CN115260309B

CN115260309B - 人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体及其应用

Info

Publication number: CN115260309B
Application number: CN202110474032.5A
Authority: CN
Inventors: 薛升; 黄思杨
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2021-04-29
Filing date: 2021-04-29
Publication date: 2024-05-07
Anticipated expiration: 2041-04-29
Also published as: CN115260309A

Abstract

本发明提供了一种人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体及其应用，属于基因工程抗体技术领域。本发明提供的人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，命名为ASH8。本发明以纯化的人源性mRNA为模版克隆人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体基因，并以此构建单链抗体噬菌体库用于生物淘选，筛选得到特异性较高的人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体ASH8，该抗体为全新的人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体，可以特异性结合动脉粥样硬化斑块，同时其能通过抑制巨噬细胞对ox‑LDL的吞噬作用并减少细胞凋亡的发生，从而可对动脉粥样硬化引起的心血管疾病具有良好的诊断和治疗效果。

Description

人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程抗体技术领域，尤其涉及一种人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体及其应用。

背景技术

动脉粥样硬化(AS)是导致人类发病率和死亡率逐年增高的心血管疾病，其具体机制仍然不清，已有的学说包括脂质浸润、氧化应激、免疫应答等。病变的主要过程可以大致概括为血管内皮损伤导致内皮细胞失去其作为屏障的作用，单核细胞迁移至内膜下分化为巨噬细胞，巨噬细胞大量吞噬脂质形成泡沫细胞，最终成为斑块组织。根据斑块的大小，致使血管腔内存在不同程度的狭窄，从而引发器官的缺血性损害。此外，当不稳定的斑块组织破裂，随血流运行，至管腔狭小分叉处时，会造成血管栓塞，重则危及生命。

氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)是动脉粥样硬化疾病的危险因素，它是由低密度脂蛋白(LDL)在氧化应激的过程中经氧化修饰而成，ox-LDL在整个疾病进展过程中，从血管内皮功能障碍、白细胞活化、泡沫细胞形成、血管平滑肌细胞(SMC)迁移和增殖到血小板粘附和聚集，都会引发动脉粥样硬化事件。其中，巨噬细胞吞噬ox-LDL在动脉粥样硬化疾病的进展中发挥着重要作用。研究表明，ox-LDL能诱导AS的氧化应激和炎症反应。在疾病早期，ox-LDL能诱导血管内皮细胞损伤，从而使得血管内皮的通透性增加，促进炎症因子的释放、白细胞的粘附和渗出、血小板的活化以及血栓的形成。循环中ox-LDL水平与心血管疾病风险有着显著的关系。此外，ox-LDL的升高常常伴随着较高的脑卒中后死亡率以及较差的功能恢复。因此，如何降低血浆中ox-LDL水平对心血管疾病的预防及治疗意义重大。

发明内容

本发明提供了一种人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体及其应用，该抗体为全新的人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体，其可通过抑制巨噬细胞对ox-LDL的吞噬作用并减少细胞凋亡的发生，从而可对动脉粥样硬化引起的心血管疾病具有良好的治疗效果。

为了达到上述目的，本发明提供了一种人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，命名为ASH8。

作为优选，所述单链抗体包括如SEQ ID NO.3所示的由108个氨基酸组成的轻链可变区V_L和如SEQ ID NO.4所示的由126个氨基酸组成的重链可变区V_H。

作为优选，所述轻链可变区V_L包括框架区和互补决定区，其中：

所述轻链框架区包括框架区L-FR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；框架区L-FR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；框架区L-FR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；框架区L-FR4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述轻链互补决定区包括互补决定区L-CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；互补决定区L-CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；互补决定区L-CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；

所述重链可变区V_H包括框架区和互补决定区，其中：

所述重链框架区包括框架区H-FR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；框架区H-FR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；框架区H-FR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；框架区H-FR4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；

所述重链互补决定区包括互补决定区H-CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；互补决定区H-CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；互补决定区H-CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。

本发明还提供了一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码如上述技术方案所述的人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作为优选，所述核苷酸分子编码轻链可变区V_L的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述核苷酸分子编码重链可变区V_H的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述核苷酸分子编码框架区L-FR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示、编码框架区L-FR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示、编码框架区L-FR3的核苷酸序列如SEQ IDNO.23所示、编码框架区L-FR4的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；

所述核苷酸分子编码互补决定区L-CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示、编码互补决定区L-CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示、编码互补决定区L-CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；

所述重链可变区V_H包括框架区和互补决定区，其中：

所述核苷酸分子编码框架区H-FR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示、编码框架区H-FR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示、编码框架区H-FR3的核苷酸序列如SEQ IDNO.30所示、编码框架区H-FR4的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；

所述核苷酸分子编码互补决定区H-CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示、编码互补决定区H-CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示、编码互补决定区H-CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示。

本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体在制备治疗/改善/减轻/诊断动脉粥样硬化引起的心血管疾病药物中的应用。

本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体通过特异性识别人源氧化型低密度脂蛋白在制备治疗/改善/减轻/诊断动脉粥样硬化引起的心血管疾病药物中的应用。

作为优选，所述人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体在浓度为100ng/μL时能够抑制巨噬细胞RAW吞噬氧化性低密度脂蛋白。

作为优选，所述人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体能够特异性结合人动脉粥样硬化斑块组织和/或能够抑制动脉粥样硬化斑块的发生。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1、本发明以纯化的人源性mRNA为模版克隆人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体基因，并以此构建单链抗体噬菌体库用于生物淘选，筛选得到特异性较高的人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体ASH8，该抗体为全新的人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体；

2、本发明提供的人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体能够与氧化型低密度脂蛋白和动脉粥样硬化斑块组织特异性结合并发挥作用；

3、本发明提供的人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体能通过抑制巨噬细胞对ox-LDL的吞噬作用并减少细胞凋亡的发生，从而可对动脉粥样硬化引起的心血管疾病具有良好的治疗效果。

4、本发明提供的人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体能特异性结合动脉粥样硬化斑块组织，从而对诊断动脉粥样硬化斑块发生具有良好效果。

附图说明

图1为本发明实施例提供的PCR合成的55条大小约为500bp的目的片段，其中M：DNA分子量标准；泳道1-55：55条重链/轻链片段回收后电泳；

图2为本发明实施例提供的通过SOE-PCR合成的单链抗体片段(Scfv)，其中M：DNA分子量标准；泳道1：V_H-κ片段；泳道2：V_H-λ片段；

图3为本发明实施例提供的PCR扩增重组质粒中插入的scFv片段，其中M：DNA分子量标准；泳道1-20：20个单克隆的PCR产物；

图4为本发明实施例提供的合成的单链抗体片段ScFv片段具有的良好多样性示意图，其中M：DNA分子量标准；泳道1-20：20个单克隆的BstN I酶切产物；

图5为本发明实施例提供的ELISA实验中确定24^#为阳性克隆的OD_405nm测量值与克隆数的关系图；

图6为本发明实施例提供的纯化后的单链抗体蛋白与对照组BSA分子量比对图；

图7为本发明实施例提供的抗体与ox-LDL特异性结合示意图，其中左侧：考马斯亮蓝染色胶图；右侧：Western-blot图；

图8为本发明实施例提供的ASH8抗体抑制巨噬细胞吞噬ox-LDL脂蛋白能力示意图：其中Dil-ox-LDL是荧光标记的ox-LDL；

图9为本发明实施例提供的TUNEL检测ASH8抗体抑制细胞凋亡实验示意图：其中凋亡细胞可以被特异性荧光染料标记荧光信号；

图10为本发明实施例提供的ASH8抗体特异性结合人动脉粥样硬化血管示意图：其中Control为健康血管，AS为动脉粥样硬化血管，ASH8抗体与动脉粥样硬化斑块的结合能够被荧光标记的二抗检测；

图11为本发明实施例提供的ASH8抗体治疗小鼠动脉粥样硬化示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.1实验材料与试剂

大肠杆菌菌株TOP10；大肠杆菌菌株XL1-Blue；辅助噬菌体VCSM13；噬菌粒载体pComb3X；限制性内切酶Sfi I，BstN I，T4DNA连接酶；EasyTaq聚合酶；反转录试剂盒；DNA凝胶回收试剂盒；抗生素：羧苄青霉素(50mg/mL)，四环素(5mg/mL)，卡那霉素(50mg/mL)；电转杯；LB培养基；SB培养基；SOC培养基；PEG/NaCl；PBS；PBST；BSA；Glycine-HCl(100mM)；2MTris；Western-Blot制胶试剂盒；人源氧化性低密度脂蛋白；荧光标记的低密度脂蛋白(Dil-ox-ldl)；青链霉素双抗(100×)；HRP-conjugated anti M13抗体；HRP-conjugated抗体；Anti-His抗体；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒Alexa Fluor 488(YEASEN 40307ES20)等。

1.2溶液配制

(1)培养基

LB液体培养：1L烧杯中加入10g Tryptone，5g Yeast Extract，10g NaCl，加入去离子水搅拌均匀，定容至1L，分装到培养瓶中高压灭菌保存。

LB固体培养基：LB液体培养机中加入琼脂糖(每1L LB液体培养基加入15g琼脂糖)，分装，高压灭菌保存。

SB培养基：10g MOPS，30g Tryptone，20g Yeast Extract溶于去离子水中，定容至1L，调PH＝7.0，高压灭菌保存。

半琼脂培养基(顶层琼脂培养基)：2g Tryptone，1g Yeast Extract，2g NaCl，1.5g Agar溶于去离子水中，定容至200mL，高压灭菌保存。

(2)10×PBS缓冲液：2.7g KH₂PO₄，14.2g Na₂HPO₄，80g NaCl，2g KCl溶于一定量去离子水中，搅拌均匀后定容至1L，调PH＝7.4。

50×TAE溶液：242g Tris，18.612g EDTA，57.1mL冰乙酸，加入去离子水搅拌均匀后定容至1L，调PH＝8.3。

5×PEG/NaCl：20％聚乙二醇(PEG8000)，2.5M Nacl，溶于去离子水中，混匀，室温保存。

TBS缓冲液：50Mm Tris-HCl，150Mm NaCl，溶于去离子水中，调PH＝7.5。

0.05％TBST：100mL TBS缓冲液中加入50μL Tween-20。

100mM Glycine-HCl：0.75g Glycine溶于100mL ddH₂O中，加HCl调PH＝2.2，用0.22μm滤器滤过后4℃保存。

2M Tris：24.2g Tris溶于100mL ddH₂O中，0.22μm滤器滤过，4℃保存。

1％BSA：称取0.5g BSA粉末溶于50mL TBS中，0.22μm滤器滤过，4℃保存。

(3)纯化蛋白相关试剂

1M IPTG：称取2.4g IPTG溶于10mL ddH₂O中，0.22μm滤器滤过，-20℃保存。

菌体重悬缓冲液：50mM Na₂HPO₄，300mM NaCl，10mM咪唑，1mM PMSF，PH＝8.0。

非特异性洗脱液(Wash Buffer)：50mM Na₂HPO₄，300mM NaCl，20mM咪唑，PH＝8.0。

特异性洗脱液(Elution Buffer)：50mM Na₂HPO₄，300mM NaCl，250mM咪唑，PH＝8.0。

(4)Western-Blot相关试剂

10×Running Buffer：30.28g Tris，144g Glycine，10g SDS，溶于去离子水中，搅拌均匀，定容至1L，室温保存。

10×Transfer Buffer：30.28g Tris，144g Glycine溶于去离子水中，搅拌均匀，定容至1L，室温保存。

0.05％PBST：50mL 1×PBS中加入250μL Tween-20，混合均匀。

(5)5％脱脂奶粉：称取2.5g脱脂奶粉溶于50mL ddH₂O中。

(6)1M MgCl₂：称取9.5g MgCl₂溶于ddH₂O水中，定容至100mL，0.22μm滤器滤过，4℃保存。

1.3统计学分析

原始数据使用GraphPad Prism 8.0软件进行分析，所得结果以均数±标准差形式表示。各组间比较采用t-检验，P＜0.05时认为差异具有统计学意义。

实施例2

2.1单链抗体基因克隆

利用已纯化的人源性mRNA为模版，oligo(dT)为引物逆转录合成全长的抗体编码cDNA。以cDNA为模板，通过PCR扩增相应的引物(引物序列见表1)得到重链可变区基因(V_H)和轻链可变区基因(V_L)，总共55个片段(重链12条，轻链分κ链16条，λ链27条)。

50μL PCR反应体系：0.5μL cDNA、5μL 10X Buffer、1μL dNTP、0.5μL正向引物(100μm)、0.5μL反向引物(100μm)、0.5μL Taq酶，加ddH₂O补至50μL。反应条件：94℃，5min；94℃，15s，56℃，15s，72℃，45s，30个循环；72℃，10min。

PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。目的片段长度约为500bp，如图1所示，V_H：1-12；V_Lκ：13-28；V_Lλ：29-55，通过凝胶回收试剂盒对55个片段进行回收，使回收后每个片段的量至少达到2-3g。

然后以V_H和V_L为模版，加入正向引物RSC-F、反向引物RSC-B、Taq酶等，通过SOE-PCR合成单链抗体片段(Scfv)。

50μL PCR反应体系：VH和VL片段各50ng、5μL 10×Buffer、1μL dNTP、0.3μL正向引物(100μm)、0.3μL反向引物(100μm)、0.5μL Taq酶，加ddH₂O补至50μL。反应条件：94℃，5min；94℃，15s，56℃，15s，72℃，90s，25个循环；72℃，10min。

PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小约为800bp(如图2所示)，凝胶回收合成的目的片段。最后利用Sfi I酶酶切Scfv以及载体pComb3X于50℃下处理5h，为下一步单链抗体噬菌体库的构建作准备，其中酶切体系为：Scfv/pComb3X 1μg、10×NEBBuffer 5μL、Sfi I酶2μL，加dd H₂O补至总体积50μL。

表1 PCR扩增引物

2.2单链抗体噬菌体文库构建

将Sfi I酶切过的ScFv片段及载体pComb3x通过T4 DNA连接酶连接合成重组质粒(连接体系为：酶切回收后的pComb3x 1400ng、ScFv片段700ng、5×T4 ligase buffer 40μL、T4 ligase 10μL，加dd H₂O补至总体积200μL)。将重组质粒通过电转化法(电转仪程序：Bacterial，2.5kV，200Ω，4ms)转入大肠杆菌XL1-blue感受态细胞中，分次向电转杯中加入5mL SOC培养基，吸出，放入50mL管中于37℃摇床中250r/min震荡培养1h。1小时后，加入10mL SB培养基、6μL羧苄青霉素(50mg/mL)、30μL四环素(5mg/mL)。然后从混合的菌液中取出2μL加入到200μL SB培养基中混合均匀，分别取出10μL、100μL涂含有羧苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃过夜培养，可以通过数平板上的菌落数计算转化效率。并随机挑取平板上的单克隆，通过特定的引物(正向引物：ompseq，反向引物：gback)做菌液PCR，随机挑选20个单克隆做菌液PCR检测目的基因是否插入。反应体系：点取单克隆，1.2μL gback、1.2μLompseq、2μL 10×Buffer、1.6μL dNTP、0.2μL Taq酶，加ddH₂O补至20μL。反应条件：94℃，5min；94℃，15s，56℃，15s，72℃，2min，30个循环；72℃，10min。如图3所示，20个克隆均含有大小约为900bp的目的片段，即目的基因插入正确。

随后，将上述PCR扩增得到的产物通过BstN I酶酶切，以分析抗体基因文库的多样性。具体的，将上述15mL菌液放入37℃摇床中250r/min震荡培养1h后，再加入9μL羧苄青霉素(50mg/mL)继续摇床1h。将上述菌液转入1L烧瓶中，加入10mL VCSM13(本实验辅助噬菌体滴度4*10¹¹pfu)辅助噬菌体，以及一定量的SB培养基使得总体为200mL，加入185μL羧苄青霉素、370μL四环素，于37℃摇床250r/min，2h。最后加入280μL卡那霉素(50mg/mL)摇床过夜。第二天收取菌液放入4℃离心机中，3000g离心15min，将上清液转入新的离心管中并加入5×PEG/NaCl混匀后于冰上放置30min。放入4℃离心机15000g，离心15min，弃上清，保留沉淀。用2mL 1％BSA重悬沉淀吸入EP管中，4℃，15000r离心5min。将上清移植新的无菌EP管中，4℃保存。

结果如图4所示，该图显示20个单克隆的酶切图谱多样性高，表明合成的单链抗体片段ScFv片段具有良好的多样性，可以用来进行下一步单链抗体的淘选。

2.3单链抗体基因的淘选

从最后1轮淘选后过夜的LB平板上随机挑选24个克隆接种至3mL含有羧苄青霉素(终浓度50μg/mL)的3mL SB培养基中，37℃摇床过夜培养。每管加入30μL辅助噬菌体VSCM13，继续摇床2h，加入4.2μL卡那霉素使得终浓度为70μg/mL，37℃摇床过夜。第二天将菌液2800g离心15min。将上清放入新的无菌管中，并加入5×PEG/NaCl，冰上放置30min，4℃，14000r离心5min，弃上清，每管加入100μL 1％BSA重悬噬菌体沉淀。提前一天在ELISA板上包被ox-LDL抗原，并设置相同数目的对照组，对照组加入等体积1％BSA。倒出抗原，每孔加入200μL 0.05％TBST洗三次；每孔加入150μL 5％的脱脂奶粉37℃封闭1h。倒出封闭液，每孔加入50μL已准备好的噬菌体液，37℃孵育2h。倒出噬菌体液，0.05％TBST洗三次，每孔加入200μL已稀释好的HRP-conjugated anti M13 antibodies(1：2500)，37℃孵育1h，洗三次，加入200μL稀释好的HRP-conjugated antibody(1：2500)孵育1h。分别用0.05％TBST和PBS各吹洗三次。每孔加入100μL TMB显色液，放置于黑暗处30min，最后加入100μL 2M H₂SO₄终止反应。用酶标仪检测OD_405nm的吸光度。通过三轮的筛选，每轮淘选计算淘选前后的噬菌体滴度，即输入量与输出量，结果如表4所示。

表4每轮淘选计算淘选前后的噬菌体滴度

	输入量(pfu/mL)	输出量(pfu/mL)
			R1	1.4ⅹ10¹⁴	1.28ⅹ10⁶
R2	4ⅹ10¹³	1.6ⅹ10⁴
			R3	8.7ⅹ10¹³	1.15ⅹ10⁶

进一步，通过表达ELISA实验，与对照组做比较，测量OD₄₀₅nm处的吸光度，以实验组/对照组>2为阳性克隆(实验重复一次)，结果如图5所示，对比BSA对照组的吸光度，确定了24^#为阳性克隆，并命名为ASH8。

2.4蛋白的表达与纯化

将含有重组噬菌粒的大肠杆菌TOP10接种到5mL含有羧苄青霉素(100μg/mL)的SB培养基中，37℃，200r/min，摇床过夜。取2mL过夜培养的菌液加入到200mL还有羧苄青霉素的SB培养基中，37℃摇床培养至OD₆₀₀nm＝0.5左右。加入终浓度为1mM的IPTG，28℃摇床过夜。第二天，收集菌液，4℃，5000r/min离心20min，弃上清，重悬菌体，高压破碎裂解。裂解液4℃，15000r/min离心30min，保留上清，4℃保存。将上清液过Ni柱，收集流穿液，通过SDS检测纯化后的单链抗体，即为纯化所得蛋白。将未插入目的片段的TOP10大肠杆菌BSA作为对照组。进行SDS-PAGE检测，转膜后，5％脱脂奶粉室温封闭1h，倒出封闭液，洗膜，室温孵育抗体(抗His-HRP)2h。孵育完毕后，洗膜，进行显影。结果如图6所示，纯化后的单链抗体蛋白分子量大小约为35kD，对照组BSA组未表达出该大小片段。

2.5小鼠RAW巨噬细胞的培养

实验准备：预先将实验仪器喷洒75％的酒精后置于超净台中，紫外线照射30min。

细胞复苏：将小鼠RAW细胞从液氮中取出，迅速放入37℃恒温水浴锅中快速融化。待液体都融化后，于超净台将冻存管中的细胞悬液吸取到1.5mL EP管中，1000r，离心五分钟。弃上清，加入含有10％胎牛血清的1640培养基重悬细胞，将细胞悬液吸入到培养皿中，置于37℃，CO₂培养箱中培养。

细胞传代：待细胞涨至培养皿的80％左右，进行细胞传代。将培养皿中的培养基吸出，加入PBS洗三次，向培养皿中加入适量胰蛋白酶，以覆盖住培养皿底部为宜，将培养皿放入37℃培养箱中消化，1min后将培养皿放置于显微镜中观察，细胞胞质回缩，细胞间间隙增大，即可终止消化。向培养皿中加入含有血清的培养基终止消化，吸取瓶内培养基，反复轻轻吹打培养皿底部，使其脱离培养皿形成细胞悬液，吹打时动作要轻柔，以免损伤细胞。将细胞悬液转移至离心管中，1000r离心5min。弃掉上清液，用培养基重悬细胞，分别接种于新的培养皿中。

细胞冻存：待细胞涨至一定密度，用枪头吸去培养皿中的细胞培养液，PBS清洗三遍，加入适量的胰蛋白酶进行消化。消化结束后吸去胰酶，加入含血清的培养基终止消化，轻轻吹打培养皿壁上的细胞，形成细胞悬液。将细胞悬液移入离心管中1000r离心5min，弃掉上清液，加入1mL冻存液(900μL FBS+100μL DMSO)轻轻吹打，使细胞分布均匀，重悬细胞。最后将含有细胞的冻存液吸入冻存管中，将冻存管置于程序性降温盒中梯度降温过夜。第二天将冻存管转移至液氮中保存。

2.6ox-LDL与抗体结合实验

运用Western-Blot检测ox-LDL与抗体结合实验。根据制胶试剂盒配制12％的SDS电泳胶，分别在泳道中加入含有上样缓冲液(Loading Buffer)的ox-LDL，斑块组织AS以及BSA蛋白进行电泳(85V，2h)，转膜(250mA，80min)，5％脱脂奶粉封闭1h，0.05％PBST洗膜三次，每次5min。用纯化后的ASH8抗体配置一抗(5mL 5％milk中加入纯化后的抗体100μL(抗体浓度100ng/μL))，于4℃冰箱中水平摇床孵育过夜。第二天取出，0.05％PBST洗膜三次，孵二抗(anti-His 1：3000)，室温孵育1h，0.05％PBST清洗三次，室温孵育三抗(GAM-HRP 1：5000)1h，洗膜三次。根据试剂盒配置显影液(A液：B液＝1：1)，最后，将膜避光浸泡在显影液中，放入显影仪中进行显影成像。

如图7所示，左侧为考马斯亮蓝染色胶图，右侧Western-Blot实验以ASH8作为一抗孵育，结果显示，抗体与ox-LDL以及AS组织均有结合，条带大小大体一致，而阴性对照BSA该处无明显结合。表明ASH8抗体能与ox-LDL特异性结合。

2.7巨噬细胞吞噬ox-LDL实验

小鼠巨噬细胞RAW培养于含有10％胎牛血清的1640高糖培养基中，待细胞长到一定密度，进行细胞爬片。预先将玻片放入24孔板中，将一定密度的细胞悬液均匀分布于各孔(500μL/孔)，置于37℃，CO₂培养箱中培养。细胞分组：①对照(control)；②Dil-ox-LDL(荧光标记的氧化性低密度脂蛋白)组；③ASH8 Antibody+Dil-ox-LDL组。培养约6h后拿出，吸去培养基，PBS洗三遍，分别向不同组加入不同药物处理细胞24h。(Dil-ox-LDL浓度为(2mg/mL)，ASH8 Antibody浓度为(200ng/μL))具体处理见表5。

表5向不同组中加入不同药物处理细胞24h结果数据

分组	Control	Dil-ox-LDL	ASH8+Dil-ox-LDL
				Dil-ox-ldl	____	10μL	10μL
ASH8 Antibody	____	____	250μL
				1640培养基	490μL	480μL	230μL
FBS	5μL	5μL	5μL
				双抗(100X)	5μL	5μL	5μL

如图8所示，与添加抗体组相比较，ox-LDL组Raw细胞红色荧光信号(Fluorescence)更强，表明吞噬的氧化低密度脂蛋白明显多于ASH8 Ab+ox-LDL组(P<0.001)，表明在Dil-ox-LDL作用浓度为40ng/μL,抗体作用浓度为100ng/μL时，添加ASH8抗体后，巨噬细胞RAW吞噬脂蛋白的能力下降了。

2.8 TUNEL检测巨噬细胞凋亡

小鼠RAW细胞于24孔板中进行爬片，加入不同药物处理24h后进行TUNEL检测细胞凋亡。将孔板中培养基吸出，用PBS轻柔清洗一遍，每孔加入500μL多聚甲醛于室温下固定细胞30min。吸出固定液，PBS洗三遍，每次10min；每孔加入500μL Triton X-100，进行细胞通透处理，室温下静置10min。吸出Triton X-100，PBS洗两遍后将玻片从孔板中抠出放置于载玻片上。根据TUNEL试剂盒配置反应液以及TdT孵育缓冲液。待避光孵育结束后，加入含有0.1％Triton X-100和5mg/mL BSA的PBS轻柔清洗玻片3次，每次5min。最后滴加含DAPI的封片剂染色封片。于荧光显微镜下观察细胞凋亡。

结果如图9所示，在ox-LDL作用浓度为40ng/μL,抗体作用浓度为100ng/μL时，ox-LDL组绿色荧光(Fluorescence)明显较其他组多，表明ox-LDL致使细胞凋亡；其次，单独ASH8抗体组无明显绿色荧光(Fluorescence)，表明抗体对巨噬细胞无明显毒性反应；ASH8Ab+ox-LDL组与ox-LDL组将比较，凋亡细胞明显减少(P<0.001)，说明添加抗体后能抑制ox-LDL所致细胞凋亡。2.9抗体免疫荧光检测人动脉粥样硬化斑块

将冷冻切片从-20℃冰箱中取出后置于室温复温10min，滴加多聚甲醛固定15min，固定完毕后滴加PBS洗3遍，每次3min。用PBS溶液配置0.1％Triton X-100，2mL PBS溶液加入2μL Triton X-100。将通透液滴加到玻片上，室温通透处理15min，处理完毕后滴加PBS洗三遍，每次3min。预先配置0.1％PBST，50mL PBS加入50μL Tween-20。称取0.1g BSA粉末加入到10mL0.1％PBST中，混匀，配置成1％BSA溶液。将1％BS溶液滴加入到玻片上，室温下封闭30min。将ASH8抗体(浓度为500ng/μL)按照1：10稀释到1％BSA中，即1mL 1％BSA加入100μL ASH8抗体，每个玻片滴加200-300μL稀释的一抗，室温孵育1h；孵育完毕后加入适量1％PBST洗三次，每次3min。将Anti-His antibody(Abclonal AE003)按照1：100进行稀释，即1mL 1％BSA加入10μL Anti-His Antibody，每个玻片滴加200-300μL；37℃孵育1h；孵育完毕后加入1％PBST洗三次，每次3min。避光条件下将Cy3 GAM IgG(Abclonal AS008)按照1：200进行稀释，即1mL 1％BSA加入5μL抗体，避光下于湿盒中孵育1h。孵育完毕后加入1％PBST洗三次，每次3min。避光条件下，每个玻片滴加一到两滴含DAPI的封片剂进行封片，封片后于荧光显微镜下观察拍照。

对上述冰冻切片进行油红O(Oil Red-O)染色，确定动脉粥样硬化脂质斑块位置。将冰冻切片复温干燥，甲醛固定15min，自来水洗，晾干。切片入油红染液浸染8-10min(加盖避光)。取出切片，停留3s后依次浸入两缸60％异丙醇分化，各3s、5s。切片依次浸入2缸纯水中浸洗，各10s。取出切片，停留3s后浸入苏木素复染3-5min，3缸纯水浸洗，各5s、10s、30s。分化液(以60％酒精为溶剂)分化2-8s，2缸蒸馏水洗各10s，返蓝液返蓝1s，将切片轻轻浸入2缸自来水中浸洗，各5s、10s，镜检染色效果。甘油明胶封片剂封片。显微镜镜检，图像采集分析。

结果如图10所示，在ASH8抗体浓度50ng/μL时，动脉粥样硬化血管组(AS)荧光信号明显强于对照组(control)。油红O(Oil Red-O)染色表明抗体结合的部位有明显的动脉粥样硬化脂质斑块。说明ASH8抗体能够特异性结合人动脉粥样硬化斑块，可以应用于动脉粥样硬化的成像和诊断领域。

2.10抗体治疗小鼠动脉粥样硬化

适宜周龄的20只ApoE基因敲除小鼠分为实验组和对照组，每组各10只。对照组、实验组在给予普通饮食喂养一周后更换为高脂饮食(HFD)喂养(包含83.5％基础饲料+15％猪油和1.5％胆固醇)。其中，实验组于高脂饮食喂养期间，连续给予尾静脉注射纯化后的ASH8抗体(500ng/μL，100μL/只)，每周1-2次，共注射ASH8抗体8次；对照组给与等量PBS注射液。待高脂饮食喂养8周后，气体麻醉并处死小鼠，仔细解剖小鼠，将心脏、肝、肾脏、脾脏等器官保存于4％多聚甲醛溶液中，分离主动脉弓，胸主动脉和腹主动脉，进行油红O染色，观察主动脉粥样硬化斑块情况。所有动物研究和程序均按照青岛大学附属医院动物伦理委员会批准的方案进行。符合国家医学研究协会制定的“实验动物的护理和使用”。

结果如图11所示，实验组小鼠在注射ASH8抗体(浓度500ng/μL，100μL/只)后主动脉动脉粥样硬化斑块分布明显少于对照组，统计结果显示差异显著。该结果表明ASH8抗体有治疗动脉粥样硬化的作用，可以应用于动脉粥样硬化治疗领域。

序列表

<110> 青岛大学

<120> 人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体及其应用

<160> 34

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 261

<212> PRT

<213> 人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体ASH8

<400> 1

VLTQPPSASGAPGQRISISCSGSTSNIGSQTVNWYHHLPGTAPRLLMYKSNERPSGVPDR 60

FSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCATWDGSLKSVVFGGGTELTVLGGGSSRSSSSGG 120

GGSGGGGQVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFIDNWIAWVRQRPGKGLEWMGIIHP 180

RDSDTRYSPSFQGQVTMSADKSINAAYLQWNSLTASDTAMYYCARRVDCYGGPCYPGNWF 240

DPWGQGTLVTVSSASTKGPSV 261

<210> 2

<211> 783

<212> DNA

<213> 人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体ASH8

<400> 2

GTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGGCCCCCGGGCAGAGGATCAGCATCTCTTGT 60

TCTGGAAGCACCTCCAACATCGGAAGTCAGACTGTAAACTGGTACCACCACCTCCCGGGA 120

ACGGCCCCCAGACTCCTCATGTATAAAAGTAATGAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGA 180

TTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTTCAGTCTGAG 240

GATGAGGCTGATTATTACTGTGCAACGTGGGATGGCAGCCTAAAAAGTGTCGTATTCGGC 300

GATGAGGCTGATTATTACTGTGCAACGTGGGATGGCAGCCTAAAAAGTGTCGTATTCGGC 360

GGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAGAAG 420

CCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTATCGACAACTGG 480

ATCGCCTGGGTGCGCCAGAGGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCCATCCT 540

CGTGACTCTGACACCAGGTACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATGTCTGCTGAC 600

AAGTCCATCAATGCCGCCTACCTACAGTGGAACAGCCTGACGGCCTCGGACACCGCCATG 660

TATTACTGTGCGAGACGGGTGGATTGTTATGGTGGTCCCTGCTACCCGGGCAACTGGTTC 720

GACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCG 780

GTC 783

<210> 3

<211> 108

<212> PRT

<213> 轻链可变区VL

<400> 3

VLTQPPSASGAPGQRISISCSGSTSNIGSQTVNWYHHLPGTAPRLLMYKSNERPSGVPDR 60

FSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCATWDGSLKSVVFGGGTELTVL 108

<210> 4

<211> 126

<212> PRT

<213> 重链可变区VH

<400> 4

QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFIDNWIAWVRQRPGKGLEWMGIIHPRDSDTRY 60

SPSFQGQVTMSADKSINAAYLQWNSLTASDTAMYYCARRVDCYGGPCYPGNWFDPWGQGT 120

LVTVSS 126

<210> 5

<211> 324

<212> DNA

<213> 轻链可变区VL

<400> 5

GTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGGCCCCCGGGCAGAGGATCAGCATCTCTTGT 60

TCTGGAAGCACCTCCAACATCGGAAGTCAGACTGTAAACTGGTACCACCACCTCCCGGGA 120

ACGGCCCCCAGACTCCTCATGTATAAAAGTAATGAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGA 180

TTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTTCAGTCTGAG 240

GATGAGGCTGATTATTACTGTGCAACGTGGGATGGCAGCCTAAAAAGTGTCGTATTCGGC 300

GGAGGCACCGAGCTGACCGTCCTA 324

<210> 6

<211> 378

<212> DNA

<213> 重链可变区VH

<400> 6

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATC 60

TCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTATCGACAACTGGATCGCCTGGGTGCGCCAGAGG 120

CCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCCATCCTCGTGACTCTGACACCAGGTAC 180

AGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATGTCTGCTGACAAGTCCATCAATGCCGCCTAC 240

CTACAGTGGAACAGCCTGACGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACGGGTG 300

GATTGTTATGGTGGTCCCTGCTACCCGGGCAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACC 360

CTGGTCACCGTCTCCTCA 378

<210> 7

<211> 23

<212> PRT

<213> 轻链框架区L-FR1

<400> 7

VLTQPPSASGAPGQRISISCSGS 23

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 轻链框架区L-FR2

<400> 8

VNWYHHLPGTAPRLLMY 17

<210> 9

<211> 36

<212> PRT

<213> 轻链框架区L-FR3

<400> 9

ERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYC 36

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 轻链框架区L-FR4

<400> 10

FGGGTELTVL 10

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 轻链互补决定区L-CDR1

<400> 11

TSNIGSQT 8

<210> 12

<211> 3

<212> PRT

<213> 轻链互补决定区L-CDR2

<400> 12

KSN 3

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 轻链互补决定区L-CDR3

<400> 13

ATWDGSLKSVV 11

<210> 14

<211> 25

<212> PRT

<213> 重链框架区H-FR1

<400> 14

QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGS 25

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 重链框架区H-FR2

<400> 15

IAWVRQRPGKGLEWMGI 17

<210> 16

<211> 38

<212> PRT

<213> 重链框架区H-FR3

<400> 16

RYSPSFQGQVTMSADKSINAAYLQWNSLTASDTAMYYC 38

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 重链框架区H-FR4

<400> 17

WGQGTLVTVSS 11

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 重链互补决定区H-CDR1

<400> 18

GYSFIDNW 8

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 重链互补决定区H-CDR2

<400> 19

IHPRDSDT 8

<210> 20

<211> 19

<212> PRT

<213> 重链互补决定区H-CDR3

<400> 20

ARRVDCYGGPCYPGNWFDP 19

<210> 21

<211> 69

<212> DNA

<213> 轻链框架区L-FR1

<400> 21

GTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGGCCCCCGGGCAGAGGATCAGCATCTCTTGT 60

TCTGGAAGC 69

<210> 22

<211> 51

<212> DNA

<213> 轻链框架区L-FR2

<400> 22

GTAAACTGGTACCACCACCTCCCGGGAACGGCCCCCAGACTCCTCATGTAT 51

<210> 23

<211> 108

<212> DNA

<213> 轻链框架区L-FR3

<400> 23

GAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCC 60

CTGGCCATCAGTGGGCTTCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGT 48

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 轻链框架区L-FR4

<400> 24

TTCGGCGGAGGCACCGAGCTGACCGTCCTA 30

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 轻链互补决定区L-CDR1

<400> 25

ACCTCCAACATCGGAAGTCAGACT 24

<210> 26

<211> 9

<212> DNA

<213> 轻链互补决定区L-CDR2

<400> 26

AAAAGTAAT 9

<210> 27

<211> 33

<212> DNA

<213> 轻链互补决定区L-CDR3

<400> 27

GCAACGTGGGATGGCAGCCTAAAAAGTGTCGTA 33

<210> 28

<211> 74

<212> DNA

<213> 重链框架区H-FR1

<400> 28

AGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCT 60

CCTGTAAGGGTTCT 74

<210> 29

<211> 51

<212> DNA

<213> 重链框架区H-FR2

<400> 29

ATCGCCTGGGTGCGCCAGAGGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATC 51

<210> 30

<211> 114

<212> DNA

<213> 重链框架区H-FR3

<400> 30

AGGTACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATGTCTGCTGACAAGTCCATCAATGCC 60

GCCTACCTACAGTGGAACAGCCTGACGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGT 54

<210> 31

<211> 33

<212> DNA

<213> 重链框架区H-FR4

<400> 31

TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 33

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 重链互补决定区H-CDR1

<400> 32

GGATACAGCTTTATCGACAACTGG 24

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 重链互补决定区H-CDR2

<400> 33

ATCCATCCTCGTGACTCTGACACC 24

<210> 34

<211> 57

<212> DNA

<213> 重链互补决定区H-CDR3

<400> 34

GCGAGACGGGTGGATTGTTATGGTGGTCCCTGCTACCCGGGCAACTGGTTCGACCCC 57

Claims

1. 人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为ASH8。

2.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1所述的人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的人源氧化型低密度脂蛋白单链抗体在制备治疗/诊断动脉粥样硬化引起的心血管疾病药物中的应用。