CN103555732B - 黄曲霉特异性单链抗体的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

黄曲霉特异性单链抗体的制备方法和应用本发明属于食品有害生物分子检测领域，涉及一种黄曲霉特异单链抗体的制备方法及应用。将黄曲霉菌丝细胞壁蛋白分别免疫鸡和小鼠，提取免疫后的鸡脾脏淋巴细胞的信使RNA，构建鸡源单链抗体文库，通过噬菌体表面展示技术筛选文库后得到了对黄曲霉具有高亲和力的曲霉属特异性单链抗体基因。将该抗体基因亚克隆至碱性磷酸酶蛋白表达载体中并在大肠杆菌中表达纯化，得到融合蛋白和分泌黄曲霉特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞2A8。以单抗为捕获抗体，AfSA4-AP融合蛋白为检测抗体，建立SandWich？ELISA免疫学检测系统可检测作物及储藏植物源产品中黄曲霉污染。

Description

黄曲霉特异性单链抗体的制备方法和应用

技术领域

本发明属于食品有害微生物分子检测技术领域，具体涉及一种黄曲霉特异单链抗体和单克隆抗体的制备方法及其在黄曲霉免疫学检测中的应用。

背景技术

黄曲霉（Aspergillusflavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）是广泛分布的产生黄曲霉毒素的丝状真菌，可以侵染花生（ArachishypogaeaL.）、玉米（ZeamaysL.）、棉花（Gossypiumspp.）等引起多种作物的病害，危害粮食和经济作物的生产，造成严重的经济损失。在粮食储藏以及食品和饲料的加工、运输等环节也及易发生黄曲霉和寄生曲霉的污染，导致黄曲霉毒素的积累，从而严重威胁人畜健康及食品安全。黄曲霉毒素主要有AFB₁,AFB₂,AFG₁,AFG₂四种类型，主要由黄曲霉和寄生曲霉产生，在我国华南、华中、华北地区产毒菌株分布较广。黄曲霉毒素是真菌生长过程中的次级代谢产物，具有强烈的急性毒性和强烈的致癌、致畸作应，被国际癌症研究机构（IARC）认定为Ⅰ类致癌物。此外，黄曲霉菌是仅次于烟曲霉（A.fumigatus）的可引起人畜侵袭性曲霉病的第二大类病原菌，严重危害人畜健康。黄曲霉毒素非常稳定，高温（200℃）处理、紫外照射都不能使其分解，一旦发生污染很难进行除去。因此，快速有效的对黄曲霉、寄生曲霉检测方法对于监测农作物病害发生、从源头上控制黄曲霉毒素的污染具有重要意义。本发明选用的抗原制备菌株是高产毒的黄曲霉菌株。

目前对黄曲霉、寄生曲霉的监测方法主要是传统生物学方法（如：传统培养基法）、分子检测（如：PCR）、免疫学检测（如：ELISA）。传统培养基法耗时太长，PCR分子检测方法需要特殊的仪器和器材，需专门提取样品的DNA，样品前处理步骤繁琐，操作人员需要具备专门技能。此外，这些传统检测方法的现场实时监测及检测方法的微型化都受到限制。酶联免疫吸附法（ELISA）检测具有较高的特异性和灵敏度，样品不需要复杂的前处理，便于微型化操作和进行现场实时监测，不受仪器设备和专业操作人员的限制。ELISA检测中常用的酶标二抗为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）标记的抗体，一般通过化学交联的方法将催化酶标记到抗体上。具有随机反应特点的化学交联过程所产生的交联位点可能会影响抗体与抗原的结合，导致抗体特异性和亲和力下降，对交联反应的优化和酶标抗体的质量检测也会导致生产成本的提高。利用生物技术得到的单链抗体（scFv）具有单克隆抗体的同质性的特点并且基因编码序列明确，同时可以通过微生物发酵进行大量生产。此外，还可以通过基因工程手段对单链抗体进行改造，可以得到抗体和酶的融合蛋白，这种同时具有抗原识别能力和酶催化活性的双功能蛋白可以极大促进ELISA检测方法的应用。本发明通过免疫鸡，在克隆鸡的抗体基因基础上构建了单链抗体噬菌体展示文库，利用噬菌体展示方法对文库进行了筛选之后得到了可以识别黄曲霉和寄生曲霉的单链抗体基因。通过免疫小鼠制备了一株可分泌黄曲霉特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过对单链抗体基因进行基因工程改造得到了scFv-AP融合蛋白并在大肠杆菌中进行大量表达。该scFv-AP融合蛋白可以与黄曲霉特异单克隆抗体配套使用在双抗体夹心ELISA检测当中。该检测方法灵敏度高，不需要额外的酶标二抗操作简便迅速，可以应用于农作物种植、粮食储藏、食品和饲料加工等领域中的对黄曲霉和寄生曲霉污染的检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，其目的之一在于提供一种黄曲霉特异单链抗体基因，该基因利用噬菌体展示技术从免疫后的鸡源单链抗体文库中获得，申请人将该基因命名为AfSA4，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示（长度为756bp），其编码的蛋白质的氨基酸的序列如序列表SEQIDNO：2所示。本发明的黄曲霉特异单链抗体基因由轻链可变区和重链可变区组成，轻链可变区V_L由312个核苷酸编码，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示（长度为390bp）；重链可变区V_II由390个核苷酸编码，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示（长度为312bp）。

本发明的目的之二在于提供了一种黄曲霉特异单链抗体蛋白，其蛋白质的序列如SEQIDNO：2所示，其轻链可变区V_L由104个氨基酸编码，序列如SEQIDNO：4所示；重链可变区V_II由130个氨基酸编码，其序列如SEQIDNO：6所示，轻链可变区和重链可变区由连接肽（GGSSRSSSSGGGGSGGGG）连接。

本发明的目的之三在于提供了一种黄曲霉特异单链抗体蛋白与碱性磷酸酶的融合基因，申请人将其命名为AfSA4-AP，其序列如SEQIDNO：7所示（长度为2175bp）。

本发明的目的之四在于提供了一种黄曲霉特异单链抗体蛋白与碱性磷酸酶的融合蛋白，其编码序列如SEQIDNO：8所示（编码725个氨基酸）。单链抗体和碱性磷酸酶之间通过连接肽（SSGSTSGSGKPGSGEGST）连接。

本发明的目的之五在于提供了一种能够分泌抗黄曲霉的单克隆抗体杂交瘤细胞株2A8。

本发明的目的之六在于提供了一种新型的黄曲霉和寄生曲霉的双抗体夹心酶联免疫检测方法（SandwichELISA），以单克隆抗体2A8作为捕获抗体，以融合蛋白AfSA4-AP作为检测抗体。

具体地，为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

从黄曲霉菌菌丝细胞壁中提取可溶性细胞壁蛋白（SCWPs），用细胞壁蛋白免疫来亨母鸡，利用分子克隆的技术和方法构建了鸡源单链抗体噬菌体展示文库，然后利用噬菌体展示技术筛选得到了高亲和力单链抗体AfSA4，并进一步构建了融合蛋白AfSA4-AP。与此同时，用细胞壁蛋白免疫的Balb/c小鼠后，利用杂交瘤细胞融合技术筛选得到了抗黄曲霉的单克隆抗体杂交瘤细胞株2A8。单克隆抗体2A8（捕获抗体）和单链抗体融合蛋白AfSA4-AP（检测抗体）可以配套应用与黄曲霉菌的检测当中。

一种黄曲霉特异单链抗体基因，其制备过程如下：

从培养的黄曲霉菌丝中制备可溶性细胞壁蛋白SCWPs，然后免疫来亨母鸡，在获得满意抗体效价后提取脾脏和骨髓淋巴细胞的mRNA并逆转录成cDNA，然后从cDNA中经PCR扩增得到鸡抗体的重链可变区基因（V_II）和轻链可变区基因（V_L）片段，以及单链抗体基因（scFv）。将scFv基因亚克隆至噬菌粒载体pComb3X上，电转化至大肠杆菌XL1-BlueMRF′得到单链抗体噬菌体展示文库。单链抗体噬菌体展示文库经过噬菌体展示筛选、表达ELISA鉴定和单链抗体基因序列分析后得到一种高亲和力单链抗体基因，将其命名为AfSA4，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，序列长度为756bp。

一种黄曲霉特异单链抗体蛋白，其制备过程如下：

将含有黄曲霉特异单链抗体基因AfSA4的pComb3X载体（pComb3X-AfSA4）转化至大肠杆菌TOP10中，经诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后，利用Ni-NTA亲和层析纯化获得AfSA4抗体蛋白。SDS-PAGE电泳检测结果（图6）表明AfSA4抗体蛋白分子量大小约为35kD，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

一种黄曲霉特异单链抗体在黄曲霉菌和寄生曲霉菌检测中的应用，其应用过程如下：

将达到纯化的AfSA4抗体通过间接酶联免疫反应（IndirectELISA）检测方法或制备成检测试剂盒、试纸条和蛋白芯片等应用于黄曲霉菌和寄生曲霉菌的检测。

1）将100μl黄曲霉菌或寄生曲霉菌SCWPs（制备方法见实施例1）（10μg/ml）加入ELISA板孔中，37℃温浴2h或4℃放置过夜，进行抗原包被。

2）每个ELISA板孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

3）将300μl封闭液（含2%（W/V）脱脂奶粉的PBS溶液（成分：137mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa₂HPO₄，1.8mMKH₂PO₄，pH7.2～7.4），加入到抗原包被孔和空白对照孔中，于37℃封闭2h。

4）每孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

5）每孔加入100μl稀释在封闭液中的AfSA4抗体（200nM），37℃温浴2h。

6）每孔用300μlPBST（含0.05%Tween20的PBS）洗涤3次，每次30sec。

7）每孔加入100μl稀释在封闭液中的鼠抗HA标签抗体（购自北京康为世纪生物科技有限公司，体积比为1：10,000），37℃温浴2h。

8）每孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

9）每孔加入100μl稀释在封闭液中的AP标记羊抗鼠IgG抗体（购自美国Sigma公司，体积比为1：10,000），37℃温浴2h。

10）每孔用300μlPBST和PBS分别洗涤3次，每次30sec。

11）每孔加入100μl显色液[0.2%（W/V，）对硝基苯磷酸二钠（pNPP）溶液（0.1Mglycinebuffer,pH10.4,1mMMgCl2,1mMZnCl2）]，避光反应15～30min，用酶标仪测定OD405nm值。

根据ELISA结果显示，AfSA4抗体对黄曲霉菌和寄生曲霉菌SCWPs具有高亲和力，酶标仪测定的OD_405nm平均值为1.560（黄曲霉）和2.188（寄生曲霉），分别比阴性对照高出36.3倍和47.6倍。在实际检测过程中样品前处理方法简单，将样品直接研磨后即可进行检测。

一种黄曲霉特异单链抗体的融合蛋白，其制备过程如下：

将黄曲霉特异单链抗体基因AfSA4亚克隆到pDAP2/S载体上，重组载体pDAP2/S-AfSA4转化至大肠杆菌XL1-BlueMRF′中，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后，利用Ni-NTA亲和层析纯化（HuZQ,LiHP,etal.Anal.Chim.Acta2013,764:84-92.）获得AfSA4-AP抗体融合蛋白。纯化后的AfSA4-AP融合蛋白经SDS-PAGE电泳检测发现其分子量约为80kD（图9），其序列如SEQIDNO：8所示。

一株黄曲霉特异的单克隆抗体杂交瘤细胞株，其制备过程如下：

用黄曲霉可溶性细胞壁蛋白SCWPs免疫Balb/c小鼠后，取小鼠的脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合，经筛选得到杂交瘤细胞后，利用SCWPs抗原对杂交瘤细胞进行ELISA筛选，经过亚克隆后获得1株能够稳定分泌抗黄曲霉的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，申请人将其命名为2A8。从接种杂交瘤细胞的小鼠腹水中利用硫酸铵沉淀法纯化得到单克隆抗体2A8，通过ELISA鉴定抗体的效价和特异性。

申请人已于2013年8月12日将获得的黄曲霉特异的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A8送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏号为CCTCCNO：C2013101。

一种黄曲霉特异单链抗体融合蛋白和单克隆抗体在黄曲霉菌和寄生曲霉菌检测中的应用，其应用过程如下：

将纯化的单克隆抗体2A8和融合蛋白AfSA4-AP通过双抗体夹心酶联免疫（SandwichELISA）检测方法（BoscoloS,PelinM,etal.Environ.Sci.Technol.2013,47:2034-2042.）或制备成检测试剂盒、试纸条和蛋白芯片等应用于黄曲霉菌和寄生曲霉菌的检测。

1）将100μl稀释在PBS中的单克隆抗体2A8（20μg/ml）加入ELISA板孔中，4℃放置过夜，进行包被。

2）每个ELISA板孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

3）每孔加入300μl封闭液（含2%（W/V）脱脂奶粉的PBS溶液）37℃封闭2h。

4）每孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

5）每孔加入100μl黄曲霉菌或寄生曲霉菌SCWPs（10μg/ml），37℃温浴2h。空白对照加入PBS。

6）每孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

7）每孔加入100μl稀释在封闭液中的AfSA4-AP融合蛋白（200nM），37℃温浴2h。

8）每孔用300μlPBST和PBS分别洗涤3次，每次30sec。

9）每孔加入100μlpNPP显色液，避光反应15～30min，用酶标仪测定OD_405nm值。

根据ELISA结果显示，本发明的单克隆抗体2A8和融合蛋白AfSA4-AP对黄曲霉菌和寄生曲霉菌SCWPs具有高亲和力，酶标仪测定的OD_405nm平均值为2.346（黄曲霉）和2.322（寄生曲霉），分别比阴性对照高出33.0倍和39.4倍。在实际检测过程中样品前处理方法简单，将样品直接研磨后即可进行检测。

本发明的有益效果：

1、本发明的有益效果之一是利用单链抗体噬菌体展示文库技术，构建了黄曲霉特异单链抗体文库，利用噬菌体展示技术从抗体文库中筛选得到一个高亲和力的黄曲霉特异单链抗体及其编码基因AfSA4。

2、本发明的有益效果之二是黄曲霉特异单链抗体AfSA4在大肠杆菌中诱导表达后形成可溶性蛋白，并可进行纯化，易于操作和大规模生产。

3、本发明的有益效果之三是从大肠杆菌中纯化的AfSA4抗体可应用于黄曲霉菌和寄生曲霉菌的间接酶联免疫（IndirectELISA）检测，包括制备检测试剂盒、试纸条和蛋白芯片等，可用在农作物生产、饲料加工、粮食储藏和食品加工等领域中的黄曲霉菌和寄生曲霉菌污染检测。

4、本发明的有益效果之四是AfSA4抗体与AP的融合蛋白可以在大肠杆菌中可溶性表达和纯化，AfSA4-AP融合蛋白可进行大规模生产，制备流程简单且成本低。

5、本发明的有益效果之五是获得的一株黄曲霉特异单克隆抗体杂交瘤细胞株2A8能够用于高亲和力单克隆抗体的大规模生产。

6、本发明的有益效果之六是黄曲霉特异单克隆抗体2A8可从小鼠腹水中大量获得，经硫酸铵沉淀纯化的抗体具有良好的特异性和亲和力。

7、本发明的有益效果之七是黄曲霉特异单克隆抗体2A8和AfSA4-AP融合蛋白可配套进行对黄曲霉菌和寄生曲霉菌的双抗体夹心酶联免疫检测（SandwichELISA），包括制备检测试剂盒、试纸条和蛋白芯片等，可用在农作物生产、饲料加工、粮食储藏和食品加工等领域中的黄曲霉菌和寄生曲霉菌污染检测。

附图说明

图1：为发明的总体技术流程图。

图2：为V_II、V_L基因片段的凝胶电泳图。

图中：M：DNA分子质量标准；泳道1：重链可变区片段（V_II）；泳道2：轻链可变区片段（V_L）。

图3：为scFv基因片段的凝胶电泳图。

图中：M：DNA分子质量标准；泳道1：scFv基因片段。

图4：为一种pComb3X载体结构图。

图5：为一种表达ELISA鉴定筛选后的单链抗体噬菌体展示文库。

图中：★标记为AfSA4，●标记为AfSA5，▲标记为AfSA8，＋标记为AfSD10。

图6：为一种SDS-PAGE电泳检测纯化的AfSA4、AfSA5、AfSA8、AfSD10单链抗体示意图。

图中：M：蛋白分子量标准；泳道1：AfSA4；泳道2：AfSA5；泳道3：AfSA8；泳道4：AfSD10。

图7：ELISA检测AfSA4、AfSA5、AfSA8、AfSD10四种单链抗体对黄曲霉、寄生曲霉亲和力示意图。

图中：不同的字母（α，β，γ）表示显著性差异（p<0.05）。

图8：为一种AfSA4抗体对黄曲霉、寄生曲霉的孢子和菌丝免疫荧光检测的照片。

图中：a和c：显微镜明场模式下的黄曲霉菌丝；e和g：显微镜明场模式下的黄曲霉孢子；i和k：显微镜明场模式下的寄生曲霉菌丝；m和o：显微镜明场模式下的寄生曲霉孢子；b，f，j，n：用AfSA4抗体检测a，e，i，m中的菌丝和孢子；d，h，l，p：用PIPP抗体检测c，g，k，o中的菌丝和孢子。

图9：为一种AfSA5、AfSA8、AfSD10抗体对黄曲霉孢子、菌丝免疫荧光检测的照片。

图中：a，c，e：显微镜明场模式下的黄曲霉菌丝；g，i，k：显微镜明场模式下的黄曲霉孢子；b，h：用AfSA5抗体检测a，g中的菌丝和孢子；d，j：用AfSA8抗体检测c，i中的菌丝和孢子；f，l：用AfSD10抗体检测e，k中的菌丝和孢子。

图10：为一种SDS-PAGE电泳检测纯化的AfSA4-AP融合蛋白示意图。

图中：M：蛋白分子量标准；泳道1：AfSA4-AP融合蛋白。

图11：为一种Westernblot分析AfSA4、AfSA4-AP融合蛋白识别黄曲霉和寄生曲霉细胞壁蛋白的示意图。图中：M：蛋白分子量标准；a：AfSA4识别的黄曲霉和寄生曲霉细胞壁蛋白；b：AfSA4-AP识别的黄曲霉和寄生曲霉细胞壁蛋白。

图12：为一种表面等离子共振（SPR）分析AfSA4抗体及AfSA4-AP融合蛋白与黄曲霉SCWPs结合能力的示意图。

图中：a：AfSA4抗体与黄曲霉SCWPs结合的动力学曲线（AfSA4抗体浓度为50～400nM）；b：AfSA4-AP融合蛋白与黄曲霉SCWPs结合的动力学曲线（AfSA4-AP融合蛋白浓度为6.25～50nM）；c：AfSA4抗体与AfSA4-AP融合蛋白在50nM浓度下动力学曲线的比较。

图13：为一种双抗体夹心ELISA法对黄曲霉、寄生曲霉最低检测限的示意图。

图中：●标记为双抗体夹心ELISA法对黄曲霉的最低检测限；▲标记为双抗体夹心ELISA法对寄生曲霉的最低检测限。

图14：为一种双抗体夹心ELISA法对黄曲霉、寄生曲霉最低定量限的示意图。

图中：●标记为双抗体夹心ELISA法对黄曲霉在玉米中的定量限；▲标记为双抗体夹心ELISA法对黄曲霉在花生中的定量限；○标记为双抗体夹心ELISA法对寄生曲霉在玉米中的定量限；△标记为双抗体夹心ELISA法对寄生曲霉在花生中的定量限。

具体实施方式

实施例1：黄曲霉菌细胞壁蛋白（SCWPs）制备

1）用灭菌牙签挑取黄曲霉（Aspergillusflavus）菌株wh-1（采集自中国，湖北，武汉）该菌株经形态鉴定为黄曲霉，其产生黄曲霉毒素的能力经过LC–MS/MS进行测定（HanZ,RenY,etal.J.Agric.FoodChem.2012,60,8233-8247），在接种花生8天后AFB₁和AFB₂的含量分别为775.39μg/kg和26μg/kg；在接种玉米8天后AFB₁和AFB₂的含量分别为1056.8μg/kg和55.04μg/kg），接种于PDA培养基（成分：20%（W/V）马铃薯，2%（W/V）葡萄糖，1.5%（W/V）琼脂）上，28℃培养5天，用含有0.05%Tween-20的无菌水将菌丝表面的分生孢子洗下，收集孢子液。

2）取上述步骤1）制备的孢子液1ml（1×10⁵/ml）接种于160mlCzapek培养基（成分：3%（W/V）蔗糖，0.3%（W/V）NaNO₃，0.1%（W/V）K₂HPO₄，0.05%（W/V）MgSO₄·7H₂O，0.05%（W/V）KCl，0.001%（W/V）FeSO₄，pH9.0）中，28℃，200r/min振荡培养5天。

3）将培养液用2层灭菌纱布过滤收集菌丝，并用灭菌水洗涤3次后将菌丝冷冻干燥。

4）用液氮冷冻菌丝并在研钵中研磨，转移至50ml离心管中，置于冰上。

5）向离心管中加入40mlCWP缓冲液（10mMTris-HCl，1mM苯甲基磺酰氟（PMSF），pH7.8）将菌丝重悬。

6）4℃，50r/min旋转洗涤30min。

7）4℃，4600r/min离心10min，弃上清。

8）用预冷的CWP清洗液（1MNaCl，1mMPMSF）洗涤3次，每次洗涤同步骤6，然后同步骤7）的方法离心。

9）加入40ml含1mMPMSF的灭菌水重悬洗涤3次，每次洗涤同步骤6），然后用步骤7）的方法离心。

10）加入10ml提取液（50mMTris-HCl（pH8.0），0.1MEDTA，2%（W/V）SDS，10mMDTT）重悬沉淀，煮沸10min。

11）室温15000r/min离心10min。

12）吸取上清，加入4倍体积的10%（v/v）TCA/丙酮，充分混匀后-20℃沉淀30min以上。

13）4℃，15000r/min离心10min，弃上清。

14）加入25ml预冷丙酮重悬沉淀后用步骤13的方法离心。

15）重复步骤5）操作2次。

16）弃上清，干燥5～10min直至丙酮完全挥发。

17）加入2mlPBS（成分：137mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa₂HPO₄，1.8mMKH₂PO₄，pH7.2～7.4），超声波助溶30min。

18）4℃，12000r/min离心10min，保留上清。

19）重复步骤17）和18），合并上清。

20）4℃，12000r/min离心10min，取上清加入3kD超滤管，再加入10mlPBS至超滤管中，4℃，4000r/min离心30～60min进行浓缩，重复该步骤2～3次。

21）吸取浓缩后的CWPs至离心管中保存于-20℃备用。

实施例2：用SCWPs免疫来亨母鸡

用制备的黄曲霉SCWPs免疫来亨母鸡（购自华中农业大学养鸡场）6次，采取肌肉注射免疫方法，每隔14天免疫一次。第一次取实施例1制备的SCWPs500μl（200μg）作为抗原与500μl弗氏完全佐剂混合后免疫，第二至第五次加强免疫：取500μl抗原与500μl弗氏不完全佐剂混合后免疫。第三次和第五次免疫1周后静脉取血，将血清从1：200倍比稀释，采用间接ELISA法检测鸡血清中抗体的效价（参照林巧爱、董海艳主编，《医学免疫学与微生物学实验指导》，浙江大学出版社，2006年）。结果表明免疫后的鸡血清中黄曲霉特异抗体效价达到1：204,800。

实施例3：提取鸡脾脏总RNA、纯化mRNA以及合成cDNA第一链

1）最后一次免疫7天后取抗体效价最高的鸡的脾脏，分离脾脏细胞。

2）利用TRIzol总RNA提取试剂（购自Invitrogen公司，按照说明书操作）提取鸡脾脏总RNA。

3）用mRNA纯化试剂盒（购自QIAGEN公司，按说明书操作），从步骤2）提取的总RNA中纯化mRNA。

4）用SuperScript^TMIII逆转录试剂盒（购自Invitrogen公司，按照说明书操作），以步骤3）得到的mRNA为模板，用引物oligo(dT)_12–18（购自Invitrogen公司的商业引物）合成cDNA第一链。

实施例4：PCR扩增重链可变区（V_II）、轻链可变区（V_L）及单链抗体（scFv）基因

1）PCR扩增V_II和V_L基因

以实施例3得到的反转录合成的cDNA为模板，用正向引物CSCVHo-FL（GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCCGGTGGTGGCGGTTCCGCCGTGACGTTGGACGAG）和反向引物CSCG-B（CTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC）进行PCR扩增获得V_II片段；以实施例3反转录合成的cDNA为模板，用正向引物CSCVK（GTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTC）和反向引物CKJo-B（GGAAGATCTAGAGGACTGACCTAGGACGGTCAGG）进行PCR扩增获得V_L片段。在50μlPCR反应体系中，加入0.5μlcDNA，5μl10×PCR缓冲液（含Mg²⁺），1μl10mMdNTPs，0.5μl正向引物CSCVHo-FL或CSCVK（100μM），0.5μl反向引物CSCG-B或CKJo-B（100μM），2.5UTaq聚合酶。PCR反应条件为：94℃5min；94℃15sec，56℃15sec，72℃45sec，30个循环；最后72℃10min。PCR产物通过1%（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图2所示，V_II和V_L片段大小与预期相一致。

2）用DNA凝胶回收试剂盒（购自QIAGEN公司，按说明书操作）从凝胶中回收步骤1）扩增得到的V_II和V_L片段。

3）SOE-PCR扩增scFv基因

以等量的V_II和V_L片段作为模板，用正向引物CSC-F（GAGGAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAG）和反向引物CSC-B（GAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGGAGG）进行SOE-PCR扩增，获得scFv基因。在50μlPCR反应体系中，加入V_II和V_L片段各50ng，5μl10×PCR缓冲液（含Mg²⁺），1μl10mMdNTPs，0.3μl正向引物CSC-F（100μM），0.3μl反向引物CSC-B（100μM），2.5UTaq聚合酶。PCR反应条件为：94℃5min；94℃15sec，56℃15sec，72℃90sec，25个循环；最后72℃10min。PCR产物通过1%（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图3所示，所得scFv片段大小与预期相一致。

4）用DNA凝胶回收试剂盒（购自QIAGEN公司，按说明书操作）从凝胶中回收步骤步骤3）获得的scFv片段。

实施例5：scFv片段连接到pComb3X载体

1）用SfiI限制性内切酶（购自NEB公司，按说明书进行操作）酶切实施例4得到的scFv片段和载体pComb3X（Andris-WidhopfJ,RaderC,etal.Methodsforthegenerationofchickenmonoclonalantibodyfragmentsbyphagedisplay.J.Immunol.Methods,2000,242:159-181，如图4所示）。

2）用DNA凝胶回收试剂盒（购自QIAGEN公司，按说明书操作）从凝胶中回收步骤1）酶切过后的scFv片段和载体pComb3X。

3）用T4DNA连接酶（购自NEB公司，按说明书操作）连接步骤2）回收的scFv片段和pComb3X载体，得到重组质粒pComb3X-scFv。

4）对步骤3得到的重组质粒pComb3X-scFv进行乙醇沉淀和除盐（参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法）。

实施例6：单链抗体噬菌体展示文库的构建

1）大肠杆菌XL1-BlueMRF′感受态细胞制备

用无菌牙签蘸取大肠杆菌甘油冻存菌株XL1-BlueMRF′（购自Stratagene公司），在LB固体培养基（成分：1%（W/V）胰蛋白胨，0.5%（W/V）酵母提取物，1%（W/V）NaCl，1.5%（W/V）琼脂，pH7.0）上37℃划线培养16h。挑取一单克隆菌落接种到15mlSB液体培养基（成分：3%（W/V）胰蛋白胨，2%（W/V）酵母提取物，1%（W/V）3-(N-吗啡啉)丙磺酸（简称MOPS，pH7.0）中，37℃，200r/min培养16h。将2.5ml大肠杆菌XL1-BlueMRF′菌液加入到500mlSB液体培养基中，并同时添加10ml20%（w/v）葡萄糖和5ml1MMgCl₂，于37℃摇床（200r/min）中培养至OD_600nm达到0.7左右时，迅速置于冰上冷却15min。将菌液分装于离心管中，4℃，4000r/min离心20min，弃上清，然后用500ml预冷的10%（V/V）甘油洗涤菌体沉淀两次（4℃，4000r/min离心20min后弃上清）。向离心管中加入2.5ml预冷的10%（V/V）甘油并将菌体重悬，分装至1.5ml离心管（100μl/管），立即保存于-80℃。

2）重组质粒电转化至大肠杆菌

将5管-80℃保存的大肠杆菌XL1-BlueMRF′感受态细胞取出，置冰上融化10min，每管感受态细胞（100μl）中加入1μg重组质粒pComb3X-scFv，混匀后冰上静置2min，然后将感受态细胞转移至冰上预冷的电转化杯（0.2cm厚）（购自BIO-RAD公司）中，用MicroPulser^TM电转化仪（购自BIO-RAD公司，使用BacteriaEc2程序）进行电转化，然后立即加入37℃预热的1mlSOC培养基（成分：2%（W/V）胰蛋白胨，0.5%（W/V）酵母提取物，0.05%（W/V）NaCl，20mM葡萄糖，pH7.0）到电转化杯中重悬菌体，将所有电转化杯中的菌液混合并转移至离心管中并在37℃摇床（240r/min）中培养1h。培养1h后，加入10ml37℃预热的SB培养基、3μl羧苄青霉素（100mg/ml）和30μl四环素（5mg/ml），从中取出2μl菌液加入到200μlSB中，然后从中分别取10μl和100μl涂含有100μg/ml羧苄青霉素的LB平板37℃培养过夜后计数。将上述15ml菌液于37℃摇床（240r/min）中培养1h后再加入4.5μl羧苄青霉素（100mg/ml）继续培养1h，然后按照实施例8进行单链抗体的筛选。

实施例7：单链抗体噬菌体展示文库的鉴定

1）通过计数实施例6步骤2）中所培养LB平板上的大肠杆菌克隆，然后乘以稀释倍数和菌液的体积计算得到的单链抗体噬菌体展示文库库容量约为1.2×10⁷cfu。

2）从实施例6步骤2）中所培养LB平板上随机挑选25个大肠杆菌克隆，接种到100μg/ml羧苄青霉素的LB液体培养基中于37℃摇床（200r/min）中培养过夜。

3）煮沸裂解法提取过夜培养菌液的质粒DNA（参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年）。

4）以步骤3）得到的质粒DNA为模板，用正向引物ompseq（AAGACAGCTATCGCGATTGCAG）和反向引物gback（GCCCCCTTATTAGCGTTTGCCATC）进行PCR扩增。在25μlPCR反应体系中，含有50ng质粒DNA，2.5μlPCR缓冲液（含Mg²⁺），2μl1.25mMdNTPs，1μl正向引物ompseq（10μM），1μl反向引物gback（10μM），1.25UTaq聚合酶。PCR反应条件为：94℃5min；94℃15sec，56℃15sec，72℃90sec，30个循环；最后72℃10min。PCR产物通过1%（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测单链抗体噬菌体展示文库的阳性率。

5）用BstNI限制性内切酶（购自NEB公司，按说明书操作）酶切步骤4）得到的PCR产物，将酶切产物进行1.5%（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测噬菌体展示文库的多样性。

对文库进行的鉴定表明，所构建的单链抗体噬菌体展示文库阳性率达到96%，多样性高于50%，说明所构建的文库质量较高，可进行筛选特异性的单链抗体。

实施例8：筛选单链单链抗体噬菌体展示文库

1）向实施例6最后获得的15ml菌液中加入10ml3.7×10¹¹cfu/ml的VCSM13辅助噬菌体（购自Stratagene公司，辅助噬菌体的繁殖和保存参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版中介绍的方法）。

2）将25ml菌液转移到装有175ml预热的500ml三角瓶中，并加入92.5μl100mg/ml的羧苄青霉素和370μl5mg/ml的四环素于37℃摇床（240r/min）中培养1.5～2h，然后加入280μl卡那霉素（50mg/ml），37℃继续培养过夜（12～15h）。

3）用黄曲霉SCWPs（200μg/ml）包被ELISA板（共4孔，每孔100μl），4℃放置过夜。

4）将步骤2）中培养过夜的大肠杆菌菌液4℃，3000g离心15min，然后保留上清。

5）向上清中加入50ml5×PEG/NaCl溶液（20%（W/V）聚乙二醇（PEG）6000，2.5MNaCl），充分混匀后分装至50ml离心管，冰上放置30min～1h。

6）4℃，15000g离心15min，将上清丢弃，然后将离心管倒立于吸水纸上10min，使管内残留的PEG/NaCl溶液全部流出。

7）向离心管中加入2ml溶解在TBS（50mMTris-HCl,pH7.5,150mMNaCl）中的1%（w/v）BSA，将所有的噬菌体沉淀重悬，然后转移到2ml离心管中，4℃，14000r/min离心5min后取上清于4℃保存并马上取一部分进行筛选。

8）将步骤3）中包被好的ELISA板中的抗原溶液甩出，加入250μl溶于TBS中的3%（w/v）牛血清白蛋白（BSA），37℃封闭1h。

9）将封闭液甩出，每个孔中加入50μl步骤7）中收集的新鲜噬菌体，37℃温浴2h。

10）将噬菌体溶液甩出，每孔中加入250μlTBST（0.05%Tween），洗涤5次，每次1min（第二轮和第三轮淘选时增加洗涤次数至10次和15次，Tween浓度增加至0.5%）。

11）每孔加入100μlGlycine-HCl（100m,pH2.2），室温放置10min，用枪剧烈吹吸10次，然后吸出并加入3μlTris（2M）中和。

12）将洗脱的噬菌体加入到2ml在SB中培养（37℃，200r/min）至OD_600nm约为0.5的XL1-BlueMRF′菌液中，室温侵染15min。

13）加入6ml37℃预热的SB培养基、1.6μl羧苄青霉素（100mg/ml）和12μl四环素（5mg/ml）。

14）从中取10μl用SB培养基稀释至10^-4，然后取100μl涂含有羧苄青霉素的LB平板37℃培养过夜，次日通过计数大肠杆菌克隆来计算淘选后的噬菌体滴度。

15）将步骤13中的8ml菌液在37℃摇床（240r/min）中培养1h。

16）加入2.4μl羧苄青霉素（100mg/ml）再继续培养1h。

17）加入5mlVCSM13辅助噬菌体（购自Stratagene公司），将菌液转移至87ml预热的SB中，并添加46μl羧苄青霉素（100mg/ml）和184μl四环素（5mg/ml），于37℃摇床（240r/min）中培养1.5～2h。

18）加入140μl卡那霉素（50mg/ml），240r/min，37℃培养过夜。

19）按照步骤4～7的方法收集噬菌体，并进行下一轮筛选。

实施例9：表达ELISA鉴定淘选抗体库

1）最后一轮淘选完成后从实施例8步骤14）的LB平板上随机挑选35个克隆，接种至3ml含有羧苄青霉素（50μg/ml）的SB培养基中，在37℃摇床（240r/min）中培养至OD_600nm约为0.5。

2）加入终浓度为2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），继续培养20h。

3）黄曲霉SCWPs按实施例8步骤3）包被到ELISA板上，空白对照用3%（w/v）BSA包被。

4）将步骤3）中包被好的ELISA板中的抗原溶液甩出，加入250μl溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中的5%（w/v）脱脂奶粉，37℃封闭1h。

5）将过夜培养的大肠杆菌菌液于4℃，2800g离心15min，保留上清。

6）取50μl步骤5）中的上清与50μl5%（w/v）脱脂奶粉混匀后加入到封闭过后的ELISA板孔中，37℃温浴2h。

7）用300μl0.05%PBST洗涤3次，每次30sec。

8）将鼠抗HA标签抗体（购自北京康为世纪生物科技有限公司）按体积比为1：4000稀释到封闭液中，每孔加入100μl，37℃温浴1h。

9）用300μl0.05%PBST洗涤3次，每次30sec。

10）将HRP标记的羊抗鼠抗体（购自北京康为世纪生物科技有限公司）按体积比为1：4000稀释到封闭液中，每孔加入100μl，37℃温浴1h。

11）用300μl0.05%PBST和PBS各洗涤3次，每次30sec。

12）每孔加入100μl可溶性单组份TMB底物（购自北京天根生化科技有限公司）避光反应15～30min。

13）加入100μlH₂SO₄溶液（2M）终止反应，用酶标仪测OD_450nm值。

表达ELISA鉴定结果显示，35个单克隆样品中有10个显色值高于1.8（图5），将这10个显色值高的样品送到上海立菲生物技术有限公司，将他们的重组质粒中的插入序列进行测序（测序引物同实施例7中的引物）。测序测序结果经分析表明它们具有四种不同类型核苷酸序列，分别命名为AfSA4（其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示）、AfSA5、AfSA8和AfSD10。含有这四种基因的大肠杆菌命名为重组大肠杆菌XL1-BlueMRF′/pComb3X-AfSA4、XL1-BlueMRF′/pComb3X-AfSA5、XL1-BlueMRF′/pComb3X-AfSA8、XL1-BlueMRF′/pComb3X-AfSD10将菌液加入等体积50%（V/V）甘油后保存于-80℃。

实施例10：单链抗体的大量表达与纯化

1）用煮沸裂解法提取过实施例9中四种含有抗体基因的四种重组大肠杆菌中的重组质粒DNA。

2）通过热激转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中（热激感受态细胞的制备和热激转化方法参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年）。

3）将含有四种重组质粒的大肠杆菌TOP10克隆接种至5ml含有100μg/ml羧苄青霉素的SB培养基中，于37℃摇床中（200r/min）培养过夜（12h）。

4）取2ml过夜培养菌液加入200ml含100μg/ml羧苄青霉素、20mMMgCl₂的SB培养基中，于37℃摇床中（200r/min）培养至OD_600nm达到0.5左右。

5）加入终浓度为1mM的IPTG，置于37℃摇床中（200r/min）培养过夜。

6）将过夜培养的菌液4℃，5000r/min离心20min，弃上清。

7）用重悬缓冲液（50mMNaH₂PO₄，300mMNaCl，10mM咪唑，1mMPMSFpH8.0）将菌体重悬。

8）用高压细胞破碎仪（购自意大利GEA尼鲁索尔维公司，按说明书操作）将大肠杆菌细胞破碎。

9）细胞裂解液4℃，15000r/min离心30min，上清保留。

10）将400μl充分混匀的Ni-NTA基质（购自QIAGEN公司）加入到纯化柱（购自BIO-RAD公司）使其沉降30min以上。

11）剪去纯化柱下端封口，加入5ml步骤7中的重悬缓冲液平衡纯化柱。

12）加入步骤9）得到的大肠杆菌细胞裂解液上清，收集样品流穿液。

13）加入50ml缓冲液B（50mMNaH₂PO₄，300mMNaCl，20mM咪唑，pH8.0）洗脱纯化柱1～2次，收集流穿液（含有杂蛋白）。

14）加入400μl缓冲液C（50mMNaH₂PO₄，300mMNaCl，250mM咪唑，pH8.0）洗脱纯化柱3次，分别收集洗脱液为C1、C2、C3（含有目的蛋白）。

15）加5ml去离子水平衡纯化柱。

16）加入1ml30%（v/v）酒精并将纯化柱保存在4℃。

17）纯化的单链抗体通过SDS-PAGE电泳检测（见实施例11）后用PBS透析后加终浓度50%（v/v）甘油保存在-20℃。

实施例11：SDS-PAGE电泳检测纯化的单链抗体

1）取约1μg实施例10纯化的单链抗体，加入5倍浓缩的十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液（250mMTris-HCl（pH6.8），10%（W/V）SDS（电泳级），0.5%（W/V）溴酚蓝，50%（V/V）甘油，5%（W/V）β-巯基乙醇），混匀后煮沸5min，置于冰上备用。

2）配制分离胶和浓缩胶（参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法制备）。

3）将1×Tris-Glycine电泳缓冲液（25mMTris，250mM甘氨酸，0.1%（W/V）SDS）加入到蛋白垂直电泳系统（购自BIO-RAD公司），将步骤1准备的样品加入到点样孔中。

4）用80伏低电压电泳20min后，再用120伏高电压电泳80～120min至溴酚蓝电泳至分离胶底端。

5）将凝胶取出并切掉浓缩胶，用染色液（0.1%（W/V）考马斯亮蓝R-250，25%（V/V）异丙醇，10%（V/V）冰醋酸）染色1h。

6）将凝胶置于脱色液（5%（V/V）甲醇，7.5%（V/V）冰醋酸）中脱色30min以上。

SDS-PAGE电泳检测结果如图6所示，四种单链抗体分子量大小约为35kD。

实施例12：利用ELISA方法检测四种单链抗体对黄曲霉、寄生曲霉的亲和力

1）用黄曲霉和寄生曲霉的SCWPs（购自北京，中国普通微生物菌种保藏管理中心，1mg/ml）分别包被ELISA板孔（100μl/孔），37℃温浴包被2h或4℃包被过夜。

2）每个ELISA板孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

3）将300μl封闭液（含2%（W/V）脱脂奶粉的PBS溶液）加入到抗原包被孔和空白对照孔中，于37℃封闭2h。

4）每孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

5）分别加入100μl稀释在封闭液中的四种单链抗体（200nM），37℃温浴2h。

6）每孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

7）每孔加入100μl稀释（1：4000）在封闭液中的鼠抗HA标签抗体（购自北京康为世纪生物科技有限公司），37℃温浴2h。

8）每孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

9）每孔加入100μl稀释（1：4000）在封闭液中的HRP标记的羊抗鼠抗体（购自北京康为世纪生物科技有限公司），37℃温浴2h。

10）每孔用300μlPBST和PBS分别洗涤3次，每次30sec。

11）每孔加入100μl可溶性单组份TMB底物（购自北京天根生化科技有限公司）避光反应15～30min。

12）加入100μlH₂SO₄溶液（2M）终止反应，用酶标仪测OD_450nm值。

ELISA结果显示（图7），单链抗体AfSA4对黄曲霉和寄生曲霉SCWPs均具有很强的结合能力，且明显高于另外三种单链抗体对两种菌株的亲和力，其差异达到了显著水平（p<0.05）。

实施例13：免疫荧光检测四种单链抗体对黄曲霉、寄生曲霉的结合特性

1）按实施例1的步骤1）制备黄曲霉、寄生曲霉孢子。

2）接种1ml孢子液（10⁵/ml）于20mlYPG培养基（成分：0.3%（W/V）酵母提取物，1%（W/V）蛋白胨，2%（W/V）葡萄糖）中，28℃，200r/min培养8h至大部分孢子萌发。

3）盖玻片浸泡于2MNaOH中2h，蒸馏水清洗后再浸泡于70%乙醇中2h。

4）盖玻片浸泡于多聚赖氨酸溶液中5min后取出晾干。

5）向12孔细胞培养板孔中加入2ml2%（W/V）小牛血清白蛋白（BSA，购自Sigma公司）溶液，37℃封闭2h。

6）每孔用2mlPBS洗涤3次。

7）将步骤4中的盖玻片置于细胞培养板孔中，加入1ml步骤2中的萌发的孢子液。

8）将细胞培养板室温离心（2800r/min）15min。

9）用2mlPBS洗涤3次。

10）加入500μl实施例10纯化的四种单链抗体（封闭液中稀释至1μg/ml），37℃放置2h。

11）用2mlPBST洗涤3次。

12）加入500μl1：4000（v/v）封闭液中稀释稀释的鼠抗HA单克隆抗体，37℃放置2h。

13）用2mlPBST洗涤3次。

14）加入500μl1：100（V/V）封闭液中稀释的Cy3标记羊抗鼠IgG(H+L)抗体（购自美国ProteinTechGroup公司），37℃避光放置1h。

15）用2mlPBST和PBS分别洗涤3次。

16）在载玻片上滴加封片剂，盖上附着有菌丝和孢子的盖玻片（有菌丝和孢子的一面贴在载玻片上），在荧光显微镜下观察。

免疫荧光实验结果如图8所示，AfSA4抗体对黄曲霉和寄生曲霉孢子和菌丝的表面都有很强的荧光信号（图a，b，e，f，i，j，m，n），而阴性对照的非特异性单链抗体PIPP（KathuriaS,SriramanR,etal.Efficacyofplant-producedrecombinantantibodiesagainstHCG.Hum.Reprod.,2002,17:2054-2061.）与菌丝或孢子均未见任何荧光反应（图c，d，g，h，k，l，o，p），说明AfSA4抗体能与黄曲霉和寄生曲霉孢子和菌丝细胞壁表面抗原特异结合。而AfSA5、AfSA8、AfSD10与黄曲霉孢子和菌丝细胞壁表面未观察到明显的荧光信号（图9），说明这3种单链抗体不能识别菌丝和孢子的细胞壁表面抗原。

实施例14：AfSA4-AP融合蛋白表达载体构建、原核表达和纯化

1）通过PCR扩增在AfSA4抗体基因3’端加上218连接肽（WhitlowM,BellBA,etal.Animprovedlinkerforsingle-chainFvwithreducedaggregationandenhancedproteolyticstability.Protein.Eng.,1993,6:989-995.）以及两端的SfiI和NotI酶切位点，然后通过这两个酶切位点连接到pDAP2/S载体（KerschbaumerRJ,HirschlS,etal.Single-chainFvfusionproteinssuitableascoatinganddetectingreagentsinadoubleantibodysandwichEnzyme-linkedimmunosorbentassay.Anal.Biochem.,1997,249:219-227.）中，得到含有AfSA4-AP融合蛋白基因的重组质粒，将其电转化到E.coliXL1-BlueMRF′感受态细胞（方法见实施例6步骤2）中，挑选有氨苄青霉素抗性的克隆送上海立菲生物技术有限公司测序，得到含有正确重组质粒DNA的重组大肠杆菌。

2）AfSA4-AP融合蛋白的表达和纯化按实施例10的方法操作，但步骤5诱导表达温度为28℃。

纯化后的AfSA4-AP融合蛋白经SDS-PAGE电泳检测表明（图10），融合蛋白分子量约为80kD。

实施例15：AfSA4-AP融合蛋白活性检测

1）将100μl黄曲霉菌或寄生曲霉菌SCWPs（10μg/ml）加入ELISA板孔中，37℃温浴2h或4℃放置过夜，进行抗原包被。

2）每个ELISA板孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

3）将300μl封闭液（含2%（W/V）脱脂奶粉的PBS溶液）加入到抗原包被孔和空白对照孔中，于37℃封闭2h。

4）每孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

5）每孔加入100μl稀释在封闭液中的AfSA4-AP抗体（200nM），37℃温浴2h。

6）每孔用300μlPBST和PBS分别洗涤3次，每次30sec。

7）每孔加入100μl显色液（0.2%（W/V）对硝基苯磷酸二钠（pNPP）溶液），避光反应15～30min，用酶标仪测定OD_405nm值。

根据ELISA结果显示，AfSA4-AP抗体对黄曲霉菌和寄生曲霉菌SCWPs具有高亲和力，酶标仪测定的OD_405nm平均值为2.842（黄曲霉）和2.794（寄生曲霉），分别比阴性对照高出49.0倍和50.8倍。

实施例16：ELISA分析AfSA4抗体和AfSA4-AP融合蛋白的结合特性

1）选取6种曲霉属菌株和其它9种非曲霉属真菌菌株（见表1），按实施例1的方法1培养孢子和菌丝。

2）将孢子液或菌丝块接种于20mlYPG培养基（0.3%酵母粉，1%蛋白胨，2%葡萄糖）中，28℃，200r/min培养5天。

3）按实施例1中步骤3）的方法将菌丝过滤收集并在液氮中研磨并重悬于PBS中。

3）在ELISA板孔中加入100μl菌丝悬浮液（1mg/ml），37℃温浴包被2h或4℃包被过夜。

4）分别用AfSA4抗体和AfSA4-AP融合蛋白进行ELISA检测。

①当用AfSA4抗体检测时：

a）每个ELISA板孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

b）将300μl封闭液（含2%（W/V）脱脂奶粉的PBS溶液）加入到抗原包被孔和空白对照孔中，于37℃封闭2h。

c）每孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

d）每孔加入100μl稀释在封闭液中的AfSA4抗体（200nM），37℃温浴2h。

e）每孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

f）每孔加入100μl稀释在封闭液中的鼠抗HA标签抗体（体积比为1：10,000），37℃温浴2h。

g）每孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

h）每孔加入100μl稀释在封闭液中的AP标记羊抗鼠IgG抗体（体积比为1：10,000），37℃温浴2h。

i）每孔用300μlPBST和PBS分别洗涤3次，每次30sec。

j）每孔加入100μl显色液（0.2%（W/V）对硝基苯磷酸二钠（pNPP）溶液），避光反应15～30min，用酶标仪测定OD_405nm值。

②AfSA4-AP融合蛋白检测：按实施例15步骤2～7）的方法操作。

ELISA结果表明（见表1）AfSA4抗体和AfSA4-AP融合蛋白对黄曲霉和寄生曲霉都具有很高的亲和力，而与非曲霉属的真菌无交叉反应，说明AfSA4-AP融合蛋白具有AfSA4抗体对抗原的亲和力和特异性。

表1ELISA检测分析AfSA4抗体和AfSA4-AP融合蛋白的抗原结合特性

注：实验中每一个样品设置3个重复，显色反应后计算平均值，其中<0.1OD_405nm标记为“-”；0.1–1.0OD_405nm标记为“+”；1.01–2.0OD_405nm标记为“++”；>2.0OD_405nm标记为“+++”。上述用于检测的菌株是公众（本领域的技术人员）可以获得的，这些菌株是一种媒介菌株，且不限于上述菌株。

实施例17：利用Westernblot方法分析AfSA4抗体和AfSA4-AP融合蛋白的结合特性

1）将用实施例1方法提取的黄曲霉和寄生曲霉SCWPs蛋白参照实施例11的步骤1～4）进行SDS-PAGE电泳。

2）通过半干转印法利用BIO-RAD公司的SDSemi-DryTransferCell装置将凝胶中的蛋白转印到尼龙膜上（200mA转印25min）。

3）将尼龙膜置于封闭液（5%（W/V）脱脂奶粉，20mMTris-HCl（pH8.0），150mMNaCl）中37℃平缓摇动2h或4℃静置过夜。

4）用TBST（0.05%（V/V）Tween20）洗涤3次，每次5min。

5）AfSA4抗体和AfSA4-AP融合蛋白检测。

①AfSA4抗体检测：加入10ml含50nM的实施例10纯化的AfSA4抗体的封闭液，室温摇床缓慢震荡2h，用10mlTBST（20mMTris-HCl（pH8.0），150mMNaCl，0.05%Tween20）缓冲液洗涤3次，每次5min；然后加入10ml经封闭液稀释（v/v1：5000）的鼠抗HA单克隆抗体，室温摇床缓慢震荡2h，用10mlTBST缓冲液洗涤3次，每次5min；再加入10ml经封闭液稀释（v/v1：5000）的AP标记羊抗鼠IgG抗体，室温摇床缓慢震荡2h。

②AfSA4-AP融合蛋白检测：加入10ml含50nM的实施例14纯化的AfSA4-AP融合蛋白的封闭液，室温平缓摇动2h倒掉。

6）分别用10mlTBST和TBS洗涤3次，每次5min。

7）分别用BCIP/NBT显色试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司，按说明书操作）显色10～20min后，用蒸馏水反复漂洗终止反应。

Westernblot结果（图11）表明，AfSA4抗体和AfSA4-AP融合蛋白识别相同的黄曲霉或寄生曲霉细胞壁蛋白成分，说明AfSA4-AP融合蛋白具备单链抗体的抗原结合能力和AP蛋白催化活性。

实施例18：表面等离子共振（SPR）分析AfSA4抗体和AfSA4-AP融合蛋白的结合特性

1）将芯片按照BIAcore3000（瑞典GEHealthcare公司）的操作手册进行安装，工作温度设定为25℃，将运行缓冲液（PBS，pH7.4）注入，流速10μl/min，初始化传感芯片3～4次直到基线稳定（需2～3min）。

2）将活化试剂EDC/NHSS（购自GEHealthcare公司）按照体积比1:1注入，活化芯片7min。

3）将溶于乙酸（pH4.5）的抗原样品（50μg/ml）注入5min，使其结合在活化的芯片表面。

4）将乙醇胺溶液（1M，pH8.5）注入7min，失活未结合蛋白的活化位点。

5）将PBS缓冲液注入，稳定基线5min。

6）将不同浓度的AfSA4抗体或AfSA4-AP融合蛋白注入5min，流速30μl/min。

7）将100mM甘氨酸溶液（pH2.0）注入，再生芯片。

8）利用BIAcoreevaluationversion4.1和IGORPro（version6.0.3.1,WaveMetrics,Inc）软件拟合SPR实时监测曲线并进行分析，计算动力学参数。

SPR动力学曲线如图12所示，动力学参数见表2。AfSA4抗体和AfSA4-AP融合蛋白均对黄曲霉SCWPs有很高的亲和力，而且AfSA4-AP的亲和力比AfSA4抗体提高了6倍。

表2SPR测定AfSA4抗体及AfSA4-AP融合蛋白的动力学常数

注：k_a，结合常数；k_d，解离常数；K_D，平衡解离常数（K_D=k_d/k_a）

实施例19：免疫小鼠及单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选

用实施例1制备的SCWPs抗原免疫Balb/c小鼠（购自中国科学院武汉病毒研究所实验动物中心）进行5次免疫，第一次免疫后4周（28天）进行第二次免疫，后三次加强免疫间隔期为1周。免疫采用背部皮下多点注射和腹腔注射，第一次取200μL免疫抗原（100μg）与等体积弗氏完全佐剂混合后免疫，加强免疫时取200μL免疫抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合后免疫。第三次免疫后1周眼窝取血，4℃静置过夜后于6000r/min离心10min，收集上清（抗血清）通过间接ELISA检测血清多抗效价（参照林巧爱、董海艳主编，《医学免疫学与微生物学实验指导》，浙江大学出版社，2006年）。结果表明免疫后的小鼠血清中黄曲霉特异抗体效价达到1：128,000。

单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选参照J.E.科立根等[美]，《精编免疫学实验指南》，科学出版社，2009年（第一版）中的方法进行，最终获得了一株能分泌抗黄曲霉单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A8。

实施例20：大量制备单克隆抗体

1）将液体石蜡接种至同系成年Balb/c小鼠腹腔，每只小鼠接种300～500μL。

2）7～10天后，将500μL稀释于PBS中的杂交瘤细胞（3×10⁵）接种至小鼠腹腔。

3）接种5天后，如小鼠腹部膨大明显，用手触摸时小鼠皮肤有紧张感，即可用带16号针头的注射器采集腹水，可连续采集2～3次。

4）将步骤3所得腹水室温3000r/min离心10min，收集上清并进行下一步纯化。

实施例21：利用硫酸铵法沉淀纯化单克隆抗体

1）向实施例20所得的腹水中加入2倍体积PBS。

2）向步骤1）的腹水稀释液中加入0.277g/mL的硫酸铵，在冰浴下搅拌的同时缓慢添加。

3）在4℃静置2h至过夜。

4）4℃，12000r/min离心10min，弃上清。

5）加入PBS溶解沉淀至原体积，重复步骤2～4）的方法。

6）用适量PBS溶解沉淀并测定蛋白浓度，加入终浓度50%（v/v）的甘油后分装保存于-70℃。

实施例22：2A8单克隆抗体和AfSA4-AP融合蛋白双抗夹心法的最低检测限测定

1）在100mlCzapek培养基中接种1ml黄曲霉或寄生曲霉孢子液（按实施例1步骤1）制备，1×10⁵/ml），于30℃摇床（200r/min）培养5～7d。

2）用2层无菌纱布过滤收集菌丝后冷冻干燥12h。

3）将菌丝在液氮中研磨后重悬于PBS缓冲液。

4）将100μl稀释在PBS中的单克隆抗体2A8（20μg/ml）加入ELISA板孔中，4℃放置过夜，进行包被。

5）每个ELISA板孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

6）每孔加入300μl封闭液（含2%（W/V）脱脂奶粉的PBS溶液）37℃封闭2h。

7）每孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

8）将菌丝溶液梯度稀释至10^-4、10^-3、10^-2、10^-1、1、10、10²、10³μg/ml，将各个浓度的菌丝溶液分别加入ELISA板，37℃温浴2h。

9）每孔用300μlPBST洗涤3次，每次30sec。

10）每孔加入100μl稀释在封闭液中的AfSA4-AP融合蛋白（200nM），37℃温浴2h。

11）每孔用300μlPBST和PBS分别洗涤3次，每次30sec。

12）每孔加入100μlpNPP显色液，避光反应15～30min，用酶标仪测定OD_405nm值。

结果如图13所示，双抗体夹心ELISA法对黄曲霉和寄生曲霉菌丝的最低检测限均达到10^-3μg/ml。

实施例23：AfSA4-AP融合蛋白的最低定量限测定

将健康的玉米和花生粒粉碎，称取0.1mg加入10ml含0.05%（v/v）PBST缓冲液悬浮，然后稀释10倍。将按实施例22步骤1～3制备的菌丝悬浮液与玉米或花生悬浮液混合，使菌丝量占总量的10^-4，10^-3，10^-2，10^-1，1，10，10²，10³μg/mg，包被ELISA板，按实施例22步骤8～12测定双抗体夹心ELISA法对黄曲霉和寄生曲霉的最低定量限。

结果如图14所示，双抗体夹心ELISA法的最低定量限达到10^-3mg/g（即10^-3μg/ml），而且菌丝含量与OD_405nm值的对数值可以用非线性方程进行拟合，说明该方法可用于快速检测黄曲霉和寄生曲霉在食品和农产品中的污染。

实施例24：双抗体夹心ELISA法检测自然发病的材料

1）从河南、湖北、山东收集自然发病的材料，玉米（7份）和花生（13份）。

2）用产黄曲霉毒素的黄曲霉和寄生曲霉分别接种花生和玉米，并于接种8天后收集发病材料。

3）将步骤1和2收集的材料粉碎，称取适量悬浮于PBS（成分同前）。与此同时，将一部分粉碎的材料100℃烘烤10min后悬浮于PBS，将另一部分材料悬浮于PBS后100℃煮沸10min。将上述所有样品稀释至1mg/ml。

4）样品翻转混匀30min后1500r/min离心5min，取上清包被ELISA板，相同处理的健康玉米和花生材料作为阴性对照。

5）按实施例22的步骤4～12）的方法操作检测。

结果显示，双抗体夹心ELISA法能很好的检测黄曲霉和寄生曲霉污染的材料，也可以有效检测经过热处理（100℃烘烤或煮沸10min）的发病材料，说明抗体所识别的抗原SCWPs具有热稳定性。因此，在黄曲霉特异单链抗体基础上开发的双抗体夹心ELISA法可以对农作物生产、粮食储藏、饲料或食品加工过程中所污染的产黄曲霉毒素的霉菌进行检测。

Claims (3)

1.一种黄曲霉菌特异单链抗体与碱性磷酸酶融合的重组蛋白AfSA4-AP，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO：8所示。

2.一株分泌抗黄曲霉菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A8，其特征在于，该杂交瘤细胞株2A8保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2013101，所述的单克隆抗体对黄曲霉菌和寄生曲霉菌具有特异性结合能力。

3.权利要求2所述的杂交瘤细胞株2A8在制备检测黄曲霉菌和寄生曲霉菌的单克隆抗体中的应用。