CN112521500A

CN112521500A - 与cxcr4结合的亲和力成熟结合蛋白及应用

Info

Publication number: CN112521500A
Application number: CN202011564860.XA
Authority: CN
Inventors: 魏星; 周晓欣
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112521500B

Abstract

本发明公开了一种与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白及应用。本发明筛选人的CXCR4亲和力成熟结合蛋白文库，得到与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白。该结合蛋白是aCX20E5亲和力成熟结合蛋白；或是aCX16C1亲和力成熟结合蛋白、aCX17D5亲和力成熟结合蛋白、aCX20B2亲和力成熟结合蛋白和aCX13C6亲和力成熟结合蛋白中的至少一种与aCX20E5亲和力成熟结合蛋白组合形成的结合蛋白。本发明还公开了上述与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白在制备自身免疫病和抗肿瘤药物中的应用。本发明所提供的结合蛋白是人源性的，在人体中无免疫原性，可更好地用于自身免疫病和抗癌药物开发及临床应用。

Description

与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白及应用

技术领域

本发明属于结合蛋白领域，特别涉及一种与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白及应用。

背景技术

恶性肿瘤，一直是医学上难以攻克的问题，更是人类健康的“头号杀手”，因此对于肿瘤的治疗一直都是研究的热点和难点。传统的治疗肿瘤方案主要通过放疗、化疗和手术治疗等相结合。这些治疗手段虽然能抑制或者消除肿瘤细胞，但是对机体正常的细胞也有损害和毒副作用。近年来，肿瘤的靶向治疗成为研究热点，这种治疗方法是将特异性的蛋白结合到肿瘤细胞上，能够起到杀死肿瘤细胞的作用，并且将机体正常细胞的损伤程度降到最低。

趋化因子受体4(CXCR4)是由352个氨基酸残基组成的7次跨膜糖蛋白，属于G蛋白偶联受体，大小约40kDa。目前已经发现CXCR4在23种不同类型肿瘤中均有表达，是肿瘤细胞表达最为普遍的趋化因子受体。CXCR4与其配体SDF-1组成的生物轴可通过激活多种信号通路而介导肿瘤细胞的迁移、侵袭、凋亡、血管生成及增殖等。基于趋化因子SDF-1/CXCR4与肿瘤的密切关系，目前就阻断SDF-1/CXCR4轴的药物研制已经引起了人们的高度关注。在治疗肉瘤、神经胶质瘤以及脑瘤中，CXCR4的拮抗剂AMD3100已经进入了临床I和II期。同时，已有抗CXCR4的抗体用于肿瘤治疗，MDX-1338单克隆抗体能阻断SDF-1结合CXCR4，有效抑制肿瘤转移，目前已经用于急性白血病，非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤的临床I期治疗。因此利用CXCR4作为癌症治疗的靶点，具有很高的医学价值。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白。

本发明的另一目的在于提供上述与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白，是aCX20E5亲和力成熟结合蛋白；或是aCX16C1亲和力成熟结合蛋白、aCX17D5亲和力成熟结合蛋白、aCX20B2亲和力成熟结合蛋白和aCX13C6亲和力成熟结合蛋白中的至少一种与aCX20E5亲和力成熟结合蛋白组合形成的结合蛋白；

所述的aCX13C6亲和力成熟结合蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区；

所述的aCX16C1亲和力成熟结合蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区；

所述的aCX17D5亲和力成熟结合蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的轻链可变区；

所述的aCX20B2亲和力成熟结合蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区；

所述的aCX20E5亲和力成熟结合蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区。

编码所述的aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO:11所示。

编码所述的aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO:12所示。

编码所述的aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO:13所示。

编码所述的aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO:14所示。

编码所述的aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO:15所示。

编码所述的aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO:16所示。

编码所述的aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO:17所示。

编码所述的aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO:18所示。

编码所述的aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO:19所示。

编码所述的aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO:20所示。

由于亲和力成熟结合蛋白的生物活性是由抗体轻链和重链可变区中的高变区特异性的基因序列决定的，因此，可通过基因工程方法对如上提供的编码重链可变区和编码轻链可变区的核苷酸序列进行重组，得到不同类型的亲和力成熟结合蛋白。

所述的与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白，由重链可变区、连接链和轻链可变区组成。

所述的aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。

所述的aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。

所述的aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。

所述的aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。

所述的aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。

编码上述与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列，是编码所述的aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列；或是编码所述的aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列、编码所述的aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列、编码所述的aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列和编码所述的aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列中的至少一种与编码所述的aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列组合形成的核苷酸序列。

编码所述的aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:29所示。

编码所述的aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:30所示。

编码所述的aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:31所示。

编码所述的aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:32所示。

编码所述的aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:33所示。

编码所述的aCX13C6亲和力成熟结合蛋白、aCX16C1亲和力成熟结合蛋白、aCX17D5亲和力成熟结合蛋白、aCX20B2亲和力成熟结合蛋白和aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列分别由774、774、774、774和774个碱基组成，对应编码的氨基酸分别为258、258、258、258和258个。

编码所述的aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的基因由381个碱基组成，编码127个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区：CDR1为GGSFSGYE；CDR2为INHSGST；CDR3为AR。

编码所述的aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的基因由339个碱基组成，编码113个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区：CDR1为QSLLHSNGYNY；CDR2为LCS；CDR3为MQALQPP。

编码所述的aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的基因由381个碱基组成，编码127个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区：CDR1为GGSFSGYY；CDR2为INHSGST；CDR3为AR。

编码所述的aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的基因由339个碱基组成，编码113个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区：CDR1为QSLLHSNGYNY；CDR2为LGS；CDR3为MQALQPP。

编码所述的aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的基因由381个碱基组成，编码127个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区：CDR1为GGSFSGYY；CDR2为INHSGST；CDR3为VR。

编码所述的aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的基因由339个碱基组成，编码113个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区：CDR1为QSLLHSNGYNY；CDR2为LGS；CDR3为MQALQPP。

编码所述的aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的基因由381个碱基组成，编码127个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区：CDR1为GGSFSGYE；CDR2为INHSGST；CDR3为AR。

编码所述的aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的基因由339个碱基组成，编码113个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区：CDR1为QSLLHSNGYNY；CDR2为LGS；CDR3为MQALQPP。

编码所述的aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的基因由381个碱基组成，编码127个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区：CDR1为GGSFSGYY；CDR2为INHSGST；CDR3为AR。

编码所述的aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的基因由339个碱基组成，编码113个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区：CDR1为QSLLHSNGYNY；CDR2为LGS；CDR3为MQALQPP。

所述的与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白的制备方法，包括如下步骤：通过基因合成编码所述的与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列，将其克隆至表达载体，再将重组后的表达载体转入宿主细胞进行包涵体表达、纯化，得到所述的与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白；或是通过蛋白合成的方法，得到所述的与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白。

所述的CXCR4亲和力成熟结合蛋白在制备治疗CXCR4高表达为特征的疾病的抗体药物中的应用。

所述的CXCR4高表达为特征疾病为自身免疫病和癌症。

所述的肿瘤为CXCR4高表达肿瘤，包括胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、食管癌、鼻咽癌，头颈癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌、卵巢瘤、宫颈癌、子宫癌、肝癌、脾脏癌、肾脏癌和脑肿瘤。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明通过噬菌体展示技术，在人源噬菌体亲和力成熟结合蛋白文库中筛选与CXCR4相互作用的亲和力成熟结合蛋白，可在无需使用抗原免疫人体的情况下获得人体蛋白的结合蛋白。

2.本发明提供的亲和力成熟结合蛋白是人源性的，在人体中无免疫原性，可更好地应用于抗肿瘤药物的开发。

3.本发明提供的亲和力成熟结合蛋白利用高表达的原核宿主进行蛋白表达，能显著降低亲和力成熟结合蛋白的生产成本，促进亲和力成熟结合蛋白的应用。

附图说明

图1是多克隆噬菌体ELISA检测5轮文库筛选的结果图。PBS孔为空白对照，EGFR和EpCAM为无关抗原对照，CXCR4孔包被了合成的CXCR4多肽；一抗为各轮文库筛选后扩增纯化获得的多克隆噬菌体结合蛋白，二抗为HRP标记的抗噬菌体M13的抗体。结果表明，从第1轮至第5轮筛选抗体文库过程中，采用CXCR4多肽筛选文库得到的OD450 nm值逐轮升高，说明每轮采用CXCR4多肽筛选得到的文库中CXCR4抗体克隆的富集逐渐升高。

图2是单克隆噬菌体ELISA筛选与CXCR4多肽结合的阳性克隆结果图；其中，A为单克隆噬菌体ELISA的代表性克隆的图，是其中32个单克隆噬菌体的ELISA结果，一抗为单克隆噬菌体，二抗为anti-M13-HRP；B为采用多个无关抗原作为对照的单克隆噬菌体ELISA检测阳性克隆与CXCR4多肽的结合的特异性结果图。图2B结果表明，CXCR4亲和力成熟结合蛋白噬菌体克隆能够与CXCR4-Fc和CXCR4多肽特异性地结合。

图3是亲和力成熟结合蛋白表达纯化后的SDS-PAGE电泳图；其中，A为aCX13C6，B为aCX16C1，C为aCX17D5，D为aCX20B2，E为aCX20E5；图中，泳道1为蛋白Marker，泳道2为未诱导的菌体蛋白，泳道3为诱导的菌体蛋白，泳道4为诱导后菌体破碎上清，泳道5为诱导后菌体破碎沉淀，泳道6为诱导的菌体破碎后的沉淀变性液，泳道7为过柱液，泳道8为洗杂液，泳道9-13为目的蛋白洗脱液1-5。

图4为采用ELISA检测纯化的CXCR4亲和力成熟结合蛋白与抗原CXCR4多肽的结合结果图；其中*p<0.05相对于PBS；**p<0.01相对于PBS(n＝3)。结果表明，与野生型结合蛋白aCX82相比，aCX13C6和aCX20E5与CXCR4-Fc具有较高的结合能力，aCX20E5与CXCR4多肽具有较高的结合能力。此外，5个亲和力成熟结合蛋白与无关抗原的结合并不明显，说明5个亲和力成熟结合蛋白能够特异性地与CXCR4结合。

图5是采用MTT实验检测亲和力成熟结合蛋白对肿瘤细胞增殖能力的影响结果图；其中，A为DU145，B为PC-3，C为MDA-MB-231；*p<0.05相对于0μg/mL；**p<0.01相对于0μg/mL；***p<0.001相对于0μg/mL；****p<0.0001相对于0μg/mL(n＝3)。结果表明，对于DU145细胞，与野生型结合蛋白aCX82相比，在使用50μg/mL浓度时，aCX20E5能较有效地抑制肿瘤细胞的增殖。对于PC-3细胞，与aCX82相比，5个亲和力成熟结合蛋白具有类似的抑制肿瘤细胞增殖的作用。对于MDA-MB-231细胞，与aCX82相比，在使用50和100μg/mL浓度时，aCX20E5能较有效地抑制肿瘤细胞的增殖。

图6是采用流式细胞分析仪和Annexin V/PI双染试剂盒检测亲和力成熟结合蛋白对肿瘤细胞DU145、PC-3和MDA-MB-231凋亡的影响及其促进肿瘤细胞凋亡比率的柱状图；其中，A为DU145细胞的流式细胞检测图，B为A的凋亡比例统计图，C为PC-3细胞的流式细胞检测图，D为C的凋亡比例统计图，E为MDA-MB-231细胞的流式细胞检测图，F为E的凋亡比例统计图；*p<0.05相对于无结合蛋白对照组；**p<0.01相对于无结合蛋白对照组；***p<0.001相对于无结合蛋白对照组；****p<0.0001相对于无结合蛋白对照组(n＝3)。结果表明，对于DU145和MDA-MB-231细胞，与野生型结合蛋白aCX82相比，aCX13C6和aCX20E5具有较高的诱导凋亡能力。对于PC-3细胞，CX20E5具有较高的诱导凋亡能力。

图7是采用Transwell迁移实验检测亲和力成熟结合蛋白对肿瘤细胞迁移的影响结果及其吸光值变化趋势图；其中，A为Transwell迁移实验检测亲和力成熟结合蛋白对DU145迁移的照片图，B为A的分析结果图，C为Transwell迁移实验检测亲和力成熟结合蛋白对PC-3迁移的照片图，D为C的分析结果图，E为Transwell迁移实验检测亲和力成熟结合蛋白对MDA-MB-231迁移的照片图，F为E的分析结果图；*p<0.05相对于0μg/mL；**p<0.01相对于0μg/mL；***p<0.001相对于0μg/mL；****p<0.0001相对于0μg/mL(n＝3)。结果表明，对于DU145细胞，与野生型结合蛋白aCX82相比，5个亲和力成熟结合蛋白具有类似的抑制肿瘤细胞迁移的作用。对于PC-3细胞，与aCX82相比，在使用50μg/mL浓度时，aCX13C6、aCX20B2和aCX20E5能较有效地抑制肿瘤细胞的迁移。对于MDA-MB-231细胞，与aCX82相比，在使用100μg/mL浓度时，aCX20E5能较有效地抑制肿瘤细胞的迁移。

图8是采用Transwell侵袭实验检测亲和力成熟结合蛋白对肿瘤细胞侵袭的影响及其吸光值变化结果图；其中，A为采用Transwell侵袭实验检测亲和力成熟结合蛋白对DU145细胞侵袭的实验照片图，B为对A的分析结果图，C为采用Transwell侵袭实验检测亲和力成熟结合蛋白对MDA-MB-231细胞侵袭的实验照片图，D为对C的分析结果图。结果表明，5个亲和力成熟结合蛋白能够抑制DU145和MDA-MB-231细胞的侵袭，随着5个亲和力成熟结合蛋白浓度升高，癌细胞的侵袭能力能够逐步地降低。

图9是采用动物实验检验2个亲和力成熟结合蛋白在DU145前列腺癌细胞小鼠模型中对肿瘤增长的影响结果图；其中，A为给药后小鼠肿瘤体积变化的曲线图，B为给药周期结束时各组小鼠的肿瘤大小照片图，C为给药周期结束后各组小鼠的肿瘤重量检测结果图，D为小鼠肿瘤组织的HE染色及免疫组化的结果图，E是利用Image Pro-Plus软件对D数据的分析结果图；*p<0.05相对于PBS；**p<0.01相对于PBS(n＝4-6)。结果表明，根据图9A肿瘤体积图，与野生型结合蛋白aCX82相比，在给药周期结束时(第30天)，aCX20E5具有较好地抑制体内肿瘤细胞生长的能力。根据图9C肿瘤重量图，与野生型结合蛋白aCX82相比，aCX13C6和aCX20E5具有较低的肿瘤重量。根据图9E免疫组化染色的积分光密度结果，与野生型结合蛋白aCX82相比，aCX20E5能够在体内较有效地抑制肿瘤细胞增殖(Ki67)，较有效地抑制肿瘤组织血管生成(CD31)。2个亲和力成熟结合蛋白对诱导肿瘤细胞凋亡(C-caspase-3)没有明显影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1构建噬菌体亲和力成熟结合蛋白文库

(1)以野生型结合蛋白aCX82为模板(编码aCX82结合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:26所示，编码aCX82结合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示)，按照GeneMorph IIRandom Mutagenesis Kit的说明书进行易错PCR，通过易错PCR的方法扩增目的基因，引物为Error-F2(核苷酸序列如SEQ ID NO:37所示)和Error-R2(核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示)。

(2)PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳来鉴定易错PCR产物。

(3)按照EZNA Gel Extraction Kit的说明书进行易错PCR产物的胶回收。

(4)将pComb3XSS噬菌体展示质粒和易错PCR产物进行双酶切反应，50℃酶切过夜。

(5)利用琼脂糖凝胶电泳来鉴定酶切产物。

(6)按照EZNA Gel Extraction Kit的说明书进行酶切产物的胶回收。

(7)利用T4 DNA连接酶进行酶连反应，4℃过夜，得到酶连产物。

(8)将酶连产物转化到电转感受态细胞中。电转后，立即加入1mL预冷的SOC培养基，37℃、220rpm培养1h，然后涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。

(9)随机挑取单克隆，进行菌液PCR鉴定(所用引物是Error-F2和Error-R2)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳来鉴定菌液PCR产物。将条带(约是800bp)位置正确的菌液送去测序，确定文库是否构建成功。

实施例2制备辅助噬菌体

(1)在一个TYE固体培养基的培养皿上三区划线TG1大肠杆菌克隆菌株，划好线的培养皿倒置于37℃培养箱培养约14h。

(2)挑取培养皿上TG1单菌落接种至5mL 2×TY液体培养基中，37℃、250rpm培养过夜。

(3)将步骤(2)得到的菌液按体积比1:100比例转接至另一5mL 2×TY液体培养基中，37℃、250rpm培养至菌液OD_600nm约为0.5。

(4)用PBS将KM13辅助噬菌体梯度稀释(10¹²pfu/mL～10⁴pfu/mL)。

(5)取200μL步骤(3)培养得到的菌液，加入10μL稀释好的KM13辅助噬菌体，混合物置于37℃水浴锅水浴30min，得到混合物A。

(6)将低熔点琼脂糖和2×TY液体培养基混合，加热至完全熔解，然后在水中孵育冷却到42℃，得到顶层(H-top)培养基，其中低熔点琼脂糖的浓度为1.5％。取3mL顶层培养基与步骤(5)得到的混合物A温和混匀，然后铺到37℃预热的TYE固体培养板上。待顶层培养基完全凝固，将培养皿倒置于37℃培养箱培养过夜。

(7)挑取一个小的空斑，接种于5mL TG1菌液中(OD_600nm＝0.5)，37℃、250rpm条件下培养2h。

(8)将菌液按体积比1:100比例转接至另一500mL 2×TY液体培养基中，37℃、250rpm摇菌2h。

(9)加入卡那霉素至其在培养基中的浓度为50μg/mL，30℃、250rpm培养过夜。

(10)将菌液离心并过滤，得到上清液，再加入相当于上清液1/5体积的20％w/vPEG-NaCl溶液，混匀后分装于50mL的离心管中冰上孵育1h，4℃、3200g离心30min，弃上清，再用1mL PBS缓冲液重悬沉淀，4℃、3200g离心5min，上清用0.45μM滤器过滤除菌，即得辅助噬菌体。

实施例3噬菌体亲和力成熟结合蛋白文库的扩增

(1)在冰上解冻含有亲和力成熟结合蛋白质粒的细菌文库，取100μL加入到50ml 2×TY培养基(含100μg/mL氨苄+和1％w/v葡萄糖)，37℃、220rpm振荡培养2h，直到OD_600nm＝0.5。

(2)然后加入5×10¹¹pfu KM13辅助噬菌体，放在37℃恒温水浴锅中，水浴30min。在小型高速离心机进行离心，3200g离心10min。用2×TY液体培养基(含100μg/mL Amp+和50μg/mL Kana+)轻轻重悬沉淀，25℃、220rpm振荡培养20h。

(3)在小型高速离心机进行离心，3200g离心20min，保留上清溶液，吸取40ml上清溶液，加入10ml 20％w/v PEG-NaCl溶液，轻轻混匀，冰浴2h。

(4)在小型高速离心机进行离心，3200g离心30min，保留沉淀。用少量PBS缓冲液轻轻重悬沉淀，在小型高速离心机进行离心，3200g离心10min。得到的上清含有噬菌体，可以直接做为噬菌体文库筛选。

实施例4噬菌体亲和力成熟结合蛋白文库中筛选CXCR4亲和力成熟结合蛋白

(1)第1轮筛选：包被抗原(CXCR4多肽，从上海波泰生物科技公司购买得到)，空白对照组的免疫管加入4ml PBS缓冲液，实验组的免疫管加入相同体积的抗原稀释液(用PBS缓冲液稀释)，抗原浓度为100μg/ml，放在4℃冰箱，过夜。

(2)第二天，使用PBS缓冲液冲洗免疫管，共冲洗3次。然后沿着管壁加入封闭液(2％w/v BSA-PBS)，室温封闭2h。

(3)使用PBS缓冲液冲洗免疫管，共冲洗3次。加入(5×10¹²)噬菌体文库(实施例3得到的含噬菌体的上清)，用2％w/v BSA-PBS稀释，体积为4ml，室温静置2h。

(4)第1轮筛选：使用PBST缓冲液冲洗免疫管10次。第2轮筛选-第5轮筛使用PBST缓冲液冲洗免疫管20次。每次冲洗都要快速进行，才能达到冲洗效果。

(5)利用胰蛋白酶溶液洗脱与抗原结合的噬菌体，浓度为1mg/ml，体积为500μL，持续旋转洗脱10min，保留上清，放在4℃冰箱暂存。

(6)将噬菌体洗脱液加到TG1菌液里，放在37℃恒温水浴锅中，水浴30min。

(7)梯度稀释菌液，取100μL稀释的菌液涂布在TYE平板(含100μg/mL Amp+和1％w/v葡萄糖)，然后在37℃的培养箱培养≥12h；

(8)剩下的菌液在小型高速离心机进行离心，3200g离心10min，用少量的2×TY液体培养基轻轻重悬沉淀，涂布在TYE平板上，然后在37℃的培养箱培养≥12h。

(9)第2天，收集步骤(8)的TYE平板中的细菌：加入2ml 2×TY液体培养基(含15％甘油)，将平板的菌落全部刮下。将50μL菌液加入到50ml 2×TY液体培养基(含100μg/mLAmp+和1％w/v葡萄糖)，37℃、220rpm振荡培养2h，直到OD_600nm＝0.5。

(10)取10ml菌液，然后加入5×10¹¹pfu KM13辅助噬菌体，放在37℃恒温水浴锅中，水浴30min。

(11)在小型高速离心机进行离心，4℃、3200g离心10min。用2×TY液体培养基(含100μg/mL Amp+和50μg/mL Kana+)轻轻重悬沉淀，25℃、220rpm振荡培养20h。

(12)在小型高速离心机进行离心，3200g离心20min，保留上清溶液，吸取40ml上清溶液，加入10ml 20％w/v PEG-NaCl溶液，轻轻混匀，冰浴2h。

(13)在小型高速离心机进行离心，3200g离心30min，保留沉淀。用少量PBS缓冲液轻轻重悬沉淀，在小型高速离心机进行离心，3200g离心10min。得到的上清含有噬菌体，可以直接进行下一轮噬菌体文库筛选，或者加入甘油，放在-80℃保存。

(14)依次进行5轮筛选，根据以上步骤(4)～(13)进行。后续4轮筛选的抗原浓度不同，第2轮和第3轮抗原浓度均为50μg/mL，第4轮和第5轮抗原浓度均为25μg/mL,依次从上一轮得到的噬菌体中进行筛选。

实施例5多克隆噬菌体ELISA检测5轮筛选的富集结果

(1)包被抗原：实验使用NUNC 96孔酶标板，空白对照组为PBS，包被PBS缓冲液，体积为100μL。无关抗原组为EGFR多肽(上海波泰生物科技公司购买得到)和EpCAM多肽(上海波泰生物科技公司购买得到)，浓度为2μg/mL，使用PBS缓冲液稀释，100μL/孔。实验组为CXCR4多肽，浓度为2μg/mL，使用PBS缓冲液稀释，体积为100μL。将96孔酶标板放在4℃过夜。

(2)用PBS缓冲液冲洗96孔酶标板3次，每次都要甩干酶标板上的液体。然后加入200μL 2％w/v BSA-PBS封闭溶液，37℃封闭2h。

(3)用PBS缓冲液冲洗96孔酶标板3次，每次都要甩干酶标板上的液体。每孔加入100μL噬菌体稀释液(将5轮得到的噬菌体稀释到2％BSA-PBS)，室温静置1h。

(4)用PBST缓冲液冲洗96孔酶标板3次，每次都要甩干酶标板上的液体。每孔加入100μL抗M13抗体-HRP稀释液(将抗M13抗体-HRP稀释到2％w/v BSA-PBS溶液中，稀释比例为1：10000)，室温静置1h。

(5)用PBST缓冲液冲洗96孔酶标板3次，每次静置2min，甩干酶标板上的液体。每孔加入100μL TMB底物显色液，避光孵育5min，加入50μL浓度为1mol/L的H₂SO₄终止反应，测量OD _450nm吸光值。

(6)图1为多克隆噬菌体ELISA检测5轮文库筛选的结果图，选择第5轮筛选扩增得到的噬菌体亲和力成熟结合蛋白文库进行单克隆噬菌体ELISA。结果表明，从第1轮至第5轮筛选抗体文库过程中，采用CXCR4多肽筛选文库得到的OD_450nm值逐轮升高，说明每轮采用CXCR4多肽筛选得到的文库中CXCR4抗体克隆的富集逐渐升高。

实施例6从第5轮富集的文库中挑取单克隆噬菌体进行ELISA验证

(1)用接种环蘸取少量的大肠杆菌TG1甘油菌进行平板划线，在37℃的培养箱培养≥12h。

(2)选择一个平板上的菌落接种到5mL 2×TY液体培养基(不含抗生素)，在摇床振荡培养过夜，温度为37℃，转速为220rpm。

(3)将过夜培养的TG1菌液按10％体积比例加入到2×TY液体培养基，37℃、220rpm振荡培养2h。

(4)将噬菌体梯度稀释到10^-8，加到TG1菌液里，放在37℃恒温水浴锅中，水浴30min。

(5)取少量菌液涂布在TYE平板(含100μg/mL Amp+和1％w/v葡萄糖)，然后在37℃的培养箱培养≥12h；

(6)从平板上选择单克隆菌落接种到96孔培养板，每孔加入200μL 2×TY液体培养基(含100μg/mL Amp+和1％w/v葡萄糖)，37℃、220rpm振荡培养过夜。

(7)从96孔板每孔吸取5μL菌液，接种到新的培养板中，每孔加入200μL 2×TY液体培养基(含100μg/mL Amp+和1％w/v葡萄糖)，37℃、220rpm振荡培养2h。旧的培养板用于保存甘油菌，每孔中加入30％甘油，放在-80℃冰箱。

(8)将96孔板的菌液逐个加到1.5mL EP管中，每个1.5mL EP管加入50μL KM13辅助噬菌体稀释液(用2×TY液体培养基稀释)，放在37℃恒温水浴锅中，水浴30min。

(9)在小型高速离心机进行离心，3200g离心10min。用2×TY液体培养基(含100μg/mL Amp+和50μg/mL Kana+)轻轻重悬沉淀，25℃、220rpm振荡培养20h。

(10)在小型高速离心机进行离心，3200g离心10min,保留上清，放在4℃保存。

(11)包被抗原：实验使用NUNC 96孔酶标板，空白对照组为PBS，包被PBS缓冲液，体积为100μL。无关抗原组为EpCAM多肽，浓度为2μg/ml，使用PBS缓冲液稀释，体积为100μL。实验组为CXCR4多肽，浓度为2μg/ml，使用PBS缓冲液稀释，体积为100μL。将96孔酶标板放在4℃过夜。

(12)用PBS缓冲液冲洗96孔酶标板3次，每次都要甩干酶标板上的液体。加入200μL2％BSA-PBS封闭溶液，37℃封闭2h。

(13)用PBS缓冲液冲洗96孔酶标板3次，每次都要甩干酶标板上的液体。每孔加入100μL单克隆噬菌体抗体，室温静置1h。

(14)用PBST缓冲液冲洗96孔酶标板3次，每次都要甩干酶标板上的液体。每孔加入100μL抗M13-HRP缀合物(购自北京义翘神州生物技术公司，将抗M13-HRP抗体稀释到2％BSA-PBS溶液中，稀释比例为1：10000)，室温静置1h。

(15)再次用PBST缓冲液冲洗96孔酶标板3次，每次静置2min，甩干酶标板上的液体。每孔加入100μL TMB底物显色液，避光静置5min，用50μL浓度为1mol/L的H₂SO₄终止反应，测量OD_450nm吸光值。

(16)实验随机挑选992个单克隆，得到了75个阳性克隆。图2A为单克隆噬菌体ELISA的代表性克隆的图，是其中32个单克隆噬菌体的ELISA结果。图2B为采用多个无关抗原作为对照的单克隆噬菌体ELISA检测阳性克隆与CXCR4的结合情况图。图2B结果表明，CXCR4亲和力成熟结合蛋白噬菌体克隆能够与CXCR4-Fc和CXCR4多肽特异性地结合。

(17)将阳性克隆送华大基因公司进行测序。在DNAMAN中对测序结果进行分析，排除相同的核苷酸序列，得到5条不同的序列，分别命名为aCX13C6、aCX16C1、aCX17D5、aCX20B2、aCX20E5，氨基酸序列如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示。

实施例7亲和力成熟结合蛋白的表达纯化

(1)亲和力成熟结合蛋白包涵体的表达

1)将BL21(DE3)感受态细胞和含有目的基因的质粒pET28a-sumo(目的基因为实施例6筛选得到的蛋白，将编码蛋白的基因序列通过HindIII和XhoI克隆入pET28a-sumo中，该重组质粒的制备由苏州金唯智公司进行合成)放在冰上解冻。吸取1μL pET28a-sumo质粒加入到含100μL BL21(DE3)感受态细胞的1.5mL EP管中，轻轻混匀，冰上放置30min。然后放在42℃恒温水浴锅中，热击2min，最后冰上放置2min。加入900μL LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养1h。12000g离心2min，吸除900μL上清，用剩下的100μL轻轻重悬沉淀，涂布在LB平板(含50μg/mL Kana+)，然后在37℃的培养箱培养12h。

2)选择一个平板上的菌落接种到5mL LB液体培养基(含50μg/mL Kana+)，37℃、220rpm振荡培养过夜。

3)将4ml菌液接种至400ml LB液体培养基(含50μg/mL Kana+)中，37℃、220rpm振荡培养2.5h，直到OD_600nm为0.6-1.0，取1mL菌液用于后续目的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳鉴定(未诱导的菌体蛋白样品)。菌液加入IPTG(工作浓度为0.5mM)进行诱导表达，30℃、220rpm诱导表达6h，取1mL菌液用于后续目的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳鉴定(诱导的菌体蛋白样品)。

4)菌液在高速冷冻离心机进行离心，4℃、5000g离心5min，保留菌体沉淀。

5)用25mL预冷的破菌缓冲液重悬菌体沉淀于50mL烧杯中，然后进行超声破碎。超声波破碎仪参数设置：功率40％，工作4s，停8s，工作时间为40min。超声破碎结束后，在高速冷冻离心机进行离心，4℃、15000g离心30min，取20μL上清用于后续目的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳鉴定(诱导后菌体破碎上清样品)，保留沉淀，此沉淀即包涵体。

6)用30mL包涵体清洗液A重悬包涵体沉淀，加入转子，4℃搅拌过夜，得到悬液。在高速冷冻离心机进行离心，4℃、15000g离心30min，保留沉淀，取20μL用于后续目的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳鉴定(诱导后菌体破碎沉淀样品)。

7)用30mL包涵体清洗液B重悬包涵体沉淀，4℃搅拌1.5h。在高速冷冻离心机进行离心，4℃、15000g离心30min，保留沉淀。

8)用变性缓冲液重悬沉淀，室温搅拌2.5h。在高速冷冻离心机进行离心，4℃、20000g离心30min，收集上清，即为包涵体溶解变性溶液。取20μL用于后续目的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳鉴定(诱导的菌体破碎后的沉淀变性液样品)。

(2)亲和力成熟结合蛋白的纯化

1)平衡柱子：取一根Ni-NTA His·Bind Resin纯化树脂，加入10mL变性缓冲液过柱。

2)上样：将包涵体溶解变性溶液过柱，目的蛋白吸附到柱子上，取20μL用于后续目的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳鉴定(过柱液样品)。

3)加入另外10mL变性缓冲液过柱，将柱子侧壁上残留样品洗净。

4)加入20mL洗杂缓冲液过柱，取20μL用于后续目的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳鉴定(洗杂液样品)。

5)加入10mL洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱，用1.5mL EP管收集，每管收集过柱液1mL，收集5管，另外每个EP管中取20μL用于后续目的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳鉴定(洗脱液样品)。

6)用Nanodrop 2000测量收集的洗脱液的蛋白浓度和纯度。

(3)亲和力成熟结合蛋白的复性

1)将收集的洗脱液加入到5kDa透析袋中，用橡皮筋扎紧透析袋两端，严防液体渗漏，透析袋内应留有一定量的空气，以免透析中透析袋胀裂。

2)将透析袋移置烧杯中，使整体浸没于蛋白复性液，4℃搅拌透析12h。更换复性液，继续透析12h。该蛋白复性液中的尿素浓度从8M-0M依次递减，在每个尿素浓度梯度复性液中透析过夜。

3)透析完毕后，将样品取出，检测蛋白浓度并放入-80℃冰箱保存。

(4)SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色

1)配制浓度为12％(w/v)的分离胶，将配制好的分离胶加入到灌胶模具距离顶部还有2-3cm左右的位置，然后加入无水乙醇压线，放置20min，等分离胶凝固。

2)倒掉无水乙醇后加入5％(w/v)的浓缩胶至顶部，插上梳子，静止30min，等浓缩胶凝固，拔掉梳子，准备上样。

3)将配制好的胶板放在电泳槽中，加入电泳液。

4)将上述亲和力成熟结合蛋白表达纯化步骤中收集到的蛋白样品加入5×的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，使缓冲液的终浓度为1×，100℃加热10min，样品制备完毕。

5)将制备好的样品5μL上样到电泳槽的胶板上，加入蛋白marker，80V跑完浓缩胶以后换120V跑完分离胶。

6)取出胶，加入考马斯亮蓝染色液染色10min，用清水换掉染色液，放在微波炉中用中火煮5min。

7)加入脱色液，放置在脱色摇床上脱色过夜，不定时换掉脱色液，直到看到清楚的目的条带，拍照分析。结果如图3所示：图3A为aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的电泳图，蛋白分子量大约为45kDa；图3B为aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的电泳图，蛋白分子量大约为45kDa；图3C为aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的电泳图，蛋白分子量大约为45kDa；图3D为aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的电泳图，蛋白分子量大约为45kDa；图3E为aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的电泳图，蛋白分子量大约为45kDa。

实施例8采用ELISA检测纯化的CXCR4亲和力成熟结合蛋白与抗原CXCR4多肽的结合

(1)包被抗原：实验使用NUNC 96孔酶标板，空白对照组为PBS，包被PBS缓冲液，体积为100μL。设置多个无关抗原(IFN、NGF、CD28、CD31、CSF1R、ICAM-1、EGFR-Fc、EpCAM-Fc和CXCR4-Fc，其中IFN、NGF、CD28、CD31、CSF1R、ICAM-1、EGFR-Fc和EpCAM-Fc购自北京义翘神州生物技术公司，CXCR4-Fc购自北京百普赛斯生物科技股份有限公司)作为特异性对照，浓度为2μg/ml，使用PBS缓冲液稀释，体积为100μL。实验组为CXCR4多肽，浓度为2μg/ml使用PBS缓冲液稀释，体积为100μL。

(3)用PBS缓冲液冲洗96孔酶标板3次，每次都要甩干酶标板上的液体。将100μL抗体(浓度为20μg/mL)加入到96孔酶标板孔中，室温静置1h。

(4)用PBST缓冲液冲洗96孔酶标板3次，每次都要甩干酶标板上的液体。将100μLanti-His-HRP(用2％w/v BSA-PBS溶液稀释，比列为1：5000)加入到96孔酶标板孔中，室温孵育1h。

(5)用PBST缓冲液冲洗96孔酶标板3次，每次静置2min，甩干酶标板上的液体。将100μL TMB底物显色液加入到96孔酶标板中，避光孵育10min，在96孔酶标板孔中加入1mol/L的H₂SO₄溶液终止反应，测量OD_450nm的吸光值。图4结果表明，与野生型结合蛋白aCX82相比，aCX13C6和aCX20E5与CXCR4-Fc具有较高的结合能力，aCX20E5与CXCR4多肽具有较高的结合能力。此外，5个亲和力成熟结合蛋白与无关抗原的结合并不明显，说明5个亲和力成熟结合蛋白能够特异性地与CXCR4结合。

实施例9获得阴性对照结合蛋白

本实验室前期实验通过噬菌体展示技术，采用人表皮生长因子受体2(Her2)和血管内皮生长因子(VEGF)合成多肽为抗原，采用以上方法筛选人源结合蛋白噬菌体文库，通过ELISA挑选2个不与对应抗原结合的克隆，分别获得阴性对照结合蛋白aHer2-13C1和aVE201，将其作为阴性对照。阴性对照结合蛋白aHer2-13C1和aVE201分别如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示氨基酸序列；编码aHer2-13C1和aVE201的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:35和SEQ ID NO:36所示。

实施例10采用MTT实验检测纯化后的CXCR4亲和力成熟结合蛋白对肿瘤细胞增殖的影响

(1)收集处于对数生长期的肿瘤细胞(人前列腺癌DU145细胞、人前列腺癌PC-3细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞)，调整细胞浓度为2.5×10⁴个/ml，接种到96孔细胞培养板，每孔5000个细胞。在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养过夜使细胞贴壁。

(2)然后吸走旧的培养基，加入含1％v/v FBS的DMEM培养基，饥饿培养6h。

(3)实验分组：5个CXCR4亲和力成熟结合蛋白(aCX13C6、aCX16C1、aCX17D5、aCX20B2和aCX20E5)、1个阳性对照结合蛋白(野生型结合蛋白aCX82)和2个阴性对照结合蛋白(aVE201和aHer2-13C1)。在不同的浓度(0、25、50、100μg/mL)下分别和SDF-1(工作浓度为100ng/ml，购自北京义翘神州科技有限公司)共同处理3种癌细胞，在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养72h。

(4)每孔加入30μL MTT溶液，在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中继续培养4h。

(5)将96孔板取出，吸出细胞培养液，每孔加入200μL DMSO，将96孔细胞培养板放在摇床上快速振荡10min，目的是使晶体溶解，最后测量OD570nm的吸光值。图5结果表明，对于DU145细胞，与野生型结合蛋白aCX82相比，在使用50μg/mL浓度时，aCX20E5能较有效地抑制肿瘤细胞的增殖。对于PC-3细胞，与aCX82相比，5个亲和力成熟结合蛋白具有类似的抑制肿瘤细胞增殖的作用。对于MDA-MB-231细胞，与aCX82相比，在使用50和100μg/mL浓度时，aCX20E5能较有效地抑制肿瘤细胞的增殖。

实施例11采用流式细胞分析仪和Annexin V/PI双染试剂盒检测纯化后的CXCR4亲和力成熟结合蛋白对肿瘤细胞凋亡的影响

(1)收集处于对数生长期的肿瘤细胞DU145、PC-3和MDA-MB-231，调整细胞浓度为2.5×10⁵个/ml，接种到6孔细胞培养板，每孔2.5×10⁵个细胞。在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养过夜使细胞贴壁。

(3)实验分组：无结合蛋白对照组、5个CXCR4亲和力成熟结合蛋白(aCX13C6、aCX16C1、aCX17D5、aCX20B2和aCX20E5)、1个阳性对照结合蛋白(野生型结合蛋白aCX82)和2个阴性对照结合蛋白(aVE201和aHer2-13C1)。在浓度为50μg/mL的条件下分别和SDF-1(工作浓度为100ng/ml，购自北京义翘神州科技有限公司)共同处理3种癌细胞，在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养48h。

(4)吸走旧的培养基，用PBS缓冲液清洗细胞，吸走PBS缓冲液，加胰酶消化细胞。加入10％v/v FBS的DMEM培养基基终止消化。轻轻吹打细胞，收集细胞悬液，1024g离心5min，保留沉淀。

(5)再次用PBS缓冲液清洗细胞，1024g离心5min，保留沉淀。连续清洗细胞2次。

(6)加入195μL 1×结合缓冲液轻轻重悬细胞，加5μL Annexin V-FITC，室温避光孵育15min。

(7)加入200μL 1×结合缓冲液轻轻重悬细胞，在小型高速离心机离心，4℃、1000g离心5min，保留沉淀。

(8)加入190μL 1×结合缓冲液轻轻重悬细胞，加10μL PI，轻轻混匀。

(9)使用流式细胞分析仪检测细胞凋亡情况。图6结果表明，对于DU145和MDA-MB-231细胞，与野生型结合蛋白aCX82相比，aCX13C6和aCX20E5具有较高的诱导凋亡能力。对于PC-3细胞，CX20E5具有较高的诱导凋亡能力。

实施例12采用Transwell迁移实验检测纯化后的CXCR4亲和力成熟结合蛋白对肿瘤细胞迁移的影响

(1)收集处于对数生长期的肿瘤细胞DU145、PC-3和MDA-MB-231，加入含1％v/vFBS的DMEM培养基，饥饿培养6h。将细胞消化、离心后用含1％v/v FBS的DMEM培养基重悬细胞。

(2)实验分组：5个CXCR4亲和力成熟结合蛋白(aCX13C6、aCX16C1、aCX17D5、aCX20B2和aCX20E5)、1个阳性对照结合蛋白(野生型结合蛋白aCX82)和2个阴性对照结合蛋白(aVE201和aHer2-13C1)。分别用不同的浓度(0、25、50、100μg/mL)和SDF-1(工作浓度为100ng/ml，购自北京义翘神州科技有限公司)共同处理的细胞悬液200μL(5×10⁴个细胞，含1％v/v FBS的DMEM培养基)，加入Transwell小室的上室。下室加入20％1％v/v FBS的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养24h。

(3)取出Transwell小室，分别吸出上室和下室中的细胞培养液，用棉签轻轻擦掉上室没有发生迁移的细胞。下室使用4％w/v多聚甲醛来固定细胞，体积为500μL，固定时间为10min。然后吸走4％多聚甲醛，使用0.1％w/v结晶紫染液对细胞进行染色，体积为500μL，时间为30min。使用超纯水清洗Transwell小室，每个小室清洗3遍，将小室置于显微镜下进行观察和拍照。每孔加入33％乙酸溶液进行洗脱，体积为100μL，放在摇床上快速振荡，最后测量OD_570nm的吸光值。图7结果表明，对于DU145细胞，与野生型结合蛋白aCX82相比，5个亲和力成熟结合蛋白具有类似的抑制肿瘤细胞迁移的作用。对于PC-3细胞，与aCX82相比，在使用50μg/mL浓度时，aCX13C6、aCX20B2和aCX20E5能较有效地抑制肿瘤细胞的迁移。对于MDA-MB-231细胞，与aCX82相比，在使用100μg/mL浓度时，aCX20E5能较有效地抑制肿瘤细胞的迁移。

实施例13采用Transwell侵袭实验检测纯化后的CXCR4亲和力成熟结合蛋白对肿瘤细胞侵袭的影响

方法步骤同实施例12中Transwell迁移实验，只是增加了铺Matrigel基质胶这一步。用Matrigel基质胶50μg/孔包被Transwell小室(8μm孔径，24孔板)的内表面，放入细胞培养箱中成胶12h。图8结果表明，5个亲和力成熟结合蛋白能够抑制DU145和MDA-MB-231细胞的侵袭，随着5个亲和力成熟结合蛋白浓度升高，癌细胞的侵袭能力能够逐步地降低。

实施例14CXCR4亲和力成熟结合蛋白对小鼠前列腺癌模型的作用

(1)根据CXCR4亲和力成熟结合蛋白的体外功能实验结果，选择构建小鼠DU145细胞前列腺癌模型，选取aCX13C6亲和力成熟结合蛋白和aCX20E5亲和力成熟结合蛋白进行动物实验。

(2)对DU145细胞进行传代培养，当细胞生长到对数期，胰酶消化并收集细胞，PBS洗涤细胞后，加入适量PBS将细胞密度调整为5×10⁷/mL。

(3)吸取100μL细胞悬液，以皮下注射方式将悬液注射于小鼠(4周龄雄性Balb/C裸鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司)腋下进行造瘤。小鼠饲养于SPF级动物实验室。

(4)每三天测量一次小鼠肿瘤体积，测量小鼠肿瘤的最长边(长)和最短边(宽)。根据公式肿瘤体积＝长×宽²×0.5。

(5)当36只小鼠肿瘤体积增长到平均100mm³左右，将其随机分为6组，每组6只。其中1组为空白对照组(PBS)，1组为阴性对照结合蛋白组(aVE201)，2组为阳性对照组(DDP和aCX82)，2组为实验亲和力成熟结合蛋白组(aCX13C6和aCX20E5)。使用胰岛素注射器，通过尾静脉注射给药。其中实验亲和力成熟结合蛋白组和阴性对照结合蛋白组每只小鼠给药量为10mg/kg，DDP组每只小鼠给药量为2mg/kg，空白对照组每只小鼠注射100μL PBS缓冲液。给药周期为30天，每3天给药一次并记录小鼠肿瘤体积和体重。

(6)完成实验后小鼠处死，剥取各组小鼠肿瘤，测量肿瘤重量并拍照，之后对肿瘤组织进行H&E染色和免疫组化分析。根据图9A肿瘤体积图，与野生型结合蛋白aCX82相比，在给药周期结束时(第30天)，aCX20E5具有较好地抑制体内肿瘤细胞生长的能力。根据图9B肿瘤大小照片图，aCX13C6和aCX20E5组的肿瘤体积稍微小于野生型结合蛋白aCX82组。根据图9C肿瘤重量图，与野生型结合蛋白aCX82相比，aCX13C6和aCX20E5具有较低的肿瘤重量。根据图9D的HE染色及免疫组化的结果图,aCX13C6和aCX20E5组没有发现明显的组织病理学异常。根据图9E免疫组化染色的积分光密度结果，与野生型结合蛋白aCX82相比，aCX20E5能够在体内较有效地抑制肿瘤细胞增殖(Ki67)，较有效地抑制肿瘤组织血管生成(CD31)。2个亲和力成熟结合蛋白对诱导肿瘤细胞凋亡(C-caspase-3)没有明显影响。

实施例中所用到的试剂的配置方法如下：

(1)LB固体培养基：蛋白胨2g、酵母粉1g、NaCl 2g、琼脂粉4g。

在电子天平量取以上试剂，溶解到200mL超纯水中，混匀后分装，121℃高温高压灭菌20min。等培养基的温度降到50℃左右时，添加相应的抗生素，氨苄青霉素工作浓度为100μg/ml，卡那霉素工作浓度为50μg/ml，轻轻混匀，倒平板。静置一段时间，等平板凝固后，将平板包好，放在4℃冰箱暂存。

(2)LB液体培养基：NaCl 1g、蛋白胨1g、酵母粉0.5g。

在电子天平量取以上试剂，溶解到100mL超纯水中，轻轻混匀后分装到试管中，121℃高温高压灭菌20min。

(3)TYE固体培养基：蛋白胨5g、酵母粉2.5g、NaCl 4g、琼脂粉6g。

在电子天平量取以上试剂，溶解到400mL超纯水中，轻轻混匀后分装，121℃高温高压灭菌20min。等培养基的温度降到50℃左右时，添加氨苄青霉素和终浓度为1％葡萄糖溶液，轻轻混匀，倒平板。静置一段时间，等平板凝固后，将平板包好，放在4℃冰箱暂存。

(4)2×TY培养基：蛋白胨8g、酵母粉5g、NaCl 2.5g。

在电子天平量取以上试剂，溶解到500mL超纯水中，轻轻混匀后分装，121℃高温高压灭菌20min。放在4℃冰箱暂存。

(5)PBS缓冲液：Na₂HPO₄·12H₂O 4.5g、NaCl 4g、KH₂PO₄ 0.12g、KCl 0.1g。

在电子天平量取以上试剂，溶解到300mL超纯水中，pH调到7.4，继续添加超纯水定容到500mL。121℃高温高压灭菌20min。放在4℃冰箱暂存。

(6)PBST：0.5mL Tween-20加入到500mL的PBS缓冲液中,轻轻混匀。121℃高温高压灭菌20min，放在4℃冰箱暂存。

(7)卡那霉素(储存浓度为50mg/mL)：在电子天平量取0.5g卡那霉素粉末，溶解在10mL的超纯水中，混匀溶解后，过滤除菌，放在-20℃冰箱暂存。

(8)氨苄青霉素(储存浓度为100mg/mL)：在电子天平量取0.5g氨苄青霉素粉末，溶解在5mL的超纯水中，混匀溶解后，过滤除菌，放在-20℃冰箱暂存。

(9)破菌缓冲液：NaCl 8.77g、Tris碱6.06g、0.5M EDTA 4ml、PMSF(100×)10ml。

在电子天平量取以上试剂，溶解到800mL超纯水，PH调到7.5，继续添加超纯水定容到1L。放在4℃冰箱暂存。

(10)包涵体清洗液A：NaCl 1.76g、Tris碱1.22g、Triton X-100 4mL、0.5M EDTA0.8mL。

在电子天平量取以上试剂，溶解到180mL超纯水，轻轻混匀后分装，加超纯水将溶液定容到200mL，放在4℃冰箱暂存。

(11)包涵体清洗液B：NaCl 1.76g、Tris碱1.22g、Triton X-100 4mL、PMSF(100×)2mL。

(12)包涵体变性缓冲液：尿素240.24g、NaCl 7.3g、Tris碱1.21g、PMSF(100×)5mL、2-巯基乙醇(2-Hydroxy-1-ethanethiol)0.345mL。

在电子天平量取以上试剂，溶解到300mL超纯水，PH调到7.5，继续添加超纯水定容到500mL。放在4℃冰箱暂存。

(13)洗杂缓冲液：在电子天平量取0.68g咪唑粉末，溶解到5ml包涵体变性缓冲液，混匀后，吸取200μL加入到19.8ml变性缓冲液，即洗杂缓冲液。

(14)洗脱缓冲液：在电子天平量取0.68g咪唑粉末，溶解到5ml包涵体变性缓冲液，混匀后，吸取1ml加入到9ml变性缓冲液，即洗脱缓冲液。

(15)1mol/L Tris-HCl：在电子天平量取0.1g Tris-base粉末，溶解到900mL超纯水，轻轻混匀后，PH调到8.8或6.8，添加超纯水将溶液定容到1L。放在4℃冰箱暂存。

(16)10％APS溶液：在电子天平量取2g APS粉末，溶解到20mL超纯水，轻轻混匀后分装。放在-20℃冰箱暂存。

(17)5×SDS-PAGE电泳缓冲液：甘氨酸94g、Tris碱30.2g、SDS 5g。

在电子天平量取以上试剂，溶解到900mL超纯水，轻轻混匀，加超纯水将溶液定容到1L，放在4℃冰箱暂存。

(18)考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝0.5g、异丙醇125mL、醋酸50mL。

在电子天平量取以上试剂，溶解到300mL超纯水，轻轻混匀，加超纯水将溶液定容到500mL，放在室温暂存。

(19)SDS-PAGE脱色液：醋酸50mL、乙醇25mL。

(20)5×蛋白上样缓冲液(loading buffer)：SDS 2.5g、溴酚蓝0.12g、甘油12.5mL、1mol/L Tris-HCl 6.25mL、β-巯基乙醇0.5mL。

在电子天平量取以上试剂，溶解到15mL超纯水，轻轻混匀，加超纯水将溶液定容到25mL，放在4℃冰箱暂存。β-巯基乙醇在使用前才加入。

(21)IPTG：在电子天平量取1.2g IPTG粉末，溶解到10mL无菌水中，混匀，过滤除菌，放在-20℃冰箱暂存。

(22)1mol/L H₂SO₄：将5.6ml的98％浓硫酸慢慢添加到94.4ml超纯水中，使用玻璃棒慢慢搅拌，待溶液冷却到室温，放在室温暂存。

(23)PMSF(100×)：在电子天平量取0.87g PMSF粉末，溶解到50mL异丙醇中，放在-20℃冰箱暂存。

(24)2％BSA-PBS溶液：在电子天平量取2g BSA粉末，溶解到100ml PBS缓冲液中，过滤除菌，放在4℃冰箱暂存。

(25)30％甘油：用量筒量取30ml丙三醇，加入70ml超纯水充分混匀，121℃高温高压灭菌20min，放在4℃冰箱暂存。

(26)PEG-NaCl：在电子天平量取100g PEG-6000和73g NaCl，溶解到500ml超纯水中，121℃高温高压灭菌20min，放在室温暂存。

(27)蛋白复性液：在电子天平量取8.383g NaCl、2.42g Tris碱、0.6g氧化型谷胱甘肽和0.8g还原型谷胱甘肽，将以上试剂溶解到400mL超纯水中，再加入一定量的尿素(8M/6M/4M/2M/1M/0.5M/0.25M/0M)，充分混匀后使用稀盐酸将溶液pH调整到7.5，加超纯水将溶液定容到1L，放在4℃冰箱暂存。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110> 暨南大学

<120> 与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白及应用

<160> 38

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<223> aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的氨基酸序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln His Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Glu Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Arg Val Gly Asp Trp Gly Pro Val Ser Gly Pro Gln Arg Thr Trp

100 105 110

Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<223> aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的氨基酸序列

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Cys Ser His Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Ala

<223> aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的氨基酸序列

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln His Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Glu Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Arg Val Gly Asp Trp Gly Pro Val Ser Gly Pro Gln Arg Thr Trp

100 105 110

Tyr Phe Asp Leu Trp Asp Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<223> aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的氨基酸序列

<400> 4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Thr Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser His Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Ala

<223> aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的氨基酸序列

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln His Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys Val

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Arg Arg Val Gly Asp Trp Gly Pro Val Ser Gly Pro Gln Arg Thr Trp

100 105 110

Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<223> aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的氨基酸序列

<400> 6

Asp Ile Val Met Thr Leu Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Cys Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

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Leu Gln Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Ala

<223> aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的氨基酸序列

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln His Trp Gly Ala Gly Val Leu Lys Pro Ser Glu

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100 105 110

Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<223> aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的氨基酸序列

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser His Arg Ala Ser Gly Val Pro

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65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

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100 105 110

Ala

<223> aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的氨基酸序列

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln His Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

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Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

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Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

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Arg Arg Val Gly Asn Trp Gly Pro Val Ser Gly Pro Gln Arg Thr Trp

100 105 110

Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<223> aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的氨基酸序列

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser His Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Ala

<223> 编码aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的核苷酸序列

<400> 11

caggtgcagc tacagcattg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttacgagt ggagctggat ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aagggtaggg 300

gactggggtc ccgtgtctgg cccgcaacgg acttggtact tcgatctctg gggccgtggc 360

accctggtca ctgtctcctc a 381

<223> 编码aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的核苷酸序列

<400> 12

gatattgtga tgacacagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttgcattgg 120

tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgtgttc tcatcgggcc 180

tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgttgggatt tattactgca tgcaagctct acaacctccg 300

ctcactttcg gcggagggac caagctggag atcaaagca 339

<223> 编码aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的核苷酸序列

<400> 13

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<223> 编码aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的核苷酸序列

<400> 14

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<223> 编码aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的核苷酸序列

<400> 15

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<223> 编码aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的核苷酸序列

<400> 16

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ctcactttcg gcggagggac caagctggag atcaaagca 339

<223> 编码aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的核苷酸序列

<400> 17

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accctggtca ctgtctcctc a 381

<223> 编码aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的核苷酸序列

<400> 18

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<223> 编码aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的核苷酸序列

<400> 19

caggtgcagc tacagcattg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagag cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120

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ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

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<223> 编码aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的核苷酸序列

<400> 20

gatattgtga tgacacagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

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tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc tcatcgggcc 180

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<223> aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln His Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

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<223> aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列

<400> 22

Gln Val Gln Leu Gln His Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Glu Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

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Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Tyr Phe Asp Leu Trp Asp Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Asn Val Tyr Tyr Thr Lys Leu Leu Ala Arg

130 135 140

Gln Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Pro Val Thr Pro

145 150 155 160

Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His

165 170 175

Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

180 185 190

Ser Thr Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser His Arg Ala Ser Gly Val

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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

210 215 220

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

225 230 235 240

Ala Leu Gln Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

245 250 255

Lys Ala

<223> aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln His Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

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Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

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Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys Val

85 90 95

Arg Arg Val Gly Asp Trp Gly Pro Val Ser Gly Pro Gln Arg Thr Trp

100 105 110

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115 120 125

Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Asn Val Tyr Tyr Thr Lys Leu Leu Ala Arg

130 135 140

Gln Asp Ile Val Met Thr Leu Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro

145 150 155 160

Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Cys Gln Ser Leu Leu His

165 170 175

Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

180 185 190

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser His Arg Ala Ser Gly Val

195 200 205

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

210 215 220

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

225 230 235 240

Ala Leu Gln Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

245 250 255

Lys Ala

<223> aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列

<400> 24

Gln Val Gln Leu Gln His Trp Gly Ala Gly Val Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Glu Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Arg Val Gly Asp Trp Gly Pro Val Ser Gly Pro Gln Arg Thr Trp

100 105 110

Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Asn Val Tyr Tyr Thr Lys Leu Leu Ala Arg

130 135 140

Gln Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro

145 150 155 160

Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His

165 170 175

Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

180 185 190

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser His Arg Ala Ser Gly Val

195 200 205

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

210 215 220

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

225 230 235 240

Ala Leu Gln Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

245 250 255

Lys Ala

<223> aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列

<400> 25

Gln Val Gln Leu Gln His Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Arg Val Gly Asn Trp Gly Pro Val Ser Gly Pro Gln Arg Thr Trp

100 105 110

Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Asn Val Tyr Tyr Thr Lys Leu Leu Ala Arg

130 135 140

Gln Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro

145 150 155 160

Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His

165 170 175

Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

180 185 190

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser His Arg Ala Ser Gly Val

195 200 205

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

210 215 220

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

225 230 235 240

Ala Leu Gln Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

245 250 255

Lys Ala

<223> aCX82结合蛋白的氨基酸序列

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln His Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Arg Val Gly Asp Trp Gly Pro Val Ser Gly Pro Gln Arg Thr Trp

100 105 110

Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Asn Val Tyr Tyr Thr Lys Leu Leu Ala Arg

130 135 140

Gln Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro

145 150 155 160

Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His

165 170 175

Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

180 185 190

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser His Arg Ala Ser Gly Val

195 200 205

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

210 215 220

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

225 230 235 240

Ala Leu Gln Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

245 250 255

Lys Ala

<223> aHER2-13C1阴性对照结合蛋白的氨基酸序列

<400> 27

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Val Ser

20 25 30

Ser Glu Asn Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Gly Ile Leu Ala Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Phe Thr Ser Gly Gln Gly Ser Leu Arg Ser Asp Pro

100 105 110

Ile Arg Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala

115 120 125

Ala

<223> aVE201阴性对照结合蛋白的氨基酸序列

<400> 28

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ser Val Ser

20 25 30

Asn Glu Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Ser Ile Thr Asp Gln Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Gln Arg Arg Arg Gln Met His Ser Tyr Lys Val

100 105 110

Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

115 120 125

<223> 编码aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列

<400> 29

caggtgcagc tacagcattg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttacgagt ggagctggat ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aagggtaggg 300

gactggggtc ccgtgtctgg cccgcaacgg acttggtact tcgatctctg gggccgtggc 360

accctggtca ctgtctcctc agcggccgca ataacatcgt ataatgtgta ctatacgaag 420

ttattggcgc gccaggatat tgtgatgaca cagtctccac tctccctgcc cgtcacccct 480

ggagagccgg cctccatctc ctgcaggtct agtcagagcc tcctgcatag taatggatac 540

aactatttgc attggtacct gcagaagcca gggcagtctc cacagctcct gatctatttg 600

tgttctcatc gggcctccgg ggtccctgac aggttcagtg gcagtggatc aggcacagat 660

tttacactga aaatcagcag agtggaggct gaggatgttg ggatttatta ctgcatgcaa 720

gctctacaac ctccgctcac tttcggcgga gggaccaagc tggagatcaa agca 774

<223> 编码aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列

<400> 30

caggtgcagc tacagcattg gggcgcagga ctgttgaagc ctgaggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aagggtaggg 300

gactggggtc ccgtgtctgg cccgcaacgg acttggtact tcgatctctg ggaccgtggc 360

accctggtca ctgtctcctc agcggccgca ataacttcgt ataatgtgta ctatacgaag 420

ttattggcgc gccaggatat tgtgatgaca cagtctccag tctccctgcc cgtcacccct 480

ggagagccgg cctccatctc ctgcaggtct agtcagagcc tcctgcatag taatggatac 540

aactatttgc attggtacct gcagaagcca gggcagtcta cacagctcct gatctatttg 600

ggttctcatc gggcctccgg ggtccctgac aggttcagtg gcagtggatc aggcacagat 660

tttacactga aaatcagcag agtggaggct gaggatgttg ggatttatta ctgcatgcaa 720

gctctacaac ctccgctcac tttcggcgga gggaccaagc tggagatcaa agca 774

<223> 编码aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列

<400> 31

caggtgcagc tacagcattg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatg actgtgtgag aagggtaggg 300

gactggggtc ccgtgtctgg cccgcaacgg acttggtact tcgatctctg gggccgtggc 360

accctggtca ctgtctcctc agcggccgca ataacttcgt ataatgtgta ctatacgaag 420

ttattggcgc gccaggatat tgtgatgaca ctgtctccac tctccctgcc cgtcacccct 480

ggagagccgg cctccatctc ctgcaggtct tgtcagagcc tcctgcatag taatggatac 540

aactatttgc attggtacct gcagaagcca gggcagtctc cacagctcct gatctatttg 600

ggttctcatc gggcctccgg ggtccctgac aggttcagtg gcagtggatc aggcacagat 660

tttacactga aaatcagcag agtggaggct gaggatgttg ggatttatta ctgcatgcaa 720

gctctacaac ctccgctcac tttcggcgga gggaccaagc tggagatcaa agca 774

<223> 编码aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列

<400> 32

caggtgcagc tacagcattg gggcgcagga gtgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttacgagt ggagctggat ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac cgactacaac 180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aagggtaggg 300

gactggggtc ccgtgtctgg cccgcaacgg acttggtact tcgatctctg gggccgtggc 360

accctggtca ctgtctcctc agcggccgca ataacttcgt ataatgtgta ctatacgaag 420

ttattggcgc gccaggatat tgtgatgaca cagtctccac tctccctgcc cgtcacccct 480

ggagagccgg cctccatctc ctgcaggtct agtcagagcc tcctgcatag taatggatac 540

aactatttgc attggtacct gcagaagcca gggcagtctc cacagctcct gatctatttg 600

ggttctcatc gggcctccgg ggtccctgac aggttcagtg gcagtggatc aggcacagat 660

tttacactga aaatcagcag agtggaggct gaggatgttg ggatttatta ctgcatgcaa 720

gctctacaac ctccgctcac tttcggcgga gggaccaagc tggagatcaa agca 774

<223> 编码aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列

<400> 33

caggtgcagc tacagcattg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagag cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aagggtaggg 300

aactggggtc ccgtgtctgg cccgcaacgg acttggtact tcgatctctg gggccgtggc 360

accctggtca ctgtctcctc agcggccgca ataacttcgt ataatgtgta ctatacgaag 420

ttattggcgc gccaggatat tgtgatgaca cagtctccac tctccctgcc cgtcacccct 480

ggagagccgg cctccatctc ctgcaggtct agtcagagcc tcctgcatag taatggatac 540

aactatttgc attggtacct gcagaagcca gggcagtctc cacagctcct gatctatttg 600

ggttctcatc gggcctccgg ggtccctgac aggttcagtg gcagtggatc aggcacagat 660

tttacactga aaatcagcag agtggaggct gaggatgttg ggatttatta ctgcatgcaa 720

gctctacaac ctccgctcac tttcggcgga gggaccaagc tggagatcaa agca 774

<223> 编码aCX82结合蛋白的核苷酸序列

<400> 34

caggtgcagc tacagcattg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aagggtaggg 300

gactggggtc ccgtgtctgg cccgcaacgg acttggtact tcgatctctg gggccgtggc 360

accctggtca ctgtctcctc agcggccgca ataacttcgt ataatgtgta ctatacgaag 420

ttattggcgc gccaggatat tgtgatgaca cagtctccac tctccctgcc cgtcacccct 480

ggagagccgg cctccatctc ctgcaggtct agtcagagcc tcctgcatag taatggatac 540

aactatttgc attggtacct gcagaagcca gggcagtctc cacagctcct gatctatttg 600

ggttctcatc gggcctccgg ggtccctgac aggttcagtg gcagtggatc aggcacagat 660

tttacactga aaatcagcag agtggaggct gaggatgttg ggatttatta ctgcatgcaa 720

gctctacaac ctccgctcac tttcggcgga gggaccaagc tggagatcaa agca 774

<223> 编码aHER2-13C1阴性对照结合蛋白的核苷酸序列

<400> 35

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggatatagc gttagctctg agaatatggg ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaggcattt tggcgggaga cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgaga 300

tttacgtcgg gtcaggggtc gttgcggtcc gaccccatcc ggtcttgggg tcagggaacc 360

ctggtcaccg tctcgagcgc ggccgca 387

<223> 编码aVE201阴性对照结合蛋白的核苷酸序列

<400> 36

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggagttagc gttagcaatg aggctatggg ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaagcatta ctgaccaaag cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgaga 300

gggcagcgtc gtaggcagat gcattcgtac aaggtcagct cttggggtca gggaaccctg 360

gtcaccgtct cgagcgcggc cgca 384

<223> Error-F2正向引物的核苷酸序列

<400> 37

actggcccag gcggcccaag cttgccaggt gcagctacag c 41

<223> Error-R2反向引物的核苷酸序列

<400> 38

actggccggc ctggccctcg agtttgatct ccagcttggt ccctcc 46

Claims

1.一种与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白，其特征在于：是aCX20E5亲和力成熟结合蛋白；或是aCX16C1亲和力成熟结合蛋白、aCX17D5亲和力成熟结合蛋白、aCX20B2亲和力成熟结合蛋白和aCX13C6亲和力成熟结合蛋白中的至少一种与aCX20E5亲和力成熟结合蛋白组合形成的结合蛋白；

2.根据权利要求1所述的与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白，其特征在于：

所述的aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；

所述的aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；

所述的aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；

所述的aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；

3.根据权利要求1所述的与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白，其特征在于：

编码所述的aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；

编码所述的aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；

编码所述的aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；

编码所述的aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；

编码所述的aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；

编码所述的aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；

编码所述的aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；

编码所述的aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；

编码所述的aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；

编码所述的aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。

4.编码权利要求2所述的与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列，其特征在于：所述的核苷酸序列是编码所述的aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列；或是编码所述的aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列、编码所述的aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列、编码所述的aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列和编码所述的aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列中的至少一种与编码所述的aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列组合形成的核苷酸序列；

编码所述的aCX13C6亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示；

编码所述的aCX16C1亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示；

编码所述的aCX17D5亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示；

编码所述的aCX20B2亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示；

编码所述的aCX20E5亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示。

5.权利要求2所述的与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白的制备方法，包括如下步骤：通过基因合成编码所述的与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列，将其克隆至表达载体，再将重组后的表达载体转入宿主细胞进行包涵体表达、纯化，得到所述的与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白；或是通过蛋白合成的方法，得到所述的与CXCR4结合的亲和力成熟结合蛋白。

6.权利要求1～3任一项所述的CXCR4亲和力成熟结合蛋白在制备治疗CXCR4高表达为特征的疾病的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的CXCR4亲和力成熟结合蛋白在制备治疗CXCR4高表达为特征的疾病的药物中的应用，其特征在于：所述的CXCR4高表达为特征疾病为自身免疫病和癌症。

8.根据权利要求7所述的CXCR4亲和力成熟结合蛋白在制备治疗CXCR4高表达为特征的疾病的药物中的应用，其特征在于：所述的癌症为CXCR4高表达肿瘤。

9.根据权利要求8所述的CXCR4亲和力成熟结合蛋白在制备治疗CXCR4高表达为特征的疾病的药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤包括胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、食管癌、鼻咽癌，头颈癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌、卵巢瘤、宫颈癌、子宫癌、肝癌、脾脏癌、肾脏癌和脑肿瘤。