WO2023182244A1 - ヒトノロウイルスｇｉｉ．２特異的抗体 - Google Patents

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WO2023182244A1
WO2023182244A1 PCT/JP2023/010780 JP2023010780W WO2023182244A1 WO 2023182244 A1 WO2023182244 A1 WO 2023182244A1 JP 2023010780 W JP2023010780 W JP 2023010780W WO 2023182244 A1 WO2023182244 A1 WO 2023182244A1
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seq
amino acid
acid sequence
sequence represented
antibody
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PCT/JP2023/010780
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義和 幸
宏 清野
慎太郎 佐藤
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株式会社HanaVax
国立大学法人 東京大学
国立大学法人大阪大学
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Publication date
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    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora

Definitions

  • the present invention relates to norovirus antibodies. More specifically, it relates to the variable region of a heavy chain antibody against norovirus.
  • Norovirus is a pathogenic virus that invades cells in the upper small intestine from the duodenum and causes non-bacterial acute gastroenteritis, and belongs to the non-enveloped Caliciviridae family.
  • the norovirus genome is a single-stranded positive-sense RNA of approximately 7.7 kb.
  • a viral protein called VPg is covalently linked to the 5' end of the genome, and the 3' end is polyadenylated.
  • the genome contains coding regions for three proteins, ORF1, VP1, and VP2, which encode nonstructural proteins, structural protein 1, and structural protein 2, respectively. Structural analysis revealed that 180 molecules of VP1 form a dimer to construct the virus structure.
  • Each VP1 monomer is divided into two domains: a shell domain (S domain) and a protruding domain (P domain), of which the P domain is further divided into subdomains P1 and P2.
  • S domain shell domain
  • P domain protruding domain
  • P2 recognizes blood group antigens that function as receptors and host infectious agents during infection. Mutations in the P2 subdomain cause changes in binding to blood group antigens (Non-Patent Document 1).
  • GI Human noroviruses are classified into three genogroups (GI, GII, and GIV) based on their genome sequences, and there are at least 25 genotypes.
  • Noroviruses exhibit a high degree of diversity, and until now, GII.4 was the cause of epidemics, but over the past few years, the proportion of infections caused by GII.2 has increased (non-patented). (Reference 2 and Non-Patent Document 3), it is expected to become the main causative strain of future infectious epidemics.
  • the present invention aims to provide antibodies against human norovirus (HuNoV) GII.2. More specifically, the aim is to provide antibodies that inhibit human norovirus GII.2 (hereinafter also referred to as "HuNoV GII.2”) infection of cells (invasion and/or replication of HuNoV GII.2). .
  • the present inventors immunized llamas with HuNoV GII.2 VP1 as an antigen, and found that VHH antibodies (nanoantibodies) inhibited infection of HuNoV GII.2 VLPs (Virus-like particles) to intestinal epithelial cells. ) was successfully produced.
  • human antibodies are composed of heavy and light chains, but camelids such as llamas, alpacas, and camels have single-chain antibodies (heavy chain antibodies) that consist only of heavy chains. .
  • Heavy chain antibodies can recognize and bind to target antigens in the same way as normal antibodies consisting of heavy and light chains.
  • variable domain of the heavy chain of heavy chain antibody is the smallest unit that has binding affinity for an antigen, and this variable region fragment is called a "VHH antibody (nano antibody)". It is. VHH antibodies have high heat resistance, resistance to digestion, and stability at room temperature, and can be easily prepared in large quantities by genetic engineering techniques.
  • the present invention includes the following (1) to (18).
  • the VHH antibody which binds to Human Norovirus (HuNoV) GII.2 and inhibits infection of HuNoV GII.2 to intestinal cells.
  • the amino acid sequence of complementarity determining regions 1 to 3 (CDR1, CDR2 and CDR3) is (A), (B), (C), (D), (E) or (F) below.
  • A CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, CDR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and/or A polypeptide consisting of an added amino acid sequence
  • a VHH antibody multimer in which a plurality of VHH antibodies according to any one of (1) to (3) above are linked.
  • a VHH antibody multimer obtained by linking one or more of the VHH antibodies described in any one of (1) to (3) above and one or more of VHH antibodies having antigen specificities different from the VHH antibody.
  • a vector comprising the nucleic acid according to (7) above.
  • (11) Rice collected from the transgenic rice described in (10) above.
  • (12) A recombinant lactic acid bacterium into which the nucleic acid described in (7) above is introduced and in which the VHH antibody is expressed.
  • the lactic acid bacterium according to (12) above wherein the VHH antibody is displayed on the surface of the bacterial cell.
  • a pharmaceutical composition comprising the VHH antibody, heavy chain antibody, or VHH antibody multimer according to any one of (1) to (6) above.
  • the pharmaceutical composition according to (15) above, wherein the disease to be treated or prevented is a norovirus infection.
  • An antibody or antigen-binding fragment thereof that competitively inhibits the binding between the VHH antibody described in (2) or (3) above and HuNoV GII.2, and inhibits infection of intestinal cells by HuNoV GII.2.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof according to (17) above. Note that in this specification, the symbol " ⁇ " indicates a numerical range that includes the values on the left and right sides thereof.
  • the present invention provides for the first time an antibody that inhibits HuNoV GII.2 infection of intestinal epithelial cells.
  • a medicament or a pharmaceutical composition containing the antibody according to the present invention is effective in treating and/or preventing an infection caused by HuNoV GII.2 and various symptoms associated with the infection.
  • the virus copy number in the culture medium was measured 1 h post-virus infection (1 hpi) and 48 h post-infection (48 hpi).
  • Examination of the neutralizing activity of VHH antibodies (YGI-1B6, YGI-1C5, YGI-1F4, YGI-1H3) against HuNoV GII.2 (OSN201926) infection of intestinal epithelial cells.
  • the virus and each VHH antibody (200 ng, 50 ng, 12.5 ng, 0 ng) were mixed and preincubated, and then the mixture was added to the intestinal epithelial cell layer to infect the virus.
  • the virus copy number in the culture medium was measured 1 h post-infection (1 hpi) and 24 h post-infection (24 hpi).
  • VHH antibodies (YGI-1B6, YGI-1C5, YGI-1F4, YGI-1H3) against HuNoV GII.4 (17B93) infection of intestinal epithelial cells.
  • the virus and each VHH antibody (5 ⁇ g) were mixed and preincubated, the mixture was added to the intestinal epithelial cell layer to infect the intestinal epithelial cell layer.
  • the virus copy number in the culture medium was measured 1 h post-infection (1 hpi) and 24 h post-infection (24 hpi).
  • the underlined parts indicate the Flag tag and His tag parts.
  • the first embodiment is a VHH antibody (hereinafter referred to as "VHH antibody according to this embodiment") that binds to HuNoV GII.2 and inhibits HuNoV GII.2 infection of intestinal epithelial cells). ) or a heavy chain antibody containing the VHH antibody (hereinafter also referred to as “heavy chain antibody according to the present embodiment").
  • the VHH antibody according to this embodiment is, for example, a polypeptide described in (a), (b), or (c) below.
  • sequence number 1 (YGI-1B6): EVQLVESGGGLVQAGGSLRLLSCAASGRTFS NYFMG WFRQAPGKEREFVA AISWSGGSTYYTDSVK GRFTISRDNAKNTMYLQMNTLKPEDTAVYYCA AEKASLSGPSYGLGLDFSRYDY WGQGTQVTVSS
  • Sequence number 2 (YGI-1C5): EVQLVESGGGLVQTGGSLRLSCAASGLTFS NYAMG WFRQAPGKEREFVA TINWSSSRTIYADSVK GRFTISREDAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCA AEGGAPRWTTGTRRNDYRY WGQGTQVTVSS
  • Sequence number 3 (YGI-1C2): EVQLVESGGELVQAGGSLRLSCVASGFTFS NYAMG WFRQGPGKERTFVA AITWDDRNRAYADSVK GRFTISRDNAKNTIYLQMNSLKPEDTA AYVGATERFPAFSGASYYSAPSTFYF WGPGTQVTVSS
  • Sequence number 4 (YGI-1E10): EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTAPKSIAS FNSVG WYRQAPGKQRELV ATITRSRTTNYADSAR GRFTISRDNTKNMMFLQMNSLKPEDT AVYYCNARDIVPVFQTY WGQGTRVTVSS
  • Sequence number 5 (YGI-1F4): EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCGASGRTFS NYAMG WFRQAPGKEREFVA AINWSGDKTDYADSVK GRFTISRDNVKNFVALQMNSLKPEDT AVYYCATEGGFPQFGSNLKRTSFGL WGQGTQVTVSS
  • Sequence number 6 (YGI-1H3): EVQLVESGGGLVQAGGSLLRLSCVVSGRSFS SLAMG WFRQAPGNQREFVA AISWSGGSSYYGDSVK GRFTISRDDAKNTVYLQMDSLKPEDT ADYYCATEIVPKYDTAAYYKSQGAFGS WGQGTQVTVSS
  • amino acid sequences having 80% or more sequence identity may be any percentage as long as the amino acid sequences have 80% or more sequence identity, but for example, 90% or more , 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • amino acid substitutions, deletions, The insertion and/or addition site is preferably a sequence other than CDR1, CDR2, and CDR3 of each amino acid sequence.
  • the above amino acid substitutions, deletions, insertions and/or additions may be mutations that originally existed in the nucleic acid sequence encoding the protein, or may be modifications of the nucleic acid sequence by techniques known in the art. It may be newly introduced by The modification, for example, the substitution of a specific amino acid residue, can be carried out using a commercially available kit (for example, PrimeSTAR (registered trademark) (TaKaRa), PrimeSTAR TM (Cosmo Bio)), or by a known method.
  • sequences of CDR1 to CDR3 of the VHH antibody according to this embodiment represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 6 are as follows. Sequence number 1 (YGI-1B6): CDR1 sequence; NYFMG (SEQ ID NO: 7) CDR2 sequence; AISWSGGSTYYTDSVK (SEQ ID NO: 8) CDR3 sequence; AEKASLSGPSYGLGLDFSRYDY (Sequence number 9)
  • Sequence number 2 (YGI-1C5): CDR1 sequence; NYAMG (SEQ ID NO: 10) CDR2 sequence; TINWSSSRTIYADSVK (SEQ ID NO: 11) CDR3 sequence; AEGGAPRWTTGTRRNDYRY (SEQ ID NO: 12)
  • Sequence number 3 (YGI-1C2): CDR1 sequence; NYAMG (SEQ ID NO: 13) CDR2 sequence; AITWDDRNRAYADSVK (SEQ ID NO: 14) CDR3 sequence; AYVGATERFPAFSGASYYSAPSTFYF (SEQ ID NO: 15)
  • Sequence number 4 (YGI-1E10): CDR1 sequence; FNSVG (SEQ ID NO: 16) CDR2 sequence; ATITRSRTTNYADSAR (SEQ ID NO: 17) CDR3 sequence; AVYYCNARDIVPVFQTY (SEQ ID NO: 18)
  • Sequence number 5 (YGI-1F4): CDR1 sequence; NYAMG (SEQ ID NO: 19) CDR2 sequence; AINWSGDKTDYADSVK (SEQ ID NO: 20) CDR3 sequence; AVYYCATEGGFPQFGSNLKRTSFGL (SEQ ID NO: 21)
  • Sequence number 6 (YGI-1H3): CDR1 sequence; SLAMG (SEQ ID NO: 22) CDR2 sequence; AISWSGGSSYYGDSVK (SEQ ID NO: 23) CDR3 sequence; ADYYCATEIVPKYDTAAYYKSQGAFGS (SEQ ID NO: 24)
  • the VHH antibody according to this embodiment has the amino acid sequences of complementarity determining regions 1 to 3 (CDR1, CDR2 and CDR3) as shown below (A), (B), (C), (D), (E) or Also included are VHH antibodies comprising a polypeptide that is (F).
  • CDR1, CDR2 and CDR3 are VHH antibodies comprising a polypeptide that is (F).
  • C CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, and CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15.
  • D CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, and CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • E CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, CDR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, and CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21.
  • F CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, and CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24.
  • this embodiment also includes a heavy chain antibody (an antibody formed only of heavy chains) that includes the VHH antibody according to the above-described embodiment as a variable region.
  • the "heavy chain antibody” according to this embodiment may be produced by genetic engineering techniques or may be produced by an animal that produces heavy chain antibodies, such as a camelid.
  • the VHH antibody according to the present embodiment includes not only VHH monomers but also multimeric "VHH antibodies"(" VHH antibody multimers") are also included.
  • one or more of the VHH antibodies according to the present embodiment may be used with other VHH antibodies having different antigen specificities, such as VHH antibodies against rotavirus (e.g., Tokuhara et al., J Clin Invest.
  • VHH antibody multimers may be generated in combination with one or more of GI, VHH antibodies that bind to norovirus GII (GII.4, GII.17, etc.) or VHH antibodies to bacterial toxins.
  • VHH antibody multimers can be produced, for example, with reference to the method described in Schmidt et al., Clin Vaccine Immuno. 23:774-784 2016.
  • the VHH antibody according to this embodiment can be easily produced using techniques known in the art.
  • the peptide may be produced by combining a peptide solid phase synthesis method and a native chemical ligation (NCL) method.
  • NCL native chemical ligation
  • DNA consisting of a nucleic acid sequence encoding the polypeptide that is the VHH antibody according to this embodiment is inserted into an appropriate expression vector using genetic engineering techniques, and the polypeptide is expressed and isolated according to a conventional method.
  • the VHH antibody according to this embodiment can be prepared by purification or displaying on the surface of bacterial cells (eg, lactic acid bacteria).
  • the VHH antibodies according to this embodiment can be used in various host cells, such as bacterial cells (e.g., Escherichia coli B strain , E.
  • coli Kl2 strain Corynebacterium ammoniagenes, C. glutamicum , Serratia liquefaciens , Streptomyces lividans , Pseudomonas putida, Lactobacillus paracasei).
  • BL23 Lactobacillus Longum, Lactobacillus gasseri, etc.
  • molds e.g. Penicillium camembertii , Acremonium chrysogenum, etc.
  • animal cells plant cells, baculovirus/insect cells or yeast cells (e.g. Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris , etc.); can be expressed in cells.
  • Expression vectors include, for example, pBR322, pBR325, pUC118, pET, etc. (Escherichia coli host), pAF900, pINTZrec, etc. (lactic acid bacteria host, secreted or displayed on the bacterial surface), pEGF-C, pEGF-N, etc. (animal cell host). , pVL1392, pVL1393 etc. (insect cell host, baculovirus vector), pG-1, Yep13 or pPICZ etc. (yeast cell host), T-DNA binary vector pZH2B (rice expression system) can be used.
  • expression vectors have replication origins, selection markers, and promoters suitable for each vector, and as necessary, enhancers, transcription assembly sequences (terminators), ribosome binding sites, polyadenylation signals, etc. may have. Furthermore, in order to facilitate the purification of the expressed polypeptide, the expression vector may have a base sequence inserted therein for expression by fusing FLAG tag, His tag, HA tag, GST tag, etc. Production of expression vectors can be carried out by methods known to those skilled in the art, and can also be carried out using commercially available kits, etc., as appropriate.
  • the rice powder By expressing the VHH antibody according to this embodiment in rice, the rice powder can be suspended and orally administered without purifying the VHH antibody (Tokuhara et al., J Clin Invest. 123:3829-38, 2013; Doi :10.1172/JCI70266), it becomes possible to ingest the VHH antibody. Furthermore, by expressing the VHH antibody according to this embodiment on the bacterial cell surface of lactic acid bacteria, it becomes possible to ingest the VHH antibody by orally administering the lactic acid bacteria without purifying the VHH antibody. (Pant et.al. J Infect Dis 194:1580-8, 2006).
  • a fusion gene of the VHH gene according to this embodiment and the anchor protein prtP gene of the lactic acid bacterium surface layer may be expressed on the cell surface of the lactic acid bacterium by introducing a gene encoding a fusion protein.
  • Introduction into the lactic acid bacterium genome can be carried out, for example, by the method described in WO2020/229677.
  • the bacterial cells or cultured cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and treated with ultrasound, lysozyme and/or Alternatively, after destroying the bacterial bodies or cells by freezing and thawing, a soluble extract is obtained by centrifugation or filtration. From the obtained extract, the target polypeptide can be obtained by appropriately combining known separation and purification methods.
  • Known separation and purification methods include methods that utilize solubility such as salting out and solvent precipitation, methods that mainly utilize differences in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-PAGE, and ion Methods that utilize differences in charge such as exchange chromatography, methods that utilize specific affinity such as affinity chromatography (for example, when expressing a polypeptide together with a GST tag, a resin with glutathione bound to a carrier may be used). , Ni-NTA resin or Co-based resin when the polypeptide is expressed with a His tag, anti-HA antibody resin when the polypeptide is expressed with an HA tag, and anti-HA antibody resin when the polypeptide is expressed with a FLAG tag.
  • the second embodiment is an antibody against HuNoV GII.2 that inhibits infection of intestinal epithelial cells by HuNoV GII.2, and competes for binding between the VHH antibody according to the first embodiment and HuNoV GII.2. It is an inhibiting antibody (hereinafter also referred to as "competing antibody according to this embodiment") or an antigen-binding fragment thereof.
  • Competitive antibodies according to this embodiment can be prepared and obtained by competition experiments and the like that are well known to those skilled in the art.
  • the binding between the VHH antibody according to this embodiment and HuNoV GII.2 is competitively inhibited by a certain anti-HuNoV GII.2 antibody
  • the binding between the VHH antibody according to this embodiment and the anti-HuNoV GII.2 The antibodies are determined to bind to substantially the same or closely adjacent antigenic sites.
  • the anti-HuNoV GII.2 antibody inhibits HuNoV GII.2 infection of intestinal epithelial cells
  • the anti-HuNoV GII.2 antibody is a competitive antibody according to this embodiment.
  • methods using Fab fragments and the like are commonly used in the art.
  • the "antibody” used herein is not particularly limited in its preparation method or structure, and includes, for example, an “antibody” that binds to a desired antigen with desired properties, such as a monoclonal antibody, polyclonal antibody, or VHH antibody. Everything is included.
  • the "antibody” is a polyclonal antibody, for example, an immunized animal (such as, but not limited to, rabbit, goat, sheep, chicken, guinea pig, mouse, rat or pig) is injected with a mixture of antigen and adjuvant. It can be prepared by Typically, the antigen and/or adjuvant is injected subcutaneously or intraperitoneally into the immunized animal multiple times.
  • Adjuvants include, but are not limited to, for example, complete Freund's and monophosphoryl lipid A synthesis-trehalose dicorynomycolate (MPL-TMD).
  • MPL-TMD monophosphoryl lipid A synthesis-trehalose dicorynomycolate
  • the antibody of interest can be purified from the serum derived from the immunized animal by a standard method (eg, using Sepharose retaining Protein A).
  • the "antibody” is a monoclonal antibody, it can be produced, for example, as follows.
  • the term "monoclonal” as used herein suggests the characteristics of an antibody obtained from a substantially homogeneous antibody population (an antibody population in which the heavy chain and light chain amino acid sequences constituting the antibody are the same). This does not imply that the antibody is produced by a particular method (eg, hybridoma method, etc.).
  • the preparation method includes, for example, the following four steps: (i) immunizing an immunized animal with the antigen; (ii) monoclonal antibody.
  • the immunized animal for example, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, etc. can be selected.
  • lymphocytes obtained from the host animal are fused with an immortalized cell line using a fusion agent such as polyethylene glycol or electrofusion to establish hybridoma cells.
  • a fusion agent such as polyethylene glycol or electrofusion to establish hybridoma cells.
  • the fused cells for example, rat or mouse myeloma cell lines are used.
  • the cells are grown in a suitable medium containing one or more substrates that inhibit the growth or survival of unfused lymphocytes and immortalized cell lines.
  • a suitable medium containing one or more substrates that inhibit the growth or survival of unfused lymphocytes and immortalized cell lines.
  • Common techniques use parental cells lacking the enzyme hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT).
  • hypoxanthine, aminopterin and thymidine are added to the medium (HAT medium) that inhibits the growth of HGPRT-deficient cells and allows the growth of hybridomas.
  • HAT medium hypoxanthine, aminopterin and thymidine
  • the hybridoma thus prepared can be cultured in vitro or in vivo in the ascites of a mouse, rat, guinea pig, hamster, etc., and the antibody of interest can be prepared from the culture supernatant or ascites.
  • the "antibody” may be a genetically recombinant antibody.
  • Genetically recombinant antibodies include, but are not limited to, human antibodies and chimeric antibodies with human antibodies.
  • a chimeric antibody is, for example, an antibody in which variable regions and constant regions derived from different animal species are linked together (for example, an antibody in which the variable region of a mouse-derived antibody is linked to a human-derived constant region), etc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984), etc.), and can be easily constructed by genetic recombination technology.
  • a humanized antibody is an antibody that has a human-derived sequence in the framework region (FR) and a complementarity-determining region (CDR) consisting of a sequence derived from another animal species (e.g., mouse).
  • Humanized antibodies are created by first grafting the CDRs from an antibody variable region derived from a mouse into a human antibody variable region from another animal species (here, a mouse), and reconstituted the heavy chain and light chain variable regions. These humanized reshaped human antibody variable regions can then be produced by linking them to human antibody constant regions. Methods for producing such humanized antibodies are well known in the art (eg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989), etc.).
  • the antigen-binding fragment of an "antibody” is a partial region of an "antibody” that binds to HuNoV GII.2.
  • fragments include Fab, Fab', F(ab' ) 2 , Fv (variable fragment of antibody), single chain antibody (heavy chain, light chain, heavy chain variable region, light chain variable region, VHH antibody, etc.), scFv (single chain Fv), diabody (scFv dimer) ), dsFv (disulfide-stabilized Fv), and a peptide containing at least a portion of the CDR of the VHH antibody according to the first embodiment.
  • Fab is an antibody fragment with antigen-binding activity in which approximately half of the N-terminal side of the heavy chain and the entire light chain are bonded by disulfide bonds.
  • Fab can be produced by treating antibody molecules with papain to obtain fragments, or by constructing an appropriate expression vector into which Fab-encoding DNA has been inserted, and then injecting this into an appropriate host cell (for example, CHO cells, etc.). This can be carried out by introducing Fab into mammalian cells, yeast cells, insect cells, etc.) and then expressing the Fab within the cells.
  • F(ab') 2 is an antibody fragment with antigen-binding activity that is slightly larger than the fragment obtained by treating an antibody molecule with the proteolytic enzyme pepsin, in which Fab is bound via a disulfide bond in the hinge region. It is.
  • F(ab') 2 can also be produced by linking Fab with thioether bonds or disulfide bonds.Furthermore, like Fab, it can also be produced using genetic engineering techniques. It can be made.
  • Fab' is an antibody fragment with antigen-binding activity obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F(ab') 2 .
  • Fab' can also be produced by genetic engineering techniques like Fab and the like.
  • scFv is a VH-linker-VL or VL-linker-VH polypeptide in which one heavy chain variable region (VH) and one light chain variable region (VL) are linked using an appropriate peptide linker. In other words, it is an antibody fragment that has antigen-binding activity.
  • scFv can be produced by obtaining cDNA encoding the heavy chain variable region and light chain variable region of an antibody and using genetic engineering techniques.
  • a diabody is an antibody fragment that is a dimerization of scFv and has bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen-binding activities may be the same antigen-binding activity, or one may be a different antigen-binding activity.
  • diabody obtains cDNA encoding the heavy chain variable region and light chain variable region of an antibody, constructs a cDNA encoding scFv in which the heavy chain variable region and light chain variable region are linked with a peptide linker, and performs genetic engineering. It can be produced by a method.
  • dsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of the heavy chain variable region and the light chain variable region is replaced with a cysteine residue, which are linked via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • Amino acid residues to be substituted for cysteine residues can be selected based on predictions of the three-dimensional structure of the antibody.
  • dsFv can be produced by genetic engineering techniques by obtaining cDNA encoding the heavy chain variable region and light chain variable region of an antibody and constructing DNA encoding dsFv.
  • a peptide containing a CDR is configured to include at least one region of a heavy chain or light chain CDR (CDR1 to CDR3).
  • Peptides containing multiple CDRs can be linked directly or via a suitable peptide linker.
  • the type of vector is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the type of host cell to be introduced subsequently. In order to express these as antibodies, they can be produced by introducing them into appropriate host cells (for example, mammalian cells such as CHO cells, yeast cells, insect cells, etc.).
  • Peptides containing CDRs can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • a human antibody generally has the same structure as a human antibody in the structure of the hypervariable region (Hypervariable region, which is the antigen-binding site of the V region), other parts of the V region, and the constant region.
  • Human antibodies can be easily produced by those skilled in the art using known techniques. Human antibodies can be produced using, for example, a method using human antibody-producing mice that have human chromosome fragments containing the H chain and L chain genes of human antibodies (for example, Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000)).
  • the third embodiment is a VHH antibody according to this embodiment, a heavy chain antibody according to this embodiment, a competitive antibody according to this embodiment, or an antigen-binding fragment of these antibodies (hereinafter referred to as "an antibody according to this embodiment, etc.”).
  • an antibody according to this embodiment etc.
  • the medicine according to this embodiment may be administered with an active ingredient such as the antibody according to this embodiment, but generally, in addition to the active ingredient such as the antibody, one or more pharmaceutical additives may be used. It is desirable to administer it in the form of a pharmaceutical composition (hereinafter also referred to as "the pharmaceutical composition according to the present embodiment") containing the following.
  • one or more can be selected from among the antibodies and the like according to this embodiment, and these can be used in combination.
  • other antibodies or VHH antibodies with different antigen specificity from the VHH antibody according to the present embodiment such as VHH antibodies against rotavirus (e.g., Tokuhara et al., J Clin Invest. Doi:10.1172/JCI70266), bind to norovirus GI.
  • VHH antibody multimers may be used in combination with one or more VHH antibodies such as VHH antibodies directed against bacterial toxins or VHH antibodies directed against bacterial toxins.
  • other known drugs may also be included in the pharmaceutical composition.
  • the medicine or pharmaceutical composition according to the embodiment of the present invention is not particularly limited, and the dosage form includes tablets, capsules, granules, powders, syrups, suspensions, suppositories, ointments, creams, and gels. agents, patches, inhalants, injections, etc.
  • These formulations are prepared according to conventional methods. Note that liquid preparations may be dissolved or suspended in water or other appropriate solvents before use. Furthermore, tablets and granules may be coated by a well-known method.
  • the compound of the present invention is prepared by dissolving it in water, but if necessary, it may be dissolved in physiological saline or glucose solution, and a buffer or preservative may be added. Good too.
  • Preparations for oral or parenteral administration are provided in any formulation form.
  • Pharmaceutical forms include, for example, granules, fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, syrups, emulsions, suspensions, and solutions for oral administration, intravenous administration, and intramuscular administration. It can be prepared in the form of an injection for administration or subcutaneous administration, an infusion, a transdermal absorption agent, a transmucosal absorption agent, a nasal drop, an inhalation agent, or a suppository. Injections, infusions, and the like can be prepared in powdered forms such as freeze-dried forms, and dissolved in an appropriate aqueous medium such as physiological saline before use.
  • the ratio of the formulation additive to the active ingredient, or the manufacturing method of the medicine or pharmaceutical composition may vary depending on the form. It is possible for the trader to select as appropriate.
  • Inorganic or organic substances, solid or liquid substances can be used as additives for formulations, and generally, for example, 0.1% to 99.9% by weight, 1% to 1% by weight, based on the weight of the active ingredient. It can be blended in an amount of 95.0% by weight, or between 1% and 90.0% by weight.
  • examples of pharmaceutical additives include lactose, glucose, mannitol, dextrin, cyclodextrin, starch, sucrose, magnesium aluminate metasilicate, synthetic aluminum silicate, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, and calcium carboxymethylcellulose.
  • ion exchange resin methylcellulose, gelatin, gum arabic, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, light silicic anhydride, magnesium stearate, talc, tragacanth, bentonite, vegum, titanium oxide, sorbitan fatty acid ester, Examples include sodium lauryl sulfate, glycerin, fatty acid glycerin ester, purified lanolin, glycerogelatin, polysorbate, macrogol, vegetable oil, wax, liquid paraffin, white petrolatum, fluorocarbon, nonionic surfactant, propylene glycol or water.
  • the active ingredient and excipient ingredients such as lactose, starch, microcrystalline cellulose, calcium lactate or silicic anhydride
  • the active ingredient and excipient ingredients may be mixed to form a powder or, if necessary, Granules are prepared by adding white sugar, a binder such as hydroxypropyl cellulose or polyvinylpyrrolidone, and a disintegrant such as carboxymethyl cellulose or carboxymethyl cellulose calcium, and granulating the product wet or dry.
  • these powders and granules may be compressed as they are or with the addition of a lubricant such as magnesium stearate or talc.
  • These granules or tablets can be coated with an enteric base such as hydroxypropyl methylcellulose phthalate, methacrylic acid-methyl methacrylate polymer to form an enteric-coated formulation, or coated with ethylcellulose, carnauba wax or hydrogenated oil to form a depot formulation. You can also do that.
  • an enteric base such as hydroxypropyl methylcellulose phthalate, methacrylic acid-methyl methacrylate polymer to form an enteric-coated formulation, or coated with ethylcellulose, carnauba wax or hydrogenated oil to form a depot formulation. You can also do that.
  • an enteric base such as hydroxypropyl methylcellulose phthalate, methacrylic acid-methyl methacrylate polymer to form an enteric-coated formulation, or coated with ethylcellulose, carnauba wax or hydrogenated oil to form a depot formulation. You can also do that.
  • powders or granules are filled into hard capsules, or the
  • active ingredients are added as necessary to hydrochloric acid, sodium hydroxide, lactose, lactic acid, sodium, pH adjusters such as sodium monohydrogen phosphate or sodium dihydrogen phosphate, sodium chloride or glucose, etc. It can be dissolved in distilled water for injection with a tonicity agent, filtered aseptically, and filled into ampoules, or further added with mannitol, dextrin, cyclodextrin, gelatin, etc. and lyophilized under vacuum to form a ready-to-dissolve injection. Good too. It is also possible to prepare an emulsion for injection by adding lecithin, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, or the like to the active ingredient and emulsifying it in water.
  • the active ingredient is dissolved in a humidified manner with a suppository base such as cocoa butter, tri-, di-, and monoglycerides of fatty acids or polyethylene glycol, poured into molds and allowed to cool; After dissolving in polyethylene glycol or soybean oil, it may be coated with a gelatin film.
  • a suppository base such as cocoa butter, tri-, di-, and monoglycerides of fatty acids or polyethylene glycol
  • the dosage and frequency of administration of the medicament or pharmaceutical composition according to the present embodiment are not particularly limited, and are subject to conditions such as the purpose of preventing and/or treating the disease to be treated, the type of disease, and the weight and age of the patient. Depending on the situation, the drug can be selected as appropriate at the discretion of the doctor or pharmacist.
  • the daily dose for adults for oral administration is about 0.01 to 1,000 mg (active ingredient weight), and it can be administered once a day, divided into several doses, or every few days. . When used as an injection, it is desirable for adults to administer a daily dose of 0.001 to 100 mg (active ingredient weight) continuously or intermittently.
  • the medicament or pharmaceutical composition according to this embodiment can be prepared as a sustained release formulation, such as an implantable tablet or a microencapsulated delivery system, using a carrier that can prevent immediate removal from the body. I can do it.
  • a carrier that can prevent immediate removal from the body. I can do it.
  • biodegradable and biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters and polylactic acid. Such materials can be readily prepared by those skilled in the art.
  • Liposomal suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers.
  • Liposomes are prepared as a lipid composition containing, but not limited to, phosphatidylcholine, cholesterol, and PEG-derived phosphatidylethanol (PEG-PE) through a filter of appropriate pore size to a size suitable for use, and by reverse-phase evaporation. It can be purified by
  • the medicament or pharmaceutical composition according to this embodiment may be provided in the form of a kit along with instructions on how to administer and the like.
  • the medicine or pharmaceutical composition contained in the kit must be manufactured from a material that maintains the activity of the active ingredient for a long period of time, does not adsorb the agent to the inside of the container, and does not alter the quality of the constituent ingredients. Supplied by container.
  • a sealed glass ampoule may contain a buffer sealed in the presence of a non-reactive gas such as nitrogen gas.
  • the kit may also be accompanied by instructions for use.
  • the instructions for use of this kit may be printed on paper or otherwise stored and supplied on an electromagnetically readable medium such as a CD-ROM or DVD-ROM.
  • the fourth embodiment is transgenic rice in which the VHH antibody according to this embodiment is expressed, and the rice.
  • VHH antibodies can be accumulated in rice without losing their properties.
  • Methods for producing transgenic rice in which VHH antibodies are expressed are already known; for details, see, for example, Tokuhara et al., J Clin Invest. Doi:10.1172/JCI70266.
  • the fifth embodiment is a recombinant lactic acid bacterium that expresses the VHH antibody according to this embodiment (referred to as "lactic acid bacterium according to this embodiment"). More specifically, the lactic acid bacteria according to this embodiment are recombinant lactic acid bacteria that display (express) VHH antibodies on the surface of the bacterial cells, or recombinant lactic acid bacteria that secrete the VHH antibodies according to this embodiment.
  • recombinant lactic acid bacteria that display VHH antibodies on the bacterial cell surface refers to recombinant lactic acid bacteria that currently display VHH antibodies on the bacterial cell surface, or recombinant lactic acid bacteria that are capable of displaying VHH antibodies on the bacterial cell surface. This refers to replacement lactic acid bacteria.
  • recombinant lactic acid bacteria that secrete VHH antibodies refers to recombinant lactic acid bacteria that currently secrete VHH antibodies or recombinant lactic acid bacteria that are capable of secreting VHH antibodies.
  • the lactic acid bacteria according to the present embodiment include a gene encoding the VHH according to the present embodiment (VHH gene) or a fusion gene of the VHH gene and the prtP gene encoding an anchor protein on the surface of the lactic acid bacteria (a fusion gene between the VHH gene and the prtP gene). This includes lactic acid bacteria into which an expression vector capable of expressing the VHH gene or a fusion gene of the VHH gene and the prtP gene has been introduced into the genome.
  • the lactic acid bacterium according to this embodiment has a fusion gene of a gene encoding VHH (VHH gene) according to this embodiment and a secretion signal gene (a fusion gene between VHH gene and secretion signal gene) capable of expressing it.
  • VHH gene a gene encoding VHH
  • secretion signal gene a fusion gene between VHH gene and secretion signal gene
  • the lactic acid bacteria according to this embodiment can be orally administered (orally ingested).
  • the lactic acid bacteria according to this embodiment can be produced by a known method (for example, Pant et.al. J Infect Dis 194:1580-8, 2006).
  • lactic acid bacteria can be formulated into freeze-dried capsules, and the clinical dosage is 10 11 cfu/dose for adults, 10 8 -10 9 cfu/dose for children, and 7-14 cfu/dose.
  • VHH antibodies can be administered in large quantities at low cost.
  • the medicine or pharmaceutical composition according to the present embodiment is administered to a patient, etc. to treat HuNoV GII.2 infection or other infectious disease, and to treat HuNoV GII.2 infection or other infectious disease.
  • “Treatment” here means to prevent or alleviate the progression and deterioration of the pathology of a mammal suffering from a disease, etc., and the purpose of this is to prevent or alleviate the progression and deterioration of the disease. This refers to the treatment to be performed.
  • prevention means to prevent the onset or infection of a disease in mammals that are at risk of contracting the disease, thereby preventing the onset of various symptoms of the disease in advance.
  • “Mammal” to be treated means any animal classified as a mammal, including, but not limited to, humans, pet animals such as dogs, cats, and rabbits, cows, pigs, and sheep. and domestic animals such as horses.
  • a particularly preferred "mammal” is a human.
  • VHH antibody against HuNoV GII.2 1-1 Preparation of phage library
  • the VHH antibody of the present invention was produced on behalf of QVQ (Utrecht, Netherlands).
  • the VP1 gene was cloned from HuNoV GII.2 (OSN201926) (distributed from the Osaka Institute for Health and Safety Research) isolated from a patient, and VLP (amino acid sequence; SEQ ID NO: 25; nucleotide sequence; SEQ ID NO: 26) was created using the baculovirus expression method. was expressed and VLPs were purified by ultracentrifugation.
  • Two llamas were immunized with purified VLPs as antigens. Immunizations were performed on days 0 (first immunization day), 14, 28, and 35 from the day of the first immunization. Sera on days 0, 28, and 43 after immunization were used to measure antibody titers.
  • Peripheral blood lymphocytes were prepared from the llamas on the 43rd day of immunization, and RNA was prepared from the obtained PBLs. The obtained RNA was reverse transcribed into cDNA.
  • a DNA fragment encoding IG-H (antibody heavy chain) was amplified using primers that bind to the leader sequence region and the CH2 region.
  • a DNA fragment encoding VHH of approximately 700 bp was amplified. After electrophoresis, this approximately 700 bp DNA fragment was cut out from the agarose and extracted. Nested PCR was performed using the obtained DNA fragment as a template. The amplified fragment was cut with BstE II and Sfi I, and a fragment of approximately 400 bp was isolated and purified.
  • the purified DNA fragment was inserted into phagemid pQ81 and introduced into E. coli TG1 to create a VHH phagemid library.
  • phages were recovered from the VHH phagemid library to prepare a VHH phage library.
  • Bacteriophage production and panning selection Phages were recovered from each library. The phages were blocked in advance for 30 minutes at room temperature with 100 ⁇ L of 2% MPBS and 10 times more Fc, and then added to a 96-well plate coated with HuNov GII.2 VLP. Thereafter, incubation was performed for 2 hours at room temperature. After incubation, each well was washed with PBS-Tween and PBS, and the phages bound to the antigen were eluted with 0.1M TEA solution and immediately neutralized with 1M Tris/HCl pH 7.5.
  • TG1 All eluted phage were infected with TG1, and then TG1 was spotted onto an LB agar plate containing 2% glucose and 100 ⁇ g/ml ampicillin.
  • a glycerol stock was prepared from all the obtained colonies and stored at -80°C (the above is the first panning selection).
  • the phages obtained in the first round of panning selection were subjected to panning selection in the same manner as the first round.
  • the obtained phages were used to infect TG1 in the same manner as the first round, spotted on LB agar plates, and glycerol stocks were prepared from the obtained colonies and stored at -80°C.
  • VHH Screening A single clone was selected from each TG1 obtained through two rounds of panning selection, and a master plate containing 92 clones was created. A periplasm fraction of E. coli containing VHH was prepared from the master plate, and binding to HuNov GII.2 VLP was examined by ELISA. VHH DNA was amplified by PCR from a clone that showed binding to HuNov GII.2 VLP, and E. coli was transformed with pMEK222 (containing a FLAG tag and a His tag) into which the amplified DNA had been inserted. E. coli harboring the insert (VHH DNA fragment) was screened, and the VHH sequence was determined (Figure 5).
  • VHH polypeptides expressed in E. coli were purified by passing cell extracts through Co resin. From the obtained VHH clones, 6 clones (YGI-1B6 (SEQ ID NO: 1), YGI-1C5 (SEQ ID NO: 2), YGI-1C2 (SEQ ID NO: 3), YGI-1E10 (SEQ ID NO: 4), YGI-1F4 (SEQ ID NO: 5), YGI-1H3 (SEQ ID NO: 6)) were selected.
  • CDR1 to CDR3 of the VHH antibody consisting of each amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 were determined with reference to the CDRs sequence of rotavirus VHH (Stability of llama heavy chain antibody fragments under extreme conditions Chapter 3 “ Applied phage display in harsh detergent conditions: implications for antibody stability:” / Edward Dolk - [S.l.] : [s.n.], 2004 -Universiteit Utrecht ISBN nr:90-393-3643-1; Spinelli et al., Biocehmistry 39:1217-1222 2000).
  • the resulting cell suspension was supplemented with 5 volumes of 10% calf serum/basal medium [Advanced DMEM/F12 (Gibco) with 10 mM HEPES (pH 7.3, Gibco), 2 mM Glutamax (Gibco) and 100 units/ After adding mL Penicillin plus 100 ⁇ g/mL streptmycin (Gibco), centrifugation was performed at 440 g for 5 minutes to collect cells.
  • the collected intestinal epithelial cells were grown on ice in 20% organoid culture medium supplemented with 10 ⁇ M Y-27632 [medium with the following added to the basal medium.
  • organoid culture medium (+10 ⁇ M Y-27632) was added to each well.
  • the average passage ratio was 1:16 or 3 ⁇ 10 4 /well.
  • the medium was replaced with fresh organoid medium every 2 days. Passage was performed every 5-6 days.
  • intestinal epithelial cells were removed from the wells and suspended in 100 ⁇ L of organoid culture medium (+10 ⁇ M Y-27632). The cells were seeded on a 2.5% Matrigel coated 96-well plate at a cell density of 2 ⁇ 10 4 /well. After culturing in a 5% CO 2 incubator at 37°C for 2 days, the medium was changed to a differentiation medium [basic medium with the following added.
  • RN CM 12.5% RN CM (Takahashi et al., Stem Cell Reports 10:314-328 2018), 1 ⁇ B-27, 50 ng/mL mouse EGF and 500 nM A83-01]. Furthermore, after culturing for 2 days, the medium was replaced with a differentiation medium supplemented with 0.03% swine bile (Sigma). Thereafter, cells cultured for 2 days were used for HuNoV infection.
  • HuNoV GII.4 was used instead of HuNoV GII.2, and the VHH antibody (5 ⁇ g per well) (YGI -1B6, YGI-1C5, YGI-1F4, YGI-1H3) on HuNoV GII.4 infection.
  • Figure 4 shows the virus copy numbers in the 1 hpi and 24 hpi samples. No reduction in viral copy number was observed in 1 hpi or 24 hpi samples when treated with either VHH antibody. Therefore, it was revealed that these VHH antibodies specifically inhibit infection of intestinal epithelial cells with HuNoV GII.2.
  • the antibody according to the present invention has the effect of effectively inhibiting infection by HuNoV GII.2. Therefore, the present invention is expected to be used in the medical field.

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Abstract

本発明は、ヒトノロウイルス（HuNoV：Human Norovirus）GII.2の細胞への感染を阻害する抗体の提供を目的とする。より具体的には、本発明は、VHH抗体であって、ヒトノロウイルス（Human Norovirus：HuNoV）GII.2に結合し、HuNoV GII.2の腸管細胞への感染を阻害するVHH抗体である。より具体的には、相補性決定領域1～3（CDR1、CDR2およびCDR3）のアミノ酸配列が下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）であることを特徴とする、HuNoV GII.2の腸管細胞への感染を阻害するVHH抗体である。 （Ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、 配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および 配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。 （Ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、 配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および 配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。 （Ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、 配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および 配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。 （Ｄ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、 配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および 配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。 （Ｅ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、 配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および 配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。 （Ｆ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、 配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および 配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。

Description

ヒトノロウイルスＧＩＩ．２特異的抗体
　本発明は、ノロウイルス抗体に関する。より具体的には、ノロウイルスに対する重鎖抗体の可変領域に関する。
　ノロウイルスは、十二指腸から小腸上部の細胞に侵入、非細菌性急性胃腸炎を引き起こす病原性ウイルスで、エンベロープを持たないカリシウイルス科に属する。
　ノロウイルスのゲノムは、約7.7kbの一本鎖プラスセンスRNAである。VPgと呼ばれるウイルスタンパク質がゲノムの5’末端に共有結合しており、3'末端はポリアデニル化されている。ゲノムには、ORF1、VP1およびVP2の3つのタンパク質のコード領域が存在しており、各々、非構造タンパク質、構造タンパク質１および構造タンパク質２をコードしている。構造学的解析から、180分子のVP1がダイマーを形成してウイルス構造を構築していることが明らかとなっている。各VP1モノマーは、shellドメイン（Sドメイン）とprotrudingドメイン（Pドメイン）の２つのドメインに分けられ、このうちPドメインは、さらにP1およびP2のサブドメインに分けられる。P2は、感染の際のレセプターおよび宿主感染性因子として機能する血液型抗原を認識する。P2サブドメインにおける突然変異によって、血液型抗原との結合に変化が生じる（非特許文献１）。
　ヒトノロウイルスは、ゲノム配列に基づいて3つの遺伝子群（GI、GIIおよびGIV）に分類され、少なくとも25種の遺伝子型が存在するとされている。高い多様性を示すノロウイルスであるが、これまでは、GII.4が感染流行の原因となっていたが、ここ数年の間に、GII.2による感染の割合が増加してきており（非特許文献２および非特許文献３）、今後の感染流行の主たる原因株になることが予想される。
　しかしながら、現在のところ、ヒトノロウイルスGII.2に対する有効な抗ウイルス治療薬およびワクチンは存在してない。そのため、今後起きうるGII.2によるアウトブレークに備えるためにも、ヒトノロウイルスGII.2感染症の治療および予防に有効な薬剤の開発および実用化が、緊急の課題となっている。
Glassら, N Engl J Med 361, 1776-1785 2009 Tanら, J Appl Microbiol. 00, 1-9 https://doi.org/10.1111/jam.15379 2021 Thongprachumら, Infection, Genetics and Evolution 51, 86-88 2017
　上記事情に鑑み、本発明は、ヒトノロウイルス（Human Norovirus：HuNoV）GII.2に対する抗体の提供を目的とする。より具体的には、ヒトノロウイルスGII.2（以下「HuNoV GII.2」とも記載する）の細胞への感染（HuNoV GII.2の侵入および／または複製）を阻害する抗体の提供を目的とする。
　本発明者らは、HuNoV GII.2のVP1を抗原として、ラマに免疫をしたところ、HuNoV GII.2のVLP（Virus-like particle）の腸管上皮細胞への感染を阻害するVHH抗体（ナノ抗体）の作製に成功した。
　通常ヒトの抗体は重鎖と軽鎖から構成されているが、ラマ、アルパカおよびラクダなどのラクダ科の動物には、重鎖のみからなる1本鎖抗体（重鎖抗体）が存在している。重鎖抗体は、通常の重鎖および軽鎖からなる抗体と同様に、標的抗原を認識し、抗原に結合することができる。重鎖抗体の可変領域（variable domain of the heavy chain of heavy chain antibody；VHH）は、抗原への結合親和性を有する最小単位であり、この可変領域断片は「VHH抗体（ナノ抗体）」と呼ばれている。VHH抗体は、高耐熱性、消化耐性、常温安定性があり、遺伝子工学的手法により容易に大量に調製することが可能である。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（１８）である。
（１）VHH抗体であって、ヒトノロウイルス（Human Norovirus：HuNoV）GII.2に結合し、HuNoV GII.2の腸管細胞への感染を阻害する、前記VHH抗体。
（２）相補性決定領域1～3（CDR1、CDR2およびCDR3）のアミノ酸配列が下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）であることを特徴とする、HuNoV GII.2の腸管細胞への感染を阻害するVHH抗体。
（Ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｄ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｅ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｆ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（３）下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のポリペプチドを含む、上記（２）に記載のVHH抗体。
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
（４）上記（１）から（３）までのいずれかに記載のVHH抗体を含む重鎖抗体。
（５）上記（１）から（３）までのいずれかに記載のVHH抗体の複数を連結したVHH抗体多量体。
（６）上記（１）から上記（３）までのいずれかに記載のVHH抗体の１または複数と、該VHH抗体と抗原特異性の異なるVHH抗体の１または複数を連結したVHH抗体多量体。
（７）上記（１）から上記（３）までのいずれかに記載のVHH抗体をコードする核酸。
（８）上記（７）に記載の核酸を含むベクター。
（９）上記（８）に記載のベクターが導入された細胞。
（１０）上記（７）に記載の核酸が導入され、前記VHH抗体がコメ中に発現するトランスジェニックイネ。
（１１）上記（１０）に記載のトランスジェニックイネから採取されたコメ。
（１２）上記（７）に記載の核酸が導入され、前記VHH抗体が発現する組換え乳酸菌。
（１３）前記VHH抗体を菌体表層に表示することを特徴とする上記（１２）に記載の乳酸菌。
（１４）前記VHH抗体を菌体から分泌することを特徴とする上記（１２）に記載の乳酸菌。
（１５）上記（１）から上記（６）までのいずれかに記載のVHH抗体、重鎖抗体またはVHH抗体多量体を含む医薬組成物。
（１６）治療または予防対象の疾患が、ノロウイルス感染症であることを特徴とする上記（１５）に記載の医薬組成物。
（１７）上記（２）または上記（３）に記載のVHH抗体とHuNoV GII.2との結合を競合阻害し、HuNoV GII.2の腸管細胞への感染を阻害する抗体またはその抗原結合断片。
（１８）上記（１７）に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物。
　なお、本明細書において「～」の符号は、その左右の値を含む数値範囲を示す。
　本発明により、HuNoV GII.2の腸管上皮細胞への感染を阻害する抗体が初めて提供される。
　本発明にかかる抗体を含有する医薬または医薬組成物は、HuNoV GII.2による感染症および当該感染症に伴う諸症状の治療および／または予防に効果を発揮する。
HuNoV GII.2 VP1に対する各VHH抗体（YGI-1B6、YGI-1C5、YGI-1E10、YGI-1C2、YGI-1F4、YGI-1H3）の結合性をELISA法で確認した結果。 HuNoV GII.2（OSN201926）の腸管上皮細胞への感染に対するVHH抗体（YGI-1B6、YGI-1C5、YGI-1E10、YGI-1C2、YGI-1F4、YGI-1H3）の中和試験。ウイルスと各VHH抗体（5μg）とを混合してプレインキュベートした後、混合物を腸管上皮細胞層に添加してウイルスを感染させた。ウイルス感染後1時間（1 hpi）および感染後48時間（48 hpi）の培地中のウイルスコピー数を測定した。 HuNoV GII.2（OSN201926）の腸管上皮細胞への感染に対するVHH抗体（YGI-1B6、YGI-1C5、YGI-1F4、YGI-1H3）の中和活性の検討。ウイルスと各VHH抗体（200 ng、50 ng、12.5 ng、0 ng）とを混合してプレインキュベートした後、混合物を腸管上皮細胞層に添加してウイルスを感染させた。ウイルス感染後1時間（1 hpi）および感染後24時間（24 hpi）の培地中のウイルスコピー数を測定した。 HuNoV GII.4（17B93）の腸管上皮細胞への感染に対するVHH抗体（YGI-1B6、YGI-1C5、YGI-1F4、YGI-1H3）の中和試験。ウイルスと各VHH抗体（5μg）とを混合してプレインキュベートした後、混合物を腸管上皮細胞層に添加してウイルスを感染させた。ウイルス感染後1時間（1 hpi）および感染後24時間（24 hpi）の培地中のウイルスコピー数を測定した。 各VHH抗体のアミノ酸配列とHuNoV GII.2 VLP1に対する結合定数。下線部分は、FlagタグおよびHisタグ部分を示す。
　以下、本発明を実施するための形態について説明する。
　第１の実施形態は、VHH抗体であって、HuNoV GII.2に結合し、HuNoV GII.2の腸管上皮細胞）への感染を阻害する、VHH抗体（以下、「本実施形態にかかるVHH抗体」とも記載する）または該VHH抗体を含む重鎖抗体（以下「本実施形態にかかる重鎖抗体」とも記載する）である。
　より具体的には、本実施形態にかかるVHH抗体は、例えば、下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のポリペプチドである。
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HuNoVに結合してHuNoVの腸管細胞への感染を阻害する活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、HuNoVに結合してHuNoVの腸管細胞への感染を阻害する活性を有するポリペプチド
　本実施形態にかかるVHH抗体のアミノ酸配列を以下に示す。なお、各配列中、下線の配列領域は、各々、CDR1、CDR2およびCDR3である。
配列番号１（YGI-1B6）：
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYFMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGSTYYTDSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNTLKPEDTAVYYCAAEKASLSGPSYGLGLDFSRYDYWGQGTQVTVSS 
配列番号２（YGI-1C5）：
EVQLVESGGGLVQTGGSLRLSCAASGLTFSNYAMGWFRQAPGKEREFVATINWSSSRTIYADSVKGRFTISREDAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEGGAPRWTTGTRRNDYRYWGQGTQVTVSS 
配列番号３（YGI-1C2）：
EVQLVESGGELVQAGGSLRLSCVASGFTFSNYAMGWFRQGPGKERTFVAAITWDDRNRAYADSVKGRFTISRDNAKNTIYLQMNSLKPEDTAAYVGATERFPAFSGASYYSAPSTFYFWGPGTQVTVSS
配列番号４（YGI-1E10）：
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTAPKSIASFNSVGWYRQAPGKQRELVATITRSRTTNYADSARGRFTISRDNTKNMMFLQMNSLKPEDTAVYYCNARDIVPVFQTYWGQGTRVTVSS
配列番号５（YGI-1F4）：
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCGASGRTFSNYAMGWFRQAPGKEREFVAAINWSGDKTDYADSVKGRFTISRDNVKNFVALQMNSLKPEDTAVYYCATEGGFPQFGSNLKRTSFGLWGQGTQVTVSS 
配列番号６（YGI-1H3）：
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVVSGRSFSSLAMGWFRQAPGNQREFVAAISWSGGSSYYGDSVKGRFTISRDDAKNTVYLQMDSLKPEDTADYYCATEIVPKYDTAAYYKSQGAFGSWGQGTQVTVSS
　本明細書において、「１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列」と記す場合、置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸の数は、特に限定はしないが、たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個程度が好ましい。また、本明細書において、「80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列」は80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であれば、何％であってもよいが、たとえば、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上であってもよい。
　上記（ｂ）および（ｃ）において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６で表される各アミノ酸配列中における、アミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加の箇所は、各アミノ酸配列のCDR1、CDR2およびCDR3以外の配列であることが望ましい。上記アミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加は、タンパク質をコードする核酸配列中に元々存在した変異であってもよく、また、当該核酸配列を当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものであってもよい。当該改変、例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、PrimeSTAR（登録商標）（TaKaRa社）、PrimeSTARTM（コスモバイオ社））等を使用し、公知の方法、または、それらに準じる方法により塩基の置換を行なうことによって実施することができる。
　上記（ｂ）および（ｃ）に記載のポリペプチドとVP1（VLP）との結合性については、ウエスタンブロッティング法やELISA法により、また、ノロウイルスの腸管上皮腸細胞（iPS細胞などから誘導した細胞も含む）への感染を阻害する活性の有無については、実施例に示すように調製した腸管上皮細胞層を用いて容易に確認することができる。
　配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６で表される本実施形態にかかるVHH抗体のCDR1～CDR3の配列は以下の通りである。
配列番号１（YGI-1B6）：
CDR1配列；NYFMG（配列番号７）
CDR2配列；AISWSGGSTYYTDSVK（配列番号８）
CDR3配列；AEKASLSGPSYGLGLDFSRYDY（配列番号９） 
配列番号２（YGI-1C5）：
CDR1配列；NYAMG（配列番号１０）
CDR2配列；TINWSSSRTIYADSVK（配列番号１１）
CDR3配列；AEGGAPRWTTGTRRNDYRY（配列番号１２）
配列番号３（YGI-1C2）：
CDR1配列；NYAMG（配列番号１３）
CDR2配列；AITWDDRNRAYADSVK（配列番号１４）
CDR3配列；AYVGATERFPAFSGASYYSAPSTFYF（配列番号１５）
配列番号４（YGI-1E10）：
CDR1配列；FNSVG（配列番号１６）
CDR2配列；ATITRSRTTNYADSAR（配列番号１７）
CDR3配列；AVYYCNARDIVPVFQTY（配列番号１８）
配列番号５（YGI-1F4）：
CDR1配列；NYAMG（配列番号１９）
CDR2配列；AINWSGDKTDYADSVK（配列番号２０）
CDR3配列；AVYYCATEGGFPQFGSNLKRTSFGL（配列番号２１）
配列番号６（YGI-1H3）：
CDR1配列；SLAMG（配列番号２２）
CDR2配列；AISWSGGSSYYGDSVK（配列番号２３）
CDR3配列；ADYYCATEIVPKYDTAAYYKSQGAFGS（配列番号２４）
　本実施形態にかかるVHH抗体には、相補性決定領域1～3（CDR1、CDR2およびCDR3）のアミノ酸配列が下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）であるポリペプチドを含むVHH抗体も含まれる。
（Ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｄ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｅ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｆ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
　さらに、本実施形態には、上述の本実施形態にかかるVHH抗体を可変領域として含む重鎖抗体（重鎖のみで形成される抗体）も含まれる。本実施形態にかかる「重鎖抗体」は、遺伝子工学的手法で作製したものであっても、ラクダ科などの重鎖抗体を産生する動物が産生したものであってもよい。
　さらに、本実施形態にかかるVHH抗体には、VHHの単量体のみならず、同一または異なる複数の「本発明のVHH抗体」をペプチドリンカーなどで結合させた多量体の「VHH抗体」（「VHH抗体多量体」）も含まれる。
　また、本実施形態にかかるVHH抗体の１または複数を、抗原特異性の異なる他のVHH抗体、例えば、ロタウイルスに対するVHH抗体（例えば、Tokuharaら, J Clin Invest. Doi:10.1172/JCI70266）、ノロウイルスGI、ノロウイルスGII（GII.4、GII.17など）に結合するVHH抗体または細菌毒素に対するVHH抗体などの１または複数と組み合わせたVHH抗体多量体を作製してもよい。VHH抗体多量体は、例えば、Schmidtら, Clin Vaccine Immuno. 23:774-784 2016に記載の方法を参考にして作製することができる。
　本実施形態にかかるVHH抗体は、当該技術分野における公知技術により容易に作製することができる。また、ペプチド固相合成法とネイティブ・ケミカル・リゲーション（Native Chemical Ligation；NCL）法を組み合わせて作製してもよい。
　または、遺伝子工学的手法により、本実施形態にかかるVHH抗体であるポリペプチドをコードする核酸配列からなるDNAを適当な発現ベクターに挿入し、常法に基づいて、ポリペプチドを発現し、単離精製または菌体（例えば、乳酸菌など）表層に表示を行うことで、本実施形態にかかるVHH抗体を調製することができる。
　本実施形態にかかるVHH抗体は、種々の宿主細胞、例えば、細菌細胞（例えば、Escherichia coli B strain, E. coli Kl2 strain, Corynebacterium ammoniagenes, C. glutamicum, Serratia liquefaciens, Streptomyces lividans, Pseudomonas putida，Lactobacillus paracasei BL23, Lactobacillus Longum, Lactobacillus gasseri など); カビ（ 例えば Penicillium camembertii, Acremonium chrysogenum、など）、動物細胞、植物細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞または酵母細胞（例えばSaccharomyces cerevisiae およびPichia pastorisなど）を使用し、これらの細胞内で発現させることができる。VHH抗体を発現させるための発現用ベクターは、各種宿主細胞に適したベクターを用いることができる。発現用ベクターとしては、例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pET など（大腸菌宿主）、pAF900、pINTZrecなど（乳酸菌宿主、分泌または菌表層に表示）、pEGF-C、pEGF-Nなど（動物細胞宿主）、pVL1392、pVL1393など（昆虫細胞宿主、バキュロウイルスベクター）、pG-1、Yep13またはpPICZなど（酵母細胞宿主）、T-DNA binary vector 　pZH2B（イネ発現系）を使用することができる。これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカーおよびプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位およびポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、FLAGタグ、Hisタグ、HAタグおよびGSTタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
　発現用ベクターの作製は、当業者に公知の手法により実施することができ、適宜、市販のキットなどを使用して行うこともできる。
　本実施形態にかかるVHH抗体をコメに発現させることで、当該VHH抗体を精製すること無く、当該コメの粉末を懸濁し経口投与（Tokuharaら,　J Clin Invest. 123：3829-38，2013;　Doi:10.1172/JCI70266）することにより、当該VHH抗体を摂取させることが可能となる。
　また、本実施形態にかかるVHH抗体を乳酸菌の菌体表層に発現させることで、当該VHH抗体を精製すること無く、当該乳酸菌を経口投与することにより、当該VHH抗体を摂取させることが可能となる（Pant et.al. J Infect Dis 194:1580-8, 2006）。VHH抗体を乳酸菌の菌体表層に発現させるために、乳酸菌のゲノムまたは乳酸菌用の発現ベクターに、本実施形態にかかるVHH遺伝子と乳酸菌表層のアンカー蛋白prtP遺伝子との融合遺伝子（VHHとprtPタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子）を導入し、当該乳酸菌の菌体表層にVHHとprtPタンパク質との融合タンパク質を発現させてもよい。乳酸菌ゲノムへの導入は例えばWO2020/229677などに記載の方法により実施することができる。
　発現させたVHH抗体を培養菌体または培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体または培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。得られた抽出液から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的のポリペプチドを取得することができる。公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS-PAGE等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法（例えば、GSTタグと共にポリペプチドを発現させた場合にはグルタチオンを担体に結合させた樹脂を、Hisタグと共にポリペプチドを発現させた場合にはNi-NTA樹脂やCoベースの樹脂を、HAタグと共にポリペプチドを発現させた場合には抗HA抗体樹脂を、FLAGタグと共にポリペプチドを発現させた場合には、抗FLAG抗体結合樹脂などを使用する方法）、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
　第２の実施形態は、HuNoV GII.2の腸管上皮細胞への感染を阻害するHuNoV GII.2に対する抗体であって、第１の実施形態にかかるVHH抗体とHuNoV GII.2との結合を競合阻害する抗体（以下「本実施形態にかかる競合抗体」とも記載する）またはその抗原結合断片である。本実施形態にかかる競合抗体は、当業者において周知である競合実験などにより、調製および取得することができる。具体的には、本実施形態にかかるVHH抗体とHuNoV GII.2との結合が、ある抗HuNoV GII.2抗体によって競合阻害を受けるとき、本実施形態にかかるVHH抗体と当該抗HuNoV GII.2抗体は、実質的に同一または極近傍の抗原部位に結合していると判断される。そして、当該抗HuNoV GII.2抗体が、HuNoV GII.2の腸管上皮細胞への感染を阻害するときには、当該抗HuNoV GII.2抗体は本実施形態にかかる競合抗体である。このような競合実験の方法として、例えば、Fab断片等を用いる方法が当該技術分野おいて、通常行われている。例えば、WO95/11317、 WO94/07922、WO2003/064473、WO2008/118356およびWO2004/046733などを参照のこと。また、競合抗体がHuNoV GII.2の腸管上皮細胞への感染を阻害するかどうかは、実施例に開示する方法等により、容易に調べることができる。
　本明細書における「抗体」は、その調製方法およびその構造は特に限定されるものではなく、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはVHH抗体など、所望の抗原と所望の特性で結合する「抗体」の全てが含まれる。
　「抗体」がポリクローナル抗体の場合、例えば、免疫動物（限定はしないが、例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、モルモット、マウス、ラットまたはブタなど）に対して、抗原およびアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、抗原および／またはアジュバントを免疫動物の皮下または腹腔内へ複数回インジェクトする。アジュバントとして、限定はしないが、例えば、完全フロイントおよびモノホスホリル脂質A合成－トレハロースジコリノミコレート（MPL-TMD）が含まれる。抗原の免疫後、免疫動物由来の血清から、定法により（例えば、ProteinAを保持したセファロースなどを用いる方法など）目的の抗体を精製することができる。
　また、「抗体」がモノクローナル抗体の場合、例えば、以下のようにして作製することができる。なお、本明細書において「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体の集団（抗体を構成する重鎖、軽鎖のアミノ酸配列が同一である抗体集団）から得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法（例えば、ハイブリドーマ法など）により作製されることを意味するものではない。
　モノクローナル抗体の作製方法としては、例えば、ハイブリドーマ法（KohlerおよびMilstein, Nature 256 495 1975）、または、組換え法（米国特許第4,816,567号）などを挙げることができる。または、本実施形態にかかる抗体および競合抗体は、ファージ抗体ライブラリー（例えば、Clacksonら, Nature 352 624-628 1991；Marksら, J.Mol.Biol. 222 581-597 1991など）から単離してもよい。より具体的に説明すると、ハイブリドーマ法を用いて調製する場合、その調製方法には、例えば、以下に示す４つの工程が含まれる：（i）抗原を免疫動物に免疫する、（ii）モノクローナル抗体分泌性（または潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（iii）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（iv）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。免疫動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギなどが選択可能である。免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤や電気融合法を用いて不死化細胞株と融合する。融合細胞としては、例えば、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球および不死化細胞株の成長または生存を阻害する1または複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンがHGPRT欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（HAT培地）に添加される。このようにして得られたハイブリドーマから、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、選択したハイブリドーマが生育する培地から、常法に従い、目的のモノクローナル抗体を取得することができる。
　このようにして調製したハイブリドーマをインビトロ培養し、あるいは、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの腹水中でインビボ培養し、目的の抗体を培養上清、あるいは、腹水から調製することができる。
  また、「抗体」は、遺伝子組換え抗体であってもよい。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、ヒト抗体およびヒト抗体とのキメラ抗体が挙げられる。キメラ抗体とは、例えば、異なる動物種由来の可変領域と定常領域を連結した抗体（例えば、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に結合させた抗体）などのことで（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, （1984） など）、遺伝子組換え技術によって容易に構築することができる。
　 ヒト化抗体は、フレームワーク領域（FR）にヒト由来の配列を持ち、相補性決定領域（CDR）が他の動物種（例えば、マウスなど）由来の配列からなる抗体である。ヒト化抗体は、まず、他の動物種、ここではマウスで説明するが、マウス由来の抗体の可変領域からそのCDRをヒト抗体可変領域に移植し、重鎖および軽鎖可変領域を再構成した後、これらヒト化された再構成ヒト抗体可変領域をヒト抗体定常領域に連結することで作製することができる。このようなヒト化抗体の作製法は、当分野において周知である（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 （1989）など）。
　「抗体」の抗原結合断片とは、「抗体」の一部分の領域であって、HuNoV GII.2に結合する抗体断片のことであり、断片としては、例えば、Fab、Fab’、F(ab’）2、Fv（variable fragment of antibody）、一本鎖抗体（重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域およびVHH抗体等）、scFv（single chain Fv）、diabody（scFv二量体）、dsFv（disulfide-stabilized Fv）、ならびに、第１の実施形態にかかるVHH抗体のCDRを少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。
　Fabは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、重鎖のＮ末端側約半分と軽鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、抗原結合活性を有する抗体断片である。Fabの作製は、抗体分子をパパインで処理して断片を取得する他、例えば、FabをコードするDNAを挿入した適当な発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞（例えば、CHO細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入後、細胞内でFabを発現させることで実施することができる。
　F（ab’）2は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、抗原結合活性を有する抗体断片である。F（ab’）2は、抗体分子をペプシンで処理して断片を取得する他、Fabをチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させて作製することも可能で、さらに、Fabと同様に遺伝子工学的手法によっても作製することができる。
　Fab’は、上記F（ab’）2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、抗原結合活性を有する抗体断片である。Fab’も、Fab等と同様に遺伝子工学的な手法により作製することができる。
　scFvは、１本の重鎖可変領域（VH）と１本の軽鎖可変領域（VL）とを適当なペプチドリンカーを用いて連結した、VH-リンカー-VLないしはVL-リンカー-VHポリペプチドであって、抗原結合活性を有する抗体断片である。scFvは、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、遺伝子工学的手法により作製することができる。
　diabodyは、scFvが二量体化した抗体断片で、2価の抗原結合活性を有する抗体断片である。2価の抗原結合活性は、同一抗原結合活性であっても、または、一方が異なる抗原結合活性であってもよい。diabodyは、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、重鎖可変領域と軽鎖可変領域をペプチドリンカーで結合したscFvをコードするcDNAを構築して、遺伝子工学的手法により作製することができる。
　dsFvは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。dsFvは、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築して遺伝子工学的手法により作製することができる。
　CDRを含むペプチドは、重鎖または軽鎖のCDR（CDR1～3）の少なくとも１領域以上を含むように構成される。複数のCDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。CDRを含むペプチドは、抗体の重鎖または軽鎖のCDRをコードするDNAを構築し、発現ベクターに挿入する。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞（例えば、CHO細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し製造することができる。また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）およびtBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
  ヒト抗体（完全ヒト抗体）は、一般にV領域の抗原結合部位である超可変領域（Hypervariable region）、V領域のその他の部分および定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。ヒト抗体は、公知の技術により当業者であれば容易に作製することができる。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体のH鎖およびL鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（例えば、Tomizukaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, （2000）97, 722-727など）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（例えば、Siriwardenaら, Opthalmology, （2002）109 （3）, 427-431 等を参照）により取得することができる。
　第３の実施形態は、本実施形態にかかるVHH抗体もしくは本実施形態にかかる重鎖抗体、本実施形態にかかる競合抗体、またはこれらの抗体の抗原結合断片（以下「本実施形態にかかる抗体等」とも記載する）を含む医薬（以下「本実施形態にかかる医薬」とも記載する）である。本実施形態にかかる医薬は、有効成分である本実施形態にかかる抗体等を投与する形態でもよいが、一般的には、有効成分である抗体等の他、１または２以上の製剤用添加物を含む医薬組成物（以下「本実施形態にかかる医薬組成物」とも記載する）の形態で投与することが望ましい。また、本実施形態にかかる医薬薬または医薬組成物の有効成分としては、本実施形態にかかる抗体等の中から１以上を選択し、それらを組み合わせて用いることができる。例えば、本実施形態にかかるVHH抗体と抗原特異性の異なる他の抗体やVHH抗体、例えば、ロタウイルスに対するVHH抗体（例えば、Tokuharaら, J Clin Invest. Doi:10.1172/JCI70266）、ノロウイルスGIに結合するVHH抗体または細菌毒素に対するVHH抗体などの１または複数と組み合わせたVHH抗体多量体を用いてもよい。また、医薬組成物中には、公知の他の薬剤を併せて配合してもよい。
　本発明の実施形態にかかる医薬または医薬組成物は、特に限定されず、剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤または注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水または他の適当な溶媒に溶解または懸濁するものであってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の化合物を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また、緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
　経口投与用または非経口投与用の製剤は、任意の製剤形態で提供される。製剤形態としては、例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤または液剤等の形態の経口投与用剤、静脈内投与用、筋肉内投与用もしくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤または坐剤などの形態として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。
　本実施形態にかかる医薬または医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、あるいは、医薬または医薬組成物の製造方法は、その形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機または有機物質、あるいは、固体または液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して、例えば、0.1重量％～99.9重量％、1重量％～95.0重量％、または1重量％～90.0重量％の間で配合することができる。具体的には、製剤用添加物の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコールまたは水等が挙げられる。
　経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分、例えば、乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウムまたは無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロースまたはポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式または乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま、あるいは、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒または錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸－メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウまたは硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤または顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま、あるいは、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油またはオリーブ油などに溶解した後ゼラチンで被覆し軟カプセルとすることができる。
　注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて、塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウムまたはリン酸二水素ナトリウムなどのpH調整剤、塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらに、マンニトール、デキストリン、シクロデキストリンまたはゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレシチン、ポリソルベート80またはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ、注射剤用乳剤とすることもできる。
　直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジおよびモノグリセリドまたはポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し、型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコールまたは大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。
　本実施形態にかかる医薬または医薬組成物の投与量および投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止および／または治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢などの条件に応じて、医師または薬剤師の判断により適宜選択することが可能である。
　一般的には、経口投与における成人1日あたりの投与量は0.01～1,000 mg（有効成分重量）程度であり、1日1回または数回に分けて、あるいは数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して1日量0.001～100ｍｇ（有効成分重量）を連続投与または間欠投与することが望ましい。
　本実施形態にかかる医薬または医薬組成物は、植込錠およびマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。そのような担体として、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの、生物分解性および生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬学上許容される担体として使用することができる。リポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導ホスファチジルエタノール（PEG-PE）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製することができる。
　本実施形態にかかる医薬または医薬組成物は、投与方法等の説明書と共にキットの形態で提供してもよい。キット中に含まれる医薬または医薬組成物は、有効成分の活性を長期間有効に持続し、剤等が容器内側に吸着することなく、また、構成成分を変質させることのない材質で製造された容器により供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような不反応性を示すガスの存在下で封入されたバッファーなどを含んでもよい。
　また、キットには使用説明書が添付されてもよい。本キットの使用説明は、紙などに印刷されたものであっても、CD-ROMまたはDVD-ROMなどの電磁的に読み取り可能な媒体に保存され、供給されてもよい
　第４の実施形態は、本実施形態にかかるVHH抗体がコメに発現しているトランスジェニックイネおよび当該コメである。
　VHH抗体は、その特性を失わせること無くコメに蓄積させることが可能である。VHH抗体がコメに発現しているトランスジェニックイネの作製方法は、すでに公知であり、詳細については、例えば、Tokuharaら, J Clin Invest. Doi:10.1172/JCI70266などを参照のこと。
　第５の実施形態は、本実施形態にかかるVHH抗体を発現する組換え乳酸菌である（「本実施形態にかかる乳酸菌」との記載する）。より具体的には、本実施形態にかかる乳酸菌は、VHH抗体を菌体表層に表示（発現）する組換え乳酸菌、または本実施形態にかかるVHH抗体を分泌する組換え乳酸菌である。ここで、「VHH抗体を菌体表層に表示する組換え乳酸菌」とは、現にVHH抗体を菌体表層に表示している組換え乳酸菌もしくはVHH抗体を菌体表層に表示し得る状態にある組換え乳酸菌のことである。また、「VHH抗体を分泌する組換え乳酸菌」とは、現にVHH抗体を分泌している組換え乳酸菌もしくはVHH抗体を分泌し得る状態にある組換え乳酸菌のことである。
　本実施形態にかかる乳酸菌には、本実施形態にかかるVHHをコードする遺伝子（VHH遺伝子）もしくはVHH遺伝子と乳酸菌表層のアンカータンパク質をコードするprtP遺伝子との融合遺伝子（VHH遺伝子とprtP遺伝子との融合遺伝子）を発現可能に有する発現ベクターを導入した乳酸菌、またはVHH遺伝子もしくはVHH遺伝子とprtP遺伝子との融合遺伝子をゲノム中に組み込んだ乳酸菌が含まれる。さらに、本実施形態にかかる乳酸菌には、本実施形態にかかるVHHをコードする遺伝子（VHH遺伝子）と分泌シグナル遺伝子との融合遺伝子（VHH遺伝子と分泌シグナル遺伝子との融合遺伝子）を発現可能に有する発現ベクターを導入した乳酸菌、またはVHH遺伝子もしくはVHH遺伝子と分泌シグナル遺伝子との融合遺伝子をゲノム中に組み込んだ乳酸菌が含まれる。本実施形態にかかる乳酸菌は経口投与（経口摂取）することが可能である。
　本実施形態にかかる乳酸菌は、公知の方法（例えば、Pant et.al. J Infect Dis 194:1580-8, 2006）により作製することができる。乳酸菌ゲノムへの遺伝子の導入は、例えば、WO2020/229677などに記載の方法により実施することができる。本実施形態にかかる該乳酸菌は、凍結乾燥カプセルに製剤化が可能で、臨床投与量は大人の場合、1011 cfu/dose、子供の場合は108-109cfu/doseで、7-14日程度投与してもよく、安価に大量のVHH抗体を投与することが可能である。
　第６の実施形態は、本実施形態にかかる医薬または医薬組成物を患者等に投与して、HuNoV GII.2感染症もしくはその他の感染症、およびHuNoV GII.2感染症もしくはその他の感染症に伴う諸症状を治療または予防するための方法が含まれる。
　ここで「治療」とは、疾患等に罹患した哺乳動物において、その病態の進行および悪化を阻止または緩和することを意味し、これによって該疾患の進行および悪化を阻止または緩和することを目的とする処置のことである。
　また、「予防」とは、疾患等に罹患するおそれがある哺乳動物について、該疾患の発症または罹患を予め阻止することを意味し、これによって該疾患の諸症状等の発症を予め阻止することを目的とする処置のことである。
　治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコおよびウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジおよびウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
　本明細書全体において、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものを含むものとする。
　以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
１．HuNoV GII.2に対するVHH抗体の調製
１－１．ファージライブラリーの作製
　本発明のVHH抗体は、QVQ社（Utrecht, Netherlands）に委託して作製した。ここでは、VHH抗体の調製の概要を示す。
　患者から分離したHuNoV GII.2（OSN201926）（大阪健康安全基盤研究所から分与）からVP1遺伝子をクローニングし、バキュロウイルス発現法によりVLP（アミノ酸配列；配列番号２５、塩基配列；配列番号２６）を発現させ、超遠心法にてVLPを精製した。精製したVLPを抗原として、2頭のラマに免疫した。免疫は、最初の免疫の日から0（最初の免疫日）、14、28および35日目に行った。抗体価の測定には、免疫0、28および43日目の血清を使用した。
　免疫43日目にラマから、末梢血リンパ球（Peripheral blood lyjphocyte：PBL）を調製し、得られたPBLsからRNAを調製した。得られたRNAは、cDNAに逆転写した。IG-H（抗体重鎖）をコードするDNA断片を、リーダー配列領域およびCH2領域に結合するプライマーを使用して増幅した。約700bpのVHHをコードするDNA断片が増幅された。この約700bpのDNA断片を電気泳動後、アガロースから切り出し、抽出した。得られたDNA断片をテンプレートとして、nested PCRを行った。増幅された断片をBstEIIおよびSfiIで切断し、約400 bpの断片を単離、精製した。精製したDNA断片をファージミドpQ81に挿入し、大腸菌TG1に導入して、VHHファージミドライブラリーを作製した。次いで、VHHファージミドライブラリーから、ファージを回収し、VHHファージライブラリーを調製した。
１－２．バクテリオファージの産生とパンニングセレクション
　各ライブラリーからファージを回収した。ファージを予め100μLの2%MPBSと10倍量以上のFcで、室温にて30分間ブロックしたのち、HuNov GII.2 VLPでコートした96ウェルプレートに添加した。その後、室温で2時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、各ウェルをPBS-TweenおよびPBSで洗浄し後、抗原と結合したファージを0.1M TEA溶液で溶出した後、すぐに1M Tris/HCl pH 7.5で中和した。溶出した全てのファージはTG1に感染させた後、TG1を2% グルコース、100μg/mlのアンピシリンを含むLBアガープレートにスポットした。得られた全てのコロニーからグリセロールストックを作製し、-80℃で保存した（以上、1回目のパンニングセレクション）。　次に、1回目のパンニングセレクションで得られたファージを、1回目と同様にパンニングセレクションに供した。得られたファージは、1回目と同様に、TG1に感染させ、LBアガープレートにスポットし、得られたコロニーからグリセロールストックを作製して、-80℃で保存した。
１－３． VHHのスクリーニング
　2回のパンニングセレクションで得られた各TG1からシングルクローンを選択し、92クローンのマスタープレートを作製した。マスタープレートから、VHHを含む大腸菌のperiplasm画分を調製し、ELISAによりHuNov GII.2 VLPとの結合性を調べた。HuNov GII.2 VLPとの結合性を示したクローンからVHH DNAをPCRで増幅し、増幅されたDNAを挿入したpMEK222（FLAGタグおよびHisタグを含んでいる）で大腸菌を形質転換した。インサート（VHH DNA断片）を保持する大腸菌をスクリーニングし、VHHの配列を決定した（図５）。大腸菌で発現させたVHHポリペプチドは、細胞抽出液をCo樹脂に通して精製した。得られたVHHクローンから、抗原との結合性を指標にして、6クローン（YGI-1B6（配列番号１）、YGI-1C5（配列番号２）、YGI-1C2（配列番号３）、YGI-1E10（配列番号４）、YGI-1F4（配列番号５）、YGI-1H3（配列番号６））を選択した。
　配列番号１～配列番号６で示される各アミノ酸配列からなるVHH抗体のCDR1～CDR3は、ロタウイルスのVHHのCDRs配列を参照して決定した（Stability of llama heavy chain antibody fragments under extreme conditions Chapter 3 “Applied phage display in harsh detergent conditions: implications for antibody stability:” / Edward Dolk - [S.l.] : [s.n.], 2004 -Universiteit Utrecht ISBN nr:90-393-3643-1；Spinelliら, Biocehmistry 39:1217-1222 2000）。
２．HuNov GII.2に対する各VHH抗体の結合性の検討
　YGI-1B6（配列番号１）、YGI-1C5（配列番号２）、YGI-1C2（配列番号３）、YGI-1E10（配列番号４）、YGI-1F4（配列番号５）、YGI-1H3（配列番号６）の各VHH抗体の抗原結合性を確認するために、HuNoV GII.2 VLPを抗原として、ELISA（Flagタグ抗体で検出）を実施し（図１）、結合定数（nM）を計算した（図５）。
３．VHH抗体によるHuNoV GII.2の腸管細胞への感染阻害効果の確認
３－１．オルガノイドまたは単層化細胞としての腸管上皮細胞の培養
　小腸切除術を施行する症例から、臨床検体より1×1cmの腸管を全層で採取し、そこから上皮細胞を単離して3次元培養を行った。細胞は、セルバンカー1（タカラバイオテクノロジー社）に懸濁し、-80℃で保存していたものを融解し、復元培養して用いた。腸管余剰検体からの腸管上皮細胞の樹立は、Takahashiら, Stem Cell Reports 10:314-328 2018に記載の方法に従って行った。
　Matrigel（Corning）で培養したオルガノイドはPBSで洗浄し、TrypLE Express（Gibco）中、37℃で5分間インキュベートした。Matrigelとオルガノイドを分離するために、細胞懸濁液をマイクロピペットでピペッティングして細胞塊を破壊し、その後、ナイロンメッシュに通した。得られた細胞懸濁液に、5倍量の10%仔ウシ血清/基本培地［Advanced DMEM/F12（Gibco）に10 mM HEPES（pH 7.3, Gibco）、2 mM Glutamax（Gibco）および100 units/mL Penicillin plus 100μg/mL streptmycin（Gibco）を添加したもの］を加えた後、440gで5分間遠心を行い、細胞を回収した。回収した腸管上皮細胞は、氷上にて、10μM Y-27632を加えた20 %のオルガノイド培養用培地［基本培地に次のものを添加した培地。25% WRN（mouse Wnt3a、human R-spondin1、human Noggin）CM（conditioned medium）（Takahashiら, Stem Cell Reports 10:314-328 2018）、1× B-27 (Gibco)、50 ng/mL mouse EGF（Peprotech）、50 ng/mL human HGF（R&D systems）、10 μM SB202190（Sigma）および500 nM A83-01（TGF-β receptor inhibitor, Tocris）］を含むMatrigelに懸濁した。得られた細胞懸濁液は、24-wellプレートに分注し、5 % CO2インキュベーターにて、37℃、10分間インキュベートした。次に、500μLのオルガノイド培養用培地（＋10μM Y-27632）を各ウェルに添加した。平均の継代比は、1:16または3×104/ウェルであった。培地は、2日毎に新しいオルガノイド培地に交換した。継代は、5～6日毎に行った。
　HuNoV（GII.2 またはGII.4（大阪健康安全基盤研究所から分与））を感染させる場合は、ウェルから剥がしてオルガノイド培養用培地（＋10μM Y-27632）100μLで懸濁した腸管上皮細胞を2×104/wellの細胞密度で、2.5 % Matrigelコート96-wellプレートに播種した。37℃の5% CO2インキュベーターで2日間培養した後、培地を分化用培地［基本培地に次のものを添加した培地。12.5% RN CM（Takahashiら, Stem Cell Reports 10:314-328 2018）、1× B-27、50 ng/mL mouse EGFおよび500 nM A83-01］に交換した。さらに、2日間培養した後、培地を0.03%のブタ胆汁（Sigma）添加した分化用培地に交換した。その後、2日間培養した細胞をHuNoVの感染に使用した。
３－２．HuNoV GII.2の感染に対するVHH抗体の中和活性の検討
　感染当日、予めウイルスゲノムコピー数を算定済みのHuNoV GII.2を1 wellあたり2×106コピーとVHH抗体（1 wellあたり5μg)（YGI-1B6、YGI-1C5、YGI-1E10、YGI-1C2、YGI-1F4、YGI-1H3）を混合し、37℃にて1.5時間プレインキュベートした。プレインキュベート後のウイルスとPBSもしくはウイルスとVHH抗体の混合液を、単層化腸管上皮細胞に添加し、37℃にて1時間感染させた。感染から1時間後、全てのwellのウイルス液を除去して2回洗浄後、100μLの培地を添加して、添加した培地を回収し、1 hpiサンプル（感染後3時間のサンプル）として回収した。1 hpiサンプル回収後のwellに新たな培地100μLを添加し、感染から24時間または48時間後まで引き続き培養を続けた。24時間後または48時間後、全てのwellから上清を回収し、各々、24 hpiサンプル（感染後48時間のサンプル）または48 hpiサンプル（感染後48時間のサンプル）とした。
　1 hpi、24 hpiまたは48 hpiサンプルからRNAを抽出し、公定法に基づいたリアルタイムPCRにより各サンプルのウイルスコピー数を算出した。
　結果を図２に示す。いずれのVHH抗体で処理した場合も、48 hpiサンプル中のウイルスコピー数が顕著に減少していた。従って、これらのVHH抗体は、HuNoV GII.2の腸管上皮細胞への感染を阻害することが明らかとなった。
　次に、YGI-1B6、YGI-1C5、YGI-1F4、YGI-1H3の添加量を変えて（200 ng、50 ng、12.5 ng）、HuNoV GII.2の腸管上皮細胞への感染に対する影響を検討した（図３）。その結果、YGI-1F4が、HuNoV GII.2の腸管上皮細胞への感染を最も効果的に阻害することが示唆された。
　本実施形態にかかるVHH抗体のウイルス特異性を確認するために、HuNoV GII.2に替えて、HuNoV GII.4を使用し、上述と同様の方法で、VHH抗体（1 wellあたり5μg)（YGI-1B6、YGI-1C5、YGI-1F4、YGI-1H3）のHuNoV GII.4感染への影響を検討した。1 hpiサンプルと24 hpiサンプル中のウイルスコピー数を図４に示す。いずれのVHH抗体で処理した場合も、1 hpiサンプル中および24hpiサンプル中のウイルスコピー数の減少は認められなかった。従って、これらのVHH抗体は、HuNoV GII.2特異的に腸管上皮細胞への感染を阻害することが明らかとなった。
　本発明にかかる抗体は、HuNoV GII.2による感染を有効に阻害する効果を有する。従って、本発明は、医療分野における利用が期待される。

Claims (18)

  1. 　VHH抗体であって、ヒトノロウイルス（Human Norovirus：HuNoV）GII.2に結合し、HuNoV GII.2の腸管細胞への感染を阻害する、前記VHH抗体。
  2. 　相補性決定領域1～3（CDR1、CDR2およびCDR3）のアミノ酸配列が下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）であることを特徴とする、HuNoV GII.2の腸管細胞への感染を阻害するVHH抗体。
    （Ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
    配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
    配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
    （Ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
    配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
    配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
    （Ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
    配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
    配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
    （Ｄ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
    配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
    配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
    （Ｅ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
    配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
    配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
    （Ｆ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
    配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
    配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
  3. 　下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のポリペプチドを含む、請求項２に記載のVHH抗体。
    （ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｃ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
  4. 　請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載のVHH抗体を含む重鎖抗体。
  5. 　請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載のVHH抗体の複数を連結したVHH抗体多量体。
  6. 　請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載のVHH抗体の１または複数と、該VHH抗体と抗原特異性の異なるVHH抗体の１または複数を連結したVHH抗体多量体。
  7. 　請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載のVHH抗体をコードする核酸。
  8. 　請求項７に記載の核酸を含むベクター。
  9. 　請求項８に記載のベクターが導入された細胞。
  10. 　請求項７に記載の核酸が導入され、前記VHH抗体がコメ中に発現するトランスジェニックイネ。
  11. 　請求項１０に記載のトランスジェニックイネから採取されたコメ。
  12. 　請求項７に記載の核酸が導入され、前記VHH抗体が発現する組換え乳酸菌。
  13. 　前記VHH抗体を菌体表層に表示することを特徴とする請求項１２に記載の乳酸菌。
  14. 　前記VHH抗体を菌体から分泌することを特徴とする請求項１２に記載の乳酸菌。
  15. 　請求項１から請求項６までのいずれか１項に記載のVHH抗体、重鎖抗体またはVHH抗体多量体を含む医薬組成物。
  16. 　治療または予防対象の疾患が、ノロウイルス感染症であることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 　請求項２または請求項３に記載のVHH抗体とHuNoV GII.2との結合を競合阻害し、HuNoV GII.2の腸管細胞への感染を阻害する抗体またはその抗原結合断片。
  18. 　請求項１７に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物。
     

     
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