CN117069831A - 广谱中和新冠病毒的纳米抗体、含其的融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种广谱中和新冠病毒的纳米抗体、含其的融合蛋白及其应用。所述纳米抗体包括CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明的纳米抗体可以广谱性中和新冠病毒，具有稳定性高、分子量小、易于表达等优势。

Description

广谱中和新冠病毒的纳米抗体、含其的融合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种广谱中和新冠病毒的纳米抗体、含其的融合蛋白及其应用。
背景技术
冠状病毒(Coronaviruses)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae) 冠状病毒属(Coronavirus)，是一类具有囊膜、遗传物质为线性单链正链RNA(ssRNA) 病毒，在自然界中广泛存在(Weiss et al.,2005)。截至目前已发现7种感染人类的冠状病毒，分别为HCoV-229E(α属，1965年)、HCoV-OC43(β属，1967年)、SARS-CoV-1 (β属，2003年)、HCoV-NL63(α属，2004年)、HCoV-HKU1(β属，2005年)、MERS- CoV(β属，2012年)和SARS-CoV-2(β属，2019年)。该7种冠状病毒均可引起人呼吸系统疾病，其中，HKU1，NL63，OC43和229E引起呼吸系统轻微症状，是普通流感相关第二大类感染病毒；而SARS-CoV-1，MERS-CoV和SARS-CoV-2可引起严重的呼吸系统疾病(Corman et al.,2018)，尤其是SARS-CoV-2传染性更强，危害性更大。
SARS-CoV-2是具有包膜结构的正链单链RNA病毒，其整体形态呈圆形或椭圆形，直径约80-120nM，由4种结构蛋白构成，分别为包膜蛋白(E蛋白)、膜蛋白(membrane， M蛋白)、刺突蛋白(spike，S蛋白)和核壳蛋白(nucleocapsid，N)。其中，N蛋白包裹病毒的核酸物质，S、E和M蛋白共同构成病毒的外壳。S蛋白表达于SARS-CoV-2病毒粒子表面，是由S1和S2亚基以非共价键构成的一个同源三聚体(Wrapp et al.,2020b)。病毒粒子通过表面刺突蛋白的受体结合域(receptor binding domain，RBD)，与表达ACE-2 的宿主细胞相结合，然后通过S2亚基功能结构域，与宿主细胞融合并侵入感染宿主。 SARS-CoV-2病毒侵入人体后，会引起机体免疫应答，分泌干扰素(IFN)以及趋化因子，用于抑制病毒增殖和召集白细胞攻击病毒；或产生特异性抗体，阻断病毒S蛋白与机体 ACE-2结合再感染等。然而，S蛋白由于存在较多N-糖基化位点而易形成糖蛋白，大量的糖基化在一定程度上可改变该蛋白的空间结构，封闭或破坏抗原表位，抑制机体产生免疫应答，从而逃避免疫。除此之外，SARS-CoV-2产生大量突变，传染性强，且离开宿主后可在室温环境下存活长达9天，在空气或不同材质的物体表面2小时到9天仍可保持感染性(Kampf et al.,2020)。
疫苗是流行性感染类疾病的有效预防措施之一。但是，个体接种疫苗后，往往需要长达2个月方能产生足够强的免疫。而对一些免疫力弱或不能有效产生抗体的老年或青少年人群，疫苗可能发挥不了应有预防的作用。广谱中和抗体，可快速应对突发的大规模病毒感染事件，或及时应对疫情中出现的病毒变异或免疫逃逸现象，具有预防及治疗的双重功效；可以弥补疫苗的不足，也为未来可能出现的新的突变株蔓延或其他突发病毒感染事件做好抗体候选分子库储备。
目前大多数新冠病毒中和抗体主要通过竞争阻断病毒RBD同宿主细胞ACE-2的结合，从而阻断病毒粒子的感染而达到防治的效果。已有较多的是自SARS-CoV-2康复病人血清中分离出的针对RBD或非RBD结合表位的传统人源IgG型中和抗体(Brouwer et al.,2020；Cao et al.,2020；Hansen et al.,2020；Liu et al.,2020；Robbiani et al.,2020；Wec et al.,2020；Wrapp et al.,2020a；Xiang et al.,2020)，该类传统抗体生产成本高，价格昂贵，不易于大规模推广应用；且同时需要评估抗体依赖性增强效应(antibody-dependent enhancement,ADE)的影响。同时，由于自康复病人血清中分离的中和抗体，受病毒株变异影响，分离所获得的中和抗体的广谱中和活性往往受到限制。开发广谱中和抗体，防止由于病毒S蛋白氨基酸变异导致的免疫逃逸问题，是目前中和抗体药物开发的重点。根据作用机制及抗原结合表位的不同，开发针对病毒S蛋白抗原保守结合表位，或组合两种作用机制以及不同作用表位的抗体，有望开发出广谱新冠病毒中和抗体，以解决病毒变异导致的免疫逃逸，及未来可能爆发的新的突发事件。
纳米抗体(nanobody，Nb)是一种新型抗体，来自驼科动物体内重链抗体的可变结构域，高质量的Nbs可以克服Fc相关抗体依赖增强(ADE)的风险，是很有前途的中和抗体治疗候选者。Nb由四个保守框架区(frame work，FR)及3个互补决定区 (Complementarity-determinning region，CDR)构成。其CDR区氨基酸数量一般较传统人或鼠的CDR3更长，可形成凸环结构(传统抗体通常具有凹或平的抗原结合位点)，有大量暴露在溶剂中的CDR环，提高了对抗原结合的特异性和亲和力；同时由于分子量小，比传统抗体更容易结合一些较难接触到的抗原表位(Vanlandschoot et al.,2011b；Desmyter et al.,2001)，有利于广谱中和抗体的筛选。Nb的FR2区四个亲水残基替代了传统抗体 FR2的四个疏水残，具有更高的水溶解性；内部的二硫键使其耐热性和耐酸碱性较传统抗体更强，聚合性降低，在高温环境或强变性条件下长期放置仍然具有生物活性，体外稳定性更高(Vanlandschoot et al.,2011b；Muyldermans et al.,1994；Hamers-Casterman et al., 1993)，可利用原核及酵母系统进行大量扩增表达，生产成本相对更低。Nbs的基因序列和人VH基因家族3序列(VH3)高度同源，在人体内免疫原性相对较低，目前市面上已有纳米抗体药物卡普赛珠单抗(caplacizumab，商品名：Cablivi)上市，充分证明了纳米抗体的可成药性及应用价值(Duggan,2018)，具有巨大的发展空间。
现有新冠病毒中和抗体大多为通过新冠病毒感染康复患者体内分离获得的传统单克隆抗体，该类传统抗体生产成本较高，价格昂贵，不利于大规模推广应用于大流行感染性疾病中；且同时需要评估抗体依赖性增强效应的影响。同时，由于自康复病人血清中分离的中和抗体，受病毒株变异等因素影响，分离所获得的中和抗体的广谱中和活性往往受到限制。开发广谱中和抗体，防止由于病毒S蛋白氨基酸变异导致的免疫逃逸问题，是目前中和抗体药物开发的重点。
发明内容
为解决现有技术中缺乏广谱中和抗体的技术问题，本发明提供了一种广谱中和新冠病毒的纳米抗体、含其的融合蛋白及其应用。本发明利于SARS-CoV-2及其变异株多抗原交叉免疫羊驼，获得广谱且高亲和力免疫血清效价，然后利用噬菌体展示技术，多抗原交叉淘选及筛选出了具有广谱中和活性的纳米抗体。具体地，本发明：利用SARS-CoV- 2野生型及变异株蛋白交叉免疫羊驼，并检测评估并确保羊驼体内获得了高亲和且广谱的血清抗体效价。免疫结束后，采集羊驼外周血，分离血浆及外周血淋巴细胞(PBMC)。提取PBMC总RNA并反转录为cDNA，之后通过多重PCR扩增羊驼纳米抗体(VHHs)，并完成纳米抗体噬菌体库建库。再通过多抗原交叉淘选的方法，筛选获得高亲和力且具有广谱活性的SARS-CoV-2RBD纳米抗体。对该纳米抗体进行多价改造及生物活性检测评估，评估抗体结合亲和力，广谱性，抗原结合表位及抗病毒中和活性等。本发明开发获得的广谱中和SARS-CoV-2及其变异株的纳米抗体分子，可为疫情的防控及未来可能的新的冠状病毒突发感染事件做好抗体分子药物储备。
本发明的第一方面提供了一种纳米抗体，所述纳米抗体包括互补决定区(CDR)1、CDR2、CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在一些优选的实施例中，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7 所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或，所述CDR1的氨基酸序列如 SEQ ID NO:8所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3 所示。
在一些更优选的实施例中，所述纳米抗体还包括框架区(FR)1、FR2、FR3和FR4；所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:13 所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。本领域技术人员皆知，纳米抗体的框架区和互补决定区从N端至C端以 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构排列。
较佳地，所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；或，所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，所述 FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；或，所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；或，所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述 FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
更佳地，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:28～31所示，或与如SEQ IDNO:28～31所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、98％、99％同一性。
本发明的第二方面提供了一种融合蛋白，其由如本发明的第一方面所述的纳米抗体和Fc缀合而成。
较佳地，所述Fc选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；和/或，所述融合蛋白具有一价、二价或多价的纳米抗体。
更佳地，所述融合蛋白包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
进一步更佳地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。
本发明的第三方面提供了一种CAR或TCR分子，其包括如本发明的第一方面所述的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的融合蛋白。所述CAR即嵌合抗原受体 (chimericantigen receptor)，所述TCR即T细胞受体(T cell receptor)。
本发明的第四方面提供了一种分离的核酸，其编码如本发明的第一方面所述的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的融合蛋白，或如本发明的第三方面所述的CAR或 TCR分子。
较佳地，编码所述纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:32～35所示。
本发明的第五方面提供了一种重组表达载体，其包括如本发明的第四方面所述的核酸。
优选地，所述重组表达载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，所述病毒载体优选逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
本发明的第六方面提供了一种转化体，其包括如本发明的第四方面所述的核酸，或如本发明的第五方面所述的重组表达载体。
所述转化体的出发宿主为细胞。优选地，所述细胞为哺乳动物细胞例如人293细胞、 CHO细胞或T细胞。
一旦已经制备了用于表达的重组表达载体或DNA序列，则可以将重组表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下，将细胞在培养基中培育并且筛选适宜的活性。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法，根据使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞变动或优化。另外，可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物，选出已经稳定将DNA掺入至其染色体中的细胞。标记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性(例如，抗生素)或重金属(如铜)抗性等。可选择标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。也可能需要额外元件以便最佳合成mRNA。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。
本发明还提供一种纳米抗体或融合蛋白的制备方法，其包括培养如上所述的转化体，从培养物中获得所述纳米抗体或融合蛋白。
本发明的第七方面提供了一种抗体药物偶联物，其包含如本发明第一方面所述的纳米抗体或本发明第二方面所述的融合蛋白，以及细胞毒性剂。
优选地，所述细胞毒性剂为MMAF或MMAE。
本发明的第八方面提供了一种药物组合物，其包括如本发明的第一方面所述的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的融合蛋白，或如本发明第三方面所述的CAR或TCR 分子，或如本发明第七方面所述的抗体药物偶联物。
较佳地，所述的药物组合物还包括其他抗新冠病毒的抗体，或治疗新冠病毒的小分子药物、核酸药物，或靶向其他病毒的抗体。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物或药物制剂包含合适的药学上可接受的载体例如药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。如本发明所用，“药学上可接受的载体”或“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”,第五版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或 pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准药用载体和/或赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。可以通过将具有所需纯度的本发明的抗体或其抗原结合片段与一种或多种任选的药用辅料(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版， Osol，A.编(1980))混合来制备包含本发明所述的药物制剂或药物组合物，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它抗感染活性成分，例如其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明的抗体或其抗原结合片段的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
与药物组合物类似地，本发明也提供一种试剂盒，其包括如本发明的第一方面所述的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的融合蛋白，或如本发明第三方面所述的CAR或TCR分子，或如本发明第七方面所述的抗体药物偶联物。
较佳地，所述的试剂盒还包括其他抗新冠病毒的抗体，或治疗新冠病毒的小分子药物、核酸药物，或靶向其他病毒的抗体。
更佳地，所述试剂盒还包括(i)施用所述纳米抗体或抗体的装置；和/或(ii)使用说明。
本发明的第九方面提供了一种套装药盒组合，其包括药盒A和药盒B，其中，所述药盒A包括如本发明的第一方面所述的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的融合蛋白，或如本发明的第七方面所述的抗体药物偶联物，或如本发明第八方面所述的药物组合物；所述药盒B包括其他靶向新冠病毒、非典病毒的抗体、小分子或核酸药物，或靶向其他病毒的抗体、小分子或核酸药物。
本发明的第九方面提供了一种如本发明的第一方面所述的纳米抗体、本发明的第二方面所述的融合蛋白、本发明的第三方面所述的CAR或TCR分子、本发明的第四方面所述的核酸、本发明的第五方面所述的重组表达载体、本发明的第六方面所述的转化体、本发明的第七方面所述的抗体药物偶联物或如本发明第八方面所述的药物组合物在制备治疗新冠病毒、非典病毒的药物中的用途。
本发明的第十方面提供了一种如本发明的第一方面所述的纳米抗体、本发明的第二方面所述的融合蛋白、本发明的第三方面所述的CAR或TCR分子，或本发明的第七方面所述的抗体药物偶联物或如本发明第八方面所述的药物组合物，其用于治疗新冠病毒相关的疾病。
本发明的第十一方面提供了一种治疗新冠病毒相关的疾病的方法，其特征在于，向有需要的受试者施用有效量的如本发明的第一方面所述的纳米抗体、本发明的第二方面所述的融合蛋白、本发明的第三方面所述的CAR或TCR分子、本发明的第七方面所述的抗体药物偶联物或如本发明第八方面所述的药物组合物。
如本发明所用，术语“有效量”表示引发例如研究者或临床医师所追求的组织、系统、动物或人的生物学或药学响应的药物或药剂的量。此外，“治疗有效量”表示，与没有接受该量的相应受试者相比，引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量，或者使疾病或病况的进展速率降低的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。
所述方法还可以是联合疗法，其包括分别向有需要的患者施用如以上所述的药物外，还包括施加第二治疗剂；所述第二治疗剂较佳地包含其他抗肿瘤抗体或者包含所述其他抗肿瘤抗体的药物组合物，和/或由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
本发明的第十二方面提供了一种免疫检测或者测定新型冠状病毒的方法，其包括使用本发明的第一方面所述的纳米抗体、本发明的第二方面所述的融合蛋白与待检测样本混合。该方法是非诊断目的，也可以是诊断目的。非诊断目的的场景应用例如在科研中，在实验室里对样品中是否含有新型冠状病毒进行检测；或，在筛选新的药物时，检测用来筛药的成分中是否还有新型冠状病毒。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本研究利用驼科类动物体外被动交叉免疫，结合噬菌体展示技术，开发出了广谱中和SARS-CoV-2及其变异体的纳米抗体；并对其进行了多价改造，增强抗体在体内的渗透性及延长作用半衰期，可有效中和清除病毒，为疫情的防控及未来可能的新的突发事件做好抗体药物储备。
本发明的新冠病毒RBD纳米抗体天然缺失轻链，稳定性高，在病菌感染类疾病中具有天然优势，可以借助气雾型设备或雾化药剂用药方式用药，且易于表达生产，有利于流行性感染疾病抗体药物的推广使用；另外，由于天然缺失轻链的性质，在衍生抗体工程技术，例如双特异抗体及多功能抗体，极具开发优势，不会出现传统双特异抗体中出现的重-轻链错配等现象，工艺简单，有利于双特异或多功能抗体改造。同时，该类型纳米抗体还可以用于TCR-T等免疫治疗技术，在开发抗体分泌型TCR-T技术中，具有分子量小，易于表达等优势。
附图说明
图1为4株纳米抗体的氨基酸序列比对结果。
图2为免疫后羊驼血浆效价检测。
图3为SDS-PAGE电泳检测纯化所得纳米抗体。
图4为竞争结合表位预测；纵坐标OD450S1-NC代表纳米抗体同S1抗原反应孔OD450值-同PBS反应孔OD450值。
图5为纳米抗体对野生型假病毒的中和作用；纳米抗体作用浓度15μg/ml；NC为不加纳米抗体的反应孔(即稀释样本用opti-MEM培养基)；PC为假病毒试剂盒里自带阳性对照抗体，作用浓度为20μg/ml；blank为同时不添加纳米抗体及假病毒的反应孔(opti-MEM)。
图6为纳米抗体对印度delta突变型假病毒的中和作用；纳米抗体作用浓度15μg/ml； NC为不加纳米抗体的反应孔(即稀释样本用opti-MEM培养基)；PC为假病毒试剂盒里自带阳性对照抗体，作用浓度为100μg/ml；blank为同时不加纳米抗体及假病毒的反应孔(opti-MEM)。
图7为非还原性电泳检测R-30-FC双价纳米抗体；其中M1为蛋白maker，R为还原性条件；NR为非还原性条件。纯化后R-30-FC双价纳米抗体条带大小约为80KD，纯度＞95％；非还原性buffer为5×native loading buffer，电泳条件140V，50min。
图8为双价纳米抗体假病毒中和抑制作用检测。
图9为R30-FC抑制野生型及印度突变型假病毒感染ACE-2细胞的结果。
图10为R-30-FC对非典SARS-CoV-1RBD的结合能力。
图11为抗体对非典SARS-CoV-1spike RBD及ACE-2受体结合的阻断抑制测试。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1多抗原交叉免疫
首次免疫：取200μg的野生型SARS-CoV-2S1全长抗原(义翘)与等体积的弗氏完全佐剂(sigma)混合，在羊驼脖颈处皮下多点注射进行首次免疫。之后选用SARS-CoV-2 spike蛋白结合域RBD蛋白及南非beta突变型S1蛋白进行交叉免疫。每次用蛋白100- 200μg，用等体积的非完全弗氏佐剂(sigma)，免疫4次，每次免疫间隔两周。免疫结束后第10天，采集羊驼静脉外周血20-30ml，分离血浆及PBMC样本用于后续免疫库建库。
实施例2血浆效价检测
取100ng的RBD和突变型S1抗原包被ELISA板，4℃，过夜。PBST(0.05％)洗涤3 次。每孔中加入2％BSA 200μl，室温，2h。PBST洗涤3次。将实施例1中免疫前及免疫后的血浆分别稀释103、104、105、106及107倍，然后加入对应的ELISA板中，室温1h。PBST 洗涤5次，每孔加入100μl 2500倍稀释的anti-alpaca H&L IgG HRP(阿帕克)，室温避光放置 1h。PBST洗涤5次，加入100μL TMB显色液(abcam)，显色10min，加入等体积TMB stop buffer(abcam)终止显色OD450读值。
ELISA检测结果如(图2)显示，免疫后的血浆效价提升明显，野生型RBD免疫效价达到106，突变株S1免疫效价在105到106之间，说明经过交叉免疫，羊驼体内已获得丰富的RBD或突变株S1抗体。
实施例3纳米抗体的噬菌体展示库构建
(1)PBMC分离。取免疫后的羊驼血液样本，用淋巴细胞分离液(GE,17-1440-02)及密度梯度离心法分离纯化羊驼外周血中的淋巴细胞，将细胞用PBS洗两到三次后，用于 RNA提取。
(2)纳米抗体文库构建。
总RNA提取。
取(1)中分离的淋巴细胞，加入1ml Trizol reagent(INVITROGEN，15596-018)，移液器吸打混匀使细胞充分裂解，室温静置10min后，加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，冰上静置5-10min，置于冷冻离心机中4℃，12,000rpm离心10min，收集上层水相，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置15min，待核酸沉淀，高速离心去上清，RNA沉淀加入1ml的75％乙醇(DEPC水配制)进行洗涤，高速离心去上清，控干水分后，RNA 用无核酸酶的水溶解，分别取1μl用于浓度和纯度测定。
cDNA合成。
取20μg RNA，采用SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen)试剂盒及流程合成cDNA，合成后的cDNA在-20℃冻存。
PCR扩增。
以反转录产物cDNA为模板，采用Nest-PCR方法扩增获得骆驼重链抗体的可变区(VHH)，表1为扩增所用引物的名称及序列。
表1羊驼VHH片段扩增使用的引物信息
PCR反应条件如下：
第一轮
反应条件：95℃，5min；94℃，45s；56℃，45s；72℃，45s per cycle；72℃，5min；扩增25cycles
第二轮
第一轮扩增产物20ng
2×Trans HiFi Mix 25μL
VHH For(10μM)1.5μL
VHH Back/VHH back-2/VHH back-3mix(10μM)1.5μL
water补足至50μL
反应条件：95℃，5min；94℃，30s；56℃，45s；72℃，35s per cycle；72℃，10min；扩增17cycles
PCR反应结束后，利用QIAgen gel purification kit(Qiagen)或PCRpurification kit (Qiagen)及其操作流程回收目的片段。回收产物经Nanodrop 2000测定浓度和纯度后，-20℃冻存。
(3)噬菌体展示库构建。
酶切和连接。用限制性内切酶NotI和PstI(NEB)分别对(2)获得的VHH片段和噬菌粒pMECs进行双酶切。
载体酶切体系：
37度，酶切过夜；
片段酶切体系：
37度，酶切过夜。
用琼脂糖凝胶电泳及琼脂糖凝胶回收试剂盒(QIAGEN，20051)分别回收VHH片段和pMECs载体的酶切产物，再对酶切产物进行连接。
连接体系为：
在16℃连接过夜。
转化：取1μl连接产物，与30μl TG1超级感受态细胞混合，冰浴5min，将混合物转入电转杯中，1.5KV电击，电击完成后，加入1ml SOC培养基，移液器吸打混匀并转移至 2ml离心管中，37℃培养复苏1h，梯度稀释102，103，104倍，将稀释后菌液涂布平板， 37℃，过夜培养，次日计算克隆数，达到约107-8个克隆。转化后的菌液，即为抗体噬菌体文库，加入等体积的50％甘油，-20℃冻存。
(4)噬菌体展示库纳米抗体的多样性检测。
随机挑取(3)的克隆54个，送检3730测序，测得抗体VHH区序列，进行比对，发现仅有3个克隆序列重复，51个克隆VHH序列不同，占比(94.4％)，说明抗体库多样性较好。
(5)噬菌体扩增和拯救。
对上述得到的文库进行扩增，并加入用辅助噬菌体拯救纳米抗体的噬菌体株。将(3) 保存的噬菌体库接入100ml培养基中培养至对数生长期，加入20μL的辅助噬菌体 (pfu＝2×10^12)，室温，静置30min，低速离心后，沉淀用培养基悬起，接入300ml培养基中，培养过夜。次日，3,000g离心30min，收集上清，加入PEG solution沉淀噬菌体，冰上静置30min，2,200g离心30min，沉淀携带纳米抗体的噬菌体库，用适量PBS悬浮沉淀至滴度为2×1012pfu/ml。
实施例4用噬菌体展示技术获得高亲和RBD或变异株S1纳米抗体
(1)亲和RBD及变异株S1纳米抗体噬菌体库淘洗。
取1μg RBD，变异株S1及5％milk分别包被ELISA板，4℃，过夜孵育。次日，在5％milk 孔中加入上述(5)获得的纳米抗体噬菌体2×1011/孔，室温，孵育1h，吸取上清加入到RBD 及S1包被孔中，室温，孵育1-2h；PBST清洗10次，加入100μl三乙胺洗脱液，室温，孵育10-30min，收集的噬菌体即亲和淘洗获得的RBD或S1纳米抗体噬菌体库；分别取10μl感染TG1细胞涂布平板，剩余的噬菌体用于进一步扩增和拯救。
(2)筛选后噬菌体库的扩增和拯救。
扩增和拯救方法同实施例3(5)，获得的第一轮筛选后的噬菌体库，置于4℃保存，并继续重复进行2-3轮淘选。
(3)RBD及变异株S1高亲和纳米抗体交叉筛选。
同上，用100ng的RBD及变异株S1抗原包被ELISA板，作实验组，同时，留相等数量的孔不包抗原，作阴性对照。4℃孵育过夜；从上述(2)中第3筛选的平板中，随机挑取单克隆于1ml培养基中，37℃，培养至对数期，加入1mM IPTG诱导过夜；次日，离心收集菌沉，破碎后，5,000g离心15min，收集上清；同时在ELISA板中加2％的BSA，室温封闭1h；实验组及阴性对照组每孔加入单克隆破碎上清，室温，孵育2h；PBST洗10次，加入anti HA-HRP标签的抗体(abcam)，室温1h；PBST洗5次，加入底物显色剂，反应10- 20min，加入终止剂，在酶标仪上读取吸光值；当吸光值与对照孔比值大于2.1时，判定为阳性克隆。本实例共筛选出5条与RBD及变异株S1均具有特异性及亲和力的纳米抗体。
4.1氨基酸序列
4.1.1第一株氨基酸序列R-30为：
QVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCTASGGIIRLNSMGWYRQAPGKQREPVATIVSDV GTNYADSVKGRFTISRDNAKNTIYLQMNSLKFEDTAVYYCVADRAFVLRGEYEYWG QGTQVTVSS(SEQ ID NO:28)。
其中，框架区1(FR1)的序列为QVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCTAS(SEQ ID NO:16)，框架区2(FR2)的序列为MGWYRQAPGKQREPVAT(SEQ ID NO:17)，框架区3(FR3)的序列为NYADSVKGRFTISRDNAKNTIYLQMN SLKFEDTAVYYC(SEQ ID NO:18)，框架区4(FR4)的序列为WGQGTQV TVSS(SEQ ID NO:15)，互补决定区1(CDR1)的序列为 GGIIRLNS(SEQ ID NO:4)，互补决定区2(CDR2)的序列为IVSDVGT(SEQ ID NO:5)，互补决定区3(CDR3)的序列为VADRAFVLRGEYEY(SEQ ID NO:3)。
4.1.2第二株氨基酸序列S1-28为：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGGIIRLNSMGWYRQAPGKQREPVATIVSDV GTNYADSVKGRFTISRDNAKNTIYLQMNSPKFEDTAVYYCVADRAFVLRGEYEYWG QGTQVTVSS(SEQ ID NO:29)。
其中框架区1的序列为QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(SEQ ID NO:19)，框架区2的序列为MGWYRQAPGKQREPVAT(SEQ ID NO:20)，框架区3的序列为 NYADSVKGRFTISRDNAKNTIYLQMNSPKFEDTAVYYC(SEQ ID NO:21)，框架区4的序列为WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:15)，互补决定区1的序列为GGIIRLNS(SEQ ID NO:6)，互补决定区2的序列为IVSDVGT(SEQ ID NO:7)，互补决定区3的序列为 VADRAFVLRGEYEY(SEQ ID NO:3)。
4.1.3第三株氨基酸序列S1-51为：
QVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCAASGGVSRLNSMGWYRQAPGKQRELVATIISD VGTNYADSVKGRFTISRDNAANTVYLQMNSLKFEDTAVYYCVADRAFVLRGEYEYW GQGTQVTVSS(SEQ ID NO:30)
其中，框架区1的序列为QVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:22)，框架区2的序列为MGWYRQAPGKQRELVAT(SEQ ID NO:23)，框架区3的序列为 NYADSVKGRFTISRDNAANTVYLQMNSLKFEDTA VYYC(SEQ ID NO:24)，框架区4 的序列为WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:15)，互补决定区1的序列为GGVSRLNS(SEQ ID NO:8)，互补决定区2的序列为IISDVGT(SEQ ID NO:9)，互补决定区3的序列为 VADRAFVLRGEYEY(SEQ ID NO:3)。
4.1.4第四株氨基酸序列S1-24为：
QVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCAASGGVSRLNSMGWYRQAQGKQRELVATIVN DVGTNYADSVKGRFTISRDNAANTVYLLMNSLKFEDTAVYNCVADRAFVLRGEYEY WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:31)。
其中，框架区1的序列为QVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:25)，框架区2的序列为MGWYRQAQGKQRELVAT(SEQ ID NO:26)，框架区3的序列为 NYADSVKGRFTISRDNAANTVYLLMNSLKFEDTA VYNC(SEQ ID NO:27)，框架区4 的序列为WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:15)，互补决定区1的序列为GGVSRLNS(SEQ ID NO:10)，互补决定区2的序列为IVNDVGT(SEQ ID NO:11)，互补决定区3的序列为 VADRAFVLRGEYEY(SEQ ID NO:3)。
4.2编码SARS-CoV-2RBD纳米抗体蛋白的基因，
4.2.1第一株RBD纳米抗体R-30的核苷酸序列为： CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGTCTGGGGGGTCTCTGA GACTCTCCTGTACAGCCTCTGGAGGCATCATCAGACTCAATTCCATGGGCTGGTAC CGCCAGGCTCCAGGGAAACAGCGCGAGCCGGTCGCGACTATAGTTAGCGACGTCG GCACAAACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAACGC CAAGAATACGATATATCTGCAAATGAACAGCCTGAAATTTGAGGACACGGCCGTT TATTACTGTGTGGCAGATCGCGCGTTCGTTCTTCGGGGGGAGTATGAGTACTGGGG CCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:32)
4.2.2第二株RBD纳米抗体S1-28的核苷酸序列为：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGTTCTC TGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGAGGCATCATCAGACTCAATTCCATGGGCTGG TACCGCCAGGCTCCAGGGAAACAGCGCGAGCCGGTCGCGACTATAGTTAGCGACG TCGGCACAAACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAATACGATATATCTGCAAATGAACAGCCCGAAATTTGAGGACACGGCC GTCTATTACTGTGTGGCAGATCGCGCGTTCGTTCTTCGGGGGGAGTATGAGTACTG GGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO:33)
4.2.3第三株RBD纳米抗体S1-51的核苷酸序列为：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGTCTGGGGGGTCTC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAGGAGTCTCTAGACTCAATTCCATGGGCTGG TACCGCCAGGCTCCAGGGAAACAGCGCGAGTTGGTCGCAACTATTATTAGTGATG TCGGCACAAATTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATTTCCAGAGACAAC GCCGCGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAATTTGAGGACACGGCCG TCTATTACTGTGTGGCAGATCGCGCGTTCGTTCTTCGGGGGGAGTATGAGTACTGG GGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO:34)
4.2.4第四株RBD纳米抗体S1-24的核苷酸序列为：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGTCTGGGGGGTCTC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGGGAGTCTCTAGACTCAATTCCATGGGCTGG TACCGCCAGGCTCAAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCAACTATTGTTAATGATG TCGGCACAAACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCGCGAACACGGTGTATCTGCTAATGAACAGCCTGAAATTTGAGGACACGGCC GTCTATAACTGTGTGGCAGATCGCGCGTTCGTTCTTCGGGGGGAGTATGAGTACTG GGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO:35)
本发明所涉及的4个RBD纳米抗体氨基酸序列同源性极高，R-30,S1-28,S1-51及S1-24 氨基酸序列相似度在90％以上(图1)。且四个抗体CDR3序列完全相同，都为VADRAFVLRGEYEY(SEQ ID NO:3)。4个氨基酸序列在FR1、FR2、FR3、FR4、CDR1 及CDR2区域展现出了较高的相似性，除CDR3及FR4序列完全相同外，在其他区域有1-5 个氨基酸序列不同。4个抗体在后续抗体亲和力常数，抗病毒活性等方面均展现出了相似的作用效果，说明该4个抗体序列高度同源部分CDR3具有该RBD纳米抗体决定性的作用，其他区域差异部分(见表2)几乎不影响抗体整体作用，为本专利RBD抗体株序列保护提供了较全面的保护范围参照。
表2纳米抗体的CDR和FR区的序列总结
其中X1为I或V，X2为I或S；X3为I或V，X4为N或S；X5为P或S，X6为T或A；X7为P或S， X8为T或A；X9为K或A，X10为I或V，X11为Q或L，X12为L或P，X13为Y或N。
实施例5纳米抗体的诱导表达和纯化
(1)纳米抗体的诱导表达。
分别挑选实施例4中4株纳米抗体单克隆，接种于10ml含氨苄的培养基中，37℃，220rpm，过夜培养。次日，将2ml过夜培养菌接种于200ml含氨苄的培养基中，37℃，220rpm，培养至对数期(OD600为0.6-0.8)，加入IPTG进行过夜诱导纳米抗体表达。次日，收集菌体沉淀，利用低渗法破碎菌体后，高速离心收集上清进行后续蛋白纯化。
(2)纳米抗体的纯化。
采用亲和纯化His-镍填料(简称Ni填料，BioRad)获得纯化的纳米抗体。Ni填料装柱，先用超纯水清洗，然后用平衡缓冲液PBS清洗；将上述破碎上清以1ml/min的流速加入纯化柱；用适量体积的PBS洗去杂蛋白，直至OD280为0.0001以下；再用10倍体积的洗脱液(150mM咪唑)洗脱目的蛋白。纯化所得目的蛋白，取等体积用12％的SDS-PAGE检测纳米抗体的表达和纯化情况(图3)。从图示可以看出，纳米抗体条带大小在15KD左右，纯度＞95％，4株纳米抗体均成功正确表达。从表达产量可以看出，R-30在4株序列相近的纳米抗体中表达产量最高。
实施例6ELISA分析纳米抗体同新冠病毒野生型及突变型抗原的结合能力
取100ng的RBD抗原或突变型S1抗原包被ELISA板，4℃，过夜。PBST(0.05％)洗涤3次。每孔中加入2％BSA 200μL，室温，2h。PBST洗涤3次。将实施例5纯化的纳米抗体进行梯度稀释。起始浓度为3μg/ml(～200nM)，并依次3倍梯度稀释，共8个浓度梯度，加入孔中，每个浓度梯度重复3个孔，每孔100μl，室温孵育1h。PBST洗涤5次，加入2000- 3000倍稀释的antiHA,HRP(abcam)100μl/well，室温放置1h。PBST洗涤5次，加入100μl TMB显色液(abcam)，显色10min，加入等体积TMB stop buffer(abcam)终止显色OD450 读值，分析纳米抗体同野生型RBD及突变型S1抗原的结合能力。
ELISA检测结果如下表3显示，4株纳米抗体均对新冠病毒野生型及beta，delta突变型 RBD或S1抗原具有较好的结合能力；同时，4株纳米抗体对非典病毒RBD亦具有较高的结合能力，提示该4株纳米抗体具有广谱的SARS类冠状病毒结合活性，半数效应浓度(EC50)依次为：14.65、11.44、19.2及49.33nM.
表3纳米抗体同S1抗原结合能力
实施例7SPR法测定纳米抗体同野生型及突变型抗原的亲和力常数
取CM5芯片，依次耦联SARS-CoV-2S1野生型及beta，delta突变体抗原，然后将纳米抗体蛋白溶液HBS-P缓冲buffer稀释成适宜的浓度梯度，本例中为从约0.96μg/ml(64nM)或0.24μg/ml(16nM)作为起始浓度，依次2倍梯度稀释，稀释6个浓度梯度。每次进样120s，解离180s，流速30/min，再用10mM PH2.0 Gly-HCL再生，重复循环直至所有浓度梯度进样完成。程序运行结束后，使用Biacore T200(GE)仪器自带分析程序进行拟合分析，得出纳米抗体亲和力常数结果(表4)。结果显示，本例中，4株纳米抗体同野生型及beta及 delta变异突变株的KD常数均在亚纳摩尔(10-10M)水平，亲和力高。
表4.RBD纳米抗体亲和力常数
实施例8利用ELISA法预测纳米抗体结合竞争表位
将实施例10中纯化的R-30-FC包被于ELISA板中；PBST洗涤3次，加入2％BSA封闭，室温2小时。PBST洗涤3次，一半孔加入1.5μg/ml S1抗原(义翘)50μl，另一半孔加入PBS 作为无抗原阴性反应对照孔，室温1小时或4℃过夜。PBST洗涤5次，各加入50μl本实施例中4株单价纳米抗体及另一专利实施例中3株纳米抗体R-47、S1-96及R-45，室温2小时。 PBST洗涤5次，加入50μl 7000倍稀释的anti-HA HRP(abcam)检测试剂，室温避光1小时。 PBST洗涤5遍，加入50μl TMB溶液避光显色20分钟，然后加入50μl TMB stop buffer(abcam) 终止显色。最终将ELISA板放置于酶标仪(BioTek)中读值。分析纳米抗体同加入S1抗原孔的OD450值与加入PBS阴性对照孔OD450的差值，差值与R-30差值相近的即与R-30为相似或相同竞争表位；差值与R-30有明显差异的即为不同竞争结合表位纳米抗体。
结果如图4所示，本实施例中另外3株纳米抗体与R-30具有相似的竞争结合表位，不能再竞争结合已结合R-30-FC的S1抗原，说明与R-30具有相似的竞争结合表位；与纳米抗体R-47、S1-96及R-45与R-30具有不同竞争结合表位，3个纳米抗体仍可以再结合S1/R-30复合物。图4的纵坐标OD450S1-NC代表纳米抗体同S1抗原反应孔OD450值-同PBS反应孔 OD450值。
R-45氨基酸序列为：
QVQLQESGGGLVQPGGSLTLSCAASGDIFSIYAMGWYRQAPGRQREAVATISTSGT TSYARSGKGRFTIFRDNAKNTAYLQMNSLEPEDTAVYYCHAVNSRSGGDYWGQGTQV TVSSS(SEQ ID NO:45)
S1-96氨基酸序列为：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGSIFSIDNMSWYRQAPGKPREWVAAATSG GAANYADFVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKPDDTAVYYCYVVDATMDYWGEGT QVTVSS(SEQ ID NO:46)
R-47氨基酸序列为：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGMTLDYYAIAWFRQAPGKEREGVSRISSSD GSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTGVYYCAASPLTYYSGTYYFPG EYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:47)
实施例9利用野生型，印度delta突变型假病毒实验检测纳米抗体中和作用
分别将5个RBD纳米抗体利用opti-MEM稀释成30μg/ml，阳性对照抗体(出自假病毒检测试剂盒，金斯瑞，SC2087A及SC2087V)利用用Opti-MEM分别稀释为40μg/ml(野生型检测时浓度)及200μg/ml(印度delta突变型检测时浓度)。白色壁96细胞培养微孔板(中和实验板)中，每个样品孔加入25μl样品；阳性对照孔中加入25μl阳性抗体(分别来自金斯瑞SC2087A及SC2087V试剂盒)；阴性对照和空白对照孔分别加入25μl Opti-MEM，每组2个重复。)将假病毒从-196℃取出，置于37℃水浴快速轻柔晃动复融，将复融后假病毒加到含有1500μl Opti-MEM的15ml管子中混匀。在96孔板中样品孔、阳性对照孔和阴性对照孔每孔加入25μl假病毒溶液。空白对照组加入25μl Opti-MEM。至此加样后每个实验孔含有50μl溶液。将样品与假病毒混合液混匀，室温孵育1h。完成样品和假病毒中和后，将Opti-HEK293/ACE2细胞立即复苏并稀释至浓度6×105/ml，并放入细胞培养箱待用。待样品与假病毒孵育结束，从细胞培养箱中取出细胞悬液。将细胞悬液充分混匀后，每孔加入50μl细胞悬液。24小时后每孔加入50μl预热的新鲜DMEM完全培养基，继续放入细胞培养箱中培养24小时。用移液器小心吸弃96孔板的培养基，连同枪头一起弃于预先装有1:10稀释的84消毒液的废液缸。立即加入50μl新配的荧光素酶显色液(金斯瑞)，室温孵育3-5分钟。将96孔板置于酶标仪(BioTek)中读取每孔的化学荧光信号。根据检测结果进行数据分析，图5的结果显示：同NC相比，4株纳米抗体与PC均能抑制野生型及印度delta突变型假病毒感染ACE-2细胞，起到中和抑制作用；针对印度delta突变型，R-30 及S1-28在15μg/ml浓度下与100μg/ml PC作用相近，同时，中和抑制作用强于其他3株纳米抗体，表现更优。
图5中纳米抗体作用浓度15μg/ml；NC为不加纳米抗体的反应孔(即稀释样本用opti- MEM培养基)；PC为假病毒试剂盒里自带阳性对照抗体，作用浓度为20μg/ml；blank为同时不添加纳米抗体及假病毒的反应孔(opti-MEM)。
图6中纳米抗体作用浓度15μg/ml；NC为不加纳米抗体的反应孔(即稀释样本用opti- MEM培养基)；PC为假病毒试剂盒里自带阳性对照抗体，作用浓度为100μg/ml；blank为同时不加纳米抗体及假病毒的反应孔(opti-MEM)。
实施例10单价纳米抗体双价改造，真核表达及纯化
以上实施例中4株纳米抗体经表达产量，亲和力，竞争结合表位及假病毒中和作用测试，R-30具有表达产量高，亲和力强及有效中和野生型及印度delta突变型假病毒的能力，因此重点对R-30纳米抗体进行双价结构改造，以评估改造后双价纳米抗体亲和力，广谱结合活性及中和活性。
首先将R-30纳米抗体，融合人IgG1 Fc氨基酸序列进行基因合成(氨基酸序列见备注)，将合成的基因序列通过无缝克隆PCR技术(具体操作参照Hieffplus One StepCloning Kit说明书)亚克隆至表达载体pCDNA4(Invitrogen，Cat V86220)。重组构建的单域抗体VHH-FC融合蛋白质粒转染至HEK293T细胞进行表达，将重组表达质粒用PBS稀释，并加入转化所需的PEI(polyethylenimine)溶液，混合后加入HEK293T细胞悬液中，放入培养箱，37℃，8％ CO2，相对湿度≥80％培养，150rpm。培养5-6天后，收集瞬时表达培养上清液。上清液用于后续蛋白纯化，分别通过protein A亲和层析纯化，纯化得到R-30- FC双价纳米抗体(图7)。结果显示，纯化所得双价纳米抗体条带大小80KD，与理论大小相符，纯度大于95％，瞬时表达产量约200mg/L。图7中纯化后R-30-FC双价纳米抗体条带大小约为80KD，纯度＞95％；非还原性buffer为5×native loading buffer，电泳条件140V， 50min。
R-30-FC的氨基酸序列为：
QVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCTASGGIIRLNSMGWYRQAPGKQREPVATIVSDV GTNYADSVKGRFTISRDNAKNTIYLQMNSLKFEDTAVYYCVADRAFVLRGEYEYWG QGTQVTVSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK(SEQ ID NO:36)。
实施例11ELISA分析双价纳米抗体同新冠病毒野生型及突变型抗原的结合能力(广谱结合活性)
取100ng的RBD抗原或突变型S1抗原包被ELISA板，4℃，过夜。PBST(0.05％)洗涤3次。每孔中加入2％BSA 200μl，室温，2h。PBST洗涤3次。将实施例10纯化的双价纳米抗体进行梯度稀释。起始浓度为2.4μg/ml(～30nM)，并依次5倍梯度稀释，共8个浓度梯度，加入孔中，每个浓度梯度重复3个孔，每孔100μl，室温孵育1h。PBST洗涤5次，加入8000倍稀释的anti human IgG,HRP(BETHYL，A80-304P)100μl/well，室温放置1h。 PBST洗涤5次，加入100μl TMB显色液(abcam)，显色5-10min，加入等体积TMB stop buffer (abcam)终止显色OD450读值，分析纳米抗体同野生型RBD及突变型S1抗原的结合能力。
ELISA检测结果如(图8，表5)显示，R-30-FC对野生型及所有突变型S1抗原或spike具有优秀的结合能力，最大效应浓度(EC50)在0.1nM以下，较单价纳米抗体提升了约20 多倍。与阳性对照AM180(北京百普赛斯，SPD-M180)相比，R-30-FC广谱结合活性更好，与参考文献Nanobody cocktails potently neutralize SARS-CoV-2D614G N501Y variant andprotect mice(Pymm et al.,2021)中两种表位纳米抗体WNb10-FC相比，本发明R-30-FC 纳米抗体可以同南非omicron仍保持高的结合亲和力，而WNb10-FC两种对照纳米抗体同南非omicron突变体无结合能力。进一步说明本专利中纳米抗体的广谱结合活性优势。
表5.双价纳米抗体同新冠病毒野生型及变异株S1抗原的结合能力
备注：“/”代表该抗体与变异体无结合能力。
实施例12SPR法测定双价纳米抗体同野生型及突变型抗原的亲和力常数
取CM5芯片，依次分别耦联野生型及突变型S1抗原，然后将纳米抗体蛋白溶液及阳性对照抗体(ARCO)用HBS-P缓冲buffer稀释成适宜的浓度梯度，本例中为从约0.8μg/ml(10nM)或0.2μg/ml(2.5nM)起始，依次2倍梯度稀释，稀释6个浓度梯度。每次进样120s，解离180s，流速30/min，再用10mM PH2.0 Gly-HCL再生，重复循环直至所有浓度梯度进样完成。程序运行结束后，使用Biacore T200(GE)仪器自带分析程序进行拟合分析，得出纳米抗体亲和力常数结果(表6)。结果显示，纳米抗体经改造为双价纳米抗体后，亲和力常数基本在10-12M水平，较单价纳米抗体(实施例7，表4)提升了近20倍；另外，与阳性对照(北京百普赛斯)相比，亲和力高10倍。
表6.双价RBD纳米抗体同各新冠野生型及各变异株蛋白的亲和力常数
备注：“/”代表该抗体与变异体无结合能力。
实施例13利用假病毒中和实验分析双价纳米抗体的中和活性
取适量R-30-FC，利用opti-MEM稀释起始浓度为200nM(16μg/ml)，然后用opti-MEM进行5倍稀释，共稀释8个浓度梯度；白色不透光壁的96细胞培养微孔板(中和实验板) 中，每孔加入25μl样品。将野生型及印度delta突变型假病毒(金斯瑞，SC2087A及SC2087V) 从-196℃取出，置于37℃水浴快速轻柔晃动复融，将复融后假病毒加到含有1500μl Opti- MEM的15ml管子中混匀。在96孔板中样品孔、阴性对照孔每孔加入25μl假病毒溶液。至此加样后每个实验孔含有50μl溶液。将样品与假病毒混合液混匀，室温孵育1h。完成样品和假病毒中和后，将Opti-HEK293/ACE2细胞(金斯瑞，SC2087A及SC2087V)立即复苏并稀释至浓度6×105/ml，并放入细胞培养箱待用。待样品与假病毒孵育结束，从细胞培养箱中取出细胞悬液。将细胞悬液充分混匀后，每孔加入50μl细胞悬液。24小时后每孔加入50μl预热的新鲜DMEM完全培养基，继续放入细胞培养箱中培养24小时。用移液器小心吸弃96孔板的培养基，连同枪头一起弃于预先装有1:10稀释的84消毒液的废液缸。立即加入50μl新配的荧光素酶显色液(金斯瑞)，室温孵育3-5分钟。将96孔板置于酶标仪 (BioTek)中读取每孔的化学荧光信号。根据检测结果进行数据分析，图9结果显示：R30- FC可有效抑制野生型及印度突变型假病毒感染ACE-2细胞，IC50分别为1.635nM及0.295nM，中和抑制作用明显且可有效抑制近来爆发的印度delta突变型感染。
实施例14检测双价纳米抗体对非典SARS-CoV-1RBD的结合活性
取100ng的非典SARS-CoV-1RBD抗原包被ELISA板，4℃，过夜。PBST(0.05％)洗涤3次。每孔中加入2％BSA 200μl，室温，2h。PBST洗涤3次。将实施例10纯化的双价纳米抗体进行梯度稀释。起始浓度为2.4μg/ml(～30nM)，并依次4倍梯度稀释，共8个浓度梯度，加入孔中，每个浓度梯度重复3个孔，每孔100μl，室温孵育1h。PBST洗涤5次，加入8000倍稀释的anti human IgG,HRP(BETHYL，A80-304P)100μl/well，室温放置1h。 PBST洗涤5次，加入100μl TMB显色液(abcam)，显色5-10min，加入等体积TMB stop buffer (abcam)终止显色OD450读值，分析纳米抗体同非典SARS-CoV-1RBD的结合能力。
ELISA检测结果如(图10)显示，R-30-FC对非典SARS-CoV-1RBD有优秀的结合能力，半数效应浓度(EC50)在0.01255nM以下，阳性对照AM180(北京百普赛斯，SPD- M180)则无结合能力；与WNb10-FC(EC50＝0.01391nM)相比，两个抗体均可高效结合非典RBD。另外，本专利R-30-FC纳米抗体还可以同南非omicron保持高的结合亲和力 (实施例11)，WNb10-FC则无omicron突变体结合能力，综合来说，本专利中纳米抗体R- 30广谱结合活性优势较AM180及WNb10-FC更明显。
实施例15检测双价纳米抗体对非典SARS-CoV-1RBD的阻断活性
本专利抗体R-30及其衍生抗体R-30-FC除了对新冠病毒SARS-CoV-2野生型及多种变异株具有结合中和活性外，还可以结合非典SARS-CoV-1RBD。本实施例通过ELISA检测 R-30-FC抗体阻断非典SARS-CoV-1RBD同ACE-2受体结合来验证其的中和活性。
取150ng的人ACE2-FC(北京百普赛斯，AC2-H5257)抗原包被ELISA板，4℃，过夜。PBST(0.05％)洗涤3次。每孔中加入2％BSA 200μl，室温，2h。PBST洗涤3次。将实施例10纯化的R-30-FC抗体进行梯度稀释。起始浓度为48μg/ml，并依次3倍梯度稀释，共8 个浓度梯度，加入孔中，每孔50μl；同时加入等倍体积的非典SARS-CoV-1RBD 0.27μg/ml, 37℃烘箱孵育1h。PBST洗涤5次，加入5000倍稀释的anti 6×His,HRP(abcam，)100μl/well，室温放置1h。PBST洗涤5次，加入100μl TMB显色液(abcam)，显色10min，加入等体积 TMB stop buffer(abcam)终止显色，于酶标仪中读取OD450，分析抗体对非典SARS-CoV- 1RBD及ACE-2的中和活性。
自图11可以看出，R-30-FC可以高效阻断非典SARS-CoV-1RBD同ACE-2受体的结合，半数抑制浓度(IC50)达到0.801nM，相比WNb10-FC(IC50＝2.024nM)，半数抑制浓度更低，对非典SARS-CoV-1RBD的阻断作用更强，抑制效果更好。
本发明制备的RBD纳米抗体，具有以下几大优点：
(1)本发明通过多抗原交叉免疫及淘选的方法，筛选获得的RBD纳米抗体具有广谱结合活性，可以有效结合SARS-CoV-2及几种传染性强、危害性大病毒变异株，例如英国的Alpha新冠病毒突变株(B.1.1.7)，南非的Beta新冠病毒突变株(B.1.351)，巴西的Gamma 新冠病毒突变株(P.1)以及近来爆发各国的印度Delta新冠病毒突变株(B.1.617.2)。
(2)本发明RBD纳米抗体可通过原核进行高效表达，相对传统抗体真核哺乳细胞表达，生产成本更低，更利于在此类感染性疾病中推广及应用。
(3)本发明RBD纳米抗体同SARS-CoV-2S1或RBD结合能力达亚纳摩尔甚至皮摩尔级别，效果优于商业化检测抗体。
(4)本发明RBD纳米抗体及其多价改造纳米抗体可以有效抑制新冠病毒感染宿主细胞，中和能力达到纳摩尔及以下水平。
本发明所涉及的RBD纳米抗体，无论以任何基因工程改造形式出现，包含但不限于对其进行以下改造：小分子结构修饰、人源化、双特异纳米抗体改造、双价或多价纳米抗体改造、CAR-T或TCR-T技术联合治疗等应用，均在本发明保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 广谱中和新冠病毒的纳米抗体、含其的融合蛋白及其应用
<130> P210110008C
<160> 47
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> X为I或V
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> X为I或S
<400> 1
Gly Gly Xaa Xaa Arg Leu Asn Ser
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> X为I或V
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> X为N或S
<400> 2
Ile Xaa Xaa Asp Val Gly Thr
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3
<400> 3
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 4
Gly Gly Ile Ile Arg Leu Asn Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R-30 CDR2
<400> 5
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1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-28 CDR1
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Ile Val Ser Asp Val Gly Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-51 CDR1
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Gly Gly Val Ser Arg Leu Asn Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-51 CDR2
<400> 9
Ile Ile Ser Asp Val Gly Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-24 CDR1
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Gly Gly Val Ser Arg Leu Asn Ser
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-24 CDR2
<400> 11
Ile Val Asn Asp Val Gly Thr
1 5
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<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR1
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> X为P或S
<220>
<221> VARIANT
<222> (23)..(23)
<223> X为T或A
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Xaa Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Xaa Ala Ser
20 25
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR2
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> X为P或S
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> X为T或A
<400> 13
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Xaa Gly Lys Gln Arg Glu Xaa Val Ala
1 5 10 15
Thr
<210> 14
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR3
<220>
<221> VARIANT
<222> (18)..(18)
<223> X为K或A
<220>
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<220>
<221> VARIANT
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<223> X为Q或L
<220>
<221> VARIANT
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<223> X为L或P
<220>
<221> VARIANT
<222> (37)..(37)
<223> X为Y或N
<400> 14
Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Xaa Asn Thr Xaa Tyr Leu Xaa Met Asn Ser Xaa Lys Phe Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Xaa Cys
35
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR4
<400> 15
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 16
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R-30 FR1
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R-30 FR2
<400> 17
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Pro Val Ala
1 5 10 15
Thr
<210> 18
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R-30 FR3
<400> 18
Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Phe Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 19
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-28 FR1
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-28 FR2
<400> 20
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Pro Val Ala
1 5 10 15
Thr
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<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-28 FR3
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Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Pro Lys Phe Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-51 FR1
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-51 FR2
<400> 23
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
1 5 10 15
Thr
<210> 24
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-51 FR3
<400> 24
Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Ala Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Phe Glu Asp
20 25 30
Thr Ala
<210> 25
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-24 FR1
<400> 25
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-24 FR2
<400> 26
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
1 5 10 15
Thr
<210> 27
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-24 FR3
<400> 27
Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Ala Asn Thr Val Tyr Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Phe Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Asn Cys
35
<210> 28
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 氨基酸序列R-30
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gly Ile Ile Arg Leu Asn
20 25 30
Ser Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Pro Val
35 40 45
Ala Thr Ile Val Ser Asp Val Gly Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Ala Asp Arg Ala Phe Val Leu Arg Gly Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 氨基酸序列S1-28
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gly Ile Ile Arg Leu Asn
20 25 30
Ser Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Pro Val
35 40 45
Ala Thr Ile Val Ser Asp Val Gly Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Pro Lys Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Ala Asp Arg Ala Phe Val Leu Arg Gly Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 氨基酸序列S1-51
<400> 30
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Val Ser Arg Leu Asn
20 25 30
Ser Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ile Ser Asp Val Gly Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Ala Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Ala Asp Arg Ala Phe Val Leu Arg Gly Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 氨基酸序列S1-24
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Val Ser Arg Leu Asn
20 25 30
Ser Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Val Asn Asp Val Gly Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Ala Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Leu Met Asn Ser Leu Lys Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asn Cys Val
85 90 95
Ala Asp Arg Ala Phe Val Leu Arg Gly Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R-30的核苷酸序列
<400> 32
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc ttggtgcagt ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtacag cctctggagg catcatcaga ctcaattcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaaac agcgcgagcc ggtcgcgact atagttagcg acgtcggcac aaactatgcc 180
gactccgtga agggccgctt caccatctcc agagacaacg ccaagaatac gatatatctg 240
caaatgaaca gcctgaaatt tgaggacacg gccgtttatt actgtgtggc agatcgcgcg 300
ttcgttcttc ggggggagta tgagtactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 33
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-28的核苷酸序列
<400> 33
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtgcagc ctgggggttc tctgagactc 60
tcctgtacag cctctggagg catcatcaga ctcaattcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaaac agcgcgagcc ggtcgcgact atagttagcg acgtcggcac aaactatgcc 180
gactccgtga agggccgctt caccatctcc agagacaacg ccaagaatac gatatatctg 240
caaatgaaca gcccgaaatt tgaggacacg gccgtctatt actgtgtggc agatcgcgcg 300
ttcgttcttc ggggggagta tgagtactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 34
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-51的核苷酸序列
<400> 34
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtgcagt ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggagg agtctctaga ctcaattcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaaac agcgcgagtt ggtcgcaact attattagtg atgtcggcac aaattatgcc 180
gactccgtga agggccgctt caccatttcc agagacaacg ccgcgaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaatt tgaggacacg gccgtctatt actgtgtggc agatcgcgcg 300
ttcgttcttc ggggggagta tgagtactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 35
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-24的核苷酸序列
<400> 35
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc ttggtgcagt ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggggg agtctctaga ctcaattcca tgggctggta ccgccaggct 120
caagggaagc agcgcgagtt ggtcgcaact attgttaatg atgtcggcac aaactatgcc 180
gactccgtga agggccgctt caccatctcc agagacaacg ccgcgaacac ggtgtatctg 240
ctaatgaaca gcctgaaatt tgaggacacg gccgtctata actgtgtggc agatcgcgcg 300
ttcgttcttc ggggggagta tgagtactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 36
<211> 347
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R-30-FC的氨基酸序列
<400> 36
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gly Ile Ile Arg Leu Asn
20 25 30
Ser Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Pro Val
35 40 45
Ala Thr Ile Val Ser Asp Val Gly Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Ala Asp Arg Ala Phe Val Leu Arg Gly Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
115 120 125
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
130 135 140
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
145 150 155 160
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
165 170 175
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
180 185 190
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
195 200 205
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
210 215 220
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
225 230 235 240
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
245 250 255
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
260 265 270
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
275 280 285
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
290 295 300
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
305 310 315 320
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
325 330 335
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CALL001
<400> 37
gtcctggctg ctcttctaca agg 23
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CALL002
<400> 38
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CALL001-2
<400> 39
gtcctggctg ctctwytaca agg 23
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CALL001-3
<400> 40
cctggykgca ggtchcmagg tg 22
<210> 41
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH-Back
<400> 41
gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29
<210> 42
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH-For
<400> 42
ctagtgcggc cgctgaggag acggtgacct gggt 34
<210> 43
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH-Back-2
<400> 43
gatgtgcagc tgcargagyc wggrggagg 29
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH-Back-3
<400> 44
gatgtgcagc tgcaggagtc gggcccagg 29
<210> 45
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R-45氨基酸序列
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ile Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gln Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Thr Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Arg Ser Gly Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His
85 90 95
Ala Val Asn Ser Arg Ser Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ser
115
<210> 46
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-96氨基酸序列
<400> 46
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asp
20 25 30
Asn Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Pro Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ala Thr Ser Gly Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Asp Phe Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
85 90 95
Val Val Asp Ala Thr Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R-47氨基酸序列
<400> 47
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Met Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Arg Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Pro Leu Thr Tyr Tyr Ser Gly Thr Tyr Tyr Phe Pro Gly
100 105 110
Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

Claims (14)

1.一种纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，
所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或，所述CDR1的氨基酸序列如SEQID NO:10所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQID NO:3所示。
3.如权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
优选地，所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:17所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO:15所示；或，所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQID NO:20所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQID NO:15所示；或，所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；或，所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
4.如权利要求1～3任一项所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:28～31所示。
5.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由如权利要求1～4任一项所述的纳米抗体和Fc缀合而成；
优选地，所述Fc选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；和/或，所述融合蛋白具有一价、二价或多价的纳米抗体；
更优选地，所述融合蛋白包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
6.一种CAR或TCR分子，其特征在于，其包括如权利要求1～4任一项所述的纳米抗体，或如权利要求5所述的融合蛋白。
7.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1～4任一项所述的纳米抗体，或如权利要求5所述的融合蛋白，或如权利要求6所述的CAR或TCR分子；
优选地，编码所述纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:32～35所示。
8.一种重组表达载体，其特征在于，其包括如权利要求7所述的核酸。
9.一种转化体，其特征在于，其包括如权利要求7所述的核酸，或如权利要求8所述的重组表达载体；所述转化体的出发宿主为细菌、真菌或细胞；优选地，所述细胞为哺乳动物细胞例如人293细胞、CHO细胞或T细胞。
10.一种抗体药物偶联物，其包含如权利要求1～4任一项所述的纳米抗体或权利要求5所述的融合蛋白，以及细胞毒性剂。
11.一种药物组合物，其特征在于，其包括如权利要求1～4任一项所述的纳米抗体，或如权利要求5所述的融合蛋白，或如权利要求10所述的抗体药物偶联物；
优选地，所述药物组合物还包括其他抗新冠病毒的抗体，或治疗新冠病毒的小分子药物、核酸药物，或靶向其他病毒的抗体。
12.一种套装药盒组合，其包括药盒A和药盒B，其特征在于，所述药盒A包括如权利要求1～4任一项所述的纳米抗体、权利要求5所述的融合蛋白、权利要求6所述的CAR或TCR分子、权利要求10所述的抗体药物偶联物或权利要求11所述的药物组合物；所述药盒B包括其他靶向新冠病毒、非典病毒的抗体、小分子或核酸药物，或靶向其他病毒的抗体、小分子或核酸药物。
13.一种如权利要求1～4任一项所述的纳米抗体、权利要求5所述的融合蛋白、权利要求6所述的CAR或TCR分子、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的重组表达载体、权利要求9所述的转化体、权利要求10所述的抗体药物偶联物或权利要求11所述的药物组合物在制备治疗新冠病毒、非典病毒的药物中的用途。
14.一种非诊断目的的免疫检测或者测定新型冠状病毒的方法，其包括使用如权利要求1～4任一项所述的纳米抗体、权利要求5所述的融合蛋白或权利要求6所述的CAR或TCR分子与待检测样本混合。
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