CN102417895A - 针对β伴大豆球蛋白β亚基的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种针对β伴大豆球蛋白β亚基的单克隆抗体及其应用。本发明提供了抗β伴大豆球蛋白β亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株5C5，它的保藏编号为CGMCC No.5555。本发明还提供了该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。所述单克隆抗体可用于检测β伴大豆球蛋白。本发明提供的杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂盒和检测方法如能推广应用，必将产生巨大的经济效益和社会效益。

Description

针对β伴大豆球蛋白β亚基的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种针对β伴大豆球蛋白β亚基的单克隆抗体及其应用。

背景技术

大豆作为人和动物优质的植物蛋白和油脂来源，具有极高的营养价值，被广泛应用。大豆中的蛋白质约占大豆籽粒的40％，但其中含有胰蛋白酶抑制因子、凝集素、异黄酮、抗原蛋白等多种抗营养因子。大豆抗原蛋白是大豆中能引起人、畜、禽过敏反应的一类蛋白质，主要包括：大豆疏水蛋白(免疫学命名为Gly m1)、大豆壳蛋白(Gly m2)、大豆抑制蛋白(Gly m3)、大豆球蛋白(glycinin)和β伴大豆球蛋白(β-conglycinin)等。

目前研究证实，大豆球蛋白和β伴大豆球蛋白是含量最丰富、免疫原性较强的大豆抗原蛋白，两者共占大豆籽实总蛋白的65-80％。β伴大豆球蛋白是大豆中的一种主要贮藏蛋白，分子量为140-180kDa，占大豆籽实总蛋白的10.0-12.7％，占总球蛋白的30.0％。β伴大豆球蛋白含有很多的糖基(3.8％甘露糖和1.2％氨基葡萄糖)，糖基通过N-乙酰葡萄糖胺形式结合在肽链的天冬氨酸残基上，因此β伴大豆球蛋白是一类糖基化蛋白质。β伴大豆球蛋白的二级结构中，α-螺旋、β-折叠和不规则结构分别占5％、35％和60％。β伴大豆球蛋白由α、α’和β三种亚基组成，三种亚基的分子量分别为58-77kDa、58-83kDa和42-53kDa，三种亚基都富含天冬氨酸/天门冬酰胺、谷氨酸/谷氨酰胺、亮氨酸和精氨酸，热稳定性顺序为：β＞α’＞α，抗原活性顺序为α’＞α＞β。

β伴大豆球蛋白作为含量丰富、热稳定性强、具有较强免疫原性的大豆抗原蛋白，经常引起过敏反应。能引起婴幼儿、5-6％的儿童和2-4％的成年人腹泻，严重的伴有颤抖、咽喉水肿和急性哮喘等症状。在畜牧行业，可导致断乳仔猪和妊娠母猪、犊牛、大鼠等幼龄动物的过敏反应，常表现为腹泻、生长性能下降直至死亡。

β伴大豆球蛋白是热稳定性的抗原蛋白，直接加热并不能彻底破坏其抗原活性。经过加热处理的大豆制品中具有抗原活性的球蛋白残留量仍高达18％，足以引起婴儿的过敏反应。所以，大豆、豆制品、豆粕饲料中β伴大豆球蛋白含量的检测具有重要的理论意义应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对β伴大豆球蛋白β亚基的单克隆抗体及其应用。

本发明保护抗β伴大豆球蛋白β亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株5C5(简称杂交瘤细胞株5C5)，已于2011年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5555。杂交瘤细胞株5C5能够稳定的产生单克隆抗体。

杂交瘤细胞株5C5分泌的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。本发明提供的单克隆抗体，可以特异地识别β伴大豆球蛋白分子β亚基，效价高、亲和性高、反应特异性强、无交叉反应。用本发明的单抗进行检测，检测范围广(3ng/ml～100ng/ml)，灵敏度高(3ng/ml)，变异系数小，成本低，操作简便，可以实现高通量检测。本发明的单克隆抗体具有如下应用前景：(1)作为研究大豆抗原性的工具，进行大豆种质资源筛选、品种改造；(2)制备免疫亲和柱，分离纯化β-伴大豆球蛋白；(3)进行动物实验研究；(4)FITC标记β-伴大豆球蛋白单克隆抗体，用于临床诊断或辅助诊断对大豆食物过敏的患者；(5)应用该抗体进行免疫组化检测β-伴大豆球蛋白在器官组织、各种体液的分布；(6)应用该抗体作为β-伴大豆球蛋白的拮抗剂，可以进行药理学研究，用于治疗大豆抗原蛋白过敏性疾病。

所述单克隆抗体可用于制备检测β伴大豆球蛋白的试剂盒。

本发明还保护一种检测β伴大豆球蛋白的试剂盒，包括所述单克隆抗体。所述试剂盒还可包括以β伴大豆球蛋白为免疫原得到的多克隆抗体。所述多克隆抗体具体可为将所述β伴大豆球蛋白免疫兔子得到的多克隆抗体。所述试剂盒还可包括β伴大豆球蛋白。

所述试剂盒可用于检测待测样本中是否含有β伴大豆球蛋白。

本发明还保护一种检测待测样本中是否含有β伴大豆球蛋白的方法，是应用所述试剂盒通过双抗夹心ELISA检测待测样本中是否含有β伴大豆球蛋白；所述双抗夹心ELISA中的双抗为所述单克隆抗体和所述多克隆抗体；所述双抗夹心ELISA中，用所述单克隆抗体包被酶标板；所述双抗夹心ELISA中，采用针对所述多克隆抗体的酶标二抗。

所述方法的具体包括如下步骤：

(1)将所述单克隆抗体包被酶标板(具体可采用10μg/ml或5μg/ml的包被浓度)；

(2)封闭酶标板；

(3)加入待测样本(或待测样本预处理后的提取液)，37℃孵育1h，洗涤，拍干；

(4)加入所述多克隆抗体，37℃孵育1h，洗涤，拍干；

(5)加入针对所述多克隆抗体的酶标二抗(如羊抗兔酶标二抗)，37℃孵育1h，洗涤，拍干；

(6)加入OPD底物溶液，37℃孵育20分钟；

(7)终止反应，用酶标仪于492nm波长下测定各个孔内溶液的吸光值(OD₄₉₂值)；

将OD₄₉₂值代入标准曲线(可采用所述β伴大豆球蛋白代替待测样本进行上述实验，制作标准曲线)，得到待测样本中β伴大豆球蛋白的含量。

所述待测样本可为大豆、大豆蛋白提取物、豆制品、豆奶粉、动物饲料等。

所述待测样本为大豆时，可将待测样本进行如下预处理：将待测样本溶于含0.01mol/L β-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液(pH8.0、0.03mol/L)中，磁力搅拌2h，离心(离心参数具体可为：4℃、12000g、30min)，取上清，即为待测样本预处理后的提取液。此步骤的目的是使大豆蛋白以游离的形式释放出来，以便于用免疫学方法定量检测其中β伴大豆球蛋白的实际含量。

以上任一所述β伴大豆球蛋白的制备方法具体包括如下步骤：

(1)去皮大豆磨浆，过滤收集滤液，用乙醚进行萃取，取水相，旋转蒸发至干燥，得到脱脂大豆粉；

(2)每1g所述脱脂大豆粉中加入20ml含10mM β-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液(pH8.0、0.03M)，室温浸提60分钟，离心(离心参数具体可为：10000rpm、30min、4℃)，收集上清液；

(3)调节步骤(2)得到的上清液的pH至6.4，离心(离心参数具体可为：10000rpm、30min、4℃)，收集上清液；

(4)调节步骤(3)得到的上清液的pH至4.8，离心(离心参数具体可为：15000rpm、30min、4℃)，收集沉淀；

(5)用含10mM β-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液(pH8.0、0.03M)溶解步骤(4)的沉淀，调节pH至6.2，离心(离心参数具体可为：15000rpm、30min、4℃)，收集上清液(即β伴大豆球蛋白粗提液)；

(6)调节步骤(5)得到的上清液的pH至7.6，加入(NH₄)₂SO₄，使(NH₄)₂SO₄的饱和度达到51％，4℃静置过夜，然后离心(离心参数具体可为：15000rpm、30min、4℃)，收集沉淀；

(7)将步骤(6)收集的沉淀溶解于磷酸盐缓冲液(pH7.6、0.01mol/L)，加入(NH₄)₂SO₄，使(NH₄)₂SO₄的饱和度达到90％，4℃静置过夜，然后离心(离心参数具体可为：15000rpm、30min、4℃)，收集沉淀；

(8)将步骤(7)收集的沉淀溶于磷酸盐缓冲液(pH7.6、0.01mol/L)中，然后进行分子筛层析；分子筛层析的参数如下：

柱子型号：100cm×2.6cm；填充介质：Sepharose 6B；

用磷酸盐缓冲液(pH7.6、0.01mol/L)进行洗脱，洗脱过程用核酸蛋白检测仪监测收集在280nm处有光吸收值的过柱后溶液；

(9)将步骤(8)收集的过柱后溶液在4℃下用蒸馏水进行透析除盐，然后冷冻干燥，得到β伴大豆球蛋白。

本发明提供的杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂盒和检测方法如能推广应用，必将产生巨大的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为SDS-PAGE分析纯化的β伴大豆球蛋白样品(泳道A)以及实施例3制备的单克隆抗体与β伴大豆球蛋白样品的免疫印迹分析(泳道D)。

图2为双抗ELISA夹心检测试剂盒的线性曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

细胞培养基(pH7.4)的制备方法为：向DMEM培养基中添加胎牛血清，使胎牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(体积百分含量)。

包被缓冲液：pH9.6、0.85mol/L的碳酸缓冲液。

封闭液：含1％(质量百分含量)明胶的包被缓冲液。

洗涤缓冲液：含0.05％(质量百分含量)Tween-20的PBS缓冲液(pH7.4、0.01mol/L)。

抗体稀释液：含0.01％(质量百分含量)Tween-20、0.1％(质量百分含量)明胶的PBS缓冲液(pH7.4、0.01mol/L)。

0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS缓冲液)的制备方法如下：8.00g NaCl、0.20g KCl、0.20g KH₂PO₄、1.15g Na₂HPO₄·12H₂O，加蒸馏水至1000mL，用1mol/L的NaOH调pH为7.6。

不完全培养液购自HyClone，产品目录号为SH30022.01B。HAT培养液购自Gibco，产品目录号为Cat.No.21060-017。HT培养液购自Gibco，产品目录号为Cat.No.11067-30。胰蛋白酶抑制因子购自sigma，产品目录号为232-906-9。凝集素购自Medicago、产品目录号为05-0117。兔抗鼠IgG：美国R&D，目录号bs-0296Rs(上海普林斯顿生物科技发展有限公司代理)。HRP标记的兔抗鼠IgG：北京中山金桥，目录号ZB-2305。小鼠IgG：上海创赛科学仪器有限公司，目录号B11000532。免疫纯单抗分型试剂盒I(ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit I)：购自Pierce，产品目录号为Prod#37501。大豆即从超市购买的普通黄豆。

实施例1、β伴大豆球蛋白的提取和纯化

一、β伴大豆球蛋白粗提液的制备

1、大豆脱皮后磨浆，过滤收集滤液，加入等体积乙醚进行萃取，取水相，旋转蒸发至干燥，得到脱脂大豆粉。

2、每1g脱脂大豆粉中加入20ml含10mM β-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液(pH8.0、0.03M)，室温浸提60分钟，离心(10000rpm、30min、4℃)，收集上清液。

3、用HCl调节步骤2得到的上清液的pH至6.4，离心(10000rpm、30min、4℃)，收集上清液。

4、用HCl调节步骤3得到的上清液的pH至4.8，离心(15000rpm、30min、4℃)，收集沉淀。

5、用含10mM β-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液(pH8.0、0.03M)溶解步骤4的沉淀，用HCl调节pH至6.2，离心(15000rpm、30min、4℃)，收集上清(β伴大豆球蛋白粗提液)。

二、β伴大豆球蛋白的纯化

1、用NaOH调节步骤一制备的β伴大豆球蛋白粗提液的pH至7.6，加入(NH₄)₂SO₄，使(NH₄)₂SO₄的饱和度达到51％，4℃静置过夜，然后离心(15000rpm、30min、4℃)，收集沉淀。

2、将步骤1收集的沉淀溶解于磷酸盐缓冲液(pH7.6、0.01mol/L)，加入(NH₄)₂SO₄，使(NH₄)₂SO₄的饱和度达到90％，4℃静置过夜，然后离心(15000rpm、30min、4℃)，收集沉淀。

3、将步骤2收集的沉淀溶于磷酸盐缓冲液(pH7.6、0.01mol/L)中，然后进行分子筛层析。

分子筛层析的参数如下：

柱子型号：100cm×2.6cm；

填充介质：Sepharose 6B。

用磷酸盐缓冲液(pH 7.6、0.01mol/L)进行洗脱，洗脱过程用核酸蛋白检测仪监测(280nm波长)，收集在280nm处有光吸收值的过柱后溶液。

4、将步骤3收集的过柱后溶液在4℃下用蒸馏水进行透析除盐，然后冷冻干燥，得到β伴大豆球蛋白。

三、β伴大豆球蛋白的鉴定

将步骤二制备的β伴大豆球蛋白进行SDS-PAGE(分离凝胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％；电泳条件为恒压100V；以低分子量标准蛋白为标准)并进行考马斯亮兰染色。

结果见图1(泳道A：β伴大豆球蛋白；泳道B：蛋白分子量marker)。结果表明，显示三条带，分子量分别为58-83kDa、58-77kDa和42-53kDa，与已知β伴大豆球蛋白的三个亚基(α’，α，β)的分子量一致。

实施例2、杂交瘤细胞的获得和保藏

一、杂交瘤细胞系的建立

1、动物免疫

将实施例1制备的β伴大豆球蛋白溶于0.5mL生理盐水中，加入等体积的完全佐剂后制成免疫原乳化剂，免疫6周龄雌性Balb/c小鼠。4周后行第二次免疫，再两周后行第三次免疫，均加入等体积的不完全佐剂后制成免疫原乳化剂。在第三次免疫后第10天间接ELISA测定小鼠血清中β伴大豆球蛋白抗体效价，效价高者进行下一步细胞融合。

2、细胞融合

无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬浮液。分别吸取含1×10⁸个脾细胞和2×10⁷个骨髓瘤细胞的悬浮液，移至50mL离心管中。加不完全培养液，使细胞液总体积为30mL。充分混匀后，于1000×g离心7min，将上清弃尽。轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散成均匀糊状。将离心管底部浸入37℃温水中，一只手均匀转动离心管，另一只手用1mL移液管将1mL 50％PEG溶液沿离心管壁移入转动的离心管。从移入到移完的时间控制在60s左右，然后立即将细胞悬浮液全部吸入吸管(时间控制在30s左右)，静置30s后，再将其吹入离心管内(时间也控制在30s左右)。在5min内加入25mL不完全培养液以稀释PEG，使PEG失去促融作用。于800g离心7min，弃去上清。加入10mL HAT培养液，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀。将细胞悬浮液加入已铺有饲养细胞的96孔培养板中，每个孔0.1mL。然后将培养板置于37℃和5％CO₂的培养箱内培养。

将融合后的细胞悬浮于HAT培养液中，置于37℃和5％CO₂的培养箱内培养。根据情况每2-3天更换培养液一次，换液时吸去1/2-2/3培养液，再加入等量新鲜培养液。所用的培养液应按培养的时间不同而有所不同：在融合后7天内用HAT培养液；第7-14天改用HT培养液；第14天以后则用普通的完全培养液。

3、间接免疫酶联吸附实验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞

在细胞融合后第7天，每次换液收集杂交瘤细胞培养液，然后采用间接ELISA方法对每个细胞培养孔的培养液进行阳性杂交瘤细胞株的筛选。具体操作如下：

(1)包被

用包被缓冲液将包被抗原β伴大豆球蛋白稀释至最佳工作浓度(2.5μg/mL)，用移液枪准确移至酶标板，每个孔100μL，置湿盒中于37℃温育1h。

(2)封闭

弃去酶标板孔内的液体。每个孔加入封闭液150μL，置湿盒中于37℃温育1h后，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次90s(简称洗涤，下同)，然后拍干。

(3)加待测培养细胞上清样品

用抗体稀释液将培养细胞上清样品以适当起始浓度倍比稀释后加入酶标板，每个孔100μL，每个浓度梯度设3个重复。37℃温育1h后，洗涤，拍干。

(4)加酶标二抗

用抗体稀释液将酶标二抗(羊抗鼠IgG/HRP)稀释到工作浓度(1∶5000)，加入酶标板，每个孔100μL，置于37℃温育1h后，洗涤，拍干。

(5)加底物溶液

向各酶标孔加新鲜配制的OPD底物使用液100μL，37℃温育15-30min。

(6)终止反应

每个孔加终止液50μL，终止底物显色反应。

(7)判定结果

用酶标仪于492nm波长下测定各个孔内溶液的吸光值(OD₄₉₂)，若待测孔OD₄₉₂大于或等于阴性对照孔的2.1倍，即认为是阳性值，从而得出血清的效价。

筛选得到分泌β伴大豆球蛋白单克隆抗体的阳性细胞株。

4、阳性杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法对筛选的阳性细胞株进行克隆，具体步骤如下：于克隆前一天制备饲养细胞。将待克隆的杂交瘤细胞用加样器反复吹打均匀后，转至24孔细胞培养板中，并进行细胞计数。根据计数结果，对细胞悬浮液做适当稀释。取250个活细胞悬浮于4.6mL(终体积)培养液中(此时平均每0.1mL溶液中含5个细胞)，接种96孔培养板，每个孔0.1mL，共36个孔。将4mL培养液加入到余下的1.0mL细胞溶液中(此时平均每0.1mL溶液中含1个细胞)，将此细胞液接种至其次的36孔，每个孔0.1mL。向剩余的1.4mL细胞悬浮液中补加培养液1.4mL(此时平均每0.1mL溶液中含0.5个细胞)。混匀后，将其接种于剩余的24孔，每个孔0.1mL。将培养板置于37℃和5％CO₂孵箱中培养。

适时进行换液和检测。有多孔阳性时，应尽可能取单克隆孔进行再次克隆，直至所有细胞孔的培养液均为阳性。

最后获得稳定分泌单克隆抗体的细胞株5C5。

二、杂交瘤细胞的保藏

抗β伴大豆球蛋白β亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株5C5(简称杂交瘤细胞株5C5)已于2011年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5555。

实施例3、单克隆抗体的制备

1、将杂交瘤细胞株5C5置于细胞培养基中，置于37℃和5％CO₂孵箱中培养，每隔2天更换一次细胞培养基，待细胞浓度大于10⁵mg/ml时停止更换培养基，持续培养到细胞全部死亡。

2、收集步骤1的培养上清，离心(1500rpm、10min、4℃)，收集上清液，即为单克隆抗体溶液，-20℃保存备用。

实施例4、β伴大豆球蛋白单克隆抗体的鉴定

一、单克隆抗体的类型及亚型

用免疫纯单抗分型试剂盒I测定实施例3制备的单克隆抗体的类型、亚型和轻链的亚型。结果表明：杂交瘤细胞系5C5产生的单克隆抗体属于含k轻链的IgG_2b。

二、单克隆抗体的含量

1、用包被缓冲液将兔抗鼠IgG稀释至0.01μg/mL，加入酶标板，每孔100微升，37℃孵育1小时。

2、吸弃上清，每孔加入封闭液150μL，37℃温育1h，洗涤，拍干。

3、每孔加入100微升小鼠IgG(用抗体稀释液配制为各种不同浓度)，37℃孵育1h，洗涤，拍干。

4、每孔加入100微升HRP标记的兔抗鼠IgG(工作浓度为1∶5000稀释)，37℃孵育1h，洗涤，拍干。

5、每孔加入100微升OPD底物溶液，37℃孵育20分钟。

6、终止反应，用酶标仪于492nm波长下测定各个孔内溶液的吸光值(OD₄₉₂值)。

以小鼠IgG的浓度为横坐标，以OD₄₉₂值为纵坐标，制作标准曲线。

用100微升实施例3制备的单克隆抗体溶液代替步骤3中的100微升小鼠IgG，依次进行步骤1至6的操作，将得到OD₄₉₂值代入标准曲线，得到单克隆抗体溶液中的单克隆抗体浓度。实施例3制备的单克隆抗体溶液中的单克隆抗体浓度为1.0mg/mL。

三、单克隆抗体的效价

1、用包被缓冲液将实施例1制备的β伴大豆球蛋白稀释至5.0μg/mL，加入酶标板，每孔100微升，37℃孵育1小时。

2、同步骤二的2。

3、每孔加入100微升实施例3制备的单克隆抗体溶液的稀释液(用抗体稀释液配制为各种不同浓度)，37℃孵育1h，洗涤，拍干。

步骤4至6同步骤二的4至6。

将OD₄₉₂值为1.0对应的稀释倍数作为单克隆抗体溶液的效价，实施例3制备的单克隆抗体溶液的效价为3.54×10⁵。

四、单克隆抗体的亲和力

1、用包被缓冲液将实施例1制备的β伴大豆球蛋白稀释至2.5μg/mL(或5μg/mL或10μg/mL)，加入酶标板，每孔100微升，37℃孵育1小时。

2、同步骤二的2。

3、每孔加入100微升实施例3制备的单克隆抗体溶液的稀释液(用抗体稀释液倍比单克隆抗体溶液)，37℃孵育1h，洗涤，拍干。

步骤4至6同步骤二的4至6。

以待测样品的不同浓度为横坐标，以其相应的OD₄₉₂值为纵坐标，绘制测定曲线。以各曲线上部趋于平坦的OD₄₉₂值为100％，计算OD₄₉₂值为50％时抗体的浓度[Ab]t，这样每份待测样品可得[Ab]t、[Ab]′t、[Ab]″t三个值，然后根据文献(徐志凯主编.1991.实用单克隆抗体技术.西安：陕西科学技术出版社.pp 7-145)中描述的方法计算，单抗5C5的亲和常数(K_a)为6.8×10¹⁰L/mol。

实施例5、杂交瘤细胞株的稳定性

将杂交瘤细胞株5C5进行传代培养，分别将第二代细胞、第四代细胞、第八代细胞和第十代细胞按照实施例3的方法制备单克隆抗体，并按照实施例4的步骤三的方法检测效价。各代细胞的效价经统计学检验无显著性差异。

实施例6、单克隆抗体的反应特异性

一、单克隆抗体与β伴大豆球蛋白的结构类似物的交叉反应

1、大豆球蛋白的制备

(1)粗提物的获得

①将大豆与水按1∶10的质量比投料，60℃条件下用1M NaOH水溶液调整pH至9.0，60℃条件下以65rpm的速度搅拌45分钟，4000rpm离心，收集上清液。

②将上清液用35％的食品工业用盐酸调整pH至4.5，3000rpm离心，收集沉淀。

③将沉淀洗涤2次，然后用8倍体积的水分散并用1M NaOH水溶液调pH至8.0，喷雾干燥后得到粗提物。

(2)大豆球蛋白的制备

①将步骤1得到的粗提物溶于磷酸盐缓冲液(pH7.6、0.01mol/L)中，然后进行分子筛层析。

分子筛层析的参数如下：

柱子型号：100cm×2.6cm；

填充介质：Sepharose 6B。

用磷酸盐缓冲液(pH 7.6、0.01mol/L)进行洗脱，洗脱过程用核酸蛋白检测仪监测(280nm波长)，收集在280nm处有光吸收值的过柱后溶液。

②将步骤①收集的过柱后溶液在4℃下用蒸馏水进行透析除盐，然后冷冻干燥，得到大豆球蛋白。

2、单克隆抗体与β伴大豆球蛋白的结构类似物交叉反应

(1)用包被缓冲液将实施例1制备的β伴大豆球蛋白稀释至50.0μg/mL，加入酶标板，每孔100微升，37℃孵育1小时。

(2)吸弃上清，每孔加入封闭液150μL，37℃温育1h，洗涤，拍干。

(3)每孔加入100微升含有实施例3制备的单克隆抗体和结构类似物(步骤1制备的β伴大豆球蛋白或步骤1制备的大豆球蛋白或胰蛋白酶抑制因子或凝集素)的混合液(单克隆抗体的浓度为25ng/mL；结构类似物进行系列倍比稀释)，37℃孵育15min，洗涤，拍干。

(4)每孔加入100微升HRP标记的兔抗鼠IgG(工作浓度为1∶5000稀释)，37℃孵育1h，洗涤，拍干。

(5)每孔加入100微升OPD底物溶液，37℃孵育20分钟。

(6)终止反应，用酶标仪于492nm波长下测定各个孔内溶液的吸光值(OD₄₉₂值)。

根据OD₄₉₂值绘制各个结构类似物(或β伴大豆球蛋白)的标准曲线(以结构类似物浓度为横坐标，OD₄₉₂值为纵坐标)，计算各类结构类似物的IC₅₀值(平均值±标准差)，结果见表1。

表1单克隆抗体与β伴大豆球蛋白及其结构类似物的交叉反应

竞争物	IC50(ng/mL)	(交叉反应，％)
			β伴大豆球蛋白	3.1±0.4	100.0
大豆球蛋白	-	＜0.01
			胰蛋白酶抑制因子	-	＜0.01
凝集素	-	＜0.01

二、单克隆抗体与β伴大豆球蛋白的Western Blot免疫印迹实验

将实施例1制备的β伴大豆球蛋白进行Western Blot免疫印迹实验，采用的一抗为实施例3制备的单克隆抗体，采用的二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG。

结果见图1的泳道D。结果显示，实施例3制备的单克隆抗体与β伴大豆球蛋白的β亚基有很强的特异性反应。

步骤一和步骤二的结果都证明：杂交瘤细胞株5C5产生的单克隆抗体能和β伴大豆球蛋白发生强烈的结合反应，因此可以应用于的免疫学检测和蛋白定量，以及其他的相关应用研究。

实施例7、β伴大豆球蛋白多克隆抗体的制备及检测

一、多克隆抗体的制备

1、免疫动物收获血清

将实施例1制备的β伴大豆球蛋白用生理盐水配成5mg/mL的抗原溶液，与等体积弗氏佐剂混合，利用旋涡混合器使其乳化完全。

选取健康雌性新西兰大白兔(北京市海淀区兴隆实验动物养殖厂)进行免疫。首次免疫为足内侧上皮，注射完全弗氏佐剂乳化的抗原，选两个位点，每点0.5mL。首次免疫14d后进行加强免疫，背部随机选取4点，皮下注射不完全弗氏佐剂乳化的抗原，0.5mL/点。以后每隔10d进行相同的加强免疫一次，连续三次。最后一次加强免疫10d后，在耳上选择清晰的静脉血管，注射肾上腺素0.1mL/只，0.5h后，再往静脉直接注射抗原溶液，0.5mL/只。对兔子进行前腔静脉采血，分离血清，-20℃保存备用。

2、多克隆抗体的纯化

(1)取步骤1的血清，用等体积的巴比妥缓冲液稀释，加二氧化硅粉末(每1mL血清加1g二氧化硅)，室温下放置30min(不时摇动)，于2000×g离心20min，收集上清。

(2)向步骤(1)的上清中加入2倍血清体积的乙酸缓冲液(pH 5.0、0.06mol/L)，用HCl调pH值至4.8，室温搅拌并在30min内逐滴加入辛酸(每1mL血清加33μL辛酸)，4℃静置2h，然后15000×g离心30min，取上清并用砂芯漏斗过滤；向滤液中加入1/10血清体积的PBS缓冲液(0.1mol/L)，用NaOH调pH值至7.4，置于4℃冰浴中，在30min内加入0.277g/mL的(NH₄)₂SO₄水溶液，使其饱和度达45％，然后静置1h，再然后10000×g离心30min，取沉淀；将沉淀溶于适量PBS缓冲液(含137mmol/L NaCl、2.6mmol/L KCl和0.2mmol/L EDTA，pH 7.4)，4℃于PBS缓冲液中透析过夜，然后10000×g离心30min，收集上清。

(3)采用HiTrap Protein G HP亲和层析柱从步骤(2)的上清纯化IgG

①用10倍柱体积(约10mL)的结合缓冲液(pH7.0、20mmol/L)平衡层析柱。

②用直径为0.45μm的过滤器过滤步骤(2)的上清以除去不溶物，然后与结合缓冲液等体积混合，然后用注射器进样。

③用10倍柱体积(约10mL)的结合缓冲液冲洗，以除去未结合杂蛋白。

④用3倍柱体积的洗脱缓冲液(pH2.7、0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液)洗脱，收集过柱后洗脱液(用于收集的试管中事先加有pH9.01mol/L的Tris-HCl缓冲液，其用量为过柱后洗脱液的体积的九分之一)。

⑤将过柱后洗脱液在5mmol/L PBS缓冲液中充分透析，然后浓缩备用，即为多克隆抗体。

二、多克隆抗体的效价

按照实施例4的步骤三的方法检测多克隆抗体的效价，结果为6.25×10⁶。

实施例8、用单克隆抗体检测样品中的β伴大豆球蛋白

一、制作标准曲线

1、包被单抗

将实施例3制备的单克隆抗体用NaHCO₃缓冲液(pH9.6、0.05mol/L)稀释至10μg/ml(或5μg/ml)，加入酶标板中(200μL/孔)，4℃过夜。

2、封闭

吸弃上清，每孔加入1％(质量百分含量)牛血清白蛋白水溶液150μL，37℃温育1h，洗涤，拍干。

3、加标准品

用包被缓冲液分别将实施例1制备的β伴大豆球蛋白(标准品)稀释成0、3、10、30、100、300和1000ng/mL七个工作浓度，按酶标板纵顺序将每一种浓度的标准品溶液加入到酶标板孔中(每个浓度设置三个重复处理)，每孔100μL，37℃孵育1h，洗涤，拍干。

4、加一抗(多抗)

用抗体稀释液将实施例7制备的多克隆抗体稀释至5μg蛋白/mL，加入酶标板，每孔100μL，37℃温育1h，洗涤，拍干。

5、加酶标二抗

用抗体稀释液将羊抗兔酶标二抗稀释到工作浓度(1∶2000，1∶4000或1∶8000)，加入酶标板，每孔100μL，37℃温育1h，洗涤，拍干。

6、每孔加入100微升OPD底物溶液，37℃孵育20分钟。

7、终止反应，用酶标仪于492nm波长下测定各个孔内溶液的吸光值(OD₄₉₂值)。结果见表2和表3。

表2单克隆抗体的包被浓度为10μg/ml时的OD₄₉₂值

表3单克隆抗体的包被浓度为5μg/ml时的OD₄₉₂值

以OD₄₉₂值为纵坐标，标准品浓度为横坐标绘制标准曲线。

单克隆抗体的包被浓度为10μg/ml、二抗1∶2000稀释时的标准曲线见图2，标准曲线方程为y＝0.0104x+0.0501，线性范围为3-100ng/ml，R2＝0.9999。

二、大豆样品的处理

将大豆溶于含0.01mol/L β-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液(pH8.0、0.03mol/L)中，磁力搅拌2h，离心(4℃、12000g、30min)，取上清，即为待测样本。此步骤的目的是使大豆蛋白以游离的形式释放出来，以便于用免疫学方法定量检测其中β伴大豆球蛋白的实际含量。

三、检测大豆样本

1、包被单抗

将实施例3制备的单克隆抗体用NaHCO₃缓冲液(pH9.6、0.05mol/L)稀释至10μg/ml，加入酶标板中(200μL/孔)，4℃过夜。

2、封闭

吸弃上清，每孔加入1％(质量百分含量)牛血清白蛋白水溶液150μL，37℃温育1h，洗涤，拍干。

3、加待测样品

加入步骤二制备的待测样本，每孔100μL，37℃孵育1h，洗涤，拍干。

4、加一抗(多抗)

用抗体稀释液将实施例7制备的多克隆抗体稀释至5μg蛋白/mL，加入酶标板，每孔100μL，37℃温育1h，洗涤，拍干。

5、加酶标二抗

用抗体稀释液将羊抗兔酶标二抗稀释到工作浓度(1∶2000)，加入酶标板，每孔100μL，37℃温育1h，洗涤，拍干。

6、每孔加入100微升OPD底物溶液，37℃孵育20分钟。

7、终止反应，用酶标仪于492nm波长下测定各个孔内溶液的吸光值(OD₄₉₂值)。

将OD₄₉₂值带入相应的标准曲线，可准确得出大豆样本中β伴大豆球蛋白的含量，大豆中β伴大豆球蛋白的含量为13.3％(以β伴大豆球蛋白占黄豆干重的质量百分含量计)。

除了大豆样本，以上方法还可以用于检测大豆蛋白提取物、豆制品、豆奶粉、豆粕饲料中的β伴大豆球蛋白。

Claims (8)

1.抗β伴大豆球蛋白β亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株5C5，它的保藏编号为CGMCC No.5555。

2.权利要求1所述抗β伴大豆球蛋白β亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株5C5分泌的单克隆抗体。

3.权利要求2所述单克隆抗体在制备检测β伴大豆球蛋白的试剂盒中的应用。

4.检测β伴大豆球蛋白的试剂盒，包括权利要求2所述单克隆抗体。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括以β伴大豆球蛋白为免疫原得到的多克隆抗体。

6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括β伴大豆球蛋白。

7.权利要求4至6中任一所述试剂盒在检测待测样本中是否含有β伴大豆球蛋白中的应用。

8.一种检测待测样本中是否含有β伴大豆球蛋白的方法，是应用权利要求5或6所述试剂盒通过双抗夹心ELISA检测待测样本中是否含有β伴大豆球蛋白；所述双抗夹心ELISA中的双抗为所述单克隆抗体和所述多克隆抗体；所述双抗夹心ELISA中，用所述单克隆抗体包被酶标板；所述双抗夹心ELISA中，采用针对所述多克隆抗体的酶标二抗。

Images