CN103421743B - 抗伏马菌素b1的单克隆重组抗体h7 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物免疫检测技术领域。具体涉及一种分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单克隆重组抗体的制备与应用。将伏马菌素B1分别与载体蛋白KLH和BSA偶联得到抗原，用所得FB1-KLH抗原免疫小鼠，细胞融合后进行选择性培养，利用FB1-BSA偶联物对杂交瘤细胞进行筛选，经亚克隆获得稳定分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C5。通过抗体基因库技术和噬菌体展示技术筛选杂交瘤细胞株2C5的单克隆重组抗体H7。本发明对单克隆抗体和重组抗体进行了大量生产和纯化，所得的2C5单克隆抗体和H7重组抗体可用于伏马菌素的免疫检测。

Description

抗伏马菌素B1的单克隆重组抗体H7

技术领域

本发明属于植物免疫检测技术领域，具体涉及一种抗伏马菌素B1的单克隆重组抗体H7的制备及其应用，所述的杂交瘤细胞株能够分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体，进一步通过基因工程技术制备得到所述的单克隆抗体的重组抗体，该单克隆抗体或制备的重组抗体可应用于伏马菌素的免疫学检测中。

背景技术

伏马菌素(Fumonisins)于1988年首次从串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides(Sacc.)Nirenberg)培养液中分离鉴定出来，是一类由不同多氢醇和丙三羧酸组成结构类似的双酯化合物，包括一个由20个碳组成的脂肪链及通过两个酯键连接的亲水性侧链。到目前为止，已分离鉴定出几十种伏马菌素类似物或异构体，分属于A、B、C、D和P组，其中以B组的FB1、FB2和FB3污染最严重，毒性也最强，可引起鼠肝癌、猪肺水肿和马脑白质软化症，并且是人类的潜在致癌物，国际癌症研究机构(IARC)将其归为2B类。报道有超过15种镰刀菌、以及交链格孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissler f.sp.lycopersici)和黑曲霉(Aspergillus niger)能够产生各种类型的伏马菌素，但串珠镰刀菌(F.verticillioides)和多育镰刀菌(F.proliferatum)是最主要的产毒菌株。伏马菌素能够污染玉米、高粱、水稻、小麦、大麦、黍、菜豆和香料作物等，其中玉米及玉米来源的食品和饲料中含量最大。目前，伏马菌素的污染在世界范围内部有报道，但以我国和南非的部分地区污染最为严重。在我国，调查显示玉米、水稻和小麦三大粮食作物均不同程度的受到伏马菌素的污染。因此，我国玉米等粮食作物中伏马菌素的污染处于高发生率和高含量的严峻态势，而关于伏马菌素的研究也得到社会的广泛关注，成为近20年来食品安全和真菌毒素研究中的热点。

真菌毒素的检测方法较多，主要分为生物学检测、化学检测和免疫学检测。生物学检测常用的有细胞培养实验、种子发芽实验和皮肤毒性试验等，虽然操作简单，但具有特异性差、误差大等缺点，现在应用较少。化学检测方法具有较高的灵敏度、准确性和特异性，但需要较复杂的样品预处理过程和较贵重的仪器设备，不易在欠发达地区和农村推广使用。免疫学方法具备操作简单、费用低、灵敏度高和特异性好等优势，而且开发的快速检测试剂盒和试纸条等携带方便，可随时检测样品，所以免疫检测方法越来越被广泛用于各种样品的检测分析。因此，通过制备抗伏马菌素FB1的单克隆抗体和重组抗体，大量纯化后检测抗体的结合力和特异性，获得高亲和力的单克隆抗体和重组抗体，可为伏马菌素FB1的抗原性研究和免疫学检测方法的建立提供原材料，在此基础上发展的免疫检测方法在食品安全和进出口检验检疫过程中，为检测和调查玉米等粮食作物、饲料以及食品或制品中伏马菌素的污染情况提供快速可靠的检测手段。所以，筛选能够分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株是大量生产单克隆抗体和制备单克隆重组抗体的基础。此外，相对于多克隆抗体和单克隆抗体，重组抗体及其编码基因可通过噬菌体展示技术筛选获得，继而可以在大肠杆菌表达系统中超量表达后提取纯化，其制备过程不需要使用动物，操作简单、省时省力。但是，由于杂交瘤细胞中无功能抗体编码基因的大量存在以及基因重组等因素的影响，直接利用PCR技术从杂交瘤细胞中扩增重组抗体的编码基因，会存在缺失、移码和终止突变等现象，组装后的重组抗体不一定保持原有亲本抗体的活性。而噬菌体展示技术不仅是一个高效筛选体系，也是一个体外成熟过程。因此，本发明通过杂交瘤技术筛选分泌抗伏马菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并在此基础上通过抗体基因库技术和噬菌体展示技术获得高亲和力的单克隆重组抗体，对探索发展有效的伏马菌素检测方法等具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种能够分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并在此基础上分离得到单克隆重组抗体，本发明得到的单克隆抗体或制备的重组抗体可应用于伏马菌素的免疫学检测中。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明是这样实现的：将伏马菌素B1(FB1)分别与钥孔嘁蓝蛋白(KLH)和小牛血清白蛋白(BSA)通过戊二醛一步偶联法制备成一种抗原FB1-KLH偶联物，将所得抗原FB1-KLH偶联物免疫Balb/c小鼠后，取脾淋巴细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合培养，通过选择性培养后利用FB1-BSA偶联物对杂交瘤细胞进行ELISA筛选，再经亚克隆获得能够稳定分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，申请人将其命名为2C5。该杂交瘤细胞株可利用常规的腹水法大量制备含有单克隆抗体的腹水，再经硫酸铵沉淀法纯化得到单克隆抗体2C5，利用ELISA分析抗体的效价，利用表面等离子共振技术(SPR)分析抗体的结合力，对所得的单克隆抗体进行生物学评价。在此基础上，构建杂交瘤细胞的抗体基因文库，通过噬菌体展示技术筛选高亲和力的抗伏马菌素的单克隆重组抗体，经phage ELISA、表达ELISA和SPR鉴定，获得一种抗伏马菌素的单克隆重组抗体及其编码基因，申请人将其命名为H7。

申请人将所得的能够分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C5，于2012年1月6日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为：CCTCC NO：C2011121。

H7单克隆重组抗体编码基因由837个核苷酸编码，其序列为SEQ ID NO：1所示。重链可变区V_H由372个核苷酸编码，其序列为SEQ ID NO：3所示。轻链可变区V_L由342个核苷酸编码，其序列为SEQ IDNO：5所示。

H7单克隆重组抗体序列为SEQ ID NO：2所示，由278个氨基酸组成，本发明的抗伏马菌素的单克隆重组抗体主要由抗体重链可变区V_H、抗体轻链可变区V_L和连接肽组成，抗体重链可变区V_H和抗体轻链可变区V_L通过连接肽(Gly₄Ser)₃连接共同完成对伏马菌素分子的识别和结合。其重链可变区V_H由124个氨基酸组成，序列为SEQ ID NO：4所示，轻链可变区V_L由114个氨基酸组成，其序列为SEQ ID NO：6所示。

本发明提供了2C5单克隆抗体在伏马菌素检测中的应用，其应用过程是：

将在小鼠腹腔内生产纯化的2C5单克隆抗体通过直接竞争酶联免疫反应或制备检测试剂盒或蛋白芯片等应用于伏马菌素的检测。

具体地，在ELISA板孔中加入100μL(1μg)羊抗鼠抗体(购自杭州隆基生物技术有限公司)，于37℃包被2h或4℃过夜；用200μL磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次；加入150μL1％(w/v)浓度的小牛血清白蛋白(BSA)溶液，37℃封闭2h；用200μLPBS洗涤3次；加入100μL纯化的本发明的单克隆抗体(0.2μg/mL)，37℃包被2h；用200μLPBST(含0.1％(v/v)浓度的Tween-20的PBS溶液)和PBS分别洗涤3次；加入100μL按体积比1∶2000稀释的FB1-HRP(伏马菌素FB1和辣根过氧化物酶HRP的偶联物)和FB1毒素标准品(购自Sigma公司)或样品提取液，37℃反应1h；用200μLPBST和PBS分别洗涤3次；加入100μL可溶性单组份TMB底物(购自天根生化科技(北京)有限公司)，黑暗条件下反应15～30min；加入50μL浓度为2M的H₂SO₄溶液终止反应，用酶标仪测OD_450nm读值。竞争ELISA结果显示本发明的单克隆抗体与伏马菌素特异性结合，可根据不同浓度的FB1毒素标准品的OD_450nm读值来绘制标准曲线，再估测样品中的伏马菌素的含量。

H7单克隆重组抗体在伏马菌素检测中的应用，其应用过程是：

将在细菌中表达的H7单克隆重组抗体纯化后，通过直接竞争酶联免疫反应或制备检测试剂盒或蛋白芯片等应用于伏马菌素的检测。

具体地，在ELISA板孔中加入100μL(1μg)羊抗鼠抗体(来源同上)，于37℃包被2h或4℃过夜；用200μLPBS洗涤3次；加入150μL1％(w/v)浓度的BSA溶液，37℃封闭2h；用200μL磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次；加入100μL按体积比1∶3000稀释的抗His单克隆抗体(购自天根生化科技(北京)有限公司)，37℃包被2h；用200μLPBST和PBS分别洗涤3次；加入100μL浓度为200nM纯化的本发明的H7单克隆重组抗体，37℃包被2h；用200μLPBST和PBS分别洗涤3次；加入100μL按体积比1∶2000稀释的FB1-HRP和FB1毒素标准品或样品提取液，37℃反应1h；用200μL PBST和PBS分别洗涤3次；加入100μL可溶性单组份TMB底物，黑暗条件下反应15～30min；加入50μL浓度为2M的H₂SO₄溶液终止反应，用酶标仪测OD_450nm读值。竞争ELISA结果显示本发明的单克隆重组抗体与伏马菌素特异性结合，可根据不同浓度的FB1毒素标准品的OD_450nm读值来绘制标准曲线，再估测样品中的伏马菌素的含量。

本发明的有益效果在于：

1、本发明的有益效果之一是筛选获得能够分泌抗伏马菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株系2C5，该细胞株系可用于大量生产高亲和力的单克隆抗体。

2、本发明的有益效果之二是具有活性的单克隆抗体2C5可通过腹水法大量生产，再采用硫酸铵沉淀纯化。得到的单克隆抗体具有很高的亲和力，可用于伏马菌素的检测分析。

3、本发明的有益效果之三是通过基因工程手段获得的H7单克隆重组抗体可在大肠杆菌中可溶性表达，操作简单，生产成本低。

4、本发明的有益效果之四是H7单克隆重组抗体通过原核表达纯化后可用于伏马菌素的检测分析。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明的单克隆重组抗体H7的核苷酸编码序列，序列长度837bp，编码278个氨基酸。

序列表SEQ ID NO：2是本发明的单克隆重组抗体H7蛋白质的氨基酸序列，由278个氨基酸组成。

序列表SEQ ID NO：3是抗体重链可变区V_H的核苷酸编码序列，序列长度为372bp，编码124个氨基酸。序列表SEQ ID NO：4足抗体重链可变区V_H蛋白质的氨基酸序列，由124个氨基酸组成。

序列表SEQ ID NO：5是抗体轻链可变区V_L的核苷酸编码序列，序列长度为342bp，编码114个核苷酸。序列表SEQ ID NO：6是抗体轻链可变区V_L蛋白质的氨基酸序列，由114个氨基酸组成。

图1：为本发明的技术流程图。

图2：利用ELISA方法检测免疫小鼠抗血清效价。

图3：利用ELISA方法检测纯化前和纯化后腹水中单克隆抗体2C5的结合力。

图4：利用SDS-PAGE电泳检测纯化的2C5和H7抗体。其中：图4中的a图是2C5单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图；图4中的b图是H7单克隆重组抗体的SDS-PAGE电泳图。

图中：M：蛋白质分子质量标准；2C5：单克隆抗体2C5；H7：单克隆重组抗体H7。

图5：为本发明载体pHENHi结构图。

图6：为本发明pHENHi-H7质粒DNA结构图。

图7：利用表面等离子共振技术(SPR)分析2C5和H7抗体的结合力。其中：图7中的a图是2C5单克隆抗体的SPR分析图；图7中的b图是H7单克隆重组抗体的SPR分析图。

具体实施方式

实施例1：抗原制备

采用戊二醛一步偶联法将伏马菌素FB1(购自Sigma公司)与钥孔嘁蓝蛋白(KLH，购自Sigma公司)偶联(KLH-NH₂+OHC-(CH₂)₃-CHO+FB1-NH₂→KLH-N＝HC-(CH₂)₃-CH＝N-FB1)后得到的FB1-KLH偶联物作为免疫抗原，将伏马菌素FB1与小牛血清白蛋白(BSA，购自Sigma公司)偶联(BSA-NH₂+OHC-(CH₂)₃-CHO+FB1-NH₂→BSA-N＝HC-(CH₂)₃-CH＝N-FB1)后得到的FB1-BSA偶联物作为检测筛选抗原。具体操作过程如下：称取1mg KLH溶于1mL PBS(成分：137mM浓度的NaCl，2.7mM浓度的KCl，10mM浓度的Na₂HPO₄，1.8mM浓度的KH₂PO₄，pH7.2～7.4)溶液中，加入0.6mg FB1，充分混匀，逐滴加入等体积2％(v/v)浓度的戊二醛溶液，4℃振荡1h，然后加入0.25mL浓度为1M的甘氨酸溶液封闭1h，偶联物溶液在PBS中透析72h后分装保存于-20℃备用。

实施例2：免疫小鼠

用实施例1制备的抗原FB1-KLH免疫Balb/c小鼠(购自中国科学院武汉病毒研究所实验动物中心)4次。第一次免疫后4周(28天)进行第二次免疫，后三次加强免疫周期为3周。免疫采用背部皮下多点注射，第一次取200μL免疫抗原(100μg)与等体积弗氏完全佐剂混合后免疫，后三次取200μL免疫抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合后免疫。第三次免疫后于第10天尾静脉取血，37℃静置放置1h后于6000r/min离心10min，收集上清(抗血清)进行间接ELISA检测免疫效果(见实施例3)。

实施例3：抗血清滴度检测

具体步骤如下所述：

1)将实施例1制备的抗原FB1-BSA，按体积比1∶400稀释，取100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜。

2)用200μLPBS洗涤ELISA板孔3次，加入150μL1％(w/v)浓度的BSA溶液，37℃水浴封闭2h。

3)用200μLPBS洗涤ELISA板孔3次，分别加入100μL用PBS倍比稀释的抗血清，稀释起始浓度为1∶1000，37℃水浴2h。

4)用200μLPBST(含0.1％(v/v)浓度的Tween-20的PBS溶液)和PBS各洗涤ELISA板孔3次，加入100μL按体积比1∶5000稀释的AP标记羊抗鼠抗体(购自Sigma公司)，37℃水浴1h。

5)用200μLPBST和PBS各洗涤ELISA板孔3次，加入100μL0.2％(w/v)浓度的对硝基苯磷酸二钠(pNPP)显色液，黑暗条件下显色15～30min。

6)加入50μL浓度为3M的NaOH溶液终止反应，在酶标仪上读取OD_405nm吸收值。

从免疫3次后的小鼠取血制备抗血清检测抗体的滴度。用抗原FB1-KLH免疫后，Balb/c小鼠的抗血清滴度分析如图2所示，表明Balb/c小鼠经3次免疫后部产生了较高的抗血清滴度，效价达到1∶512000。

实施例4：骨髓瘤细胞培养

骨髓瘤细胞选用SP2/0细胞(购自武汉纽斯特生物技术有限公司)，融合前两周左右开始复苏细胞，培养直至融合当天细胞处于对数生长期。骨髓瘤细胞的制备方法如下：

1)融合前36～48h，将骨髓瘤细胞在RPMI1640培养基(购自美国Gibco公司)中扩大培养，置4％浓度的CO₂培养箱(购自美国Thermo-Scientific公司)中，37℃恒温培养。

2)融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50mL离心管中。

3)1500r/min离心5min，弃上清。

4)加入30mL不完全培养基(购自美国Gibco公司)，1500r/min离心5min洗涤一次。

5)加入10mL不完全培养基重悬细胞，混匀。

6)取骨髓瘤细胞悬液300μL，加入等体积1mg/mL台盼蓝染液，混匀，用血球计数板计数。

实施例5：饲养层细胞制备

取未免疫的Balb/c小鼠，摘除眼球采血，并制备血清作为抗体检测时的阴性对照。饲养层细胞一般提前一天制备或融合当天制备，其操作过程如下：

1)通过颈脱位处死小鼠，于75％(v/v)浓度的酒精中浸泡5分钟。

2)在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于平皿中，并剥去周围结缔组织。

3)用注射器内芯挤压脾脏，使细胞分散。

4)加入10mL不完全培养基(来源同上)，吹洗细胞数次，制成单细胞悬液。

5)细胞液转移至50mL离心管，1000r/min离心10min，弃上清。

6)加入10mL不完全培养基，1000r/min离心10min，洗涤1～2次。

7)加入10mL不完全培养基重悬细胞，混匀。

8)取300μL细胞悬液，加入等体积浓度为1mg/mL的台盼蓝染液，混匀，用血球计数板计数。

9)吸取细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔100μL，置4％浓度的CO₂培养箱中，37℃恒温培养。

实施例6：脾淋巴细胞的制备

取实施例2免疫后的Balb/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照。脾淋巴细胞的制备方法与饲养层细胞的制备方法相同，见实施例5。

实施例7：细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养

1)将1×10⁸脾淋巴细胞(实施例6制备)与2×10⁷～5×10⁷骨髓瘤细胞SP2/0(实施例4制备)混合于50mL融合管中，补加不完全培养基(来源同上)至30mL，充分混匀。

2)在1000r/min下离心10min，吸净上清。

3)轻弹融合管底，使沉淀细胞松散均匀。

4)用1mL吸管在1min左右加入800μL37℃预热的浓度为45％(w/v)的聚乙二醇(PEG)4000(pH8.0)，边加边轻轻转动融合管。

5)用10mL吸管在90s内加入20mL37℃预热的不完全培养基。

6)1000r/min离心8min，弃上清。

7)轻弹管底使沉淀细胞松散，缓慢加入60mL37℃预热的HAT培养基(购自美国Gibco公司)悬浮细胞。

8)将细胞悬浮液转移至大瓶中，补加HAT培养基至80～100mL，混匀。

9)吸取100μL加入已经制备好的96孔饲养层细胞培养板(实施例5制备)中，置4％浓度的CO₂培养箱内，37℃恒温培养。

10)培养5天后用HAT培养基置换出培养孔中的1/2培养基。

11)培养7～10天后用HT培养基(购自美国Gibco公司)置换出培养孔中的HAT培养基。

12)观察杂交瘤细胞的生长情况，待细胞长至孔底面积1/10以上时取上清检测(方法见实施例3)。

实施例8：杂交瘤细胞筛选

利用ELISA方法(具体操作见实施例3所述)检测细胞培养液上清，筛选杂交瘤细胞。

实施例9：杂交瘤细胞的亚克隆

1)制备饲养层细胞，具体方法参见实施例5。

2)制备待克隆的杂交瘤细胞悬液：用10mL含20％(v/v)浓度的血清的HT培养基(来源同上)稀释200个杂交瘤细胞，滴加入制备好的饲养层细胞中，每孔杂交瘤细胞亚克隆至96孔细胞培养板中。

3)将培养板置4％浓度的CO₂培养箱中，37℃培养7～10天，在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清检测(试验方法见实施例3所述)。

4)取步骤3中单克隆抗体检测为阳性孔的杂交瘤细胞进行扩大培养，并液氮冻存。

将免疫小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合培养，杂交瘤细胞经ELISA法筛选和有限稀释法亚克隆后，获得能分泌抗伏马菌素B1的且亲和力高的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C5。

实施例10：利用腹水法大量制备单克隆抗体

1)将同系成年Balb/c小鼠腹腔接种液体石蜡，每只小鼠300～500μL。

2)7～10天后，用500μL PBS稀释的杂交瘤细胞(3×10⁵)进行腹腔接种。

3)间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，用手触摸时皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，可连续采集2～3次。

4)将步骤3所得腹水3000r/min进行离心10min，收集上清。

5)利用ELISA方法检测纯化前的单克隆抗体效价(具体方法见实施例3所述)，分装后于-70℃下冻存备用。

采用ELISA方法检测小鼠腹水中单克隆抗体的结果如图3所示。从图中可以看出，腹水中的单克隆抗体2C5对伏马菌素B1有较高的结合力。

实施例11：利用硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体

1)将实施例10所得的腹水加入2倍体积PBS进行稀释。

2)将硫酸铵按照0.277g/mL浓度加入到步骤1的腹水稀释液中，添加过程中在冰浴下搅拌。

3)于4℃静置2h或过夜。

4)在12000r/min下离心10min，弃上清。

5)用PBS复溶至原体积，重复步骤2～4。

6)用适量PBS溶解，测定浓度，加入50％(v/v)浓度的甘油分装后于-70℃冻存备用。

5)采用ELISA方法检测纯化后的单克隆抗体的结合力(方法见实施例3)。

采用ELISA方法检测纯化的单克隆抗体如图3所示。由ELISA结果可以看出，从腹水中纯化的单克隆抗体2C5对伏马菌素仍保持很高的结合力，其梯度稀释检测的曲线与腹水检测结果保持一致，说明硫酸铵沉淀纯化过程未明显影响抗体的结合力。因此，杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体2C5具有很高的活性，可用于伏马菌素B1的检测。

实施例12：SDS-PAGE电泳检测纯化的单克隆抗体

1)取2μL实施例11纯化的单克隆抗体，加入2.5μL5×十二烷基硫酸钠(SDS)加样缓冲液(成分：250mM浓度的Tris-HCl(pH6.8)，10％(w/v)浓度的SDS(电泳级)，0.5％(w/v)浓度的溴酚蓝，50％(v/v)浓度的甘油，5％(w/v)浓度的β-巯基乙醇)，充分混匀，水浴煮沸5min，然后置于冰上备用。

2)参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法制备分离胶和浓缩胶。

3)安装蛋白垂直电泳系统(购自BIO-RAD公司)，加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(成分：25mM浓度的Tris，250mM甘氨酸，0.1％(w/v)浓度的SDS)，取放置在冰上的样品上样。

4)先设置电压80伏电泳20min，再用120伏电压电泳80～120min至溴酚蓝跑至分离胶外。

5)取下凝胶，去掉浓缩胶后用染色液(成分：0.1％(w/v)浓度的考马斯亮蓝R-250，25％(v/v)浓度的异丙醇，10％(v/v)浓度的冰醋酸)染色30min。

6)用脱色液(成分：5％(v/v)浓度的甲醇，7.5％(v/v)浓度的冰醋酸)脱色3～5次，观察照相。

SDS-PAGE电泳检测结果如图4中的a图所示，可见在约25kDa和50kDa大小的位置分别有一条目的蛋白条带，而且纯化的单克隆抗体纯度较高。

实施例13：杂交瘤细胞总RNA提取

1)用实施例8筛选并经实施例9亚克隆获得的阳性杂交瘤细胞株在24孔细胞培养板中扩大培养。

2)将细胞悬浮，转移至50mL离心管中，4℃，1500r/min离心5min，弃上清。

3)加入10mL RPMI-1640培养基(购自美国Gibco公司)重悬细胞，4℃，1500r/min离心5min，弃上清。

4)吸取细胞液转移至2mL离心管中，4℃，1500r/min离心5min，吸尽培养基上清，轻弹管底使细胞分散。

5)加入2mL TRNzol-A+(购自天根生化科技(北京)有限公司)，用移液器混匀后立即用0.7～0.8mm注射器吹吸5次以上，使细胞裂解，匀浆液分装到1.5mL离心管中(1mL/管)。

6)每管加入200μL氯仿，用力摇晃15s后在室温下孵育5min。

7)4℃，11000r/min离心15min。

8)取500μL上清液转移到另一离心管中，加入等体积异丙醇，室温下沉淀10min。

9)4℃，11000r/min离心15min，弃上清。

10)加入1mL浓度为75％(v/v)的乙醇洗涤RNA沉淀一次。

11)4℃，8500r/min离心5min。

12)去上清，室温干燥10～20min，加入20μL无RNase超纯水溶解RNA。

实施例14：反转录合成cDNA

以mRNA为模板，用Oligo(dT)_12-18引物和SuperScript III反转录酶合成单克隆抗体编码基因cDNA第一链。其操作过程如下：

1)在离心管中加入特异引物或Oligo(dT)_12-18引物、RNA和dNTPs(10mM)各1μL，补加无RNase超纯水10μL混匀。

2)65℃水浴5min，立即取出放在冰上孵育1min。

3)轻微离心后加入5×First-strand Buffer4μL，0.1mol/L DTT、RNA酶抑制剂和III反转录酶(200U/μL)各1μL，混匀。

4)50℃水浴1h。

5)70℃水浴15min使酶失活，保存于-70℃备用。

实施例15：PCR扩增重链可变区(V_H)、轻链可变区(V_L)及单链抗体(scFv)基因

1)PCR扩增重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)基因

以实施例14反转录合成的cDNA为模板，利用表1所述的正向混合引物MVHF1～10和反向混合引物MVHB1～4分别进行PCR扩增，获得抗体的重链可变区片段(V_H)；利用正向混合引物MVLF1～5和反向混合引物MVLB1～3进行PCR扩增，获得κ轻链可变区片段(V_κ)；利用引物对MVLF6和MVLB4进行PCR扩增，获得λ轻链可变区片段(V_λ)。在50μLPCR反应液中，含有4μLcDNA，5μLPCR缓冲液(含Mg²⁺)，8μL浓度为1.25mM的dNTPs，2μL正向(混合)引物(10μM)，2μL反向(混合)引物(10μM)，2.5U Taq聚合酶(购自北京全式金生物技术有限公司)。PCR反应条件为：95℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃80sec，30个循环；最后72℃10min。

2)用DNA凝胶回收试剂盒(购自QIAGEN公司，按照该试剂盒的说明书操作)分别纯化步骤1扩增得到的V_H和V_L(V_κ或V_λ)片段。

3)SOE-PCR扩增单链抗体(scFv)基因

加入近等摩尔浓度的V_H和V_L片段作为模板，用表1所述的正向混合引物MVHF1～10和反向混合引物MVLB1～4进行SOE-PCR扩增，获得scFv基因。SOE-PCR分两步反应完成，第一步反应在50μLPCR反应液中，含有V_H和V_L片段各400ng，5μL PCR缓冲液(含Mg²⁺)，8μL浓度为1.25mM的dNTPs，2.5U Taq聚合酶。PCR反应条件为：95℃5min，55℃2min，72℃15min，7个循环；第二步反应在50μLPCR反应液中，含有10μL第一步反应PCR产物，4μL PCR缓冲液(含Mg²⁺)，8μL浓度为1.25mM的dNTPs，2μL正向混合引物(10μM)，2μL反向混合引物(10μM)，2.5UTaq聚合酶。PCR反应条件为：95℃5min；94℃1min，55℃80sec，72℃2min，30个循环；最后72℃10min。

4)用DNA凝胶回收试剂盒纯化回收步骤3获得的scFv基因。

表1.PCR扩增及测序所用引物序列表

实施例16：pHENHi载体及scFv片段酶切、连接

1)分别用SfiI和NotI限制性内切酶(购自NEB公司，按照该酶的说明书操作)进行双酶切pHENHi载体(Peschen D，Li HP，et al.Fusion proteins comprising a Fusarium-specific antibody linked to antifungalpeptides protect plants against a fungal pathogen.Nat Biotechnol，2004，22：732-738，如图5所示)和实施例15得到的scFv基因。

2)用DNA凝胶回收试剂盒(购自QIAGEN公司，按照该试剂盒的说明书操作)纯化步骤1酶切后的pHENHi载体和scFv片段。

3)用T4DNA连接酶(购自NEB公司，按照该酶的说明书操作)连接步骤2回收的pHENHi载体和scFv片段，得到酶连接产物pHENHi-scFv。

4)参照J萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法对步骤3得到的酶连接产物pHENHi-scFv进行乙醇沉淀除盐。

实施例17：单克隆重组抗体基因文库构建

1)大肠杆菌XL1-Blue MRF’感受态细胞制备

用无菌牙签蘸取大肠杆菌菌株XL1-Blue MRF’(购自武汉凯胜生物技术有限公司)，在LB固体培养基(成分：1％(w/v)浓度的胰蛋白胨，0.5％(w/v)浓度的酵母提取物，1％(w/v)浓度的NaCl，1.5％(w/v)浓度的琼脂，pH7.0)平板上划线，于37℃恒温箱培养16h后，挑取一单克隆菌落接种到5mL LB液体培养基(成分：1％(w/v)浓度的胰蛋白胨，0.5％(w/v)浓度的酵母提取物，1％(w/v)浓度的NaCl，pH7.0)中，37℃，200r/min振荡过夜培养16h。取1.6mL菌液加入到160mL LB液体培养基中，37℃，230r/min振荡培养至OD_600nm达到0.45左右时，取出培养菌的三角瓶置于冰上冷却30min后，将菌液分装于50mL离心管中，4℃，4000r/min离心15min，弃上清，然后用30mL预冷的10％(v/v)浓度的甘油洗涤菌体沉淀两次(4℃，4000r/min离心15min后弃上清)。最后每个离心管中加入100μL预冷的GYT培养基(成分：0.25％(w/v)浓度的胰蛋白胨，0.125％(w/v)浓度的酵母提取物，10％(v/v)浓度的甘油)悬浮菌体，分装成100μL/管，立即保存于-80℃冰箱。

2)电转化酶连接产物

将-80℃保存的大肠杆菌XL1-Blue MRF’感受态细胞取出，置冰上溶化后，每管感受态细胞(100μL)中加入5μL酶连接产物pHENHi-scFv，小心轻微地混匀后放冰上静置3min，然后将感受态细胞转移至冰上预冷的电转化杯(0.2cm)(购自BIO-RAD公司)中，用BIO-RAD公司的MicroPulser^TM电转化仪进行电转化(设置Bacteria Ec2程序)。转化后立即加入1mL SOC培养基(成分：2％(w/v)浓度的胰蛋白胨，0.5％(w/v)浓度的酵母提取物，0.05％(w/v)浓度的NaCl，20mM浓度的葡萄糖，pH7.0)到电转化杯中，并将菌液转移至离心管中，37℃，200r/min振荡培养1h使细胞复苏。

3)电转化感受态细胞涂布平板培养

取出复苏后的感受态细胞，取100μL涂布于含1％(w/v)浓度的葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基平板用于计算单克隆菌落数。其余的菌液通过6000r/min离心1min后吸弃部分上清，每管保留约100～150μL上清重悬菌体，涂布于含1％(w/v)浓度的葡萄糖和100μg/mL Amp的LB固体培养基平板，置于37℃恒温箱过夜培养12～16h至长出单克隆菌落。

4)抗体基因文库收集保存

计算电转化感受态细胞涂布平板培养后长出的单克隆菌落数量，估算抗体基因文库容量。收集LB固体培养基平板上长出的菌落，加入等体积50％(v/v)浓度的甘油保存于-80℃冰箱。

实施例18：噬菌体展示筛选单克隆重组抗体基因文库

1)取500μL实施例17保存的单克隆重组抗体基因文库，加入到50mL含1％(w/v)浓度的葡萄糖和100μg/mLAmp的2×TY培养基(成分：1.6％(w/v)浓度的胰蛋白胨，1％(w/v)浓度的酵母提取物，0.5％(w/v)浓度的NaCl，pH7.0)中，37℃，200r/min振荡培养至OD_600nm达到0.5。

2)取5mL菌液于50mL离心管中，加入0.5μLM13KO7辅助噬菌体(购自Amersham Biosciences公司，参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法制备保存，其中：噬菌体的量为大肠杆菌的20倍)，混匀后于37℃水浴静置30min。

3)在4000r/min下离心10min，弃上清，然后重悬于140mL含100μg/mLAmp和25μg/mL卡那霉素(Kan)的2×TY培养基中，30℃，200r/min振荡过夜培养至少15h。

4)将过夜培养的菌液分装于50mL离心管中，4℃，4000r/min离心30min。

5)取上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液(成分：20％(w/v)浓度的PEG6000，2.5M浓度的NaCl)，充分混匀后放置冰上1h。

6)4℃，8000r/min离心30min，弃上清，将沉淀重悬于40mL无菌水中，并加入1/5体积的PEG/NaCl溶液，充分混匀后4℃放置20min。

7)4℃，4000r/min离心30min，弃上清。

8)轻微离心，去除残留的PEG/NaCl溶液。

9)加入1.6mL无菌水重悬沉淀，4℃，12000r/min离心10min，取上清于4℃保存。

10)用20ng/μL抗原FB1-BSA(第二轮和第三轮淘选时的浓度分别为15ng/μL和10ng/μL)包被ELISA板(共20孔，每孔100μL)，37℃水浴2h。

11)用200μL PBS洗涤3次。

12)每孔加入150μL浓度为2％(w/v)的BSA溶液，37℃水浴封闭2h。

10)用200μLPBS洗涤3次，每次3min。

11)每孔中加入100μL步骤9保存的上清(噬菌体)，37℃水浴2h。

12)用200μLPBST和PBS分别洗涤5次，每次3min(第二轮和第三轮淘选时增加洗涤次数至10次和15次，且第三轮PBST中的Tween20的浓度增加至0.5％(v/v))。

13)每孔加入100μL浓度为100mM的三乙胺溶液，室温放置10min。

14)立即加入50μL浓度为1M的Tris-HCl溶液(pH7.4)中和，并转移至50mL离心管中。

15)取6mL在37℃，230r/min振荡培养条件下生长至OD_600nm达到0.5～0.9的大肠杆菌XL1-Blue MRF’加入到50mL离心管中，37℃水浴侵染30min。

16)4000r/min离心10min，弃上清。

17)加入800μL LB培养基重悬菌体后涂布于TYE固体培养基(成分：1％(w/v)浓度的胰蛋白胨，0.5％(w/v)浓度的酵母提取物，0.8％(w/v)浓度的NaCl，1.5％(w/v)浓度的琼脂，pH7.0)平板上，37℃恒温箱过夜培养12～16h至长出菌落。

18)收集TYE固体培养基平板上长出的菌落，进行下一轮淘选或加入等体积50％(v/v)浓度的甘油保存于-80℃冰箱。

实施例19：Phage ELISA鉴定淘选抗体库

1)在96孔细胞培养板孔中加入180μL含1％(w/v)浓度的葡萄糖和100μg/mLAmp的2×TY培养基，用灭菌牙签从第三轮淘选抗体库的菌落中随机挑取48个单克隆接种，30℃，150r/min振荡过夜培养16h。

2)在另一96孔培养板孔中加入180μL2×TY培养基(含1％(w/v)浓度的葡萄糖，100μg/mL浓度的Amp以及约10⁸辅助噬菌体M13KO7)，再加入20μL过夜培养菌液，37℃，150r/min振荡培养2h。

3)室温条件下1800r/min离心10min，弃上清。

4)加入180μL含100μg/mLAmp和50μg/mL Kan的2×TY培养基至培养板孔中，37℃，150r/min振荡过夜培养16h。

5)1800r/min离心10min，培养基上清用于phage ELISA检测。

6)在ELISA板孔中加入100μL浓度为2μg/mL的FB1-BSA或PBS(对照)，37℃水浴包被2h。

7)用200μL PBS洗涤3次。

8)加入150μL浓度为1％(w/v)的BSA溶液，37℃水浴封闭2h。

9)用200μL PBS洗涤3次。

10)加入50μL步骤5收集的培养基上清，并加入50μL浓度为1％(w/v)的BSA溶液，37℃反应2h。

11)用200μL PBST和PBS分别洗涤3次。

12)加入100μL按体积比1∶5000稀释的HRP标记鼠抗M13抗体(购自Amersham Biosciences公司)，37℃反应2h。

13)用200μL PBST和PBS分别洗涤3次。

14)加入100μL可溶性单组份TMB底物(购自天根生化科技(北京)有限公司)，黑暗条件下反应15～30min。

15)加入50μL浓度为2M的H₂SO₄溶液终止反应，用酶标仪测OD_450nm读值。

Phage ELISA鉴定的阳性克隆送到南京金斯瑞生物科技有限公司测序，结果显示来源于杂交瘤细胞株2C5的单克隆重组抗体为H7，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。含有该基因的大肠杆菌被命名为重组大肠杆菌XL1-Blue MRF’/pHENHi-H7(即含有pHENHi-H7质粒DNA(如图6所示)的大肠杆菌XL1-Blue MRF’菌株)，单克隆培养菌液培养液中，加入等体积50％(v/v)浓度的甘油保存于-80℃冰箱。

实施例20：重组大肠杆菌超量表达、纯化H7单克隆重组抗体

1)取5μL实施例19保存的重组大肠杆菌XL1-Blue MRF’/pHENHi-H7接种于20mL含1％(w/v)浓度的葡萄糖和100μg/mLAmp的2×TY培养基中，37℃，200r/min振荡过夜培养12h。

2)取8mL过夜培养菌液加入160mL含1％(w/v)浓度的葡萄糖和100μg/mLAmp的2×TY培养基中，37℃，200r/min振荡培养至OD_600nm达到0.5左右。

3)加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，置于30℃，200r/min诱导表达8h。

4)取培养菌液分装到50mL离心管中，4℃，5000r/min离心10min，弃上清。

5)每管中加入500μLPPP溶液(成分：30mM浓度的Tris-HCl，20％(w/v)浓度的蔗糖，pH8.0)重悬菌体，再加入1μL终浓度为1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，冰上放置15min。

6)4℃，5000r/min离心15min，上清装入另一离心管中。

7)每管中加入1mL终浓度为5mM的MgCl₂溶液重悬菌体，再加入2μL终浓度为1mM的EDTA溶液，冰上放置15min。

8)4℃，5000r/min离心15min，上清与步骤6上清合并。

9)取收集步骤6和8上清的离心管于4℃，12000r/min离心15min。

10)取上清用PBS透析72h。

11)安装纯化柱(购自BIO-RAD公司)，加入400μL充分混匀的基质(购自QIAGEN公司)，使其固定2h以上。

12)剪去下端封口，使液体流下，用5mL PBS进行平衡。

13)加入步骤10透析后的样品(单克隆重组抗体)过柱，收集保存过柱后的样品流出液。

14)加入1mL缓冲液B(成分：50mM浓度的NaH₂PO₄，300mM浓度的NaCl，20mM浓度的咪唑，pH8.0)洗脱纯化柱3次，分别收集洗脱液为B1、B2和B3(杂蛋白)。

15)加入400μL缓冲液C(成分：50mM浓度的NaH₂PO₄，300mM浓度的NaCl，250mM浓度的咪唑，pH8.0)洗脱纯化柱3次，分别收集洗脱液为C1、C2和C3(目的蛋白)。

16)加5mL PBS平衡纯化柱后，加入1mL30％(v/v)浓度的酒精，4℃保存纯化柱。

17)单克隆重组抗体取10μL通过SDS-PAGE电泳检测(具体操作见实施例12所述)后，用PBS透析。

SDS-PAGE电泳检测结果如图4中的b图所示，可见有一条约32kDa大小的目的蛋白条带，表达的H7单克隆重组抗体纯度较高，完整性好。

实施例21：利用表面等离子共振技术(SPR)测定2C5和H7抗体的结合力

1)按照GE Healthcare公司的BIAcore T200的操作手册安装芯片，设定工作温度为25℃，注射运行1×HBS-EP缓冲液(成分：10mM浓度的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，pH7.4)，0.15M浓度的NaCl，3mM浓度的EDTA，0.005％(v/v)浓度的表面活性剂P20)，流速为10μL/min，初始化传感芯片3～4次，2～3min后得到稳定基线。

2)以10μL/min的速度注入浓度为8μg/mL的抗原蛋白(FB1-BSA)1min，使其与芯片结合。

3)抗体分别以不同的浓度(4、16、64、256、1024nM)和30μL/min的速度注射到FB1-BSA的表面。

4)结合和解离时间分别为4min和10min。

5)注射浓度为10mM的甘氨酸溶液(pH2.0)30s，再生芯片。

6)通过随机附送的BIAcore T200evaluation软件模拟分析抗体的结合力。

采用SPR分析的结果如图7所示，利用BIAcore T200evaluation软件模拟分析后得到的抗体的结合动力学参数见表2。2C5和H7抗体与伏马菌素结合的动力学常数(K_D)分别达到5.38×10^-8M和2.00×10^-7M，说明2C5和H7抗体都具有很高的结合力，可用于伏马菌素污染的检测应用。

表2SPR测定2C5和H7抗体的动力学常数

注：k_a：结合常数；k_d：解离常数；K_D：动力学常数(K_D＝k_d/k_a)

实施例22：纯化的单克隆重组抗体H7用于伏马菌素的检测

1)在ELISA板孔中加入100μL浓度为1μg/mL的FB1-BSA，37℃水浴包被2h。

2)用200μL PBS洗涤3次。

3)在抗原包被的孔及对照孔中分别加入150μL浓度为1％(w/v)的BSA溶液，37℃水浴封闭2h。

4)用200μL PBS洗涤3次。

5)在抗原包被孔及其对照孔中分别加入100μL浓度为200nM的实施例20纯化的H7抗体，37℃反应2h。

6)用200μL PBST和PBS分别洗涤3次。

7)每孔加入100μL按体积比1∶5000稀释的抗His单克隆抗体(购自天根生化科技(北京)有限公司)，37℃反应1.5h。

8)用200μL PBST和PBS分别洗涤3次。

9)每孔加入100μL按体积比1∶5000稀释的AP标记羊抗鼠IgG抗体(购自Sigma公司)，37℃反应1.5h。

10)用200μL PBST和PBS分别洗涤3次。

11)每孔加入100μL浓度为0.2％(w/v)的pNPP溶液，黑暗条件下反应15～30min。

12)每孔加入50μL浓度为3M的NaOH溶液终止反应，用酶标仪测OD_405nm读值。

加入pNPP显色液显色30min后，样品OD_405nm平均读值(0.642)与阴性对照OD_405nm平均读值(0.046)之比P/N＝14，说明经大肠杆菌大量表达纯化的H7单克隆重组抗体对伏马菌素仍保持很高的亲和力，可用于伏马菌素的检测。

Claims (2)

1.一株分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C5，其特征在于，该杂交瘤细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为：CCTCC NO：C2011121。 

2.一种抗伏马菌素B1的单克隆重组抗体H7，其特征在于，所述的单克隆重组抗体H7的编码核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，其还具有下列特征： 

所述的H7单克隆重组抗体主要由抗体重链可变区V_H，抗体轻链可变区V_L和连接肽组成，所述的抗体重链可变区V_H和抗体轻链可变区V_L通过连接肽(Gly₄Ser)₃连接共同完成伏马菌素的识别和结合， 

其中： 

所述的抗体重链可变区VH由372个核苷酸编码，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示； 

所述的抗体重链可变区VH由124个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示； 

所述的抗体轻链可变区VL由342个核苷酸编码，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示； 

所述的抗体轻链可变区VL由114个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示。