CN103275238B - 一种去除a、c群脑膜炎球菌荚膜多糖中蛋白质杂质的新方法 - Google Patents
一种去除a、c群脑膜炎球菌荚膜多糖中蛋白质杂质的新方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种去除A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖中蛋白质杂质的新方法。本发明利用离子型去垢剂脱氧胆酸钠在酸性pH条件下具有形成胶团并吸附沉淀蛋白质的特性分离荚膜多糖与蛋白质，运用本发明生产的精制多糖均符合药典要求，多糖回收率与传统冷酚抽提法相近，且具有操作简单、生产成本低、对生产人员和环境没有危害、更适合大规模生产的特性。
Description
技术领域
本发明涉及去除脑膜炎球菌荚膜多糖中蛋白质杂质的方法技术领域，特别是一种去除A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖中蛋白质杂质的新方法。
背景技术
脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis，Nm)是脑膜炎和爆发性败血症的首要致病菌，流行性脑脊髓膜炎(以下简称为流脑)的发病常呈散发性，各病例之间并无明显关联，通常以小规模方式爆发，在一些地区可转变为灾难性的、难以预料的地方性流行病。全球每年流脑发病人数约为50万，死亡5万。Nm为需氧菌，革兰染色阴性，有荚膜，一般成对出现(双球菌)。Nm根据荚膜多糖的化学组成可将其分成l3个血清群，根据外膜蛋白(Outermem—braneprotein，OMP)PorB和P0rA的抗原性差异，又可分成不同的血清型和血清亚型。A、B、C、Y和W135群脑膜炎球菌是主要的致病血清群，且血清群分布有显著的地理差异。
在我国90%以上的流脑病例是由A群脑膜炎奈瑟氏菌引起的。从1984年起全国各地连年给儿童注射了大量的A群荚膜多糖疫苗以后，流脑的流行得到了控制。但近年来，B群和C群，尤其是C群病例在我国开始增加，目前我国预防流脑的重点以A群和C群为主。
研究表明，A群C群脑膜炎球菌的荚膜多糖具有良好的免疫原性，提取荚膜多糖可直接制备成疫苗，经注射免疫后的人群可以获得免疫保护。A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖制备的过程中，目前普遍运用的制备方法是：利用液体发酵的方法制备菌液，杀菌后再经CDAP沉淀、乙醇沉淀、冷酚抽提、无水乙醇和丙酮洗涤等步骤获得A群C群脑膜炎球菌荚膜多糖。在荚膜多糖精制纯化过程中，去除蛋白质杂质是很重要的一步，目前常用的方法有冷酚抽提和蛋白酶酶解后超滤，其中蛋白酶酶解后超滤是最有效的，但由于成本较高，不能应用于大规模生产，因此冷酚抽提成为了生产规模精制纯化荚膜多糖去蛋白的主要方法。但是冷酚抽提法，需要使用大量的苯酚，对人体和环境的危害很大。苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能，苯酚对环境有严重危害，对水体和大气可造成污染。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种去除A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖中蛋白质杂质的新方法，该方法具有操作简单、生产成本低、对生产人员和环境没有危害、更适合大规模生产的特性。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种去除A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖中蛋白质杂质的新方法，它包括以下步骤：
S1.将粗制A群或C群流行性脑脊髓膜炎荚膜多糖用注射用水溶解，稀释成5～10mg/ml的多糖溶液，加入2%、PH8.0的脱氧胆酸钠溶液，体积比为0.5～1.5:1，混匀，于2～6℃下搅拌0.5～1.5h；
S2.用1mol/L盐酸将PH调节至2～3，于2～6℃搅拌3～7min，然后8000rpm离心1.5～2.5h；
S3.取上清，用1mol/L氢氧化钠调PH至7，重复步骤S1、S2一次；
S4.取上清，用1mol/L氢氧化钠调PH至7，加注射用水稀释5～15倍，经250～350kd超滤膜超滤至原体积，重复稀释、超滤浓缩2～5次，最后一次超滤浓缩至原体积的1/3。
本发明具有以下优点：本发明利用离子型去垢剂脱氧胆酸钠在酸性pH条件下具有形成胶团并吸附沉淀蛋白质的特性分离荚膜多糖与蛋白质，运用本发明生产的精制多糖均符合药典要求，多糖回收率与传统冷酚抽提法相近，且具有操作简单、生产成本低、对生产人员和环境没有危害、更适合大规模生产的特性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
实施例1：去除A群脑膜炎球菌荚膜多糖中蛋白质杂质的新方法，它包括以下步骤：
S1.将粗制A群流行性脑脊髓膜炎荚膜多糖500mg用注射用水溶解，稀释成5mg/ml的多糖溶液，加入2%、PH8.0的脱氧胆酸钠溶液，体积比为0.5:1，混匀，于2℃下搅拌0.5h；
S2.用1mol/L盐酸将PH调节至2，于2℃搅拌3min，然后8000rpm离心1.5h；
S3.取上清，用1mol/L氢氧化钠调PH至7，重复步骤S1、S2一次；
S4.取上清，用1mol/L氢氧化钠调PH至7，加注射用水稀释5倍，经250kd超滤膜超滤至原体积，重复稀释、超滤浓缩2次，最后一次超滤浓缩至原体积的1/3。
实施例2：去除A群脑膜炎球菌荚膜多糖中蛋白质杂质的新方法，它包括以下步骤：
S1.将粗制A群流行性脑脊髓膜炎荚膜多糖700mg用注射用水溶解，稀释成10mg/ml的多糖溶液，加入2%、PH8.0的脱氧胆酸钠溶液，体积比为1.5:1，混匀，于6℃下搅拌1.5h；
S2.用1mol/L盐酸将PH调节至3，于6℃搅拌7min，然后8000rpm离心1.5～2.5h；
S3.取上清，用1mol/L氢氧化钠调PH至7，重复步骤S1、S2一次；
S4.取上清，用1mol/L氢氧化钠调PH至7，加注射用水稀释15倍，经350kd超滤膜超滤至原体积，重复稀释、超滤浓缩5次，最后一次超滤浓缩至原体积的1/3。
实施例3：去除A群脑膜炎球菌荚膜多糖中蛋白质杂质的新方法，它包括以下步骤：
S1.将粗制A群流行性脑脊髓膜炎荚膜多糖1000mg用注射用水溶解，稀释成8mg/ml的多糖溶液，加入2%、PH8.0的脱氧胆酸钠溶液，体积比为1:1，混匀，于4℃下搅拌1h；
S2.用1mol/L盐酸将PH调节至2，于4℃搅拌5min，然后8000rpm离心2h；
S3.取上清，用1mol/L氢氧化钠调PH至7，重复步骤S1、S2一次；
S4.取上清，用1mol/L氢氧化钠调PH至7，加注射用水稀释10倍，经300kd超滤膜超滤至原体积，重复稀释、超滤浓缩3次，最后一次超滤浓缩至原体积的1/3。
实施例4：去除C群脑膜炎球菌荚膜多糖中蛋白质杂质的新方法，它包括以下步骤：
S1.将粗制C群脑膜炎球菌荚膜多糖500mg用注射用水溶解，稀释成10mg/ml的多糖溶液，加入2%、PH8.0的脱氧胆酸钠溶液，体积比为1.5:1，混匀，于6℃下搅拌1.5h；
S2.用1mol/L盐酸将PH调节至3，于6℃搅拌7min，然后8000rpm离心2.5h；
S3.取上清，用1mol/L氢氧化钠调PH至7，重复步骤S1、S2一次；
S4.取上清，用1mol/L氢氧化钠调PH至7，加注射用水稀释15倍，经350kd超滤膜超滤至原体积，重复稀释、超滤浓缩5次，最后一次超滤浓缩至原体积的1/3。
实施例5：去除C群脑膜炎球菌荚膜多糖中蛋白质杂质的新方法，它包括以下步骤：
S1.将粗制C群脑膜炎球菌荚膜多糖700mg用注射用水溶解，稀释成5mg/ml的多糖溶液，加入2%、PH8.0的脱氧胆酸钠溶液，体积比为0.5:1，混匀，于2℃下搅拌0.5h；
S2.用1mol/L盐酸将PH调节至2，于2℃搅拌3min，然后8000rpm离心1.5h；
S3.取上清，用1mol/L氢氧化钠调PH至7，重复步骤S1、S2一次；
S4.取上清，用1mol/L氢氧化钠调PH至7，加注射用水稀释5倍，经250kd超滤膜超滤至原体积，重复稀释、超滤浓缩2次，最后一次超滤浓缩至原体积的1/3。
实施例6：去除C群脑膜炎球菌荚膜多糖中蛋白质杂质的新方法，它包括以下步骤：
S1.将粗制C群脑膜炎球菌荚膜多糖1000mg用注射用水溶解，稀释成7mg/ml的多糖溶液，加入2%、PH8.0的脱氧胆酸钠溶液，体积比为0.8:1，混匀，于5℃下搅拌1h；
S2.用1mol/L盐酸将PH调节至2，于3℃搅拌6min，然后8000rpm离心2h；
S3.取上清，用1mol/L氢氧化钠调PH至7，重复步骤S1、S2一次；
S4.取上清，用1mol/L氢氧化钠调PH至7，加注射用水稀释12倍，经320kd超滤膜超滤至原体积，重复稀释、超滤浓缩4次，最后一次超滤浓缩至原体积的1/3。
实施例7：取上述实施例样品，进行检测并计算回收率，其中，A群流行性脑脊髓膜炎荚膜精糖检测固体总量、磷含量、O-乙酰基含量、蛋白质含量、核酸含量、内毒素；C群流行性脑脊髓膜炎荚膜精糖检测固体总量、唾液酸含量、O-乙酰基含量、蛋白质含量、核酸含量、内毒素，结果见表1、表2。
表1
由表1可见，制得的三批A群精制多糖回收率分别为57.2%、54.4%、53.9%，与传统冷酚法去蛋白相比，多糖回收率相近，且各项指标均符合药典要求。
表2
由表2可见，制得的三批C群精制多糖回收率分别为47.6%、47.7%、51.6%，与传统冷酚法去蛋白相比，多糖回收率相近，且各项指标均符合药典要求。
Claims (1)
1.一种去除A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖中蛋白质杂质的方法，利用离子型去垢剂脱氧胆酸钠在酸性pH条件下具有形成胶团并吸附沉淀蛋白质的特性分离荚膜多糖与蛋白质，其特征在于，它包括以下步骤：
S1. 将粗制A群或C群流行性脑脊髓膜炎荚膜多糖用注射用水溶解，稀释成5～10 mg/ml的多糖溶液，加入2%、pH 8.0的脱氧胆酸钠溶液，体积比为0.5～1.5:1，混匀，于2～6℃下搅拌0.5～1.5h；
S2. 用1mol/L盐酸将pH调节至2～3，于2～6℃搅拌3～7min，然后8000rpm离心1.5～2.5h；
S3. 取上清，用1mol/L氢氧化钠调pH至7，重复步骤S1、S2一次；
S4. 取上清，用1mol/L氢氧化钠调pH至7，加注射用水稀释5～15倍，经250～350kd超滤膜超滤至原体积，重复稀释、超滤浓缩2～5次，最后一次超滤浓缩至原体积的1/3。
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