CN101899111A - 杂交瘤细胞株f3 - Google Patents

Abstract

本发明涉及杂交瘤细胞株F₃的研制，属于生物技术领域。取Sp2/0骨髓瘤细胞与用牛血清白蛋白(BSA)与伏马菌素B₁(FB₁)偶联后的偶联蛋白(FB₁-BSA)免疫BALB/c小鼠的脾细胞进行细胞融合，用HAT培养基进行选择性培养后，用卵清白蛋白(OVA)与伏马菌素B₁偶联后的偶联蛋白(FB₁-OVA)进行间接ELISA筛选，对细胞培养上清进行检测、筛选获得稳定分泌抗伏马菌素B₁单克隆抗体的杂交瘤细胞株F₃，测得F₃腹水ELISA效价为1∶51200，经鉴定该单克隆抗体可与FB₁特异性结合，F₃细胞株的染色体数目为101条，该单克隆抗体的类别为IgG1，轻链类型为κ。本发明提供的FB₁单克隆抗体特异性强，制备方法简单，可用于FB₁的研究和FB₁免疫学检测方法的建立。

Description

杂交瘤细胞株F3

技术领域

本发明涉及分泌伏马菌素B₁(Fumonisin B₁，FB₁)单克隆抗体的杂交瘤细胞株F₃，属于生物技术领域，涉及抗体工程技术。 

背景技术

伏马菌素(Fumonisins)是一类主要由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)产生的真菌毒素。FB₁是串珠镰刀菌培养物中伏马菌素的主要组分，也是导致伏马菌素毒性作用的主要原因，其促癌性和致癌性已在大鼠中得到证实。FB₁还可诱发马脑白质软化症(ELEM)、猪的肺水肿症候群(PPE)、羊的肝病样改变和肾病、大鼠的肝坏死和心室内形成血栓等。另外，FB₁对实验仓鼠具有妊娠毒性、对鸡胚的致病性和致死性，以及对灵长类动物致动脉粥样硬化样脂肪改变等。流行病学调查发现，串珠镰刀菌和伏马菌素对玉米及玉米制品的污染可能与人类食管癌的高发率有一定相关性。国际癌症研究中心(IARC)已把FB划分到2B组，即人类可能致癌物。 

伏马菌素(FBs)是一组结构相似的双酯类化合物，由丙烷基-1，2，3-三羧酸和2-氨基-12，16-二甲基多羟二十烷构成，其C₁₄和C₁₅的羟基被羧化，而FB₁的分子结构就是在这个结构相似的双酯类化合物中其三个取代基团分别为羟基、羟基和氢。FB₁是自然界中最普遍，且毒性最强的一种伏马毒素。FB₁是白色粉末，易溶于水、甲醇及乙睛：水中。伏马菌素B₁具有热稳定性，100℃蒸煮30min也不能破坏其结构。 

伏马菌素B₁广泛存在于玉米及其制品中，对人类健康和畜牧业发展构成潜在威胁。食品添加剂和污染物法典委员会(The Codex Committee on Food Additives and Contaminants，CCFAC)等国际组织认为，伏马菌素B₁是一种具有重大卫生学意义的真菌毒素。因此，通过制备伏马菌素B₁单克隆抗体，可为伏马菌素B₁的抗原性研究和伏马菌素B₁免疫学方法建立提供必要的试剂和技术手段，对探索伏马菌素B₁的生物学功能区域和建立伏马菌素B₁的特异性、敏感性检测方法等具有重要意义。 

发明内容

技术问题 

本发明的目的是提供分泌FB₁单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明的单克隆抗体是将牛血清白蛋白(BSA)作为载体蛋白与FB₁偶联制备完全抗原，免疫BALB/c小鼠， 利用杂交瘤技术获得能特异识别FB₁的单克隆抗体F₃。 

技术方案 

一种伏马菌素B₁单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体是杂交瘤细胞株F₃产生的，杂交瘤细胞株F₃于2010年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉武汉大学邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：C201053。制备方法包括： 

1)免疫偶联抗原FB₁-BSA的制备 

根据戊二醛(GA)一步法将FB₁偶联到牛血清白蛋白(BSA)上。称取1.8mg的BSA蛋白，用PBS(0.01M，PH 7.4)配制蛋白悬浮液，浓度为1mgmL^-1。在磁力搅拌中用蛋白悬浮液溶解FB₁。使用相同体积的戊二醛(2％，V/V)，逐滴加入，室温反应1h。用硼氢化纳终止反应，使硼氢化纳的终浓度为10mg mL^-1，室温反应1h。在4℃，磁力搅拌条件下用PBS透析72h(Azcona-Olivera J I，Abouzied M M，Plattner R D.Production of monoclonal antibodies to the fumonisins B₁，B₂ and B₃[J].J Agric Food Chem，1992，40：531-534)。 

2)小鼠免疫 

本实验采用小剂量长周期的免疫方案。使用偶联蛋白FB₁-BSA作为免疫抗原，对7周龄的雌性BALB/c小鼠(购自扬州大学比较医学中心)进行免疫。首次免疫每只小鼠的免疫剂量为90μg，与等体积的弗氏完全佐剂混匀后，皮下多点免疫注射。两周后，再用90μg免疫抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混匀后，皮下多点免疫注射。此后每隔两周用90μg免疫抗原与等体积的不完全弗氏佐剂混匀，皮下注射。四次免疫后，腹腔免疫40μg免疫抗原作为加强免疫，3d后取脾细胞进行融合。 

3)细胞融合 

取Sp2/0骨髓瘤细胞(江苏省农科院惠赠)与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1∶5～1∶10的比例混合于50mL离心管中，充分混匀，1000rpm离心10min，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散均匀，置40℃水浴预热，用1mL吸管在45s内加完预热至40℃的50％聚乙二醇4000(PEG 4000)(购于Sigma公司)1mL，边加边轻轻振荡，然后在90s内加入30mL预热至37℃的1640不完全培养基(购于Invitrogen公司)，室温静置10min，1000rpm离心10min，弃上清，加入20mL含20％FCS(购于上海慧人生物科技工程研究所)和HAT(购于Invitrogen公司)的1640培养基重悬。分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5％CO₂培养箱培养，7d后，观察细胞的生长状况，用含有20％FCS和HT(购于Invitrogen公司)的1640培养基换出1/2培养基；14d后，改用含20％FCS和HT的1640培 养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/5时，取上清进行抗体检测。 

4)杂交瘤筛选 

用包被液为0.05mol L^-1pH 9.6碳酸盐缓冲液，将偶联好的包被抗原(FB₁-OVA)，做倍比稀释包被ELISA板，100μL/孔，置4℃包被过夜；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以1％明胶封闭每孔，300μμL/孔，37℃放置2h；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将细胞上清、1∶400稀释的阳性参考血清和1∶400稀释的阴性参考血清，加入相应孔内，100μL/孔，37℃作用60min；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1∶10000稀释的酶标羊抗鼠IgG(购自博士德生物技术公司)，100μL/孔，37℃放置60min；PBST洗涤5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB-H₂O₂，100μL/孔，室温避光显色15min；每孔加入100μL 2mol/L硫酸终止反应；经酶标仪测定OD_450nm值：以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为阴性参考血清的OD₄₅₀值，当阴性参考血清的OD₄₅₀值≤0.1，阳性参考血清的OD₄₅₀值与阴性参考血清的OD₄₅₀值的比值≥2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，P/N≥2.1的检测孔判为阳性，1.5≤P/N＜2.1的检测孔判为可疑，P/N＜1.5的检测孔判为阴性。 

5)有限稀释法对杂交瘤细胞亚克隆 

首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用1640完全培养基稀释成每15mL培养基100个细胞，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.15mL，37℃，5％CO₂培养箱中培养，4～5d后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个克隆生长孔，8～9d时取细胞上清，及时进行ELISA检测；选择阳性的单克隆细胞再进行同样的亚克隆3次以上，直至亚克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性、且各孔检测OD值较接近；将多次亚克隆培养后的阳性孔细胞扩大培养，并冻存，获得稳定分泌FB₁单克隆抗体的杂交瘤细胞株F₃。 

6)FB₁单克隆抗体的制备 

将液体石蜡注射成年BALB/c小鼠，0.5mL/只，致敏7d后，将阳性杂交瘤细胞株F₃用PBS稀释后注入小鼠腹腔，每只小鼠注射5×10⁶～1×10⁷个细胞，0.2mL，5～10d后采集腹部明显鼓起小鼠的腹水，10000rpm，离心5min，收集上清，小量分装，-70℃保存。 

有益效果本发明的特点和优点如下： 

1、本发明提供的抗原制备方法简便可行。 

2、本发明提供的FB₁单克隆抗体特异性强，制备方法简单。 

3、本发明提供的特异性单克隆抗体可用于FB₁的研究和FB₁免疫学检测方法的建 立。 

4、获得稳定分泌FB₁单克隆抗体的杂交瘤细胞株F₃，测得F₃腹水ELISA效价为1∶51200，经鉴定该单克隆抗体的类别为IgGl，轻链类型为κ。 

附图说明

图1偶联抗原非变性琼脂糖电泳鉴定。 

图2纯化后单抗的电泳图。 

图3F₃杂交瘤细胞的染色体图。 

生物保藏 

杂交瘤细胞株F₃，于2010年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉武汉大学邮编：430072，保藏编号为CCTCC C201053。 

具体实施方式

(一)免疫偶联抗原FB₁-BSA的制备与检测 

根据戊二醛(GA)一步法将FB₁偶联到牛血清白蛋白上。称取1.8mg的BSA蛋白，用PBS配制蛋白悬浮液，浓度为1mg mL^-1。在磁力搅拌中用蛋白悬浮液溶解FB₁。使用相同体积的戊二醛(2％，V/V)，逐滴加入，室温反应1h。用硼氢化纳终止反应，使硼氢化纳的终浓度为10mg mL^-1，室温反应1h。在4℃，磁力搅拌条件下用PBS透析72h。 

偶联好的蛋白通过非变性琼脂糖凝胶电泳法鉴定。制备1％的琼脂糖凝胶。取10μL的样品与等体积的上样缓冲液混合后加入凝胶孔中。在冰浴中，240V电压下，30min左右。取出凝胶先用去离子水冲洗后，加入20％的三氯乙酸固定20min。最后用考马斯蓝R-250染液染色2h。脱色过夜，直到达到试验要求(Kamp C，Carlin R G，Shefield L，et al.Analysis of hapten-carrier protein conjugates by non-denaturing gel electrophoresis[J].JImmun Meth，1993，164：245-253)。当偶联产物的电泳条带与载体蛋白的条带不同时，可说明偶联成功，见图1。 

(二)杂交瘤细胞株的建立 

1、小鼠免疫 

本实验采用小剂量长周期的免疫方案。使用偶联蛋白FB₁-BSA作为免疫抗原，对7周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫。首次免疫每只小鼠的免疫剂量为90μg，与等体积的弗氏完全佐剂混匀后，皮下多点免疫注射。两周后，再用90μg免疫抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混匀后，皮下多点免疫注射。此后每隔两周用90μg免疫抗原与等体积 的不完全弗氏佐剂混匀，皮下注射。四次免疫后，腹腔免疫40μg免疫抗原作为加强免疫，3d后取脾细胞进行融合。 

2、细胞融合 

按常规方法进行(刘秀梵.单克隆抗体在农业上的应用(第1版)[M].合肥：安徽科学技术出版社，1994，18～30)。取Sp2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1∶5～1∶10的比例混合于50mL离心管中，充分混匀，1000rpm离心10min，弃上清。用手掌轻击管底，使细胞松散均匀，置40℃水浴预热。用1mL吸管在45s内加完预热至40℃50％PEG 40001mL，边加边轻轻振荡，然后在90s内加入30mL预热至37℃的1640不完全培养基，室温静置10min，1000rpm离心10min，弃上清，加入20mL含20％FCS和HAT1640培养基重悬。分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5％CO₂培养箱培养，7d后，观察细胞的生长状况，用含有20％FCS和HT的1640培养基换出1/2培养基。14d后，改用含20％FCS和HT的1640，当融合细胞生长至96孔板孔底面积的1/5时，取上清进行抗体检测。 

3、杂交瘤筛选 

用包被抗原(FB₁-OVA)包被进行间接ELISA，对细胞培养上清进行检测，筛选出对包被抗原呈为阳性的杂交瘤细胞。用包被液为0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液对包被抗原进行倍比稀释，包被ELISA板，100μL/孔，置4℃包被过夜；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以1％明胶封闭每孔，300μL/孔，37℃放置2h；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将细胞上清1∶400稀释的阳性参考血清和1∶400稀释的阴性参考血清，加入相应孔内，100μL/孔，37℃作用60min；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1∶10000稀释的酶标羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃放置60min；PBST洗涤5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB-H₂O₂，100μL/孔，室温避光显色15min；每孔加入100μL 2mol/L硫酸终止反应；经酶标仪测定OD_450nm值：以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为阴性参考血清的OD_450nm值，当阴性参考血清的OD_450nm值≤0.1，阳性参考血清的OD_450nm值与阴性参考血清的OD_450nm值的比值≥2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，P/N≥2.1的检测孔判为阳性，1.5≤P/N＜2.1的检测孔判为可疑，P/N＜1.5的检测孔判为阴性。 

4、有限稀释法对杂交瘤细胞亚克隆 

对于筛选所得的分泌特异性单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，及时采用有限稀释法(刘秀梵.单克隆抗体在农业上的应用(第1版)[M].合肥：安徽科学技术出版社，1994，35-36)进行亚克隆。首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用1640完全培养基(首次 亚克隆应加HT)稀释成每15mL培养基100个细胞，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.15mL，37℃，5％CO₂培养箱中培养，4～5d后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个克隆生长孔，8～9d时取细胞上清，及时进行ELISA检测；选择阳性的单克隆细胞再进行同样的亚克隆3次以上，直至亚克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性、且各孔检测OD值较接近。将多次亚克隆培养后的阳性孔细胞扩大培养，并冻存，获得稳定分泌抗伏马菌素B₁单克隆抗体的杂交瘤细胞株F₃。 

(三)FB₁单克隆抗体的制备 

将液体石蜡注射成年BALB/c小鼠，0.5mL/只，致敏7d后，将阳性杂交瘤细胞用PBS稀释后注入小鼠腹腔，每只小鼠注射5×10⁶～1×10⁷，0.2mL，5～10d后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，10000rpm，离心5min，收集上清，小量分装，-70℃保存。 

(四)FB₁单克隆抗体的腹水效价测定 

用PBS缓冲液1∶100稀释单克隆抗体腹水，然后进行倍比稀释，加入FB₁-OVA包被的酶标板，100μL/孔，37℃，孵育60min；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1∶10000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃，孵育60min；PBST洗涤5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB-H₂O₂，100μL/孔，室温避光显色15min；每孔加入100μL 2molL^-1硫酸终止反应；经酶标仪测定OD_450nm值。以阴性OD_450nm值小于0.2，检测孔与阴性OD_450nm值的比值大于2.1判为阳性，以阳性孔的最大稀释度作为单克隆抗体的腹水效价。结果显示，F₃细胞株腹水间接ELISA效价为1∶51200。 

(五)FB₁单克隆抗体纯度的鉴定-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 

配制10mL 12％分离胶溶液。迅速在两玻璃板之间灌注分离胶，上面用水密封。约30min后，待分离胶完全聚合，倒出覆盖胶上层的水，用滤纸吸干。配制5％浓缩胶，灌注在分离胶上，之后立即插入梳子，小心气泡。待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子，用电泳缓冲液清洗孔洞。样品与5×上样缓冲液按比例混合，水中加热煮沸10min，离心，每孔上样约20μL。加满电泳缓冲液，80V电泳，当样品在浓缩胶内压成一条直线后，调节电压至120V，直到溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源。卸下玻璃板，用刮勺敲开玻璃板，在一边做记号后，刮下凝胶。考马斯亮蓝R250染液染色2h。脱色过夜至条带清晰可见，拍照，如图2。 

(六)F₃杂交瘤细胞的染色体分析 

在培养瓶中加入秋水仙素(100μg mL^-1，除菌，-20℃保存)，使最终浓度为0.1～0.4μg mL^-1；继续培养4～6h，然后吹打细胞，移入离心管中，1000rpm离心10min，弃上 清。加入已预温到37℃的0.075mol L^-1 KCl溶液5mL，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴15～20min。向悬液中加入新配制的固定液(甲醇与冰醋酸3∶1混合)1mL，混匀，然后1000rpm离心10min，弃去上清液；加入固定液5mL，将细胞悬液混匀，室温静置20～30min，然后1000rpm离心10min，弃去上清液，重复操作一次；其后加5mL固定液，将细胞悬液混匀，封上管口，置4℃过夜。取出离心管，1000rpm离心5min，轻轻吸去上清液，根据细胞压积多少而留下0.5～1mL固定液，将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液1～2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，用口吹散，并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。用新配制的10％吉姆萨染液染色10～20min，然后用自来水洗去染液，自然干燥。选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行镜检，观察分析。每份标本应计数100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。经过显微镜镜检计数，计算得到F₃细胞株的染色体数目为101条，如图3。正常的小鼠脾细胞为40条染色体，而Sp2/0细胞有62-68条染色体。 

(七)FB₁单克隆抗体类别和亚类的鉴定 

通过ELISA方法，对单抗免疫球蛋白的类别和亚类进行鉴定。以4μg mL^-1每孔的抗原量包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜。洗涤后，加入待检的单抗样品，100μL/孔，37℃温育1h；设阴性、阳性对照孔。洗涤后，加入HRP标记的抗小鼠类及亚类Ig的抗体试剂，100μL/孔，37℃避光显色15min；用2mol L^-1 H₂SO₄终止反应后，阅读各孔的OD_490nm值。经过单抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定，可知杂交瘤细胞株F₃分泌的单克隆抗体的类别为IgGl，轻链类型为κ。 

Claims (2)

1.一种FB₁单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体是杂交瘤细胞株F₃产生的，杂交瘤细胞株F₃于2010年5月27保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201053。

2.根据权利要求1所述的一种FB₁单克隆抗体，其特征在于，是由以下方法制备而获得的：

1)免疫偶联抗原FB₁-BSA的制备

根据戊二醛一步法将FB₁偶联到牛血清白蛋白上，称取1.8mg的BSA蛋白，用0.01mol L^-1 PH 7.4PBS配制蛋白悬浮液，浓度为1mg mL^-1，在磁力搅拌中用蛋白悬浮液溶解FB₁，使用相同体积的2％戊二醛，逐滴加入，室温反应1h，用硼氢化纳终止反应，使硼氢化纳的终浓度为10mg mL^-1，室温反应1h，在4℃，磁力搅拌条件下用PBS透析72h；

2)小鼠免疫

本实验采用小剂量长周期的免疫方案，使用偶联蛋白FB₁-BSA作为免疫抗原，对7周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫，首次免疫每只小鼠的免疫剂量为90μg，与等体积的弗氏完全佐剂混匀后，皮下多点免疫注射，两周后，再用90μg免疫抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混匀后，皮下多点免疫注射，此后每隔两周用90μg免疫抗原与等体积的不完全弗氏佐剂混匀，皮下注射，四次免疫后，腹腔免疫40μg免疫抗原作为加强免疫，3d后取脾细胞进行融合；

3)细胞融合

取Sp2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1∶5～1∶10的比例混合于50mL离心管中，充分混匀，1000rpm离心10min，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散均匀，置40℃水浴预热，用1mL吸管在45s内加完预热至40℃的50％PEG 40001mL，边加边轻轻振荡，然后在90s内加入30mL预热至37℃的1640不完全培养基，室温静置10min，1000rpm离心10min，弃上清，加入20mL含20％FCS和HAT的1640培养基重悬；分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5％CO₂培养箱培养，7d后，观察细胞的生长状况，用含有20％FCS和HT的1640培养基换出1/2培养基；14d后，改用含20％FCS和HT的1640培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/5时，取上清进行抗体检测；

4)杂交瘤筛选

用包被抗原(FB₁-OVA)包被进行间接ELISA，对细胞培养上清进行检测，筛选出对包被抗原呈为阳性的杂交瘤细胞，用包被液为0.05mol L^-1 pH 9.6碳酸盐缓冲液对包被抗原进行倍比稀释，包被ELISA板，100μL/孔，置4℃包被过夜；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以1％明胶封闭每孔，300μL/孔，37℃放置2h；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将细胞上清1∶400稀释的阳性参考血清和1∶400稀释的阴性参考血清，加入相应孔内，100μL/孔，37℃作用60min；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1∶10000稀释的酶标羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃放置60min；PBST洗涤5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB-H₂O₂，100μL/孔，室温避光显色15min；每孔加入100μL 2mol L^-1硫酸终止反应；经酶标仪测定OD_450nm值：以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为阴性参考血清的OD_450nm值，当阴性参考血清的OD_450nm值≤0.1，阳性参考血清的OD_450nm值与阴性参考血清的OD_450nm值的比值≥2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，P/N≥2.1的检测孔判为阳性，1.5≤P/N＜2.1的检测孔判为可疑，P/N＜1.5的检测孔判为阴性；

5)有限稀释法对杂交瘤细胞亚克隆

首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用1640完全培养基稀释成100个细胞/15mL培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.15mL，37℃，5％CO₂培养箱中培养，4～5d后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个克隆生长孔，8～9d时取细胞上清，及时进行ELISA检测；选择阳性的单克隆细胞再进行同样的亚克隆3次以上，直至亚克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性、且各孔检测OD值较接近，将多次亚克隆培养后的阳性孔细胞扩大培养，并冻存，获得稳定分泌FB₁单克隆抗体的杂交瘤细胞株F₃；

6)FB₁单克隆抗体的制备

将液体石蜡注射成年BALB/c小鼠，0.5mL/只，致敏7d后，将阳性杂交瘤细胞株F₃用PBS稀释后注入小鼠腹腔，每只小鼠注射5×10⁶～1×10⁷个细胞，0.2mL，5～10d后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，10000rpm，离心5min，收集上清，小量分装，-70℃保存。

Images