CN103623404B - 一种b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的制备方法，制备方法为:A.B型流感嗜血杆菌的多糖提取物，室温下用超纯水或注射用水溶解PRP多糖至20mg/ml，按照PRP与CDAP的质量比为1的条件下加入CDAP，维持1.5min。0.3M NaOH调节pH至9.5，维持3min。按照ADH与PRP多糖质量比为4：1的条件，加入固体ADH。0.3M NaOH调节pH至9.5，维持1h。2‑8℃，0.2M NaCl透析；B.透析后的PRP‑AH与20mg/ml TT溶液以质量比1：2混合。0.1M HCL调节pH至5.0，然后按照EDAC与PRP质量比为10：1的比例加入固体EDAC，室温下维持pH5.060min，0.3M NaOH调节pH至7.5反应30min。
Description
技术领域
本发明涉及一种疫苗的制备方法，特别涉及一种B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的制备方法。
背景技术
B型流感嗜血杆菌(Hib)是流感嗜血杆菌中具极强侵袭力的一种，在流感嗜血杆菌引起的严重感染中，几乎90%是由B型引起的，主要引起脑膜炎、肺炎、心包炎、关节炎、菌血症、会厌炎等疾病，该病使15%至35%的存活者患有终身残疾，典型的病症有精神发育迟滞或耳聋。B型流感嗜血杆菌引起的脑膜炎、肺炎是导致婴幼儿死亡的主要原因。
多年流行病学研究表明，使用Hib疫苗是控制Hib侵袭性疾病的有效措施。因此研发效果好、成本低的Hib疫苗是必要的，也是重要的。
国内已经上市的B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗,系用纯化的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖与破伤风类毒素共价结合而成。随着大量的结合疫苗使用以及基础免疫中百白破的使用，目前以TT作为载体存在一些明显的劣势。目前国际市场上存在的Hib结合疫苗主要有三种载体蛋白，TT、DT、CRM197以及OMP。
现有Hib结合疫苗的生产技术，主要包括菌种的选育培养，荚膜多糖的提取分离纯化，载体蛋白的培养、分离纯化，荚膜多糖和载体蛋白的结合，以及疫苗的分离纯化等步骤，其中关键步骤存在工艺复杂，成本高，质量不稳定等缺陷。
本发明设计了不含动物源、有利于嗜血杆菌生长和PRP分泌的新培养基，此培养基完全不同于此前大家普遍采用的动物源BHI培养基。
本发明提出了新的PRP提取途径的荚膜多糖提取方法，此工艺的优点为处理量大，流程简单，回收率高，而且对内毒素也有部分去除能力。
本发明载体蛋白纯化工艺解决了蛋白纯化回收率低，蛋白纯化过程中活性丧失以及蛋白降解等困难，实现了高纯度（达90%以上），短流程。
本发明公开使用CDAP活化PRP，并连接CRM197蛋白或TT蛋白的方法。
发明内容
本发明提供一种B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的制备方法，该方法包括：菌种的选育培养，荚膜多糖的提取分离纯化，载体蛋白的培养、分离纯化，荚膜多糖和载体蛋白的结合，以及疫苗的分离纯化的步骤。
本发明在于提供以下制备方法：
1）B型流感嗜血杆菌的培养（购买至ATCC）；
2）B型流感嗜血杆菌的多糖提取物即PRP的提取；
3）取PRP用水溶解，不断搅拌加入适量CDAP，维持1-3min；加NaOH调节
pH至8-11，维持1-5min；加入CRM197，加NaOH调节pH至8-11，反应；
4）分离纯化得B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗原液。
其中，优选的步骤3)为：取PRP用水溶解，不断搅拌加入适量CDAP，维持1-2min；NaOH调节pH至9-10，维持2-4min；加入CRM197，加NaOH调节pH至9-10，反应；特别优选的步骤3)为：PRP用超纯水溶解至25mg/ml，不断搅拌加入CDAP，其中PRP与CDAP的重量比为1:1.25，维持1.5min；0.3M NaOH调节pH至9.5，维持3min；加入CRM197，加0.3M NaOH调节pH至9.5，反应；利用4FF凝胶色谱柱进行纯化，收集Vo附近液体，得B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗。
本发明也包括，其中步骤3中的CRM197蛋白可用TT蛋白代替，具体工艺如下:
A.取B型流感嗜血杆菌的多糖提取物即PRP，室温下用超纯水或注射用水溶解PRP多糖至20mg/ml，不断搅拌的情况下按照PRP与CDAP的质量比为1的条件下加入CDAP，维持1.5min；0.3M NaOH调节pH至9.5，维持3min；按照ADH与PRP多糖质量比为4：1的条件，加入固体ADH。0.3M NaOH调节pH至9.5，维持1h；2-8℃，0.2M NaCl透析；
B.透析后的PRP-AH与20mg/ml TT溶液以质量比1：2混合；0.1M HCL调节pH至5.0，然后按照EDAC与PRP质量比为10：1的比例加入固体EDAC，室温下维持pH5.060min，0.3MNaOH调节pH至7.5反应30min；利用4FF凝胶色谱柱进行纯化。
其中，步骤b)中PRP多糖的制备方法如下：
A,提取PRP粗糖：1）B型流感嗜血杆菌培养液离心去除菌体沉淀，收集上清；2）上清过中空纤维，收获滤过液；3）中空纤维滤过液用50KDa的膜包超滤浓缩；4）膜包浓缩液进行分级醇沉：a.低浓度醇沉：顺序加入以下物质，每100ml加入0.5-0.7g NaCl，加入无水乙醇使得终浓度为20-30%，同时按每100ml加入2M 0.5-1.5ml CaCl2比例加入CaCl2.醇沉过夜后离心，收集上清；高浓度乙醇醇沉：低浓度醇沉的上清中加入乙醇，终浓度为70-90%，醇沉过夜后离心，收集沉淀；c.0.2M NaCl复溶70-90%乙醇醇沉的沉淀；5）复溶液过0.45um的滤膜后上样，用4FF柱子进行进一步的分离；6）按照KD=0.55的原则收集洗脱液，脱盐，冻干即得；
B,提取PRP精糖：1）用乙酸钠溶解步骤A中得到的PRP多糖，浓度为5mg/ml或10mg/ml；2）加入等体积的苯酚，混匀数次，低温过夜；3）离心收集上层水相；4）再次加入等体积的苯酚，之后重复进行步骤2-3，连续抽提三次，透析，冻干即得PRP多糖。
优选的，PRP多糖的制备方法如下：
A,提取PRP粗糖：1）B型流感嗜血杆菌培养液8000rpm 10min去除菌体沉淀，收集上清；2）上清过0.22um的中空纤维，收获滤过液；3）中空纤维滤过液用50KDa的膜包超滤浓缩；4）膜包浓缩液进行分级醇沉：a.25%低浓度醇沉：顺序加入以下物质，每100ml加入0.616gNaCl，加入无水乙醇使得终浓度为25%，同时按每100ml加入1ml2M CaCl2比例加入CaCl 2.醇沉过夜后8000rpm离心20min，收集上清；b.80%高浓度乙醇醇沉：低浓度醇沉的上清中加入乙醇，终浓度为80%，醇沉过夜后8000rpm离心20min，收集沉淀；c.0.2M NaCl复溶80%乙醇醇沉的沉淀；5）复溶液过0.45um的滤膜后上样，用4FF柱子进行进一步的分离；6）按照KD=0.55的原则收集洗脱液，脱盐，冻干即得；
B,提取PRP精糖：1）用10%乙酸钠溶解步骤A中得到的PRP多糖，浓度为5mg/ml或10mg/ml；2）加入等体积的苯酚，混匀数次，4摄氏度过夜；3）12000rpm离心20min，收集上层水相；4）再次加入等体积的苯酚，之后重复进行步骤2-3，连续抽提三次，透析，冻干即得PRP多糖。
其中步骤a)中用于提取PRP的B型流感嗜血杆菌用如下方式获得的：
培养基配方为，每升培养液中含有如下成分：
培养方式为：35-40℃振荡培养，进入对数生长期后每隔1-3h用NaOH调节PH
到7-8，共培养24小时，培养结束后杀菌即得。
优选的培养基配方为，每升培养液中含有如下成分：
培养方式为：37摄氏度150rpm振荡培养，进入对数生长期后每隔2h用NaOH调节PH到7.4，共培养24小时，培养结束后用0.6%甲醛杀菌即得。
其中步骤d)中所得的疫苗原液经含NaCl的水溶液稀释，同时加入PB缓冲液、tween-80以及磷酸铝佐剂，至PRP终浓度为20ug/ml，NaCl终浓度为0.9%，磷酸铝终浓度为2.5mg/ml，PB终浓度为10mM，tween-80终浓度为0.01%时，分装得到B型流感嗜血杆菌多糖蛋白结合疫苗。
本发明还包括，CRM197的制备方法，具体步骤如下：
1）采用天然棒状白喉杆菌（Corynebacterium diphtheriae）进行发酵培养；
2）发酵液通过连续流或者杯式离心机离心后，过中空纤维进行进澄清处理；
3）经过澄清之后的发酵液用10kDa超滤膜进行超滤浓缩；
4）超滤浓缩液采用20-50%饱和硫酸铵进行第一次盐析，离心去除沉淀后用60-85%饱和硫酸铵对上清液进行第二次盐析，然后复溶；
5）复溶液经离子交换捕获CRM197蛋白，过程为，复溶液经10-50M PB缓冲液超滤换液至Cond 10.0-2.0，pH调节至7.0-8.0上样，色谱填料选自：Toyopearl DEAE-650S、DEAE.Fratogel EMD、Q.Sepharose.FF、CaptoQ Seharose.FF；洗脱液为:10mM-100M PB+0.5M KC；25%B一步洗脱；
6）捕获后的蛋白经疏水分离进行进一步纯化，分离纯化过程为：疏水填料为Butyl-650S Toyopearl、Phenyl Sepharose highsub，平衡缓冲液为10～50mM PB，pH 7.0，1.5M硫酸铵；洗脱缓冲液为10～100mMPB，pH 7.0～7.6；洗脱缓冲液为10～50mM PB，pH7.0，洗脱方式为一步洗脱，先用预洗缓冲液洗脱杂蛋白以后，再用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，其中预洗缓冲液为50mM PB，PH 7.0，1.05M硫酸铵；
7）浓缩至所需浓度保存。
本发明从美国模式培养物集存库（ATCC）获得菌株B型流感嗜血杆菌（Hib），经过进行筛选培养，并建立了生产用三级种子库，每级种子都进行了革兰氏染色、血清凝集、生化反应实验。其中选用的菌种ATCC编号为31441、31512、53763、51654或10211。
本发明筛选符合疫苗生产条件的能够大量产生CRM197蛋白的菌株（天然棒状白喉杆菌，来自ATCC单位），确立了该菌株三级种子库的建库方法，建立了 疫苗生产三级种子库；并采用以下方法培养菌种，培养基的配方如下:
CY培养基主要成分(Perliter)
生长因子母液的成分(Per liter)
氨基酸的成分(Per liter)
调节pH值至7.4,其中每升培养基加入生长因子的母液1mL,麦芽糖25g,葡萄糖15g(麦芽糖和葡萄糖配制成50%的溶液，115℃,灭菌15min)，培养方式：35度，150rpm振荡培养。
本发明经过工艺改进，得到一种由b型流感嗜血杆菌荚膜多糖与CRM197蛋白共价结合而成B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗，经过实验发现，该疫苗效果优良。
PRP-CRM197结合疫苗的有效性实验
1，实验方案
2，免疫方式
腹腔注射
间隔两周免疫一次
免疫一周后摘眼球取血
采血时间为7天，21天，35天
3，免疫剂量
CRM1977.5ug/0.5ml（样品为15ug/ml）
PRP 2.5ug/0.5ml（样品为5ug/ml）
PRP-CRM1972.5ug/0.5ml（样品为5ug/ml）
4，抗体测定方法
ELISA
5，检测结果
HiB结合疫苗动物实验阳性率统计
ELISA检测动物免疫血清，根据空白对照所确定的CUT OFF值来确定阳性结果的下限，统计免疫后的阳性率，结果如下：
免疫强度分析
实验统计检测的结果，分支表示如下：
统计学分析
三针之间的相互比较
PRP-CRM197：P＜0.05，即三针质检具有免疫增强效果
CRM197：P＜0.05，即三针质检具有免疫增强效果
PRP：P＞0.05，即三针质检没有免疫增强效果
PRP-CRM197和PRP比较：P＜0.05，即PRP-CRM197的免疫效果明显强于PRP从上表中可以看出PRP-CRM197具有明显增强免疫效果的作用，且具有明显的免疫记忆效应，且PRP-CRM197的效果明显好于PRP。
附图说明
图1，Hib菌库建立即鉴定工艺流程
图2，Hib的生长曲线
图3，粗糖提取工艺
图4，精糖提取工艺
图5，Hib荚膜多糖色谱图
图6，CRM197菌库的建立及鉴定流程
图7，CRM197生长曲线和pH变化曲线
图8，CRM197纯化工艺流程图
图9，CRM197电泳图
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1，
疫苗的制备
1,B型流感嗜血杆菌的培养；
培养基配方为，每升培养液中含有如下成分：
培养方式为：37摄氏度150rpm振荡培养，进入对数生长期后每隔2h用NaOH调节PH到7.4，共培养24小时，培养结束后用0.6%甲醛杀菌即得。
2,B型流感嗜血杆菌的多糖提取物的提取；
A,提取PRP粗糖：1）B型流感嗜血杆菌培养液8000rpm 10min去除菌体沉淀，收集上清；2）上清过0.22um的中空纤维，收获滤过液；3）中空纤维滤过液用50KDa的膜包超滤浓缩；4）膜包浓缩液进行分级醇沉：a.25%低浓度醇沉：顺序加入以下物质，每100ml加入0.616gNaCl，加入无水乙醇使得终浓度为25%，同时按每100ml加入1ml2M CaCl2比例加入CaCl2.醇沉过夜后8000rpm离心20min，收集上清；b.80%高浓度乙醇醇沉：低浓度醇沉的上清中加入乙醇，终浓度为80%，醇沉过夜后8000rpm离心20min，收集沉淀；c.0.2M NaCl复溶80%乙醇醇沉的沉淀；5）复溶液过0.45um的滤膜后上样，用4FF柱子进行进一步的分离；6）按照KD=0.55的原则收集洗脱液，脱盐，冻干即得；
B,提取PRP精糖：1）用10%乙酸钠溶解步骤A中得到的PRP多糖，浓度为5mg/ml或10mg/ml；2）加入等体积的苯酚，混匀数次，4摄氏度过夜；3）12000rpm离心20min，收集上层水相；4）再次加入等体积的苯酚，之后重复进行步骤2-3，连续抽提三次，透析，冻干即得PRP多糖。
3,结合疫苗的制备
PRP用超纯水溶解至25mg/ml，不断搅拌加入CDAP，其中PRP与CDAP的重量比为1:1.25，维持1.5min；0.3M NaOH调节pH至9.5，维持3min；加入CRM197，加0.3M NaOH调节pH至9.5，反应；利用4FF凝胶色谱柱进行纯化，收集Vo附近液体，得B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗原液，所得的疫苗原液经含NaCl的水溶液稀释，同时加入PB缓冲液、tween-80以及磷酸铝佐剂，至PRP终浓度为20ug/ml，NaCl终浓度为0.9%，磷酸铝终浓度为2.5mg/ml，PB终浓度为10mM，tween-80终浓度为0.01%时，分装得到B型流感嗜血杆菌多糖蛋白结合疫苗。
实施例2，
与实施例1的方法相同，但在B型流感嗜血杆菌的培养；
培养基配方为，每升培养液中含有如下成分：
培养方式为：35℃振荡培养，进入对数生长期后每隔1h用NaOH调节PH到7，共培养24小时，培养结束后杀菌即得。
实施例3，
与实施例1的方法相同，但在B型流感嗜血杆菌的培养；
培养基配方为，每升培养液中含有如下成分：
培养方式为：40℃振荡培养，进入对数生长期后每隔3h用NaOH调节PH到8，共培养24小时，培养结束后杀菌即得。
实施例4，
与实施例1的方法相同，但在结合疫苗的制备方法中，CRM197蛋白用TT蛋白代替，具体工艺如下:
A.取B型流感嗜血杆菌的多糖提取物即PRP，室温下用超纯水或注射用水溶解PRP多糖至20mg/ml，不断搅拌的情况下按照PRP与CDAP的质量比为1的条件下加入CDAP，维持1.5min；0.3M NaOH调节pH至9.5，维持3min；按照ADH与PRP多糖质量比为4：1的条件，加入固体ADH。0.3M NaOH调节pH至9.5，维持1h；2-8℃，0.2M NaCl透析；
B.透析后的PRP-AH与20mg/ml TT溶液以质量比1：2混合；0.1M HCL调节pH至5.0，然后按照EDAC与PRP质量比为10：1的比例加入固体EDAC，室温下维持pH5.060min，0.3MNaOH调节pH至7.5反应30min；利用4FF凝胶色谱柱进行纯化。
实施例5，
与实施例1的方法相同，但其中B型流感嗜血杆菌的多糖提取物的提取制备方法如下：
A,提取PRP粗糖：1）B型流感嗜血杆菌培养液离心去除菌体沉淀，收集上清；2）上清过中空纤维，收获滤过液；3）中空纤维滤过液用50KDa的膜包超滤 浓缩；4）膜包浓缩液进行分级醇沉：a.低浓度醇沉：顺序加入以下物质，每100ml加入0.5g NaCl，加入无水乙醇使得终浓度为20%，同时按每100ml加入2M 0.5ml CaCl2比例加入CaCl 2.醇沉过夜后离心，收集上清；高浓度乙醇醇沉：低浓度醇沉的上清中加入乙醇，终浓度为70%，醇沉过夜后离心，收集沉淀；c.0.2M NaCl复溶70-90%乙醇醇沉的沉淀；5）复溶液过0.45um的滤膜后上样，用4FF柱子进行进一步的分离；6）按照KD=0.55的原则收集洗脱液，脱盐，冻干即得；
B,提取PRP精糖：1）用乙酸钠溶解步骤A中得到的PRP多糖，浓度为5mg/ml或10mg/ml；2）加入等体积的苯酚，混匀数次，低温过夜；3）离心收集上层水相；4）再次加入等体积的苯酚，之后重复进行步骤2-3，连续抽提三次，透析，冻干即得PRP多糖。
实施例6，
与实施例1的方法相同，但其中B型流感嗜血杆菌的多糖提取物的提取制备方法如下：
A,提取PRP粗糖：1）B型流感嗜血杆菌培养液离心去除菌体沉淀，收集上清；2）上清过中空纤维，收获滤过液；3）中空纤维滤过液用50KDa的膜包超滤浓缩；4）膜包浓缩液进行分级醇沉：a.低浓度醇沉：顺序加入以下物质，每100ml加入0.7g NaCl，加入无水乙醇使得终浓度为30%，同时按每100ml加入2M 1.5ml CaCl2比例加入CaCl 2.醇沉过夜后离心，收集上清；高浓度乙醇醇沉：低浓度醇沉的上清中加入乙醇，终浓度为90%，醇沉过夜后离心，收集沉淀；c.0.2M NaCl复溶90%乙醇醇沉的沉淀；5）复溶液过0.45um的滤膜后上样，用4FF柱子进行进一步的分离；6）按照KD=0.55的原则收集洗脱液，脱盐，冻干即得；
B,提取PRP精糖：1）用乙酸钠溶解步骤A中得到的PRP多糖，浓度为5mg/ml或10mg/ml；2）加入等体积的苯酚，混匀数次，低温过夜；3）离心收集上层水相；4）再次加入等体积的苯酚，之后重复进行步骤2-3，连续抽提三次，透析，冻干即得PRP多糖。
实施例7
与实施例1的方法相同，但其中结合疫苗的制备采用以下方法：
取PRP用水溶解，不断搅拌加入适量CDAP，维持1min；加NaOH调节pH至8，维持1min；加入CRM197，加NaOH调节pH至8，反应；
实施例8
与实施例1的方法相同，但其中结合疫苗的制备采用以下方法：
取PRP用水溶解，不断搅拌加入适量CDAP，维持3min；加NaOH调节pH至11，维持5min；加入CRM197，加NaOH调节pH至11，反应；
实施例9
与实施例1的方法相同，但其中结合疫苗的制备采用以下方法：
取PRP用水溶解，不断搅拌加入适量CDAP，维持1min；NaOH调节pH至9，维持2min；加入CRM197，加NaOH调节pH至9，反应；
实施例10
与实施例1的方法相同，但其中结合疫苗的制备采用以下方法：
取PRP用水溶解，不断搅拌加入适量CDAP，维持2min；NaOH调节pH至10，维持4min；加入CRM197，加NaOH调节pH至10，反应；
实施例11
本发明还包括，CRM197的制备方法，具体步骤如下：
1）采用天然棒状白喉杆菌（Corynebacterium diphtheriae）进行发酵培养；
2）发酵液通过连续流或者杯式离心机离心后，过中空纤维进行进澄清处理；
3）经过澄清之后的发酵液用10kDa超滤膜进行超滤浓缩；
4）超滤浓缩液采用20-50%饱和硫酸铵进行第一次盐析，离心去除沉淀后用60-85%饱和硫酸铵对上清液进行第二次盐析，然后复溶；
5）复溶液经离子交换捕获CRM197蛋白，过程为，复溶液经10-50M PB缓冲液超滤换液至Cond 10.0-2.0，pH调节至7.0-8.0上样，色谱填料选自：Toyopearl DEAE-650S、DEAE.Fratogel EMD、Q.Sepharose.FF、CaptoQ Seharose.FF；洗脱液为:10mM-100M PB+0.5M KC；25%B一步洗脱；
6）捕获后的蛋白经疏水分离进行进一步纯化，分离纯化过程为：疏水填料为Butyl-650S Toyopearl、Phenyl Sepharose highsub，平衡缓冲液为 10～50mM PB，pH7.0，1.5M硫酸铵；洗脱缓冲液为10～100mMPB，pH 7.0～7.6；洗脱缓冲液为10～50mM PB，pH7.0，洗脱方式为一步洗脱，先用预洗缓冲液洗脱杂蛋白以后，再用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，其中预洗缓冲液为50mM PB，PH 7.0，1.05M硫酸铵；
7）浓缩至所需浓度保存。
其中，CRM197蛋白的菌株（天然棒状白喉杆菌，来自ATCC），并采用以下方法培养菌种，培养基的配方如下:
CY培养基主要成分(Per liter)
生长因子母液的成分(Per liter)
氨基酸的成分(Per liter)
调节pH值至7.4,其中每升培养基加入生长因子的母液1mL,麦芽糖25g,葡萄糖15g(麦芽糖和葡萄糖配制成50%的溶液，115℃,灭菌15min)，培养方式：35度，150rpm振荡培养。
Claims (10)
1.一种B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于制备方法如下：
1)B型流感嗜血杆菌的培养；
2)B型流感嗜血杆菌的多糖提取物即PRP的提取；
3)取PRP用水溶解，不断搅拌加入适量CDAP，维持1-3min；加NaOH调节pH至8-11，维持1-5min；加入CRM197，加NaOH调节pH至8-11，反应；
4)分离纯化得B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗原液。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤3为取PRP用水溶解，不断搅拌加入适量CDAP，维持1-2min；NaOH调节pH至9-10，维持2-4min；加入CRM197，加NaOH调节pH至9-10，反应；
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于制备方法如下:
1)B型流感嗜血杆菌的培养；
2)B型流感嗜血杆菌的多糖提取物即PRP的提取；
3)PRP用超纯水溶解至25mg/ml，不断搅拌加入CDAP，其中PRP与CDAP的重量比为1:1.25，维持1.5min；0.3M NaOH调节pH至9.5，维持3min；加入CRM197，加0.3M NaOH调节pH至9.5，反应；
4)利用4FF凝胶色谱柱进行纯化，收集Vo附近液体，得B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗原液。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3中的CRM197蛋白用TT蛋白代替，具体工艺如下:
A.取B型流感嗜血杆菌的多糖提取物即PRP，室温下用超纯水或注射用水溶解PRP多糖至20mg/ml，不断搅拌的情况下按照PRP与CDAP的质量比为1的条件下加入CDAP，维持1.5min；0.3M NaOH调节pH至9.5，维持3min；按照ADH与PRP多糖质量比为4：1的条件，加入固体ADH。0.3M NaOH调节pH至9.5，维持1h；2-8℃，0.2M NaCl透析；
B.透析后的PRP-AH与20mg/ml TT溶液以质量比1：2混合；0.1M HCL调节pH至5.0，然后按照EDAC与PRP质量比为10：1的比例加入固体EDAC，室温下维持pH5.0 60min，0.3M NaOH调节pH至7.5反应30min；利用4FF凝胶色谱柱进行纯化。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于PRP多糖的制备方法如下：
A.提取PRP粗糖：1)B型流感嗜血杆菌培养液离心去除菌体沉淀，收集上清；
2)上清过中空纤维，收获滤过液；3)中空纤维滤过液用50KDa的膜包超滤浓缩；4)膜包浓缩液进行分级醇沉：a.低浓度醇沉：顺序加入以下物质，每100ml加入0.5-0.7g NaCl，加入无水乙醇使得终浓度为20-30％，同时按每100ml加入2M 0.5-1.5ml CaCl2比例加入CaCl2.醇沉过夜后离心，收集上清；b.高浓度乙醇醇沉：低浓度醇沉的上清中加入乙醇，终浓度为70-90％，醇沉过夜后离心，收集沉淀；c.0.2M NaCl复溶70-90％乙醇醇沉的沉淀；5)复溶液过0.45um的滤膜后上样，用4FF柱子进行进一步的分离；6)按照KD＝0.55的原则收集洗脱液，脱盐，冻干即得；
B.提取PRP精糖：1)用乙酸钠溶解步骤A中得到的PRP多糖，浓度为5mg/ml或10mg/ml；2)加入等体积的苯酚，混匀数次，低温过夜；3)离心收集上层水相；4)再次加入等体积的苯酚，之后重复进行步骤2-3，连续抽提三次，透析，冻干即得PRP多糖。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于PRP多糖的制备方法如下：
A.提取PRP粗糖：1)B型流感嗜血杆菌培养液8000rpm 10min去除菌体沉淀，收集上清；2)上清过0.22um的中空纤维，收获滤过液；3)中空纤维滤过液用50KDa的膜包超滤浓缩；4)膜包浓缩液进行分级醇沉：a.25％低浓度醇沉：顺序加入以下物质，每100ml加入0.616gNaCl，加入无水乙醇使得终浓度为25％，同时按每100ml加入1ml2M CaCl2比例加入CaCl2.醇沉过夜后8000rpm离心20min，收集上清；b.80％高浓度乙醇醇沉：低浓度醇沉的上清中加入乙醇，终浓度为80％，醇沉过夜后8000rpm离心20min，收集沉淀；c.0.2M NaCl复溶80％乙醇醇沉的沉淀；5)复溶液过0.45um的滤膜后上样，用4FF柱子进行进一步的分离；6)按照KD＝0.55的原则收集洗脱液，脱盐，冻干即得；
B.提取PRP精糖：1)用10％乙酸钠溶解步骤A中得到的PRP多糖，浓度为5mg/ml或10mg/ml；2)加入等体积的苯酚，混匀数次，4摄氏度过夜；3)12000rpm离心20min，收集上层水相；4)再次加入等体积的苯酚，之后重复进行步骤2-3，连续抽提三次，透析，冻干即得PRP多糖。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于用于提取PRP的B型流感嗜血杆菌用如下方式获得的：
培养基配方为，每升培养液中含有如下成分：
培养方式为：35-40℃振荡培养，进入对数生长期后每隔1-3h用NaOH调节PH到7-8，共培养24小时，培养结束后杀菌即得。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于用于提取PRP的B型流感嗜血杆菌用如下方式获得的：
培养基配方为，每升培养液中含有如下成分：
培养方式为：37摄氏度150rpm振荡培养，进入对数生长期后每隔2h用NaOH调节PH到7.4，共培养24小时，培养结束后用0.6％甲醛杀菌即得。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于CRM197的生产过程如下：
1)采用天然棒状白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)进行发酵培养；
2)发酵液通过连续流或者杯式离心机离心后，过中空纤维进行进澄清处理；
3)经过澄清之后的发酵液用10kDa超滤膜进行超滤浓缩；
4)超滤浓缩液采用20-50％饱和硫酸铵进行第一次盐析，离心去除沉淀后用60-85％饱和硫酸铵对上清液进行第二次盐析，然后复溶；
5)复溶液经离子交换捕获CRM197蛋白，过程为，复溶液经10-50M PB缓冲液超滤换液至Cond 10.0-2.0，pH调节至7.0-8.0上样，色谱填料选自：Toyopearl DEAE-650S、DEAE.Fratogel EMD、Q.Sepharose.FF、CaptoQ Seharose.FF；洗脱液为:10mM-100M PB+0.5M KCL；25％B一步洗脱；
6)捕获后的蛋白经疏水分离进行进一步纯化，分离纯化过程为：疏水填料为Butyl-650S Toyopearl、Phenyl Sepharose highsub，平衡缓冲液为10～50mM PB，pH 7.0，1.5M硫酸铵；洗脱缓冲液为10～100mM PB，pH 7.0～7.6；洗脱缓冲液为10～50mM PB，pH 7.0，洗脱方式为一步洗脱，先用预洗缓冲液洗脱杂蛋白以后，再用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，其中预洗缓冲液为50mM PB，PH 7.0，1.05M硫酸铵；
7)浓缩至所需浓度保存。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤4中所得的疫苗原液经含NaCl的水溶液稀释，同时加入PB缓冲液、tween-80以及磷酸铝佐剂，至PRP终浓度为20ug/ml，NaCl终浓度为0.9％，磷酸铝终浓度为2.5mg/ml，PB终浓度为10mM，tween-80终浓度为0.01％时，分装得到B型流感嗜血杆菌多糖蛋白结合疫苗。
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