CN115925911A - 一株羊驼源纳米抗体r67及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株羊驼源纳米抗体及其应用，具体涉及一种与SARS‑CoV‑2RBD结合的羊驼源纳米抗体R67或其抗原结合片段及其应用，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下的CDR：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3。本发明的纳米抗体R67能以较高的亲和力与SARS‑CoV‑2RBD蛋白结合，且能以较高的中和活性中和SARS‑CoV‑2原始毒株及其一系列变异毒株，从而抑制其感染。本发明的纳米抗体R67在临床治疗、预防和/或检测SARS‑CoV‑2原始毒株及其变异毒株以及相关冠状病毒感染方面具有巨大的潜在应用价值。

Description

一株羊驼源纳米抗体R67及其应用

交叉引用

本申请要求于2021年11月17日提交的、申请号为202111363955.X、发明名称为“一株羊驼源纳米抗体R67及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一株羊驼源纳米抗体R67及其应用，更具体地，涉及一种与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、其制备方法、转化的细胞以及包含上述的药物组合物，以及它们在制备预防、治疗或检测新冠病毒和/或相关冠状病毒感染的药物中的应用。

背景技术

中和抗体类药物主要是通过与病原微生物表面的抗原结合，阻止病原微生物表达的特定分子与细胞表面受体结合，达到“中和”的效果。

SARS-CoV和SARS-CoV-2病毒表面都具有糖基化的刺突蛋白(spike protein,S)，该S蛋白能与宿主细胞受体蛋白ACE2相互作用并触发膜融合，因此阻断S蛋白与ACE2的结合是治疗新冠病毒感染的有效途径。S蛋白包含两个功能亚基S1和S2，其中位于S1亚基的受体结合域(RBD)主要与病毒受体识别相关，因此分离并鉴定靶标RBD区域的中和抗体对于新冠感染的预防和治疗十分重要。

然而，旨在阻断病毒与宿主细胞受体的抗体策略，仍需要进一步优化和升级。一方面，新冠病毒这样的RNA病毒具有易突变、易发生免疫逃逸等特点，单一特异性抗体很难满足长久的治疗需求。另外，常规的单克隆抗体因其分子量过大，在实际应用中也存在一定的缺陷。

发明内容

发明目的

本发明的目的在于提供一种与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、其制备方法、转化的细胞以及包含上述的药物组合物，以及它们在制备预防或新冠病毒的药物中的应用。本发明的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段为高中和活性的纳米抗体，与SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株以及相关冠状病毒的RBD蛋白的结合能力强，能有效抑制SARS-CoV-2原始毒株及其一系列变异毒株以及相关冠状病毒的感染；该纳米抗体具有分子量小(～15kDa)、免疫原性小、更好的溶解度和稳定性、较长的CDR3区的优点，可以雾化给药，能直达肺部，起效更快，为新冠或其他冠状病毒感染提供了潜在的治疗策略。

解决方案

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下的CDR：

氨基酸序列如SEQ ID NO:1(即，GFTLDYYA)所示的CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO:2(即，ISPSGTST)所示的CDR2，

以及氨基酸序列如SEQ ID NO:3(即，AAASPSYYYCSHHEVEYDY)所示的CDR3。

在具体的实施方案中，所述重链可变区还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1、CDR2和CDR3按顺序交错排列。

在一个优选的实施方案中，所述FR1-4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4(即，QVQLQESGGGLVRPGGSLRLSCAAS)、SEQ ID NO:5(即，IGWFRQAPGKEREGVSC)、SEQ ID NO:6(即，NYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQIDSLKPEDTAIYYC)和SEQ IDNO:7(即，WGQGTQVTVSS)所示。

在一个优选的实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示：

其中，下划线部分分别为框架区FR1-4，标黑部分分别为重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。

第二方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码如上述第一方面所述的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段。

进一步地，所述多核苷酸为DNA或mRNA。

进一步地，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCGGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTGGATTATTATGCCATAGGCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGAGCGTGAGGGGGTCTCATGTATTAGTCCTAGTGGTACGAGCACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATAGACAGCCTGAAACCTGAGGACACAGCCATTTATTACTGTGCAGCAGCTTCTCCCTCATATTACTACTGTTCACATCATGAGGTTGAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTGACCGTGAGCTCT。

第三方面，本发明提供一种核酸构建体，其包含如上述第二方面所述的多核苷酸。

进一步优选地，所述核酸构建体还包含与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。例如组氨酸标签、终止密码子等。

第四方面，本发明提供一种表达载体，其包含如上述第三方面所述的核酸构建体。

第五方面，本发明提供了一种转化的细胞，其包括如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体或如上述第四方面所述的表达载体。

第六方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如上述第一方面所述的与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

优选地，所述药物组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式。

进一步优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂。

进一步优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；

更进一步优选地，所述片剂为舌下片；

更进一步优选地，所述颗粒剂为细粒剂；

更进一步优选地，所述粉末剂为散剂；

更进一步优选地，所述丸剂为小丸剂。

进一步优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射制剂；更进一步优选地，所述可注射制剂为可推注制剂。

第七方面，本发明提供了一种如上述第一方面所述的与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞或如上述第六方面所述的药物组合物在制备预防、治疗或检测新冠病毒和/或相关冠状病毒感染的药物中的应用。

优选地，所述新冠病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株。

进一步优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株为SARS-CoV-2的Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Kappa(B.1.617.1)和/或Delta(B.1.617.2)变异毒株。

优选地，所述相关冠状病毒为SARS-CoV、RaTG13、RshSTT182、RsYN04、GX/P2V/2017或GD/1/2019。

第八方面，本发明提供了一种预防或治疗新冠病毒或相关冠状病毒的方法，其包括：向有需要的受试者施用预防或治疗有效量的如上述第一方面所述的与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞或如上述第六方面所述的药物组合物。

作为优选，所述相关冠状病毒为SARS-CoV、RaTG13、RshSTT182、RsYN04、GX/P2V/2017或GD/1/2019。

第九方面，本发明提供了一种检测新冠病毒或相关冠状病毒的方法，其包括使用如上述第一方面所述的与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段。

优选地，所述新冠病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株。

进一步优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株为SARS-CoV-2的Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Kappa(B.1.617.1)和/或Delta(B.1.617.2)变异毒株。

优选地，所述相关冠状病毒为SARS-CoV、RaTG13、RshSTT182、RsYN04、GX/P2V/2017或GD/1/2019。

本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。

有益效果

本发明针对新冠病毒进行纳米抗体药物开发，通过用SARS-CoV-2RBD蛋白和NTD蛋白免疫羊驼、构建抗体文库、利用噬菌体展示技术筛选特异性纳米抗体等，筛选到以高亲和力特异性结合SARS-CoV-2RBD的纳米抗体，本文命名为纳米抗体R67。本发明的发明人通过表面等离子共振技术检测证实，本发明的纳米抗体R67能以高亲和力与SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株以及相关冠状病毒的RBD结合，并且在病毒中和试验(包括真病毒中和试验和假病毒中和试验)中，能以高中和活性中和SARS-CoV-2原始毒株及其一系列变异毒株，这些均表明：纳米抗体R67是高亲和力的、并具有高中和活性的针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)原始毒株及其变异毒株以及相关冠状病毒的羊驼源纳米抗体。

本发明为新型冠状病毒原始毒株及其变异毒株以及相关冠状病毒感染的临床预防、治疗和检测提供了潜在的纳米抗体新药。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1是本发明实施例1中记载的SARS-CoV-2WT RBD-his蛋白的分子筛层析和SDS-PAGE鉴定结果示意图；

图2是本发明实施例1中记载的SARS-CoV-2WT NTD-his蛋白的分子筛层析和SDS-PAGE鉴定结果示意图；

图3是本发明实施例1中记载的SARS-CoV-2WT RBD-hFc蛋白的分子筛层析和SDS-PAGE鉴定结果示意图；

图4是本发明实施例4中记载的纳米抗体R67的分子筛层析和SDS-PAGE鉴定结果示意图；

图5是本发明实施例7中测定的纳米抗体R67中和VSV-SARS-CoV-2假病毒感染的效果示意图，其中，A为纳米抗体R67中和原始毒株SARS-CoV-2WT的假病毒感染的效果图；B为纳米抗体R67中和SARS-CoV-2变异毒株Alpha(B.1.1.7)的假病毒感染的效果图；C为纳米抗体R67中和SARS-CoV-2变异毒株Beta(B.1.351)的假病毒感染的效果图；D为纳米抗体R67中和SARS-CoV-2变异毒株Gamma(P.1)的假病毒感染的效果图；E为纳米抗体R67中和SARS-CoV-2变异毒株Kappa(B.1.617.1)的假病毒感染的效果图；F为纳米抗体R67中和SARS-CoV-2变异毒株Delta(B.1.617.2)的假病毒感染的效果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

以下，对本发明进行详述。

定义

“纳米抗体”，即“单域抗体”，该类抗体只包含一个重链可变区(VHH，variabledomain of heavy chain of heavy-chain antibody)，相比于其他抗体，轻链天然缺失。

由于纳米抗体自身的生物物理优势，可以很容易地对其进行雾化并通过吸入器直接递送到肺部，从而治疗呼吸系统病毒引起的感染，被认为是非常有潜力的抗体类药物。

当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如本发明的纳米抗体与SARS-CoV-2RBD蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。

本发明以下实施例中所使用的试剂、酶、培养基、抗生素和牛奶等化学材料均为市售产品，例如，TRIzol购自Invitrogen，Superscript II First-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR试剂盒购自Invitrogen。

一些常用的生物材料，如感受态细胞、载体、辅助噬菌体、待转化的细胞等也为市售产品，例如，pCAGGS载体购自MiaoLingPlasmid，293F细胞、HEK293T细胞等购自ATCC；电感受态E.coli TG1细胞购自Lucigen，VCSM13辅助噬菌体购自StrataGene、质粒pMES4购自Addgene；protein A芯片购自GE Healthcare；Vero细胞购自ATCC CCL81。

一些合成类生物材料，例如引物、序列等需要人工合成的材料，均委托合成公司完成，例如，本发明中的引物(SED ID NO:15～20)由北京擎科生物科技有限公司合成。

实施例1：SARS-CoV-2原始毒株(WT)RBD-his、SARS-CoV-2WT NTD-his和SARS-CoV-2WT及其变异毒株以及相关冠状病毒的RBD-hFc蛋白的表达与纯化

在SARS-CoV-2WT RBD蛋白编码序列(如SEQ ID NO:10所示)的5’端连上信号肽的编码序列(如SEQ ID NO:11所示)，并在其3’端连上6个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子TGA，通过限制性内切酶位点EcoRI和XhoI，将其构建入pCAGGS载体中，转染至293F细胞中，进行SARS-CoV-2WT RBD-his蛋白的表达。

同样地，在SARS-CoV-2WT NTD蛋白编码序列(如SEQ ID NO:12所示)的5’端连上信号肽的编码序列(如SEQ ID NO:13所示)，并在其3’端连上6个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子TGA，通过EcoRI和XhoI限制性内切酶位点，将其构建入pCAGGS载体中，转染至293F细胞中，进行SARS-CoV-2WT NTD-his蛋白的表达。

同样地，在SARS-CoV-2WT RBD蛋白编码序列(如SEQ ID NO:10所示)的5’端连上信号肽的编码序列(如SEQ ID NO:11所示)，在其3’端连上人源Fc标签(hFc)的编码序列(如SEQ ID NO:14所示)及翻译终止密码子TGA，通过连接EcoRI和XhoI构建入pCAGGS载体中，转染至293F细胞中，进行SARS-CoV-2WT RBD-hFc蛋白的表达，并在如下所述进一步纯化、鉴定后，用于表面等离子共振分析。

含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析(HisTrap^TM excel((GEHealthcare))和凝胶过滤层析(Superdex^TM 200Increase 10/300GL column(GEHealthcare))纯化后，可以获得较纯的目的蛋白。SARS-CoV-2RBD-his蛋白的SDS-PAGE鉴定大小为30KD左右，结果如图1；SARS-CoV-2NTD-his蛋白的SDS-PAGE鉴定大小为60KD左右，结果如图2；SARS-CoV-2RBD-hFc蛋白的SDS-PAGE鉴定大小约为130KD左右，结果如图3。

采用与上述制备SARS-CoV-2WTRBD-hFc蛋白相同的方法，制备SARS-CoV-2变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Kappa和Delta以及相关冠状病毒SARS-CoV、RaTG13、RshSTT182、RsYN04、GX/P2V/2017和GD/1/2019的RBD-hFc蛋白，用于表面等离子共振分析；上述病毒株的RBD蛋白的编码序列可在公众数据库NCBI中获得。

实施例2：羊驼免疫和抗体文库构建

实施例1中制备的带有6个组氨酸标签的SARS-CoV-2WT RBD蛋白和SARS-CoV-2WTNTD各200μg，用PBS稀释至终体积1mL，加1ml完全弗氏佐剂乳化5min，皮下多点注射进行免疫。之后每两周进行一次免疫，第四次免疫后的第12天，采集50-60mL的血液，分离PBMCs(外周血单个核细胞)。将分离的PBMCs加入1mL TRIzol，按照说明书的步骤提取总RNA。以提取的总RNA为模板，使用Superscript II First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒，用随机引物oligo-dT_12-18引物合成cDNA。以cDNA为模板，使用特异性引物CALL001和CALL002(引物序列如表1)进行PCR试验，对700bp大小的条带进行切胶并回收。纯化后的DNA作为模板，使用巢式引物VHH-BACK和PMCF进行巢式PCR，来扩增纳米抗体(VHHs)序列，回收纯化大小在400bp左右VHHs序列。

使用双酶切法，通过限制性酶切位点PstⅠ和BstEⅡ，将VHHs片段连接入质粒pMES4。将纯化的克隆载体和电感受态E.coli TG1细胞混合，使用电转仪(BIO-RAD电转化仪MicroPulser)将克隆载体转化入电感受态E.coli TG1细胞，全部涂布在含有氨苄青霉素的选择性培养基上，37℃过夜培养后，收集所有的菌落于LB培养基中，离心并弃上清，用LB重悬细胞，此为抗体文库。

表1.反应引物

实施例3：噬菌体展示技术筛选特异性的纳米抗体

取实施例2已转染重组质粒的E.coli TG1，以感染复数(multiplicity ofinfection,MOI)约为20的比例，加入VCSM13辅助噬菌体，过夜培养后，4000rpm离心，取上清，0.22μm的膜过滤后，按体积比1:4加入PEG6000/NaCl，混合后，4℃下放置至少1小时，8000×g离心30min，弃上清，沉淀用PBS重悬，即为收集的噬菌体颗粒，测定噬菌体效价。

将2×10¹¹个上述收集的噬菌体与等体积的5％(w/v)脱脂牛奶混合，加到包被有SARS-CoV-2WT RBD-his抗原的96孔板中，室温孵育1h后，用0.2M甘氨酸洗脱特异性的噬菌体，并用Tris-HCl(pH 9.1)中和洗脱的噬菌体。然后用该噬菌体感染E.coli TG1细胞，并对噬菌体进行扩增。再次准备包被有SARS-CoV-2WT RBD-his抗原的96孔板，进行第2轮淘选，来富集表达有特异性纳米抗体的噬菌体，共进行3轮淘选。每轮淘选后，从长有菌落的琼脂平板上随机挑选不同单一菌落，在37℃摇床中培养，随后加入VCSM13辅助噬菌体过夜扩培，第二天离心培养液，取噬菌体上清进行ELISA实验(采用SARS-CoV-2WT RBD-his蛋白作为包被抗原)，当OD_450nM>0.2时，判定为阳性反应，取对应的克隆，使用特异性引物MP57和GⅢ对质粒进行测序(引物序列如表2)，获得其质粒中编码VHHs的序列。通过序列测定，获得R67的核心编码序列。

表2.反应引物

实施例4：纳米抗体R67的表达与纯化

为了使R67的重链可变区更加完整，在实施例3获得的R67的核心编码序列的5’端连上QVQLQ的编码序列(CAGGTGCAGCTGCAG，SED ID NO:28)，3’端连上QVTVSS的编码序列(CAGGTGACCGTGAGCTCT，SED ID NO:29)，得到如SEQ ID NO:9的核苷酸序列，即本申请的纳米抗体R67的编码序列，然后在其前连上信号肽(SED ID NO:21)，并在其后连上6个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子TGA，通过限制性酶切位点EcoRI和XhoI，将其构建入pCAGGS载体中，转染293F细胞，培养5天后，收集上清，经过5000rpm离心30min后，经过0.22μm滤膜过滤后，经镍离子亲和层析(HisTrap^TM excel((GE Healthcare))和凝胶过滤层析(Superdex^TM 75Increase 10/300 GL column(GE Healthcare))纯化后，获得较纯的目的蛋白。目的峰通过SDS-PAGE确定，结果如图4，得到纯化的纳米抗体R67。

实施例5：表面等离子共振技术检测抗体与SARS-CoV-2RBD的结合能力

表面等离子共振分析利用Biacore 8K(Biacore Inc.)进行。具体步骤如下：

选用protein A芯片(购自GE Healthcare)，通过protein A芯片与hFc的亲和力将实施例1得到的SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株(Alpha、Beta、Gamma、Kappa和Delta)以及相关冠状病毒(SARS-CoV、RaTG13、RshSTT182、RsYN04、GX/P2V/2017和GD/1/2019)的RBD-hFc蛋白分别固定在芯片上，固定量约为100RU，用PBST缓冲液(2.7mM KCl，137mM NaCl，4.3mM Na₂HPO₄，1.4mM KH₂PO₄，0.05％吐温)倍比稀释R67蛋白，从低浓度到高浓度逐一上样。获得纳米抗体R67结合SARS-CoV-2RBD蛋白的动力学曲线。纳米抗体R67结合SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株(Alpha、Beta、Gamma、Kappa和Delta)以及相关冠状病毒(SARS-CoV、RaTG13、RshSTT182、RsYN04、GX/P2V/2017和GD/1/2019)的RBD的结合常数(ka)、解离常数(kd)和平衡解离常数(K_D)如表3所示，这些参数的计算利用BIAevaluation software 8K(Biacore，Inc.)软件进行。表3结果说明，纳米抗体R67能够以较高的亲和力与SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Kappa和Delta以及相关冠状病毒SARS-CoV、RaTG13、RshSTT182、RsYN04、GX/P2V/2017和GD/1/2019的RBD蛋白结合。

表3、抗体R67与SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株以及相关冠状病毒的RBD蛋白结合的结合常数(ka)、解离常数(kd)和平衡解离常数(K_D)

实施例6：SARS-CoV-2原始毒株及变异毒株假病毒的包装

1)分别将编码SARS-CoV-2原始毒株(WT)及变异毒株(Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Kappa(B.1.617.1)和Delta(B.1.617.2))的S蛋白后18位氨基酸的基因去掉，S蛋白其余序列进行合成(由苏州金唯智提供合成服务)，得到SARS-CoV-2-WT-S-del18、B.1.1.7-S-del18、B.1.351-S-del18、P.1-S-del18、B.1.617.1-S-del18、B.1.617.2-S-del18基因的核苷酸序列，序列分别如SEQ ID NO:22～27所示。

2)分别将1)中获得的该蛋白基因克隆到pCAGGS载体上，得到表达质粒pCAGGS-SARS-CoV-2-WT-S-del18、pCAGGS-B.1.1.7-S-del18、pCAGGS-B.1.351-S-del18、pCAGGS-P.1-S-del18、pCAGGS-B.1.617.1-S-del18、pCAGGS-B.1.617.2-S-del18。

SARS-CoV-2原始毒株及变异毒株假病毒的包装步骤如下：

a.细胞准备：在10cm细胞培养皿中铺HEK293T细胞，使第二天细胞汇合密度至80％左右。培养液为含10％ FBS的DMEM培养基。

b.转染：取上述步骤2)中的各S蛋白的表达质粒，用PEI转染30μg质粒/10cm细胞培养皿，目的质粒与PEI按1:3比例混匀后转染，4-6h换培养液(含10％ FBS的DMEM培养基)，37℃培养24h。

c.加毒：将假病毒包装骨架病毒G*VSV-delG(购自武汉枢密脑科学技术有限公司)加入上述转染后的HEK293T细胞，37℃孵育2h，换培养液(含10％ FBS的DMEM培养基)，并加入VSV-G抗体(表达该抗体的杂交瘤细胞购自ATCC细胞库)，在培养箱中继续培养30h。

d.收毒：收上清3000rpm离心10min,在超净工作台中经0.45μm无菌滤器过滤，去除细胞碎片，分装，-80℃冰箱冻存。

分别得到SARS-CoV-2原始毒株(SARS-CoV-2WT)及变异毒株(Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Kappa(B.1.617.1)及Delta(B.1.617.2))的假病毒。

实施例7：纳米抗体R67中和SARS-CoV-2原始毒株及其一系列变异毒株的假病毒感染的检测

将实施例4得到的纯化的纳米抗体R67从50μg/mL开始5倍倍比稀释至第9个梯度(120pg/mL)，将该稀释的纳米抗体R67与1.6x10⁴ TCID₅₀实施例6获得的SARS-CoV-2原始毒株及一系列变异毒株的假病毒分别混合，在37℃混合孵育1h，然后加入到预先接种Vero细胞(购自ATCC CCL81)的96孔板中。孵育18～20小时后，通过CQ1 Confocal QuantitativeImage Cytometer(Yokogawa)检测。根据带GFP荧光的细胞数，计算抗体对上述SARS-CoV-2原始毒株及一系列变异毒株的假病毒的中和能力，其结果分别如图5A～5F所示，结果统计如表4。

表4纳米抗体R67对新冠病毒原始毒株及一系列变异毒株的假病毒的中和效果

*其中，IC₅₀(μg/mL)^a为纳米抗体R67的半抑制浓度。

由表4可知，纳米抗体R67能以高中和活性中和上述SARS-CoV-2原始毒株及一系列变异毒株的假病毒。

综上，纳米抗体R67能够作为高中和活性的针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)原始毒株及其变异毒株的羊驼源纳米抗体。

实施例8：纳米抗体R67中和SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株的活病毒感染的检测

本实施例中，通过基于细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)的活病毒中和试验，测定纳米抗体R67对新冠病毒原始毒株及其变异毒株Alpha、Beta和Delta活病毒的中和效应，具体步骤如下：

将纳米抗体R67以2倍倍比稀释至第11个梯度，每个梯度4个重复孔，每孔50μL，将各稀释液与等体积的100TCID₅₀的SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株Alpha、Beta、Delta于37℃孵育；1小时后，将混合物加入到悬浮的Vero细胞中，并在37℃下继续孵育3天；观察和记录细胞病变情况；使用GraphPad Prism 7.0计算该纳米抗体抑制新冠病毒活病毒感染的IC₅₀。该实验在中国疾病预防控制中心的生物安全三级实验室(BSL3)中进行。

结果显示，纳米抗体R67对新冠病毒原始毒株及其变异毒株Alpha、Beta和Delta活病毒的IC₅₀值分别为0.10μg/ml、0.46μg/ml、0.11μg/ml、0.11μg/ml，表明：纳米抗体R67对新冠病毒原始毒株及变异毒株活病毒均具有较好的抑制效果。

综上，广谱性纳米抗体R67能够作为预防、治疗和检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)原始毒株及其变异毒株及相关冠状病毒感染的候选抗体药物。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (13)

1.一种与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，

所述重链可变区包含以下的CDR：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3。

2.根据权利要求1所述的与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1、CDR2和CDR3按顺序交错排列；

优选地，所述FR1-4分别如SEQ ID NO:4、5、6、7所示。

3.根据权利要求1所述的与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

4.一种多核苷酸，其编码权利要求1至3任一项所述的与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段。

5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为DNA或mRNA；

优选地，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

6.一种核酸构建体，其包含权利要求4或5所述的多核苷酸。

7.根据权利要求6所述的核酸构建体，其特征在于，还包含与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。

8.一种表达载体，其包含权利要求6或7所述的核酸构建体。

9.一种转化的细胞，其包括权利要求4或5所述的多核苷酸、权利要求6或7所述的核酸构建体或权利要求8所述的表达载体。

10.一种药物组合物，其包含权利要求1至3任一项所述的与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求4或5所述的多核苷酸、权利要求6或7所述的核酸构建体、权利要求8所述的表达载体或权利要求9所述的转化的细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；

优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；

优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；

进一步优选地，所述片剂为舌下片；

进一步优选地，所述颗粒剂为细粒剂；

进一步优选地，所述粉末剂为散剂；

进一步优选地，所述丸剂为小丸剂；

优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射制剂；进一步优选地，所述可注射制剂为可推注制剂。

12.一种权利要求1至3任一项所述的与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求4或5所述的核苷酸序列、权利要求6或7所述的核酸构建体、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的转化的细胞或权利要求10或11所述的药物组合物在制备预防、治疗或检测新冠病毒和/或相关冠状病毒感染的药物中的应用。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述新冠病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株；

优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株为SARS-CoV-2的Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Kappa(B.1.617.1)和/或Delta(B.1.617.2)变异毒株；

和/或，所述相关冠状病毒为SARS-CoV、RaTG13、RshSTT182、RsYN04、GX/P2V/2017或GD/1/2019。

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