CN105056221A - 利用a群脑膜炎球菌精糖制备多糖-adh衍生物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的是利用A群脑膜炎球菌精糖制备多糖-ADH衍生物的方法。本发明包括以下步骤：（1）采用脑膜炎球菌精糖与注射用水混合配制成多糖溶液，并调节pH至9.0；（2）将CDAP用乙腈溶解成CDAP溶液；然后按多糖：CDAP=1：0.4～0.6的重量比例，往多糖溶液中加入CDAP溶液，室温搅拌2～5分钟制成CDAP混合液；（3）将ADH用0.2mol/L的NaHCO3溶解成浓度为100mg/ml的ADH溶液，按多糖：ADH=1：3～5的重量比例，往CDAP混合液中加入ADH溶液，室温搅拌1小时；（4）最后再用超滤膜包进行过滤、冷冻干燥即可。本发明具有环保、安全、衍生效果佳等优点。

Description

利用A群脑膜炎球菌精糖制备多糖-ADH衍生物的方法
技术领域
本发明涉及一种多糖-ADH衍生物的制备方法，具体涉及的是利用A群脑膜炎球菌精糖制备多糖-ADH衍生物的方法。
背景技术
流行性脑脊髓膜炎(简称流脑，下同)是一种由奈瑟氏脑膜炎球菌(Neisseriameningitidis)引起的急性呼吸道传染病。一百多年来，一直在世界各地流行或散在发生，感染病原菌后可引起败血症、脑膜炎。易感人群主要为儿童，以暴发型病死率最高，可达40%～60%。当今世界各大洲发病率在1/10万～10/10万，总病死率在5%～15%，高达20%的脑膜炎患者会有神经系统后遗症，包括智力受损和耳聋等。根据荚膜多糖型别进行血清学分类可分13个血清型，其中A群、B群、C群约占流行菌群的90%。A群脑膜炎球菌是较大流行的主要致病血清群，特别是在所谓的非洲“流脑流行带”，每隔7-14年就会出现一次较大流行。
我国于1938年、1949年、1959年、1967年和1977年曾发生过5次全国性流脑流行；其中以1967年春季流行最为严重，发病率高达403/10万，病死率为5.49%。我国过去90%以上的病例是A群病菌致病，现在B群或C群病菌有时亦引起流脑暴发。2003年开始，C群流脑的发病率明显上升。目前A群和C群共占所有血清群的50%以上，且C群仍有进一步增高的趋势。因此，目前我国预防流脑工作的重点是以预防A群和C群为主。
目前预防流行性脑脊髓膜炎最有效的方法是接种疫苗。研究表明，A群C群脑膜炎球菌的荚膜多糖具有良好的免疫原性，提取荚膜多糖可直接制备成疫苗，经注射免疫后的人群可以获得免疫保护。我国从2007年起已将流脑疫苗纳入国家免疫规划，在全国范围对适龄儿童普及接种。目前纳入国家免疫计划的流脑多糖疫苗包括A群脑膜炎球菌多糖疫苗，A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗。
目前，国产的所有已经上市的结合疫苗（如b型流感嗜血杆菌结合疫苗、A群C群脑膜炎球菌结合疫苗）全部采用同一种化学结合方法制备而成，即用溴化氰（CNBr）活化多糖的邻位羟基，活化后的多糖与己二酰肼（ADH）反应生成多糖-ADH衍生物。然后在碳二亚胺（EDAC）的催化作用下，多糖-ADH衍生物与载体蛋白共价结合。该工艺有个很大的缺点是在多糖的活化过程中会使用到溴化氰。溴化氰为极毒而且性质活泼的物质，受热、遇水放出剧毒气体如氰化氢和氰化氢，遇酸易引起爆炸。溴化氰的毒性作用类似氢氰酸，对眼睛和皮肤有強烈刺激性。对人来说，在极低的浓度下，就能刺激眼、咽喉而催泪、咳嗽；在0.05mg/L（20PPM）的浓度下1分钟也忍耐不了；如果在120mg/m3条件下，接触30分钟后即死亡。在第一次世界大战期间，溴化氢曾作为澳大利亚军队使用的毒气。
随着对环保意识的增强，以及对工人工作环境状况的重视，人们一直在寻找合适的方法来避免在疫苗制造过程中使用溴化氰这类的剧毒化学试剂。使用现代的技术对传统的生产工艺进行改进以减少或弃用有毒化学试剂对于保护人类健康以及减少环境污染都具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中在疫苗制造过程中使用溴化氰这类的剧毒化学试剂导致不利于保护人类健康以及环境的问题，提供一种解决上述问题的利用A群脑膜炎球菌精糖制备多糖-ADH衍生物的方法。
为解决上述缺点，本发明的技术方案如下：
利用A群脑膜炎球菌精糖制备多糖-ADH衍生物的方法，包括以下步骤：
（1）称取脑膜炎球菌精糖溶解于注射用水中，配制成浓度为5mg/ml的多糖溶液，并调节pH至9.0；
（2）将CDAP用乙腈溶解成浓度为100mg/ml的CDAP溶液；然后按多糖：CDAP=1：0.4～0.6的重量比例，往多糖溶液中加入CDAP溶液，室温搅拌2～5分钟制成CDAP混合液；
（3）将ADH用0.2mol/L的NaHCO3溶解成浓度为100mg/ml的ADH溶液，按多糖：ADH=1：3～5的重量比例，往CDAP混合液中加入ADH溶液，室温搅拌1小时；
（4）最后再用超滤膜包进行过滤，过滤得到的固体经过冷冻干燥即制成多糖-ADH衍生物。
本发明中采用的所有化学物质均是无毒的物质，进而有效保证了人类健康，并且避免了环境的污染。
本发明的方法优化了各化学物质加入反应时的比例和浓度，有效提高了ADH衍生率，衍生效果更佳。
优选地，所述步骤（1）中pH采用氢氧化钠进行调节。
优选地，所述步骤（3）中超滤膜包过滤时所用超滤液由浓度为0.05mol/L的氯化钠溶液组成。
为了达到最高的衍生率，使衍生效果最佳，所述步骤（2）中的多糖与CDAP的重量比为1：0.5；所述步骤（3）中的多糖与ADH的重量比为1：3.5。
本发明中，CDAP即为1-氰基-2甲胺基吡啶四氟硼酸酯；ADH即为己二酰肼；CTAB即为十六烷基三甲基溴化铵。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
1、本发明中采用的所有化学物质均是无毒的物质，进而有效保证了人类健康，并且避免了环境的污染；
2、本发明的方法优化了各化学物质加入反应时的比例和浓度，有效提高了ADH衍生率，衍生效果更佳。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
利用A群脑膜炎球菌精糖制备多糖-ADH衍生物的方法，包括以下步骤：
（1）称取脑膜炎球菌精糖溶解于注射用水中，配制成浓度为5mg/ml的多糖溶液，并采用氢氧化钠调节pH至9.0；
（2）将CDAP用乙腈溶解成浓度为100mg/ml的CDAP溶液；然后按多糖：CDAP=1：0.5的重量比例，往多糖溶液中加入CDAP溶液，室温搅拌2～5分钟制成CDAP混合液；
（3）将ADH用0.2mol/L的NaHCO3溶解成浓度为100mg/ml的ADH溶液，按多糖：ADH=1：3.5的重量比例，往CDAP混合液中加入ADH溶液，室温搅拌1小时；
（4）最后再用超滤膜包进行过滤，超滤膜包过滤时所用超滤液由浓度为0.05mol/L的氯化钠溶液组成；过滤得到的固体经过冷冻干燥即制成多糖-ADH衍生物。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅仅在于，本实施例中所述步骤（2）中的多糖与CDAP的重量比为1：0.6；所述步骤（3）中的多糖与ADH的重量比为1：4。
实施例3
本实施例与实施例1的区别仅仅在于，本实施例中各化学物质加入反应时的比例和浓度，具体设置如下：
步骤（1）中多糖溶液的浓度为10mg/ml，并采用氢氧化钠调节pH至9.0；
步骤（2）中CDAP溶液的浓度为80mg/ml，多糖：CDAP=1：0.7；
步骤（3）中ADH溶液的浓度为80mg/ml的ADH溶液，多糖：ADH=1：5。
实施例4
本实施例为本发明的对照实施例，具体过程如下：
将溴化氰用乙腈溶解成100mg/ml的溶液。将A群脑膜炎球菌精糖溶解于注射用水中，配制成浓度为5mg/ml的溶液，调节pH至9.0。按多糖：溴化氰=1：0.5（w/w）的比例加入溴化氰溶液。维持温度23±3℃，pH10.8±0.2反应30分钟进行活化。活化完成后，按多糖：己二酰肼=1：3.5（w/w）的比例加入己二酰肼溶液。维持温度23±3℃，pH8.5±0.2反应15分钟进行衍生。反应结束后，用0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除溴化氰，即为多糖-ADH衍生物对照品。
对实施例1～4取样三次，检测ADH衍生率，检测结果如表1所示。
表1
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但凡采用本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化，均应属于本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.利用A群脑膜炎球菌精糖制备多糖-ADH衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）称取脑膜炎球菌精糖溶解于注射用水中，配制成浓度为5mg/ml的多糖溶液，并调节pH至9.0；
（2）将CDAP用乙腈溶解成浓度为100mg/ml的CDAP溶液；然后按多糖：CDAP=1：0.4～0.6的重量比例，往多糖溶液中加入CDAP溶液，室温搅拌2～5分钟制成CDAP混合液；
（3）将ADH用0.2mol/L的NaHCO3溶解成浓度为100mg/ml的ADH溶液，按多糖：ADH=1：3～5的重量比例，往CDAP混合液中加入ADH溶液，室温搅拌1小时；
（4）最后再用超滤膜包进行过滤，过滤得到的固体经过冷冻干燥即制成多糖-ADH衍生物。
2.根据权利要求1所述的利用A群脑膜炎球菌精糖制备多糖-ADH衍生物的方法，其特征在于，所述步骤（1）中pH采用氢氧化钠进行调节。
3.根据权利要求1所述的利用A群脑膜炎球菌精糖制备多糖-ADH衍生物的方法，其特征在于，所述步骤（3）中超滤膜包过滤时所用超滤液由浓度为0.05mol/L的氯化钠溶液组成。
4.根据权利要求1所述的利用A群脑膜炎球菌精糖制备多糖-ADH衍生物的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的多糖与CDAP的重量比为1：0.5；所述步骤（3）中的多糖与ADH的重量比为1：3.5。
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