的蛋白溶剂，而且非离子表面活性剂胶束又能包裹氯化血红素，本发明正是利用非离子表面活性剂的这种特性，将蛋白与氯化血红素同时与多糖进行分离，且几乎无毒副作用，是替代苯酚的理想选择。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明制备的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖各项指标均符合药典要求，且纯度高，经核磁检测本发明制备的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖在结构上与传统方法完全一致；
2、本发明在制备过程中，避免了苯酚的使用，使用的非离子表面活性剂（曲拉通X-100、曲拉通X-114、吐温-80、乙基苯基聚乙二醇）均为低毒或无毒，且用量少，对人体及环境友好；
3、本发明能同时去除杂蛋白及氯化血红素对荚膜多糖的干扰，操作简便，且不受载样量的限制，工艺稳定，重现性好，且对设备要求低，成本低廉，适于大规模的生产。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
a、将Hib粗多糖5g溶于体积浓度为5%(v/v)的曲拉通X-100水溶液（pH为7.5）中，使Hib粗多糖的最终浓度为5mg/mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液；
b、在步骤a所得粗糖溶解液中添加600g的(NH4)2SO4使其质量浓度为50%(w/v)，搅拌25分钟后，在8000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复2次，收集下层溶液；
c、在步骤b所得下层溶液中添加曲拉通X-100，使其体积浓度为10%(v/v)，再搅拌30分钟后，在8000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复3次，收集下层溶液；
d、在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为10%（v/v），搅拌30分钟后，在8000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复2次，收集下层溶液；
e、将步骤d所得下层溶液用生理盐水稀释至所含荚膜多糖的浓度为100mg/L，再用100KD膜包进行超滤5次，所得浓缩液体即为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液。
实施例2
a、将Hib粗多糖溶于体积浓度为15%(v/v)的曲拉通X-100水溶液（pH为6.2）中，使Hib粗多糖的最终浓度为10mg/mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液；
b、在步骤a所得粗糖溶解液中添加500g(NH4)2SO4使其质量浓度为30%(w/v)，搅拌20分钟后，在9000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复3次，收集下层溶液；
c、在步骤b所得下层溶液中添加曲拉通X-100使其体积浓度为3%(v/v)，再搅拌40分钟后，在9000rpm下进行离心分离30分钟，取下层溶液，该步骤重复2次，收集下层溶液；
d、在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为6%（v/v），搅拌40分钟后，在9000rpm下进行离心分离30分钟，取下层溶液，该步骤重复2次，收集下层溶液；
e、将步骤d所得下层溶液用生理盐水稀释至所含荚膜多糖的浓度为10mg/L，再用100KD膜包进行超滤5次，所得浓缩液体即为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液。
实施例3
a、将Hib粗多糖溶于体积浓度为30%(v/v)的曲拉通X-100水溶液（pH为5.5）中，使Hib粗多糖的最终浓度为30mg/mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液；
b、在步骤a所得粗糖溶解液中添加(NH4)2SO4使其质量浓度为30%(w/v)，搅拌30分钟后，在10000rpm下进行离心分离30分钟，取下层溶液，该步骤重复1次，收集下层溶液；
c、在步骤b所得下层溶液中添加曲拉通X-100使其体积浓度为30%(v/v)，再搅拌60分钟后，在10000rpm下进行离心分离40分钟，取下层溶液，该步骤重复1次，收集下层溶液；
d、在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为4%（v/v），搅拌20分钟后，在10000rpm下进行离心分离40分钟，取下层溶液，该步骤重复3次，收集下层溶液；
e、将步骤d所得下层溶液用生理盐水稀释至所含荚膜多糖的浓度为1000mg/L，再用100KD膜包进行超滤3次，所得浓缩液体即为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液。
实施例4
a、将Hib粗多糖溶于体积浓度为3%(v/v)的曲拉通X-114水溶液（pH为6.5）中，使Hib粗多糖的最终浓度为5mg/mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液；
b、在步骤a所得粗糖溶解液中添加(NH4)2SO4使其质量浓度至饱和，搅拌20分钟后，在8000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复2次，收集下层溶液；
c、在步骤b所得下层溶液中添加曲拉通X-114使其体积浓度为10%(v/v)，再搅拌30分钟后，在8000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复2次，收集下层溶液；
d、在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为6%（v/v），搅拌30分钟后，在8000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复1次，收集下层溶液；
e、将步骤d所得下层溶液用生理盐水稀释至所含荚膜多糖的浓度为4000mg/L，再用100KD膜包进行超滤5次，所得浓缩液体即为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液。
实施例5
a、将Hib粗多糖溶于体积浓度为15%(v/v)的曲拉通X-114水溶液（pH为6.2）中，使Hib粗多糖的最终浓度为5～30mg/mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液；
b、在步骤a所得粗糖溶解液中添加(NH4)2SO4使其质量浓度为30%(w/v)，搅拌30分钟后，在10000rpm下进行离心分离40分钟，取下层溶液，该步骤重复1次，收集下层溶液；
c、在步骤b所得下层溶液中添加曲拉通X-114使其体积浓度为20%(v/v)，再搅拌60分钟后，在8000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复3次，收集下层溶液；
d、在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为10%（v/v），搅拌40分钟后，在10000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复3次，收集下层溶液；
e、将步骤d所得下层溶液用生理盐水稀释至所含荚膜多糖的浓度为2000mg/L，再用100KD膜包进行超滤4次，所得浓缩液体即为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液。
实施例6
a、将Hib粗多糖溶于体积浓度为25%(v/v)的曲拉通X-114水溶液（pH为7.5）中，使Hib粗多糖的最终浓度为25mg/mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液；
b、在步骤a所得粗糖溶解液中添加(NH4)2SO4使其质量浓度为60%(w/v)，搅拌25分钟后，在8000rpm下进行离心分离30分钟，取下层溶液，该步骤重复3次，收集下层溶液；
c、在步骤b所得下层溶液中添加曲拉通X-114使其体积浓度为30%(v/v)，再搅拌60分钟后，在10000rpm下进行离心分离40分钟，取下层溶液，该步骤重复2次，收集下层溶液；
d、在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为10%（v/v），搅拌40分钟后，在8000rpm下进行离心分离40分钟，取下层溶液，该步骤重复1次，收集下层溶液；
e、将步骤d所得下层溶液用生理盐水稀释至所含荚膜多糖的浓度为3000mg/L，再用100KD膜包进行超滤3次，所得浓缩液体即为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液。
实施例7
a、将Hib粗多糖溶于体积浓度为5%(v/v)的吐温-80水溶液（pH为5.5）中，使Hib粗多糖的最终浓度为30mg/mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液；
b、在步骤a所得粗糖溶解液中添加(NH4)2SO4使其质量浓度为饱和，搅拌30分钟后，在10000rpm下进行离心分离40分钟，取下层溶液，该步骤重复1次，收集下层溶液；
c、在步骤b所得下层溶液中添加吐温-80使其体积浓度为20%(v/v)，再搅拌30分钟后，在8000rpm下进行离心分离40分钟，取下层溶液，该步骤重复2次，收集下层溶液；
d、在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为10%（v/v），搅拌40分钟后，在10000rpm下进行离心分离40分钟，取下层溶液，该步骤重复2次，收集下层溶液；
e、将步骤d所得下层溶液用生理盐水稀释至所含荚膜多糖的浓度为500mg/L，再用100KD膜包进行超滤4次，所得浓缩液体即为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液。
实施例8
a、将Hib粗多糖溶于体积浓度为15%(v/v)的吐温-80水溶液（pH为6.2）中，使Hib粗多糖的最终浓度为10mg/mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液；
b、在步骤a所得粗糖溶解液中添加(NH4)2SO4使其质量浓度为40%(w/v)，搅拌30分钟后，在10000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复2次，收集下层溶液；
c、在步骤b所得下层溶液中添加吐温-80使其体积浓度为30%(v/v)，再搅拌60分钟后，在10000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复3次，收集下层溶液；
d、在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为4%（v/v），搅拌20分钟后，在10000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复1次，收集下层溶液；
e、将步骤d所得下层溶液用生理盐水稀释至所含荚膜多糖的浓度为4000mg/L，再用100KD膜包进行超滤3次，所得浓缩液体即为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液。
实施例9
a、将Hib粗多糖溶于体积浓度为25%(v/v)的乙基苯基聚乙二醇水溶液（pH为7.5）中，使Hib粗多糖的最终浓度为25mg/mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液；
b、在步骤a所得粗糖溶解液中添加(NH4)2SO4使其质量浓度为30%(w/v)，搅拌30分钟后，在8000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复3次，收集下层溶液；
c、在步骤b所得下层溶液中添加乙基苯基聚乙二醇，使其体积浓度为30%(v/v)，再搅拌30分钟后，在9000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复3次，收集下层溶液；
d、在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为4%（v/v），搅拌40分钟后，在9000rpm下进行离心分离30分钟，取下层溶液，该步骤重复2次，收集下层溶液；
e、将步骤d所得下层溶液用生理盐水稀释至所含荚膜多糖的浓度为100mg/L，再用100KD膜包进行超滤3次，所得浓缩液体即为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液。
实施例10
a、将Hib粗多糖溶于体积浓度为5%(v/v)的乙基苯基聚乙二醇水溶液（pH为5.5）中，使Hib粗多糖的最终浓度为5mg/mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液；
b、在步骤a所得粗糖溶解液中添加(NH4)2SO4使其质量浓度为饱和，搅拌30分钟后，在8000rpm下进行离心分离40分钟，取下层溶液，该步骤重复3次，收集下层溶液；
c、在步骤b所得下层溶液中添加乙基苯基聚乙二醇，使其体积浓度为30%(v/v)，再搅拌50分钟后，在8000rpm下进行离心分离40分钟，取下层溶液，该步骤重复1次，收集下层溶液；
d、在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为4%（v/v），搅拌40分钟后，在8000rpm下进行离心分离40分钟，取下层溶液，该步骤重复1次，收集下层溶液；
e、将步骤d所得下层溶液用生理盐水稀释至所含荚膜多糖的浓度为2000mg/L，再用100KD膜包进行超滤3次，所得浓缩液体即为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液。
实施例11
a、将Hib粗多糖溶于体积浓度为15%(v/v)的乙基苯基聚乙二醇水溶液（pH为7.5）中，使Hib粗多糖的最终浓度为30mg/mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液；
b、在步骤a所得粗糖溶解液中添加(NH4)2SO4使其质量浓度为40%(w/v)，搅拌30分钟后，在8000rpm下进行离心分离40分钟，取下层溶液，该步骤重复3次，收集下层溶液；
c、在步骤b所得下层溶液中添加乙基苯基聚乙二醇，使其体积浓度为20%(v/v)，再搅拌60分钟后，在8000rpm下进行离心分离40分钟，取下层溶液，该步骤重复1次，收集下层溶液；
d、在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为10%（v/v），搅拌40分钟后，在10000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复3次，收集下层溶液；
e、将步骤d所得下层溶液用生理盐水稀释至所含荚膜多糖的浓度为4000mg/L，再用100KD膜包进行超滤5次，所得浓缩液体即为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液。
实施例12
a、将Hib粗多糖溶于体积浓度为30%(v/v)的乙基苯基聚乙二醇水溶液（pH为6.7）中，使Hib粗多糖的最终浓度为5mg/mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液；
b、在步骤a所得粗糖溶解液中添加(NH4)2SO4使其质量浓度为50%(w/v)，搅拌30分钟后，在10000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复1次，收集下层溶液；
c、在步骤b所得下层溶液中添加乙基苯基聚乙二醇，使其体积浓度为30%(v/v)，再搅拌60分钟后，在10000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复3次，收集下层溶液；
d、在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为10%（v/v），搅拌40分钟后，在10000rpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复3次，收集下层溶液；
e、将步骤d所得下层溶液用生理盐水稀释至所含荚膜多糖的浓度为4000mg/L，再用100KD膜包进行超滤3次，所得浓缩液体即为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液。
实施例1～12制备的各b型流感嗜血杆菌荚膜多糖按照2010版中国药典要求，对其质量指标进行检测，其结果如下表：
表1 本发明制备的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的质量指标检测结果
由上表可知，本发明制备的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖各项指标均符合药典要求，且纯度高，与现有技术相比，避免了苯酚的使用，并能同时去除杂蛋白及氯化血红素对荚膜多糖的干扰。
Claims (4)
1.一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于：所述制备方法能同时去除杂蛋白及氯化血红素对荚膜多糖的干扰，所述制备方法包括以下步骤：
a、将Hib粗多糖溶于体积浓度为1～30%的曲拉通X-100水溶液、曲拉通X-114水溶液、吐温-80水溶液或乙基苯基聚乙二醇水溶液中，使Hib粗多糖的最终浓度为5～30mg/mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液；
b、在步骤a所得粗糖溶解液中添加(NH4)2SO4使其质量浓度为20%至饱和，搅拌20～30分钟后，在8000～10000rpm下进行离心分离20～40分钟，取下层溶液；
c、在步骤b所得下层溶液中添加曲拉通X-100、曲拉通X-114、吐温-80或乙基苯基聚乙二醇，使其体积浓度为3～30%，再搅拌30～60分钟后，在8000～10000rpm下进行离心分离20～40分钟，取下层溶液；
d、在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为2～20%，搅拌20～40分钟后，在8000～10000rpm下进行离心分离20～40分钟，取下层溶液；
e、将步骤d所得下层溶液用生理盐水稀释至所含荚膜多糖的浓度为10～4000mg/L，再用100KD膜包进行超滤，所得浓缩液体即为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液。
2.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤a中曲拉通X-100水溶液、曲拉通X-114水溶液、吐温-80水溶液、乙基苯基聚乙二醇水溶液的pH为5.5～7.5。
3.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤b、c、d均分别重复1～3次，收集下层溶液后再继续下一步骤。
4.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤e中的超滤重复3～5次。
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| "细菌荚膜多糖的分离纯化研究进展";赵海平等;《微生物学免疫学进展》;20120420;第40卷(第2期);第72-77页 * |
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