CN102209730A - 抗cxcr4抗体及其用于治疗癌症的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及能够结合CXCR4以及还诱导CXCR4同二聚体和/或异二聚体构象变化的新的分离的抗体、或其衍生化合物或功能片段。更特别地,本发明涉及对CXCR4蛋白有特异性的414H5和515H7抗体,及其用于治疗癌症的用途。本发明还涵盖由这样的抗体组成的药物组合物和选择这样的抗体的方法。
Description
技术领域
本发明涉及能够特异性结合趋化因子受体(CXCR)的新抗体,特别是鼠的、嵌合的和人源化的单克隆抗体,以及编码这样的抗体的氨基酸序列和核酸序列。根据一个方面,本发明涉及能够特异性结合CXCR4和具有强抗肿瘤活性的新抗体、衍生化合物或功能片段。本发明还包括这样的抗体作为用于预防和/或治疗性治疗癌症的药物、以及在涉及癌症诊断的方法或试剂盒中的用途。最后,本发明包括包含这样的抗体与其它抗癌化合物比如抗体、毒素、细胞毒素/细胞增殖抑制剂的联合或结合的组合物,及其用于预防和/或治疗某些癌症的用途。
背景技术
趋化因子是特别地在免疫反应期间,控制白细胞沿着配体的化学梯度(称为趋化因子梯度)迁移的小的分泌肽(ZlotnickA.等人,2000)。基于其NH2-末端半胱氨酸残基的位置,将它们分成两个主要的亚家族CC和CXC,其结合G蛋白偶联受体,该受体的两个主要的亚家族称为CCR和CXCR。迄今,已经发现超过50个人类趋化因子和18个趋化因子受体。
许多癌症具有复杂的趋化因子网状,其影响肿瘤的免疫细胞浸润以及肿瘤细胞生长、存活、迁移和血管生成。免疫细胞、内皮细胞和肿瘤细胞自身表达趋化因子受体,可以响应趋化因子梯度。人类癌症活组织检查样品和小鼠癌症模型的研究表明癌细胞趋化因子受体的表达与转移能力的增加有关。来自不同癌症类型的恶性细胞具有趋化因子受体表达的不同特征,但是趋化因子受体4(CXCR4)是最常发现的。来自至少23个不同类型的上皮起源、间充质起源和造血起源的人类癌症的细胞表达CXCR4受体(Balkwill F.等人,2004)。
趋化因子受体4(也称为融合素、CD184、LESTR或HUMSTR)作为包含352个或360个氨基酸的两种同工型存在。残基Asn11是糖基化的,残基Tyr21是通过添加硫酸根修饰的,Cys 109和186使用受体细胞外部分上的二硫桥结合(Juarez J.等人,2004)。
该受体由不同类型的正常组织、天然的、非记忆T细胞、调节性T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、初级单核细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、CD34+造血干细胞表达,且以低水平表达在心脏、结肠、肝、肾和脑中。CXCR4在白细胞转运(trafficking)、B细胞淋巴细胞生成和髓细胞生成中起关键作用。
CXCR4受体在大量癌症中过表达,所述癌症包括但不限于结肠癌(Ottaiano A.等人,2004)、乳腺癌(Kato M.等人,2003)、前列腺癌(Sun Y.X.等人,2003)、肺癌[小细胞癌和非小细胞癌(Phillips R.J.等人,2003)]、卵巢癌(Scotton C.J.等人,2002)、胰腺(Koshiba T.等人,2000)、肾癌、脑癌(Barbero S等人,2002)、恶性胶质瘤和淋巴瘤。
迄今描述的CXCR4受体的唯一配体是基质细胞衍生的因子1(SDF-1)或CXCL12。SDF-1在淋巴结、骨髓、肝、肺中大量分泌,肾、脑和皮肤分泌的较少。CXCR4也被拮抗趋化因子识别,该拮抗趋化因子是III型人疱疹病毒编码的病毒巨噬细胞炎症蛋白II(vMIP-II)。
CXCR4/SDF-1轴在癌症中起关键作用,直接参与迁移、侵入,导致转移。实际上,癌细胞表达CXCR4受体,它们迁移并进入体循环。然后,癌细胞被滞留(arrested)在产生高水平SDF-1的器官的血管床中,其中SDF-1增殖、诱导血管生成和形成转移性肿瘤(Murphy PM.,2001)。该轴也通过活化细胞外信号调节的激酶(ERK)途径(Barbero S.等人,2003)和血管生成(Romagnani P.,2004)参与细胞增殖。实际上,CXCR4受体及其配体SDF-1通过刺激VEGF-A表达显然地促进了血管生成,所述VEGF-A表达转而增加了CXCR4/SDF-1的表达(Bachelder R.E.等人,2002)。还已知与肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)聚集在肿瘤的低氧区域,受刺激会与肿瘤细胞合作,促进血管生成。据观察缺氧选择性地上调包括TAM的各种细胞类型中CXCR4的表达(Mantovani A.等人,2004)。最近证实CXCR4/SDF-1轴调节CXCR4+造血干细胞/祖细胞(HSC)的转运/回位(homing),可在新生血管形成中起作用。证据显示除了HSC之外,功能性CXCR4也在来自其它组织(组织定向干细胞=TCSCs)的干细胞上表达,因此,SDF-1可在器官/组织再生所需的化学引诱CXCR4+TCSC中起关键作用,但是这些TCSC也可以是癌症发展的细胞起源(癌症干细胞理论)。对于人类白血病,和最近对于几种实体肿瘤,比如脑肿瘤和乳腺肿瘤,证实了癌症的干细胞起源。存在几个可以从正常CXCR4+组织/器官特异性干细胞衍生的CXCR4+的肿瘤实例,比如白血病、脑肿瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、肝胚细胞瘤、卵巢癌和宫颈癌(Kucia M.等人,2005)。
使用针对CXCR4受体的单克隆抗体在体内证实了通过干扰CXCR4受体可以靶向癌症转移(MullerA.等人,2001)。简而言之,已表明针对CXCR4受体(Mab 173R & D Systems)的单克隆抗体显著地减少了SCID小鼠中常位乳腺癌模型(MDA-MB231)中淋巴结转移的数量。另一个研究(Phillips R.J等人,2003)也显示SDF-1/CXCR4轴在使用抗SDF-1多克隆抗体的常位肺癌模型(A549)的转移中起决定性作用,但是在该研究中,其对于肿瘤生长和血管生成都没有作用。几个其它的研究也描述了使用CXCR4的siRNA双链(Liang Z.等人,2005)生物稳定的CXCR4肽拮抗剂(Tamamura H.等人,2003)对体内转移的抑制,或使用CXCR4的小分子拮抗剂如AMD 3100(Rubin J.B.等人,2003;De Falco V.等人,2007)或Mab(专利WO2004/059285 A2)对体内肿瘤生长的抑制。因此,CXCR4是证实的用于癌症的治疗靶点。
趋化因子受体2(CXCR2)是另一种趋化因子受体,也被描述为肿瘤学中感兴趣的靶点。实际上,CXCR2在几种肿瘤细胞类型中传递自分泌细胞生长信号,也可以通过促进血管生成间接地影响肿瘤生长(Tanaka T.等人2005)。
CXCR2趋化因子受体包含360个氨基酸。其主要在内皮细胞中表达,尤其是在新生血管形成期间。几种趋化因子结合CXCR2受体:CXCL5、-6、-7、IL-8、GRO-α、-β和γ,其属于ERL+促血管生成趋化因子。所述CXCR2受体与CXCR4受体共享序列同源性:37%的序列同一性和48%的序列同源性。CXCR2/配体轴参与几种肿瘤生长机制,比如转移(Singh RK.等人,1994)、细胞增殖(Owen J.D.等人,1997)和ERL+趋化因子介导的血管生成(Strieter R.M.等人,2004;Romagnani等人,2004)。最后,与肿瘤相关的巨噬细胞和嗜中性粒细胞是炎症诱导的肿瘤生长的关键元素,趋化因子比如CXCL5、IL-8和GRO-α启动嗜中性粒细胞的募集。
二聚化作为调节G蛋白偶联受体功能的常见机制出现,所述G蛋白偶联受体是趋化因子受体(Wang J.和Norcross M.2008)。已经表明响应趋化因子结合的同源二聚化和异源二聚化是通过许多趋化因子受体的信号传导的启动和改变所需要的。不断有证据支持所述受体二聚体或寡聚体可能是趋化因子受体的基本功能单元的概念。在没有配体的情况下,发现了趋化因子受体二聚体,并且趋化因子诱导受体二聚体的构象变化。已知CXCR4与例如δ阿片类受体(DOR)(Hereld D.,2008)或CCR2(Percherancier Y.等人,2005)形成同二聚体,也形成异二聚体。在后一个实例中,来源于CXCR4的跨膜结构域的肽通过阻断配体诱导的所述二聚体的构象转换而抑制活化(Percherancier Y.等人,2005)。另一个研究表明CXCR4-TM4肽(CXCR4的跨膜区的合成肽)降低了CXCR4同二聚体的原体之间的能量转移,并且抑制了恶性细胞中SDF-1诱导的迁移和肌动蛋白聚合(Wang J.等人,2006)。最近,也描述了CXCR7与CXCR4形成功能性异二聚体,并且增强了SDF-1诱导的信号传导(Sierro F.等人,2007)。组成型异二聚体的其它实例包括显示CXCR1和CXCR2相互作用以及形成各自同二聚体的研究。对于它们中任一个与另外的GPCR(α(1A)肾上腺素受体)都没有记录到相互作用,表明CXCR1和CXCR2相互作用的特异性(Wilson S.等人,2005)。
如前所述,CXCR4和CXCR2受体是令人感兴趣的肿瘤靶点。干扰那些受体将通过减少肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤细胞迁移和侵入、肿瘤对嗜中性粒细胞和巨噬细胞的募集和通过抑制CXCR4癌干细胞,以非常有效的方式抑制肿瘤生长和转移。
本发明的一个发明方面是产生诱导CXCR4二聚体构象变化的小鼠单克隆抗体。本发明包括能够结合和诱导CXCR4同二聚体和CXCR4/CXCR2异二聚体构象变化的CXCR4 Mab 414H5(或其片段),其在小鼠异种移植物和存活模型中都具有强抗肿瘤活性。本发明还包括能够结合和诱导CXCR4同二聚体和CXCR4/CXCR2异二聚体构象变化的CXCR4 Mab 515H7(或其片段),其具有强抗肿瘤活性。抗CXCR4 414H5 Mab抑制MDA-MB-231异种移植物模型中的肿瘤生长,并且增加了U937模型中小鼠存活。它们诱导CXCR4同二聚体和CXCR4/CXCR2异二聚体的构象变化。考虑到这两种趋化因子受体在癌症中的重要作用,这一新性质将是癌症治疗应用所感兴趣的。
已经发现靶向受体的同二聚体和异二聚体增强了Mab的治疗效果。实际上,已经证实例如靶向IGF-1R和胰岛素/IGF-1杂化受体的Mab(h7C10)对于抑制体内肿瘤生长比仅仅靶向IGF-1R的Mab更有效(Pandini G,2007)。
而且,抗CXCR4 Mabs 414H5和515H7是CXCR4的沉默拮抗剂(silent antagonists),在体外测定中,其不会改变基础信号,但是在不同测定(GTPγS结合、cAMP释放)中其抑制SDF-1诱导的信号传导,并且也能够在体外抑制SDF-1诱导的肿瘤细胞增殖和迁移。
充当部分激动剂或反向激动剂的分子在不存在配体的情况下显示出内在活性。这些类型的分子甚至在不存在配体的情况下,分别稳定高亲和力或低亲和力的GPCR状态,从而活化或抑制下游信号传导级联(Galandin等人,2007;Kenakin,2004)。
在414H5和515H7Mab的情况下,这些分子表现为沉默拮抗剂,在不存在SDF-1的情况下对于CXCR4受体没有任何内在活性。与部分或反向激动剂相比,该药理学特征很可能与不利的副作用较少有关,如已经对于阿片类受体配体观察到的(Bosier和Hermans,2007)。实际上,414H5和515H7 Mab的功能活性完全取决于SDF-1的存在,在其中血流不表达、分泌或提供SDF-1配体的组织和器官中,没有观察到CXCR4受体活性的调节。因此,与具有阳性或阴性功效的其它CXCR4受体配体相比,414H5和515H7 Mab可能毒性更小。另外,沉默拮抗剂是药理学空间(pharmacological space)中的少数种类(Wurch等人,1999,Kenakin,2004)。
发明内容
令人惊奇地,本发明人首次设法产生了能够结合CXCR4,还能够诱导CXCR4同二聚体和/或异二聚体构象变化的抗体。更特别地,本发明人的抗体能够诱导CXCR4同二聚体和CXCR4/CXCR2异二聚体的构象变化。
在下文说明书中,复数表述“CXCR4二聚体”必须理解为涵盖CXCR4同二聚体和CXCR4/CXCR2异二聚体。
在此必须提及,在现有技术中从来没有描述过这样的抗体。而且,必须提及从来没有描述过CXCR4/CXCR2异二聚体的存在。
本发明的一部分是发现了CXCR4和CXCR2形成的异二聚体的存在。
因此,在一个特别的方面,本发明涉及一种分离的复合物,其包含CXCR4/CXCR2异二聚体或由其组成。
优选地,所述CXCR4/CXCR2异二聚体复合物的CXCR4复合部分是选自下述的两个人类CXCR4同工型之一:
-趋化因子(C-X-C基序)受体4同工型b[人类(Homo sapiens)],其具有如在Genbank登录号NP_003458 SEQ ID No.29下描述的序列:
MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGN
GLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLC
KAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPA
LLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCI
IISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENT
VHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRG
GHSSVSTESESSSFHSS;
-趋化因子(C-X-C基序)受体4同工型a[人类],其具有如在Genbank登录号NP_001008540 SEQ ID No.30下描述的序列:
MSIPLPLLQIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGI
VGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGN
FLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVW
IPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSC
YCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFE
NTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGK
RGGHSSVSTESESSSFHSS;
-替换性的转录剪接变体或其天然变体,其与具有SEQ ID No.29或30的这些b或a同工型之一具有至少95%的同一性;和
-其片段,该片段能够被其天然配体基质细胞衍生的因子1(SDF-1)特异性识别,并且优选地具有至少100、150和200个氨基酸长度。
优选地,所述CXCR4/CXCR2异二聚体复合物的CXCR2复合部分选自:
-白细胞介素8受体β[人类],其具有如在Genbank登录号NP_001548SEQ ID No.31下描述的序列:
MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIY
ALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVN
GWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFIC
LSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFI
VPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADT
LMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIH
GLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL;
-替换性的转录剪接变体或其天然变体,其与具有SEQ ID No.31的白细胞介素8受体β具有至少95%的同一性;和
-其片段,该片段能够被IL-8特异性识别,并且优选地具有至少100、150和200个氨基酸长度。
在这一特别的方面,本发明还包括编码包含所述CXCR4/CXCR2异二聚体复合物的多肽的分离的RNA或DNA。
本发明进一步包括编码所述CXCR4/CXCR2异二聚体复合物的核构建体,优选表达载体,比如质粒。
本发明进一步包括包含至少一种编码所述CXCR4/CXCR2异二聚体复合物的部分CXCR4的核构建体,优选表达载体,比如质粒,和编码所述CXCR4/CXCR2异二聚体复合物的部分CXCR2的第二构建体,优选表达载体,比如质粒。
在这一方面,本发明进一步包括表达所述CXCR4/CXCR2异二聚体复合物的重组宿主细胞的制备方法,其中该方法包括转化所述宿主细胞的步骤:
a)采用编码所述CXCR4/CXCR2异二聚体复合物的核构建体,优选表达载体,比如质粒;或
b)采用至少一种编码所述CXCR4/CXCR2异二聚体复合物的部分CXCR4的核构建体,优选表达载体,比如质粒,和编码所述CXCR4/CXCR2异二聚体复合物的部分CXCR2的第二构建体,优选表达载体,比如质粒。
在一个优选的实施方式中,所述宿主细胞是真核细胞,比如哺乳动物细胞。
在一个优选的实施方式中,编码所述CXCR4/CXCR2异二聚体复合物的核构建体还编码结合(特别地通过共价偶联)CXCR4序列的第一标记,比如luc标记,和结合(特别地通过共价偶联)CXCR2序列的第二标记,比如GFP标记(即,用于BRET分析)。
本发明还包括一种选择具有抗癌活性或可用于制备用于治疗癌症的组合物的化合物的方法,其特征在于所述方法包括步骤:
a)用待试验的化合物接触本发明的重组宿主细胞,该细胞表达所述CXCR4/CXCR2异二聚体复合物;和
b)确定该化合物是否能够调节,优选地抑制重组宿主细胞中该CXCR4/CXCR2异二聚体复合物的活性。
在第一个方面,本发明的一个主题是产生和选择根据本发明的抗体的方法。
更特别地,本发明涉及一种选择能够抑制CXCR4的配体依赖性和配体非依赖性活化的抗CXCR4抗体,或其功能片段或衍生物之一的方法,所述方法包括下列步骤:
i)筛选产生的抗体,并且选择能够特异性结合CXCR4和调节CXCR4活化的抗体;
ii)测试步骤i)中的所选抗体,并且选择能够诱导CXCR4同二聚体构象变化的抗体,然后
iii)测试步骤ii)中的所选抗体,并且选择能够诱导CXCR4/CXCR2异二聚体构象变化的抗体。
表述“调节”必须理解为提高或抑制。优选地,本发明的所选抗体必须抑制CXCR4活化。
如前面解释的,诱导CXCR4二聚体的构象变化是本发明的一个重要方面,因为这样的抗体将为更大群体的患者提供真正的好处。
抗体的产生可以由本领域技术人员通过任何已知方法来实现,所述方法比如例如用来自免疫的小鼠或与所选骨髓瘤细胞相容的其它物种(species)的脾细胞融合骨髓瘤细胞[Kohler和Milstein,1975,Nature,256:495-497]。所述免疫的动物可以包括转基因小鼠,其具有人类免疫球蛋白基因座,然后直接产生人类抗体。另一个可能的实施方式可以包括使用噬菌体展示技术筛选文库。
筛选步骤i)可以由本领域技术人员通过任何已知方法或过程来实现。作为非限制性的实例,可以提及ELISA、BIAcore、免疫组织化学、FACS分析和功能性筛选。一个优选的过程包括通过FACS分析CXCR4转染子和至少一个肿瘤细胞以确保产生的抗体也能够识别肿瘤细胞上的天然受体的筛选。该过程将更准确地描述在下列实施例中。
表述“调节CXCR4活化”旨在调节至少一个在如下实施例4、5、7和13中描述的活性:
优选地调节:
-特别地在稳定地表达人野生型CXCR4受体的真核转化细胞膜,比如CHO-K1膜上通过竞争,在细胞膜上受体CXCR4上的配体SDF-1的特异性结合(参见实施例4);
-在细胞膜上受体CXCR4上的GTPγS的特异性结合(参见实施例5),特别地是在稳定地和组成性表达野生型CXCR4受体膜的真核转化细胞膜上,比如NIH-3T3细胞膜上;
-CXCR4介导的cAMP生成的抑制(参见实施例7);和
-CXCR4受体介导的细胞内钙贮存的动员(参见实施例13)。
更优选地,至少一种这些活性的调节是抑制所述活性。
在本发明的方法选择的步骤ii)和iii)一个优选的实施方式中,所述步骤ii)和iii)包括通过BRET分析分别在表达CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP和CXCR4-Rluc/CXCR2-YFP的细胞上评价抗体,并选择能够抑制BRET信号至少40%,优选地45%、50%、55%和最优选地60%的抗体。
BRET技术是一种称为蛋白质二聚化的代表技术[Angers等人,PNAS,,2000,97:3684-89]。
在该方法的步骤ii)和iii)中使用的BRET技术是本领域技术人员所熟知的,将详细描述在下述实施例中。更特别地,BRET(生物发光共振能量转移)是一种生物发光供体(Renilla荧光素酶(Rluc))和荧光受体GFP的突变体(绿色荧光蛋白)或YFP(黄色荧光蛋白)之间出现的非放射性能量转移。在目前的情况下,使用EYFP(增强的黄色荧光蛋白)。转移的功效取决于供体和受体之间的方向和距离。然后,只有当两个分子非常接近(1-10nm)时才出现能量转移。该性质可用于进行蛋白质-蛋白质相互作用测定。实际上,为了研究两个配偶体(partners)之间的相互作用,将第一个配偶体遗传融合至Renilla荧光素酶,将第二个配偶体遗传融合至GFP的黄色突变体。融合蛋白通常(但不是必须地)在哺乳动物细胞中表达。在其膜可渗透性底物(腔肠素(coelenterazine))的存在下,Rluc发射蓝光。如果GFP突变体距离Rluc小于10纳米,则可以出现能量转移,可以检测到另外的黄色信号。BRET信号测量为受体发射的光和供体发射的光的比例。因此,当使两个融合蛋白接近时,或者如果构象变化引起Rluc和GFP突变体接近时,BRET信号将增加。
如果BRET分析包括在优选的实施方式中,可以使用本领域技术人员已知的任何方法测量CXCR4二聚体的构象变化。可以提及下述技术,但不限于此:FRET(荧光共振能量转移)、HTRF(均相时间分辨荧光)、FLIM(荧光寿命成像显微镜检查)或SW-FCCS单波长荧光交叉相关光谱)。
也可以使用其它常规技术,比如免疫共沉淀、α筛选、化学交联、双杂交、亲和色谱、ELISA或Far western印迹。
在根据本发明的方法的一个特别的方面,步骤ii)包括在同时表达CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP的细胞上通过BRET分析来评价抗体和选择能够抑制至少40%的BRET信号的抗体。
在根据本发明方法的另一个特别的方面,步骤iii)包括在同时表达CXCR4-RLuc/CXCR2-YFP的细胞上通过BRET分析来评价抗体和选择能够抑制至少40%的BRET信号的抗体。
在第二个方面,本发明的一个主题是通过所述方法获得的分离的抗体或其功能片段或衍生物之一。所述抗体或其所述片段或衍生物之一能够特异性结合人类CXCR4,而且,如有必要,其优选地还能够抑制其配体的自然连接,所述抗体也能够诱导CXCR4二聚体的构象变化。
表述“功能片段和衍生物”将在本说明书中随后详细地定义。
在此必须理解,本发明并不涉及天然形式的抗体,即其不是在其自然环境中,而是其能够通过纯化从天然来源分离或获得,或者通过遗传重组或通过化学合成获得,以及其可以包含将进一步描述的非天然氨基酸。
更特别地,根据本发明的另一个方面,其要求一种抗体、或其功能片段或衍生物之一,所述抗体的特征在于其包含至少一个选自包含氨基酸序列SEQ ID No.1至12的CDR的互补决定区CDR。
更特别地,根据本发明的另一个方面,其要求一种抗体、或其功能片段或衍生物之一,所述抗体的特征在于其包含至少一个选自包含氨基酸序列SEQ ID No.2、5或40至49的CDR的互补决定区CDR。
根据第一个方面,本发明涉及一种分离的抗体、或其衍生化合物或功能片段,其包含至少一个选自序列SEQ ID No.1、2、3、4、5或6的CDR的CDR或至少一个如下CDR:在优化比对之后,其序列与序列SEQ ID No.1、2、3、4、5或6具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%的同一性。
根据另一个方面,本发明涉及一种分离的抗体、或其衍生化合物或功能片段,其包含至少一个选自序列SEQ ID No.40、2、41、42、5或43的CDR的CDR或至少一个如下CDR:在优化比对之后,其序列与序列SEQ ID No.40、2、41、42、5或43具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%的同一性。
抗体的“功能片段”特别地指抗体片段,比如片段Fv、scFv(sc=单链)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc或双特异抗体(diabodies)、或半衰期已增加的任何片段。这样的功能片段将在本说明书中随后详细描述。
抗体的“衍生化合物”或“衍生物”特别地指由肽骨架和用于保持其识别CXCR4能力的原始抗体的至少一个CDR组成的结合蛋白。这样的衍生化合物是本领域技术人员熟知的,将在本说明书中随后更详细地描述。
更优选地,本发明包括通过遗传重组或化学合成获得的根据本发明的抗体、其衍生化合物或其功能片段,特别是嵌合的或人源化的。
根据一个优选的实施方式,根据本发明的抗体或其衍生化合物或功能片段的特征在于其由单克隆抗体组成。
“单克隆抗体”应理解为指来源于几乎同质的抗体群的抗体。更特别地,除了可以以最小比例发现的很少可能天然出现的突变之外,群中的单个抗体是相同的。换句话说,单克隆抗体是由来源于单个细胞克隆(例如杂交瘤、用编码同质性抗体的DNA分子转染的真核宿主细胞、用编码同质性抗体的DNA分子转染的原核宿主细胞等)生长的同质性抗体组成,其特征通常是一个且仅仅一个种类和亚类的重链,和仅仅一种类型的轻链。单克隆抗体是高度特异性的,并针对单一抗原。另外,与通常包括针对各种决定簇或表位的各种抗体的多克隆抗体制剂相比,每个单克隆抗体针对抗原的单一表位。
在此必须理解,本发明并不涉及天然形式的抗体,即,其不是从其自然环境中取得的,而是通过纯化从天然来源分离或获得的,或者通过遗传重组或化学合成获得的,因而,其可以带有如下所述的非天然氨基酸。
更特别地,根据本发明的一个优选的实施方式,所述抗体、或其衍生化合物或功能片段的特征在于其包括轻链,该轻链包含至少一个选自氨基酸序列SEQ ID No.1、2或3的CDR的CDR、或至少一个如下CDR:在优化比对之后,其序列与序列SEQ ID No.1、2或3具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%的同一性;或者其包括重链,该重链包含至少一个选自氨基酸序列SEQ ID No.4、5或6的CDR的CDR,或至少一个如下CDR:在优化比对之后,其序列与序列SEQ ID No.4、5或6具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%的同一性。
根据另一个实施方式,本发明的抗体、或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括轻链,该轻链包含序列SEQ ID No.1、2或3的三种CDR中的至少一个,或至少一个在优化比对之后,与序列SEQ ID No.1、2或3具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%的同一性的序列。
在一个优选的方式中,本发明的抗体、或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括包含下述三种CDR的轻链:分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3,其中:
-CDR-L1包含序列SEQ ID No.1或9,或在优化比对之后与序列SEQ ID No.1或9具有至少80%同一性的序列;
-CDR-L2包含序列SEQ ID No.2或10,或在优化比对之后与序列SEQ ID No.2或10具有至少80%同一性的序列;和
-CDR-L3包含序列SEQ ID No.3,或在优化比对之后与序列SEQ ID No.3具有至少80%同一性的序列。
根据一个特别的实施方式,抗体或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括轻链,该轻链包含序列SEQ ID No.1的CDR-L1、序列SEQ ID No.2的CDR-L2和序列SEQ ID No.3的CDR-L3。
根据另一个特别的实施方式,抗体或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括轻链,该轻链包含序列SEQ ID No.9的CDR-L1、序列SEQ ID No.10的CDR-L2和序列SEQ ID No.3的CDR-L3。
更特别地,本发明的抗体、或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括重链,该重链包含序列SEQ ID No.4、5或6的三种CDR中的至少一个,或至少一个在优化比对之后,与序列SEQ ID No.4、5或6具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%的同一性的序列。
甚至更优选地,本发明的抗体、或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括包含下述三种CDR的重链:分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,其中:
-CDR-H1包含序列SEQ ID No.4、7或11,或在优化比对之后与序列SEQ ID No.4、7或11具有至少80%同一性的序列;
-CDR-H2包含序列SEQ ID No.5或12,或在优化比对之后与序列SEQ ID No.5或12具有至少80%同一性的序列;和
-CDR-H3包含序列SEQ ID No.6或8,或在优化比对之后与序列SEQ ID No.6或8具有至少80%同一性的序列。
根据一个特别的实施方式,抗体或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括重链,该重链包含序列SEQ ID No.7的CDR-H1、序列SEQ ID No.5的CDR-H2和序列SEQ ID No.8的CDR-H3。
根据另一个特别的实施方式,抗体或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括重链,该重链包含序列SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQ ID No.12的CDR-H2和序列SEQ IDNo.6的CDR-H3。
更特别地,根据本发明的一个优选的实施方式,所述抗体、或其衍生化合物或功能片段的特征在于其包括轻链,该轻链包含至少一个选自氨基酸序列SEQ ID No.40、2或41的CDR的CDR、或至少一个如下CDR:在优化比对之后,其序列与序列SEQ ID No.40、2或41具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%的同一性;或者其包括重链,该重链包含至少一个选自氨基酸序列SEQ ID No.42、5或43的CDR的CDR,或至少一个如下CDR:在优化比对之后,其序列与序列SEQ ID No.42、5或43具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%的同一性。
根据另一个实施方式,本发明的抗体、或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括轻链,该轻链包含序列SEQ ID No.40、2或41的三种CDR中的至少一个,或至少一个在优化比对之后,与序列SEQ ID No.40、2或41具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
在一个优选的方式中,本发明的抗体、或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括包含下述三种CDR的轻链:分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3,其中:
-CDR-L1包含序列SEQ ID No.40或46,或在优化比对之后与序列SEQ ID No.40或46具有至少80%同一性的序列;
-CDR-L2包含序列SEQ ID No.2或47,或在优化比对之后与序列SEQ ID No.2或47具有至少80%同一性的序列;和
-CDR-L3包含序列SEQ ID No.41,或在优化比对之后与序列SEQ ID No 41具有至少80%同一性的序列。
根据一个特别的实施方式,抗体或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括轻链,该轻链包含序列SEQ ID No.40的CDR-L1、序列SEQ ID No.2的CDR-L2和序列SEQ ID No.41的CDR-L3。
根据另一个特别的实施方式,抗体或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括轻链,该轻链包含序列SEQ ID No.46的CDR-L1、序列SEQ ID No.47的CDR-L2和序列SEQ ID No.41的CDR-L3。
更特别地,本发明的抗体、或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括重链,该重链包含序列SEQ ID No.42、5或43的三种CDR中的至少一个,或至少一个在优化比对之后,与序列SEQ ID No.42、5或43具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
甚至更优选地,本发明的抗体、或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括包含下述三种CDR的重链:分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,其中:
-CDR-H1包含序列SEQ ID No.42、44或48,或在优化比对之后与序列SEQ ID No.42、44或48具有至少80%同一性的序列;
-CDR-H2包含序列SEQ ID No.5或49,或在优化比对之后与序列SEQ ID No.5或49具有至少80%同一性的序列;和
-CDR-H3包含序列SEQ ID No.45或43,或在优化比对之后与序列SEQ ID No.45或43具有至少80%同一性的序列。
根据一个特别的实施方式,抗体或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括重链,该重链包含序列SEQ ID No.44的CDR-H1、序列SEQ ID No.5的CDR-H2和序列SEQ ID No.45的CDR-H3。
根据另一个特别的实施方式,抗体或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括重链,该重链包含序列SEQ ID No.48的CDR-H1、序列SEQ ID No.49的CDR-H2和序列SEQ ID No.43的CDR-H3。
在本说明书中,术语“多肽”、“多肽序列”、“肽”和“连接抗体化合物或其序列的蛋白”是可互换的。
在此必须理解,本发明并不涉及天然形式的抗体,即,其不是从自然环境中取得的,而是通过纯化从天然来源分离或获得的,或者通过遗传重组或化学合成获得的,因而,其可以带有如下所述的非天然氨基酸。
在第一个实施方式中,互补决定区或CDR指如Kabat等人(Kabat等人,Sequences of proteins of immunological interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH,1991及后来的版本)定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高变区。存在三条重链CDR和三条轻链CDR。在此,术语“CDR”和“CDRs”用于指,取决于具体情形,一种或多种或者甚至全部包含大多数如下氨基酸残基的区域:所述氨基酸残基负责抗体与其识别的抗原或表位的结合亲和力。
在第二个实施方式中,CDR区或CDR旨在指IMGT所定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高变区。
将IMGT唯一的编号定义为与可变结构域比较,无论抗原受体或链类型或物种是什么[Lefranc M.-P.,Immunology Today 18,509(1997)/Lefranc M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.和Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)]。在IMGT唯一编号中,保守性氨基酸总是具有相同位置,例如半胱氨酸23(第1个CYS),色氨酸41(保守性TRP)、疏水性氨基酸89、半胱氨酸104(第2个CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或J-TRP)。所述IMGT唯一编号提供了框架区(FR1-IMGT:位置1至26,FR2-IMGT:39至55,FR3-IMGT:66至104和FR4-IMGT:118至128)和互补决定区CDR1-IMGT:27至38,CDR2-IMGT:56至65和CDR3-IMGT:105至117的标准化定界。由于缝隙(gap)代表未占用的位置,CDR-IMGT长度(在括号之间显示,并用点分开,例如[8.8.13])成为关键信息。在2D图解中使用IMGT唯一编号,命名为IMGT Colliers de Perles[Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q.和Lefranc,M.-P.,Current Bioinformatics,2,21-30(2007)],以及在IMGT/3D结构DB中的3D结构中使用[Kaas,Q.,Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,T cell receptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)]。
存在三条重链CDR和3条轻链CDR。此处使用术语CDR或CDRs用于指,取决于具体情形,包含大多数如下氨基酸残基的这些区域中的一种或几种或者甚至全部这些区域:所述氨基酸残基负责抗体与其识别的抗原或表位的亲和力结合。
为了更清楚,必须理解在下述说明书中,更特别地在表2和3中,CDR以IMGT编号、kabat编号和普通编号定义。
普通编号将每种CDR的残基部分重新分组,所述每种CDR与IMGT和Kabat编号系统所定义的CDR相同。
IMGT编号系统根据如上定义的IMGT系统定义了CDR,而kabat编号系统根据如上定义的kabat系统定义了CDR。
更特别地,CDR-L1由普通编号系统和IMGT编号系统中的SEQ ID No.1(QSLYNSRTRKNY)和kabat编号系统中的SEQ ID No.9(KSSQSLYNSRTRKNYLA)组成。
对于CDR-L2,其由普通编号系统和IMGT编号系统中的SEQ ID No.2(WAS)和kabat编号系统中的SEQ ID No.10(WASTRES)组成。
CDR-L3由三个编号系统中每个的SEQ ID No.3(KQSYNLRT)组成。
对于重链,CDR-H1由普通编号系统中的SEQ ID No.4(TDYY)、IMGT编号系统中的SEQ ID No.7(GFTFTDYY)和kabat编号系统中的SEQ ID No.11(TDYYMS)组成。
CDR-H2由普通编号系统和IMGT编号系统中的SEQ ID No.5(IRNKANGYTT)和kabat编号系统中的SEQ ID No.12(FIRNKANGYTTEYSASVKG)组成。
最后,CDR-H3由普通编号系统和kabat编号系统中的SEQ ID No.6(DIPGFAY)组成,然而其由IMGT编号系统中的SEQ ID No.8(ARDIPGFAY)组成。
更特别地,CDR-L1由普通编号系统和IMGT编号系统中的SEQ ID No.40(QSLFNSRTRKNY)和kabat编号系统中的SEQ ID No.46(KSSQSLFNSRTRKNYLA)组成。
对于CDR-L2,其由普通编号系统和IMGT编号系统中的SEQ ID No.2(WAS)和kabat编号系统中的SEQ ID No.47(WASARDS)组成。
CDR-L3由三个编号系统中每个的SEQ ID No.41(MQSFNLRT)组成。
对于重链,CDR-H1由普通编号系统中的SEQ ID No.42(DNY)、IMGT编号系统中的SEQ ID No.44(GFTFTDNY)和kabat编号系统中的SEQ ID No.48(DNYMS)组成。
CDR-H2由普通编号系统和IMGT编号系统中的SEQ ID No.5(IRNKANGYTT)和kabat编号系统中的SEQ ID No.49(FIRNKANGYTTDYSASVRG)组成。
最后,CDR-H3由普通编号系统和kabat编号系统中的SEQ ID No.43(DVGSNYFDY)组成,然而其由IMGT编号系统中的SEQ ID No.45(ARDVGSNYFDY)组成。
在本发明的意义上,两个核酸或氨基酸序列之间的“百分数同一性”指两个进行比较的序列之间在优化比对后获得的相同的核苷酸或氨基酸残基的百分数,该百分数是纯粹统计学上的,并且两个序列之间的区别沿其长度随机分布。两个核酸或氨基酸序列之间的比较通常通过比较两个在优化比对后的序列而进行,所述比较能够分段进行或使用“比对窗口”进行。用于比较的序列的优化比对,除了手工比较之外,可以通过Smith和Waterman的局部同源性算法(1981)[Ad.App.Math.2:482]、通过Neddleman和Wunsch的局部同源性算法(1970)[J.Mol.Biol.48:443]、通过Pearson和Lipman的相似性查找法(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444]或通过使用这些算法的计算机软件(威斯康星遗传学软件包,遗传学计算机组,575Science Dr.,Madison,WI的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,或通过比较软件BLAST NR或BLAST P)进行。
两个核酸或氨基酸序列之间的百分数同一性通过比较两个优化比对的序列确定,其中,与用于两个序列之间优化比对的参照序列相比,待比较的核酸或氨基酸序列可以具有添加或缺失。通过如下方法计算百分数同一性:确定两个序列,优选两个全序列之间相同氨基酸核苷酸或残基的位置数目,将相同位置的数目除以比对窗口中的位置总数,并将结果乘以100以获得两个序列之间的百分数同一性。
例如,可使用在网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html可获得的BLAST程序″BLAST 2序列″(Tatusova等人,″Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences″,FEMS Microbiol,1999,Lett.174:247-250),使用缺省参数(特别是参数“开放缝隙罚分”:5和“延伸缝隙罚分”:2;所选的矩阵是例如程序建议的″BLOSUM 62″矩阵);直接通过该程序计算两个待比较序列之间的百分数同一性。
对于显示出与参照氨基酸序列具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的氨基酸序列而言,优选的实例包括包含参照序列、某些修饰,特别是至少一个氨基酸的删除、添加或置换、截短或延伸的那些。在置换一个或多个连续或不连续氨基酸的情况下,其中被置换的氨基酸被“等同”氨基酸替换的置换是优选的。在此,表述“等同氨基酸”指可能被结构性氨基酸之一置换,然而并未改变相应抗体和下述定义的那些具体实例的生物活性的任何氨基酸。
等同氨基酸可根据其与被置换氨基酸的结构同源性或根据各种可能产生的抗体之间生物活性的比较性试验结果而确定。
作为非限制性实例,下表1概述了可能进行却没有引起相应修饰抗体的生物活性发生显著改变的可能的置换;在相同条件下,反向置换当然是可能的。
表1
原始残基 | 置换 |
Ala(A) | Val,Gly,Pro |
Arg(R) | Lys,His |
Asn(N) | Gln |
Asp(D) | Glu |
Cys(C) | Ser |
Gln(Q) | Asn |
Glu(G) | Asp |
Gly(G) | Ala |
His(H) | Arg |
Ile(I) | Leu |
Leu(L) | Ile,Val,Met |
Lys(K) | Arg |
Met(M) | Leu |
Phe(F) | Tyr |
Pro(P) | Ala |
Ser(S) | Thr,Cys |
Thr(T) | Ser |
Trp(W) | Tyr |
Tyr(Y) | Phe,Trp |
Val(V) | Leu,Ala |
本领域技术人员已知,在本领域的现状下,发现六个CDR之间的最大可变性(长度和组成)位于三条重链CDR上,更特别地,在这条重链的CDR-H3上。因此,很显然:本发明所述抗体或其衍生化合物或功能片段之一的优选特征性CDR是重链的三种CDR,即,对于414H5,其是由分别根据IMGT和Kabat定义的序列SEQID No.7、5、8和11、12、6编码的CDR,对于515H7,其是由分别根据IMGT和Kabat定义的序列SEQ ID No.44、5、45和48、49、43编码的CDR。甚至更优选地,对于414H5,所述CDR对应于由序列SEQ ID No.8或6编码的CDR-H3,对于515H7,所述CDR对应于由序列SEQ ID No.45或43编码的CDR-H3。
在一个特定实施方式中,本发明涉及鼠抗体或其衍生化合物或功能片段。
本发明的另一个实施方式公开了一种抗体或其衍生化合物或功能片段,其包括包含下列三种CDR的轻链:
CDR-L1,其具有序列SEQ ID No.1,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.1具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列;
CDR-L2,其具有序列SEQ ID No.2,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.2具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列;和
CDR-L3,其具有序列SEQ ID No.3,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.3具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列,和
包含下述三种CDR的重链:
CDR-H1,其具有序列SEQ ID No.4,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.4具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列;
CDR-H2,其具有序列SEQ ID No.5,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.5具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列;和
CDR-H3,其具有序列SEQ ID No.6,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.6具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
本发明的再另一个实施方式公开了一种抗体或其衍生化合物或功能片段,其包括包含下列三种CDR的轻链:
-CDR-L1,其具有序列SEQ ID No.1,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.1具有至少80%同一性的序列;
-CDR-L2,其具有序列SEQ ID No.2,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.2具有至少80%同一性的序列;和
-CDR-L3,其具有序列SEQ ID No.3,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.3具有至少80%同一性的序列,和
包含下述三种CDR的重链:
-CDR-H1,其具有序列SEQ ID No.7,或具有在优化比对之后与序列SEQ IDNo.7具有至少80%同一性的序列;
-CDR-H2,其具有序列SEQ ID No.5,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.5具有至少80%同一性的序列;和
-CDR-H3,其具有序列SEQ ID No.8,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.8具有至少80%同一性的序列。
本发明的再另一个实施方式公开了一种抗体或其衍生化合物或功能片段,其包括包含下列三种CDR的轻链:
-CDR-L1,其具有序列SEQ ID No.9,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.9具有至少80%同一性的序列;
-CDR-L2,其具有序列SEQ ID No.10,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.10具有至少80%同一性的序列;和
-CDR-L3,其具有序列SEQ ID No.3,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.3具有至少80%同一性的序列,和
包含下述三种CDR的重链:
-CDR-H1,其具有序列SEQ ID No.11,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.11具有至少80%同一性的序列;
-CDR-H2,其具有序列SEQ ID No.12,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.12具有至少80%同一性的序列;和
-CDR-H3,其具有序列SEQ ID No.6,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.6具有至少80%同一性的序列。
根据本发明的抗体、或其衍生化合物或功能片段的特征在于其包括:
-轻链,其包含序列SEQ ID No.1的CDR-L1、序列SEQ ID No.2的CDR-L2和序列SEQ ID No.3的CDR-L3;和
-重链,其包含序列SEQ ID No.7的CDR-H1、序列SEQ ID No.5的CDR-H2和序列SEQ ID No.8的CDR-H3。
在另一个实施方式中,根据本发明的抗体、或其衍生化合物或功能片段的特征在于其包括:
-轻链,其包含序列SEQ ID No.9的CDR-L1、序列SEQ ID No.10的CDR-L2和序列SEQ ID No.3的CDR-L3;和
-重链,其包含序列SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQ ID No.12的CDR-H2和序列SEQ ID No.6的CDR-H3。
根据再另一个实施方式,本发明的抗体或其衍生化合物或功能片段的特征在于其包括轻链序列,该轻链序列包含氨基酸序列SEQ ID No.13或在优化比对之后,与序列SEQ ID No.13具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列;或者在于其包括重链序列,该重链序列包含氨基酸序列SEQ ID No.14或在优化比对之后,与序列SEQ ID No.14具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
本发明的另一个实施方式公开了一种抗体或其衍生化合物或功能片段,其包括包含下列三种CDR的轻链:
CDR-L1,其具有序列SEQ ID No.40,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.40具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列;
CDR-L2,其具有序列SEQ ID No.2,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.2具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列;和
CDR-L3,其具有序列SEQ ID No.41,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.41具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列,和
包含下述三种CDR的重链:
CDR-H1,其具有序列SEQ ID No.42,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.42具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列;
CDR-H2,其具有序列SEQ ID No.5,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.5具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列;和
CDR-H3,其具有序列SEQ ID No.43,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.43具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
本发明的再另一个实施方式公开了一种抗体或其衍生化合物或功能片段,其包括包含下列三种CDR的轻链:
-CDR-L1,其具有序列SEQ ID No.40,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.40具有至少80%同一性的序列;
-CDR-L2,其具有序列SEQ ID No.2,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.2具有至少80%同一性的序列;和
-CDR-L3,其具有序列SEQ ID No.41,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.41具有至少80%同一性的序列,和
包含下述三种CDR的重链:
-CDR-H1,其具有序列SEQ ID No.44,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.44具有至少80%同一性的序列;
-CDR-H2,其具有序列SEQ ID No.5,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.5具有至少80%同一性的序列;和
-CDR-H3,其具有序列SEQ ID No.45,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.45具有至少80%同一性的序列。
本发明的再另一个实施方式公开了一种抗体或其衍生化合物或功能片段,其包括包含下列三种CDR的轻链:
-CDR-L1,其具有序列SEQ ID No.46,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.46具有至少80%同一性的序列;
-CDR-L2,其具有序列SEQ ID No.47,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.47具有至少80%同一性的序列;和
-CDR-L3,其具有序列SEQ ID No.41,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.41具有至少80%同一性的序列,和
包含下述三种CDR的重链:
-CDR-H1,其具有序列SEQ ID No.48,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.48具有至少80%同一性的序列;
-CDR-H2,其具有序列SEQ ID No.49,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.49具有至少80%同一性的序列;和
-CDR-H3,其具有序列SEQ ID No.43,或具有在优化比对之后与序列SEQ ID No.43具有至少80%同一性的序列。
根据本发明的抗体、或其衍生化合物或功能片段的特征在于其包括:
-轻链,其包含序列SEQ ID No.40的CDR-L1、序列SEQ ID No.2的CDR-L2和序列SEQ ID No.41的CDR-L3;和
-重链,其包含序列SEQ ID No.44的CDR-H1、序列SEQ IDNo.5的CDR-H2和序列SEQ ID No.45的CDR-H3。
在另一个实施方式中,根据本发明的抗体、或其衍生化合物或功能片段的特征在于其包括:
-轻链,其包含序列SEQ ID No.46的CDR-L1、序列SEQ ID No.47的CDR-L2和序列SEQ ID No.41的CDR-L3;和
-重链,其包含序列SEQ ID No.48的CDR-H1、序列SEQ ID No.49的CDR-H2和序列SEQ ID No.43的CDR-H3。
根据再另一个实施方式,本发明的抗体或其衍生化合物或功能片段的特征在于其包括轻链序列,该轻链序列包含氨基酸序列SEQ ID No.50或在优化比对之后,与序列SEQ ID No.50具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列;且在于其包括重链序列,该重链序列包含氨基酸序列SEQ ID No.51或在优化比对之后,与序列SEQ ID No.51具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
如上可见,本发明还涉及来源于本发明所述抗体的任何化合物。更特别地,本发明的抗体或其衍生化合物或功能片段的特征在于所述衍生化合物由结合蛋白组成,该结合蛋白包含肽支架,在该肽支架上以保留原始抗体的全部或部分互补位识别特性的方式移植了至少一种CDR。
本发明中所述的六个CDR序列之中的一个或多个序列也可以存在于各种免疫球蛋白的蛋白支架上。在这种情况下,蛋白序列使重新构建有利于移植的CDR折叠的肽骨架成为可能,使其保留了其互补位抗原识别特性。
通常,本领域技术人员知道如何确定蛋白支架的类型,在所述蛋白支架上移植了至少一种来自原始抗体的CDR。更特别地,已知选择这种支架必须满足最大数量的下列条件(SkerraA.,J.Mol.Recogn.,2000,13:167-187):
-良好的种系发生保守性;
-已知的三维结构(例如,通过结晶学、NMR光谱学或本领域技术人员已知的任何其它技术);
-小尺寸;
-几乎没有或没有转录后修饰;和/或
-易于产生、表达和纯化。
这样的蛋白支架的来源可以是但不限于选自下列的结构:纤连蛋白,优选III型纤连蛋白结构域10、脂笼蛋白(lipocalin)、anticalin(Skerra A.,J.Biotechnol.,2001,74(4):257-75)、来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的结构域B的蛋白Z、硫氧还蛋白A(thioredoxin A)或带有如“锚蛋白重复序列”(Kohl等人,PNAS,2003,vol.100,No.4,1700-1705)“犰狳(armadillo)重复序列”、“富含亮氨酸的重复序列”和“三十四肽(tetratricopeptide)重复序列”的重复基序的蛋白。
还应提及来源于毒素,比如例如蝎子、昆虫、植物、软体动物等的毒素的支架和神经元NO合酶(PIN)的蛋白抑制剂。
这样的杂合构建体的非限制方式的一个实例是在PIN的一个环内插入抗CD4抗体的CDR-H1(重链),即13B8.2,因此获得的新的结合蛋白保留了与原始抗体相同的结合特性(Bes等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2006,343(1),334-344)。在纯粹说明性基础上,还可以提及将抗溶菌酶VHH抗体的CDR-H3(重链)移植到新制癌菌素(neocarzinostatin)的一个环上(Nicaise等人,Protein Science,2004,13(7):1882-1891)。
最后,如上所述,这样的肽支架可以包含一至六个来自原始抗体的CDR。优选地,但非必要的,本领域技术人员将选择至少一个来自重链的CDR,已知后者主要负责抗体的特异性。选择一个或多个相关CDR对于本领域技术人员而言是显而易见的,本领域技术人员然后将选择合适的已知技术(Bes等人,FEBS letters 508,2001,67-74)。
本发明的一个特定方面涉及一种选择来源于根据本发明抗体的化合物的方法,所述衍生化合物能够抑制体外和/或体内肿瘤细胞生长,并且所述衍生化合物包含其上移植了至少一个抗体CDR的肽支架,该方法的特征在于其包括下述步骤:
a)在允许肿瘤细胞生长的条件下,使由其上移植了至少一个抗体CDR的肽支架组成的化合物在体外接触包含能够生长的肿瘤细胞的生物样品;和
b)如果所述化合物能够抑制这些肿瘤细胞的生长,并且其特征在于所述至少一个移植的CDR选自下列CDR,选择所述化合物:
-序列SEQ ID No.1、9、40、46的CDR或在优化比对后与序列SEQ ID No.1、9、40、46具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR;
-序列SEQ ID No.2、10、47的CDR或在优化比对后与序列SEQ ID No.2、10、47具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR;
-序列SEQ ID No.3、41的CDR或在优化比对后与序列SEQ ID No.3、41具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR;
-序列SEQ ID No.4、7、11、42、44、48的CDR或在优化比对后与序列SEQ ID No.4、7、11、42、44、48具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR;
-序列SEQ ID No.5、12、49的CDR或在优化比对后与序列SEQ ID No.5、12、49具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR;和
-序列SEQ ID No.6、8、43、45的CDR或在优化比对后与序列SEQ ID No.6、8、43、45具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR。
根据一个优选的方式,所述方法可以在步骤a)中包括使包含其上移植了至少两个或三个抗体CDR的肽支架的化合物在体外接触。
根据该方法的一个甚至更优选的方式,所述肽支架选自其结构在上述提及的支架或结合蛋白。
显而易见地,这些实施例绝不是限制性的,并且应将任何对于本领域技术人员是已知的或显而易见的其它结构视为涵盖在本专利申请给予的保护之内。
因此,本发明涉及其特征在于肽支架选自下列蛋白的抗体或其衍生化合物或功能片段:a)种系发生保留良好的蛋白,b)结构坚固的蛋白,c)具有熟知的3D分子组成的蛋白,d)小尺寸的蛋白和/或e)包含可以通过删除和/或插入修饰而未改变稳定性特性的区域的蛋白。
根据一个优选的实施方式,本发明所述的抗体、或其衍生化合物或功能片段的特征在于所述肽支架选自:i)来自纤连蛋白的支架,优选3型纤连蛋白结构域10的支架、脂笼蛋白、anticalin、来自金黄色葡萄球菌的蛋白A结构域B的蛋白Z、硫氧还蛋白A或具有如“锚蛋白重复序列”(Kohl等人,PNAS,2003,vol.100,No.4,1700-1705)、“犰狳重复序列”、“富含亮氨酸的重复序列”和“三十四肽重复序列”的重复基序的蛋白,或iii)神经元NO合酶(PIN)的蛋白抑制剂。
本发明的另一个方面涉及如上所述抗体的功能片段。
更特别地,本发明的目标是抗体或其衍生化合物或功能片段,其特征在于所述功能片段选自片段Fv、Fab、(Fab’)2、Fab’、scFv、scFv-Fc和双特异抗体,或任何其半衰期增加的片段,如PEG化的片段。
根据本发明的抗体的这种功能片段由下列组成,例如,片段Fv、scFv(sc=单链)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc或双特异抗体或任何其半衰期通过化学修饰而增加的片段,比如添加聚亚烷基二醇,比如聚乙二醇(PEG化)(PEG化的片段被称作Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG和Fab’-PEG),或掺入脂质体、微球体或PLGA,所述片段具有至少一个本发明的特征性CDR,该CDR特别能够以一般方式发挥出其来源抗体的活性,即使是部分活性。
优选地,所述功能片段包含或包括衍生其的抗体可变重链或轻链的部分序列,所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性,和足够的亲和力,优选至少等于其来源抗体的亲和力的1/100,更优选至少是其来源抗体的亲和力的1/10。
这样的功能片段将包含其来源抗体序列的至少五个氨基酸,优选6、7、8、10、15、25、50或100个连续氨基酸。
优选地,这些功能片段将是Fv、scFv、Fab、F(ab’)2、F(ab’)、scFv-Fc或双特异抗体类型,这些功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。根据本发明,本发明的抗体片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或番木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法从上述抗体获得。抗体片段还可以通过重组遗传学技术(也是本领域技术人员所知)或通过例如自动肽合成仪,比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪,通过肽合成获得。
为了更清楚,下表2概述了对应于本发明抗体的各种氨基酸序列。
表2(其中Mu.=鼠的,Ch.=嵌合的)
本发明的另一个具体方面涉及嵌合抗体,或其衍生化合物或功能片段,其特征在于所述抗体还包含来源于与小鼠特别是人类异源的物种抗体的轻链和重链恒定区。
本发明的再另一个具体方面涉及人源化抗体,或其衍生化合物或功能片段,其特征在于来源于人抗体的轻链和重链的恒定区分别是λ或κ区和γ-1、γ-2或γ-4区。
根据另一个方面,本发明涉及能够分泌根据本发明的单克隆抗体的鼠杂交瘤,特别是于2007年10月22日以保藏号I-3860提交至法国微生物培养物中心(CNCM,法国巴黎巴斯德研究所)的鼠源杂交瘤。所述杂交瘤是通过将Balb/C免疫接种的小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/O-Ag14细胞系融合而获得。
在本文称为414H5的单克隆抗体或其衍生化合物或功能片段的特征在于所述抗体是由2007年10月22日以保藏号I-3860提交至CNCM的杂交瘤分泌的,其显而易见地成为本发明的一部分。
根据另一个方面,本发明涉及能够分泌根据本发明的单克隆抗体的鼠杂交瘤,特别是于2008年6月25日以保藏号I-4019提交至法国微生物培养物中心(CNCM,法国巴黎巴斯德研究所)的鼠源杂交瘤。所述杂交瘤是通过将Balb/C免疫接种的小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/O-Ag14细胞系融合而获得。
在本文称为515H7的单克隆抗体或其衍生化合物或功能片段的特征在于所述抗体是由2008年6月25日以保藏号I-4019提交的杂交瘤分泌的,其显而易见地成为本发明的一部分。
本发明的抗体还包含嵌合抗体或人源化抗体。
嵌合抗体是由一种包含来源于给定物种的天然可变区(轻链和重链)和与所述给定物种异源的物种的抗体轻链和重链的恒定区结合而成的抗体。抗体或抗体的嵌合片段可通过使用重组遗传学技术制备。例如,嵌合抗体可以通过克隆包含启动子和编码本发明的非人类单克隆抗体(特别是鼠单克隆抗体)可变区的序列和编码人抗体恒定区的序列的重组DNA而产生。根据本发明的由这样的重组基因编码的嵌合抗体可以是,例如,小鼠-人嵌合体,这种抗体的特异性通过来源于鼠DNA的可变区确定,其同种型通过来源于人DNA的恒定区确定。用于制备嵌合抗体的方法参见Verhoeyn等人(BioEssays,8:74,1988)。
在另一个方面,本发明描述包含嵌合抗体的抗体、或其衍生化合物或功能片段。
在一个特别优选的实施方式中,本发明的嵌合抗体或其衍生化合物或功能片段包括包含氨基酸序列SEQ ID No.64的轻链序列,并且其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.65的重链序列。
在另一个优选的实施方式中,本发明的嵌合抗体或其衍生化合物或功能片段包括包含氨基酸序列SEQ ID No.66的轻链序列,并且其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.67的重链序列。
“人源化抗体”指包含来源于非人类来源抗体的CDR区的抗体,该抗体分子的其它部分来源于一种(或几种)人抗体。另外,可以修饰一些骨架区段残基(称作FR)以保留结合亲和力(Jones等人,Nature,321:522-525,1986;Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536,1988;Riechmann等人,Nature,332:323-327,1988)。
本发明的人源化抗体或其片段可以通过本领域技术人员已知的技术制备(比如例如在文献Singer等人,J.Immun.,150:2844-2857,1992;Mountain等人,Biotechnol.Genet.Eng.Rev.,10:1-142,1992;和Bebbington等人,Bio/Technology,10:169-175,1992中描述的那些)。这样的人源化抗体因其在包括体外诊断或预防性和/或体内治疗性治疗方法中的用途而是优选的。也可以引用也是本领域技术人员已知的其它人源化技术,比如例如,PDL在专利EP 0 451 261、EP 0 682 040、EP 0 939 127、EP 0 566 647或US 5,530,101、US 6,180,370、US 5,585,089和US 5,693,761、US专利5,639,641或6,054,297、5,886,152和5,877,293中描述的“CDR移植”技术。
另外,本发明还涉及来源于如上所述鼠抗体的人源化抗体。
在一个优选的方式中,来源于人抗体的轻链和重链的恒定区分别为λ或κ区和γ-1、γ-2或γ-4区。
在对应于IgG1同种型IgG1的实施方式中,抗体的另一个特征是显示出效应子功能,比如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
本发明的一个新的方面是涉及分离的核酸,其特征在于该核酸选自下述核酸(包括任一种简并性遗传密码):
-编码根据本发明的抗体或其衍生化合物或功能片段的核酸、DNA或RNA;
-与a)中定义的核酸互补的核酸;
-能够在高度严谨条件下与至少一个具有下述核酸序列的CDR杂交的至少18个核苷酸的核酸:核酸序列SEQ ID No.15至26或SEQ ID No.52至61或在优化比对后与序列SEQ ID No.15至26或SEQ ID No.52至61具有至少80%,优选85%,90%、95%和98%同一性的序列;和
-能够在高度严谨条件下与下述杂交的至少18个核苷酸的核酸:核酸序列SEQ ID No.27或SEQ ID No.62或SEQ ID No.68或70的至少轻链和/或核酸序列SEQ ID No.28或SEQ ID No.63或SEQ ID No.69或71的重链或在优化比对后与序列SEQ ID No.27和/或28或SEQ ID No.62和/或63或SEQ ID No.68和/或69或SEQ ID No.70和/或71具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的重链。
下表3概述了涉及本发明抗体的各种核苷酸序列。
表3
术语“核酸”、“核序列”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本说明书中可互换地使用,指修饰或未修饰的核苷酸的精确序列,其定义了核酸的一个片段或一个区域,包含或不包含非天然核苷酸,并且是双链DNA、单链DNA、或所述DNA的转录产物。
此处还应包括:本发明不涉及天然染色体环境中的,即天然状态的核苷酸序列。本发明的序列是已分离和/或纯化的,即它们是直接或间接取样的,例如通过拷贝,其环境至少已部分改变的。本文还应提及通过例如宿主细胞的重组遗传学获得的,或通过化学合成获得的分离的核酸。
“显示出在优化比对后与优选序列具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%的百分数同一性的核序列”指,相对于参照核序列,显示出某些修饰(比如特别是(特别是准时的)删除、截短、延伸、嵌合融合和/或置换)的核序列。优选地,这些是编码与参照序列相同的氨基酸序列的序列,这与遗传密码的简并相关,或是可能与参照序列特异性杂交的互补性序列(优选在高度严谨条件下杂交),特别是下列定义的那些序列。
在高度严谨条件下杂交是指以能使两条互补性DNA片段之间保持杂交的方式选择涉及温度和离子强度的条件。基于纯粹解释的基础上,为了定义如上所述多核苷酸片段的目的,杂交步骤的高度严谨条件有利地为如下。
DNA-DNA或DNA-RNA杂交以两个步骤进行:(1)在42℃,在包含5X SSC(1X SSC相当于0.15M NaCl+0.015M柠檬酸钠溶液)、50%甲酰胺、7%十二烷基磺酸钠(SDS)、10X Denhardt’s、5%硫酸右旋糖苷和1%鲑精DNA的磷酸盐缓冲液中预杂交3小时;(2)初步杂交20小时,温度取决于探针长度(即:对于即长度>100个核苷酸的探针是42℃),接着是在20℃下在2X SSC+2%SDS中洗涤两次,每次20分钟,在20℃下在0.1X SSC+0.1%SDS中洗涤一次20分钟。对于长度>100个核酸的探针,最后一次洗涤是在60℃下,在0.1X SSC+0.1%SDS中进行30分钟。如上所述对于确定尺寸的多核苷酸的高度严格性杂交条件可由本领域技术人员根据Sambrook等人(Molecular cloning:a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory;第3版,2001)描述的方法对较长或较短的寡核苷酸进行适应性调整。
本发明还涉及包含本发明所述的核酸的载体。
本发明的目标特别是包含这样的核苷酸序列的克隆和/或表达载体。
本发明的载体优选地包含能够在给定宿主细胞内表达和/或分泌核苷酸序列的元件。因此,载体必须包含启动子、翻译起始和终止信号,以及合适的转录调控区。它必须能以稳定方式在宿主细胞内保持,并且可以任选地具有指定翻译蛋白分泌的特异性信号。这几种元件可由本领域技术人员根据所用宿主细胞选择和优化。为此目的,核苷酸序列可插入在所选宿主体内自我复制的载体或是所选宿主的整合性载体。
这样的载体是通过本领域技术人员一般使用的方法制备的,而且得到的克隆可以通过标准方法(比如脂转染法、电穿孔、热休克或化学方法)引入合适的宿主体内。
所述载体是,例如,质粒或病毒来源的载体。其用于转化宿主细胞以克隆或表达本发明的核苷酸序列。
本发明还包含被本发明中描述的载体转化的宿主细胞或包含本发明中描述的载体的宿主细胞。
宿主细胞可以选自原核或真核系统,比如细菌细胞,例如,以及酵母细胞或动物细胞,特别是哺乳动物细胞。也可以使用昆虫或植物细胞。
本发明还涉及具有根据本发明的转化细胞的动物,不包括人。
本发明的另一方面涉及用于制备根据本发明的抗体或其功能片段之一的方法,其特征在于所述方法包括下述步骤:
a)在培养基中和合适的培养条件下培养根据本发明的宿主细胞;和
b)从培养基中或从所述培养细胞中回收如此产生的所述抗体或其功能片段之一。
根据本发明的转化细胞用于制备根据本发明的重组多肽的方法中。用于制备根据本发明的重组形式多肽的方法的特征在于,所述方法使用载体和/或根据本发明的载体转化的细胞,该方法也包括在本发明中。优选地,在使上述多肽表达和回收所述重组肽的条件下培养根据本发明的载体转化的细胞。
如已经提及的,宿主细胞可以选自原核或真核系统。特别地,可能鉴定在这样的原核或真核系统中促进分泌的本发明的核苷酸序列。因此,带有这样的序列的根据本发明的载体可有利地用于制备待分泌的重组蛋白。实际上,这些目的重组蛋白的纯化可由于其存在于细胞培养物的上清液中而不是宿主细胞内的事实而变得容易。
本发明的多肽也可以通过化学合成制备。一种这样的制备方法也是本发明的目的。本领域技术人员已知化学合成的方法,比如固相技术(特别参见Steward等人,1984,Solid phase peptides synthesis,Pierce Chem.Company,Rockford,111,第2版.)或部分固相技术(通过片段缩合或在溶液中常规合成)。通过化学合成获得的并能够含有相应非天然氨基酸的多肽也包括在本发明中。
可能通过本发明的方法获得的抗体或其衍生化合物或功能片段也包括在本发明中。
根据再另一个方面,本发明涉及如上所述的抗体,其特征在于它额外地能够特异性结合人趋化因子家族受体和/或能够特异性抑制这种受体的信号传导。
根据新的实施方式,本发明涉及抗体或其衍生化合物或功能片段,其由是双特异性的抗体组成,所述双特异性的意义是其包含能够与参与肿瘤发展的任何受体相互作用的第二基序,所述受体比如例如VEGFR、VEGF、EGFR、IGF-1R、HER2neu、HGF、cMET、FGF、四跨膜蛋白(tetraspanins)、整合素、CXCR4(不同于本发明的抗体,即靶向另外的表位)、CXCR7或CXCR2。
双特异性或双功能性抗体构成第二代单克隆抗体,其中两种不同可变区组合在同一分子中(Hollinger和Bohlen,1999,Cancer and metastasis,rev.18:411-419)。与其募集新的效应子功能或靶向肿瘤细胞表面上的几种分子有关,其在诊断性和治疗性领域的应用已得到证实;这样的抗体可通过化学方法(Glennie MJ等人,1987,J.Immunol.139,2367-2375;Repp R等人,1995,J.Hemat.,377-382)或体细胞方法(Staerz U.D.和Bevan M.J.,1986,PNAS 83,1453-1457;Suresh M.R.等人,986,Method Enzymol.,121:210-228)获得,也可优选通过遗传工程技术获得,遗传工程技术使促进异二聚体成为可能并因此促进目标抗体的纯化(Merchand等人,1998,Nature Biotech.,16:677-681)。
这些双特异性抗体可以构建为完整IgG、双特异性Fab’2、Fab’PEG、双特异抗体或双特异性scFv,也可构建为四价的双特异性抗体,其中对于每个靶抗原存在两个结合位点(Park等人,2000,MoL.Immunol,37(18):1123-30)或如上所述的其片段。
除了特定的经济优势外,考虑到双特异性抗体的生产和给药比两个特异性抗体的生产更便宜,使用这种双特异性抗体还具有降低治疗毒性的优势。实际上,使用双特异性抗体有可能降低循环抗体的总量和随之产生的可能的毒性。
在本发明的一个优选的实施方式中,所述双特异性抗体是二价抗体或四价抗体。
最后,本发明涉及如上所述的抗体或其衍生化合物或功能片段,用作药物。
本发明还涉及包含由本发明的抗体或其衍生化合物或功能片段之一组成的化合物作为活性成分的药物组合物。优选地,所述抗体中补充了赋形剂和/或可药用载体。
本发明还涉及组合物,特征在于其另外包括作为用于同时、分开或延长方式使用的联合产品的不同于抗CXCR4抗体的抗肿瘤抗体。
根据再另一实施方式,本发明还涉及包括至少一个第二抗肿瘤化合物的如上所述的药物组合物,所述第二抗肿瘤化合物选自能够特异性抑制受体(比如IGF-IR、EGFR、HER2/neu、cMET、VEGFR或VEGF或本领域技术人员已知的任何其它抗肿瘤化合物)的酪氨酸激酶活性的化合物。
在本发明的第二个优选的方面,所述第二化合物可以选自分离的抗体抗EGFR、抗IGF-IR、抗HER2/neu、抗cMET、VEGFR、VEGF等,或其功能片段和衍生化合物,上述分离的抗体或其功能片段和衍生化合物能够抑制所述受体促进的转移性扩散的增殖和/或抗凋亡和/或血管生成和/或诱导活性。
还可以提及抗CD20抗体,比如利妥昔单抗、替伊莫单抗(ibritumomab)或托西莫单抗;抗CD33抗体,比如吉姆单抗或林妥珠单抗;抗CD22抗体,比如依帕珠单抗;抗CD52抗体,比如阿仑单抗;抗EpCAM抗体,比如依决洛单抗、Ch 17-1A或IGN-101;抗CTP21或16抗体,比如Xactin;抗DNA-Ag抗体,比如131I-Cotara TNT-1;抗MUC1抗体,比如pemtumomab或R1150;抗MUC18抗体,比如ABX-MA1;抗GD3抗体,比如米妥莫单抗;抗ECA抗体,比如CeaVac或拉贝珠单抗(labetuzumab);抗CA125抗体,比如OvaRex;抗HLA-DR抗体,比如apolizumab;抗CTLA4抗体,比如MDX-010;抗PSMA抗体,比如MDX-070、111In和90Y-J591、177Lu J591、J591-DM1;抗Lewis Y抗体,比如IGN311;抗血管发生抗体,比如AS1405和90YmuBC1;抗Trail-R1抗体,比如TRAIL R1mAb或TRAIL R2mAb。
本发明补充性的另一个实施方式由如上所述的组合物组成,其另外还包含作为联合或结合产品用于同时、分开或延长使用的细胞毒剂/细胞增殖抑制剂。
“同时使用”指给予包含在单一剂型中的组合物中的两种化合物。
“分开使用”指同时给予包含在不同剂型中的组合物中的两种化合物。
“延长使用”指连续给予包含在不同剂型中的组合物中的两种化合物。
通常,根据本发明的组合物显著地提高了癌症治疗功效。换句话讲,本发明的抗体的治疗效果通过给予细胞毒剂而以出人意料的方式得到增强。本发明的组合物产生的另一主要后续优势可能与使用较低有效剂量的活性成分有关,因此可能避免或降低副作用出现的风险,特别是细胞毒剂的效应。而且,该组合物可能更快地达到预期的治疗效果。
“治疗性抗癌剂”或“细胞毒剂”指当将其给予患者时,治疗或预防患者癌症发展的物质。这样的试剂的非限制性实例包括“烷化”剂、抗代谢剂、抗肿瘤性抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素剂、抗雄激素剂和免疫调节剂。
例如,在VIDAL中在肿瘤学和血液学相关化合物的那一页,在“细胞毒的”题目下引用了这样的试剂;将参考该文献引用的细胞毒化合物引入本文作为优选的细胞毒剂。
“烷化剂”指可在细胞内与任何分子优选核酸(例如DNA)共价结合或能使这些分子烷化的任何物质。这样的烷化剂的实例包括氮芥类,比如氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、盐酸氮芥、哌泊溴烷、泼尼莫司汀、磷酸二钠或雌莫司汀;氧氮磷环类(oxazaphosphorine),比如环磷酰胺、六甲密胺、曲磷胺、磺基磷酰胺(sulfofosfamide)或异环磷酰胺;氮丙啶类或乙撑亚胺类,比如如塞替派、三亚乙基二胺(triethyleneamine)或altetramine;亚硝基脲类,比如卡莫司汀、链脲菌素(streptozocine)、福莫司汀或洛莫司汀;烷基磺酸盐类,比如白消安、曲奥舒凡或英丙舒凡;三氮烯类,比如达卡巴嗪;或铂复合物,比如顺铂、奥克赛铂(oxaliplatine)或碳铂。
“抗代谢剂”指通过干扰某些活性(通常是DNA合成)阻断生长和/或细胞代谢的物质。抗代谢剂的实例包括甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、5-氟脱氧尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、胞嘧啶阿糖胞苷、6-巯基嘌呤(6-MP)、6-巯基鸟嘌呤(6-TG)、氯脱氧腺苷、5-氮胞苷、吉西他滨、克拉屈滨、脱氧柯福霉素和喷司他丁。
“抗肿瘤性抗生素”指可预防或抑制DNA、RNA和/或蛋白质合成的化合物。这样的抗肿瘤性抗生素的实例包括多柔比星、柔红霉素、伊达比星、戊柔比星、米托蒽醌、更生霉素、光神霉素、普卡霉素、丝裂霉素C、博来霉素和丙卡巴肼。
“有丝分裂抑制剂”阻止细胞周期和有丝分裂的正常进行。通常,微管抑制剂或“紫杉烷”比如紫杉醇和紫杉萜能够抑制有丝分裂。长春花属生物碱类比如长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨也能够抑制有丝分裂。
“染色质抑制剂”或“拓扑异构酶抑制剂”是抑制形成染色质的蛋白比如拓扑异构酶I和II的正常功能的物质。这样的抑制剂的实例包括,对于拓扑异构酶I有喜树碱及其衍生物,比如伊立替康或托泊替康;对于拓扑异构酶II,有依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷。
“抗血管生成剂”是抑制血管生长的任何药物、化合物、物质或试剂。抗血管生成剂的实例包括,但不限于雷佐生、马立马司他、巴马司他、普啉司他、坦诺司他、伊洛马司他、CGS-27023A、卤夫酮、COL-3、新伐司他、BMS-275291、沙利度胺、CDC 501、DMXAA、L-651582、角鲨胺、内皮抑素(endostatine)、SU5416、SU6668、干扰素α、EMD121974、白介素12、IM862、血管他丁和vitaxin。
“抗雌激素剂”或“雌激素拮抗剂”指降低、拮抗或抑制雌激素作用的任何物质。这样的试剂的实例是他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、iodoxyfene、阿那曲唑、来曲唑(letrozole)和依西美坦。
“抗雄激素剂”或“雄激素拮抗剂”指降低、拮抗或抑制雄激素作用的任何物质。抗雄激素剂的实例包括氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、螺内酯、乙酸环丙孕酮、非那雄胺和甲氰咪胍。
免疫调节剂是刺激免疫系统的物质。免疫调节剂的实例包括干扰素,白细胞介素比如阿地白介素、OCT-43、:地尼白介素-毒素连接物或白介素-2,肿瘤坏死因子比如他索纳明(tasonermine)或其它类型的免疫调节剂,比如蘑菇多糖、西佐喃、罗喹美克、匹多莫德、培加酶、胸腺五肽(thymopentine)、poly I:C或与5-氟尿嘧啶联合的左旋咪唑。
对于进一步的细节,本领域技术人员可参照the French Association of Therapeutic Chemistry Teachers出版的名为“Therapeutic Chemistry,vol.6,Antitumor drugs and perspectives in the treatment of cancer,TEC and DOC edition,2003[法语]”的手册。
在一个特别优选的实施方式中,作为联合产物的本发明的所述组合物的特征在于所述细胞毒剂以化学方式结合至所述抗体上用于同时使用。
在一个特别优选的实施方式中,所述组合物的特征在于所述细胞毒剂/细胞增殖抑制剂选自纺锤体抑制剂或稳定剂,优选长春瑞滨和/或长春氟宁和/或长春新碱。
为了促进所述细胞毒剂与根据本发明的抗体之间的结合,可在结合的两种化合物之间引入间隔分子,比如聚(亚烷基)二醇聚乙二醇或氨基酸;或者,在另一个实施方式中,可以使用其中已引入能够与所述抗体反应的功能的所述细胞毒剂的活性衍生物。这些结合技术是本领域技术人员熟知的,在本说明书中将不再更详细地讨论。
其它EGFR抑制剂包括,但不限于单克隆抗体C225和抗EGFR 22Mab(ImClone Systems Incorporated)、ABX-EGF(Abgenix/Cell Genesys)、EMD-7200(Merck KgaA)或化合物ZD-1834、ZD-1838和ZD-1839(AstraZeneca)、PKI-166(Novartis)、PKI-166/CGP-75166(Novartis)、PTK 787(Novartis)、CP 701(Cephalon)、来氟米特(flunomide,Pharmacia/Sugen)、CI-1033(Warner Lambert Parke Davis)、CI-1033/PD 183、805(Warner Lambert Parke Davis)、CL-387、785(Wyeth-Ayerst)、BBR-1611(Boehringer Mannheim GMBH/Roche)、Naamidine A(Bristol-board Myers Squibb)、RC-3940-II(Pharmacia)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、OLX-103(Merck & Co)、VRCTC-310(Ventech Research),EGF融合毒素(Seragen Inc.)、DAB-389(Seragen/Lilgand)、ZM-252808(Imperial Cancer Research Fund)、RG-50864(INSERM)、LFM-A12(Parker Hughes Center Cancer)、WHI-P97(Parker HughesCenter Cancer)、GW-282974(Glaxo)、KT-8391(Kyowa Hakko)或“EGFR疫苗”(York Medical/Centro of Immunologia Molecular)。
本发明的另一个方面涉及特征在于至少一种所述抗体或其衍生化合物或功能片段与细胞毒素和/或放射性同位素联合或结合的组合物。
优选地,所述毒素或所述放射性同位素能够阻止肿瘤细胞的生长或增殖,特别是能够完全灭活所述肿瘤细胞。
还优选的,所述毒素是肠道细菌毒素,特别是假单胞菌外毒素A。
优选与治疗性抗体联合使用的放射性同位素是放射γ射线的放射性同位素,优选碘131、钇90、金199、钯100、铜67、铋217和锑211。在治疗上也可以使用放射α和β射线的放射性同位素。
“与至少一种本发明的抗体或其功能片段联合的毒素或放射性同位素”指使所述毒素或所述放射性同位素可能与至少一种抗体结合,特别是通过两个化合物之间的共价结合(引入或不引入结合分子)的任何方法。
使全部或部分偶联物元素形成化学键(共价键)、静电键、或非共价键的试剂的实例包括,特别是苯醌、碳化二亚胺,更特别地是EDC(1-乙基-3-[3-二甲基-氨基丙基]-碳二亚胺-盐酸盐)、二马来酰亚胺、二硫代双硝基苯甲基(DTNB)酸、N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、具有一个或多个基团的桥键试剂、具有一个或多个侧苯基(phenylaside)基团(与紫外线(UV)反应)的桥键试剂,最优选N-[-4(叠氮水杨酰氨基)丁基]-3’-(2’-二硫代吡啶基)-丙酰胺(APDP)、N-琥珀酰亚胺基3(2-二硫代吡啶基)丙酸酯(SPDP)和6-肼基-烟酰胺(HYNIC)。
特别是对于放射性同位素,另一种结合形式可以由双功能离子螯合剂组成。
这样的螯合剂的实例包括来源于EDTA(乙二胺四乙酸)或DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)的螯合剂,其被开发用于使金属,特别是放射性金属与免疫球蛋白结合。因此,DTPA及其衍生物可以在碳链上被各种基团置换以增加配基-金属复合体的稳定性和刚性(Krejcarek等人,1977;Brechbiel等人,1991;Gansow,1991;美国专利4,831,175)。
例如,DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)及其衍生物,以其游离形式或以其与金属离子复合的形式,长时间广泛应用于药物和生物学,显示出与金属离子形成稳定螯合剂的显著特征,该稳定螯合剂可以与治疗目的或诊断目的的蛋白比如抗体偶联,以开发用于癌症治疗的放射免疫偶联物(Meases等人,1984;Gansow等人,1990)。
还优选地,形成所述偶联物的本发明的所述至少一种抗体选自其功能片段,特别是丧失其Fc成分的片段,如scFv片段。
本发明还包含所述组合物在制备旨在用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
本发明还涉及抗体或其衍生化合物或功能片段(优选人源化的)和/或根据本发明的组合物在制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途。通常,本发明涉及抗体或其衍生化合物或功能片段(优选人源化的)和/或组合物在制备用于癌症预防或治疗的药物中的用途。
可以预防和/或治疗的优选的癌症包括前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌或任何其它癌症。
本发明还涉及如上所述的抗体、或其衍生化合物或功能片段和/或其组合物在制备用于调节细胞中CXCR4活性的药物中的用途。
本发明的另一个方面涉及所述的抗体在与CXCR4表达水平相关的疾病的诊断方法,优选体外诊断方法中的用途。优选地,在所述诊断方法中的所述CXCR4蛋白的相关疾病是癌症。
因此,本发明的抗体或其衍生化合物或功能片段可以用于生物样品中的CXCR4蛋白的体外检测和/或定量方法中,特别是用于与该蛋白异常表达相关的疾病比如癌症的诊断中,其中所述方法包括下述步骤:
a)使生物样品与根据本发明的抗体或其衍生化合物或功能片段接触;
b)证实可能形成的抗原-抗体复合体。
因此,本发明还包括用于实施所述方法的试剂盒或配件,其包括下述元素:
a)本发明的多克隆或单克隆抗体;
b)任选地,构成有益于免疫反应的介质的试剂;
c)任选地,显示免疫反应产生的抗原-抗体复合体的试剂。
有利地,可以将抗体或其功能片段固定在支持物上,特别是固定在蛋白芯片上。一种这样的蛋白芯片是本发明的目标。
有利地,可以将蛋白芯片用于检测和/或定量生物样品中的CXCR4蛋白所需的试剂盒或配件中。
必须指出,术语“生物样品”在本文中涉及取自活生物体的样品(特别是血液、组织、器官或其它取自哺乳动物特别是人的样品)或任何可能包含一种这样的CXCR4蛋白的样品(比如,细胞样品,如果需要的话,是转化的细胞样品)。
所述抗体或其功能片段可以是免疫偶联物的形式或标记抗体的形式,以获得可检测和/或可定量的信号。
本发明的标记抗体或其功能或片段包括,例如抗体偶联物(免疫偶联物),其可以例如与酶结合,这些酶比如过氧化物酶、碱性磷酸酶、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱脂酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或葡萄糖-6磷酸脱氢酶,或者可以与分子结合,比如生物素、地高辛或5-溴代脱氧尿嘧啶核苷。荧光标记也可以结合本发明的抗体或其功能片段,包括特别是荧光素及其衍生物、荧光染料、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、绿色荧光蛋白(GFP)、丹酰、伞形酮等。在这样的偶联物中,本发明的抗体或其功能片段也可以通过本领域技术人员已知的方法制备。它们可以与酶或荧光标记直接结合;通过间隔子基团或连接基团比如多醛、戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)或二亚乙基三胺五乙酸(DPTA)结合;或者在结合剂比如上述提及的用于治疗性偶联物的结合剂的存在下结合。带有荧光标记的偶联物可以与异硫氰酸酯发生反应来制备。
其它偶联物还可以包括化学发光标记,比如鲁米诺和二氧杂环丁烷(dioxetane),生物发光标记比如荧光素酶和荧光素,或放射性标记,比如碘123、碘125、碘126、碘133、溴77、锝99m、铟111、铟113m、镓67、镓68、钌95、钌97、钌103、钌105、汞107、汞203、铼99m、铼101、铼105、钪47、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168、氟18、钇199和碘131。放射性同位素与抗体结合的本领域技术人员已知的现有方法,直接结合或通过螯合剂比如上述提及的EDTA或DTPA结合,可以作为诊断性放射性同位素使用。因此,应该提到,通过氯胺T技术用[I125]钠标记[Hunter W.M.和Greenwood F.C.(1962)Nature 194:495];用Crockford等人描述的锝99m标记(美国专利4,424,200)或者通过Hnatowich描述的DTPA结合(美国专利4,479,930)。
本发明还涉及根据本发明的抗体在制备用于将具有生物活性的化合物特异性靶向表达或过表达CXCR4的细胞的药物中的用途。
在本说明书的意义上,“具有生物活性的化合物”是任何能够调节特别是抑制细胞活性,特别是生长活性、增殖活性、转录和基因翻译活性的化合物。
本发明还涉及由根据本发明的抗体或其功能片段,优选标记的抗体或其功能片段,特别是放射性标记的抗体或其功能片段组成的体内诊断试剂,及其在医学成像中的用途,特别是在细胞表达或过表达CXCR4相关癌症的检测中的用途。
本发明还涉及作为联合产物的组合物或涉及用作药物的根据本发明的抗CXCR4/毒素偶联物或放射性同位素。
优选地,所述作为联合产物的组合物或所述偶联物中补充有赋形剂和/或药物载体。
在本说明书中,“药物载体”指进入药物组合物中的化合物或联合的化合物,不会引起次级反应,并且例如促进活性化合物的给药、延长其在生物体中的存在时间和/或有效性、增强其在溶液中的溶解性或改善其贮存。这样的药物载体是本领域技术人已熟知的,并且可由本领域技术人员根据所选活性化合物的性质和给药途经进行适应性调整。
优选地,这样的化合物通过全身途径给药,特别是通过静脉内、肌内、皮内、腹膜腔内、皮下或口服途径给药。更优选地,由根据本发明的抗体组成的组合物分间隔时间相同的几次剂量给药。
根据制定适合患者的治疗方法时一般考虑的条件,比如例如,患者的年龄或体重、其一般状态的严重程度、其对治疗的耐受性和经历过的副作用,可以确定其给药途径、剂量时间表和最佳盖仑形式。
因此,本发明涉及抗体或其功能片段之一在制备用于将具有生物活性的化合物特异性靶向表达或过表达CXCR4的细胞的药物中的用途。
本发明的其它特征和优点用实施例和附图(其图例如下显示)在说明书中进一步描述。
附图说明
图1A和1B分别显示qPCR分析的癌细胞中CXCR4和CXCR2的表达。
图2显示FACS分析的癌细胞中CXCR4和CXCR2蛋白的表达。
图3A和3B显示在稳定地表达野生型人类CXCR4的CHO-K1细胞的细胞膜上,未标记的SDF-1(图3A)和414H5和515H7Mab(图3B)对特异性[125I]SDF1结合的竞争(T:全部结合;NS:非特异性结合)。
图4A和4B显示通过监测NIH-3T3细胞中稳定地表达野生型CXCR4受体的[35S]GTPγS结合反应,414H5 Mab(图4A)和515H7 Mab(图4B)对G蛋白活化的调节。
图5显示通过监测SDF-1(10和100nM)刺激的HeLa人肿瘤细胞的[35S]GTPγS结合反应,抗CXCR4 Mab 414H5和515H7对G蛋白活化的调节。
图6A-6F显示在HEK293细胞中,通过生物发光共振能量转移(BRET)方法,通过SDF-1和414H5与515H7 Mab调节CXCR4受体与不同相互作用配偶体的结合。(图6A和6B:CXCR4:CXCR4同二聚化;图6C和6D:CXCR2:CXCR4异二聚化,图6E和6F:CXCR4介导的β-抑制蛋白(arrestin)的募集。
图7A和7B显示在稳定地表达CXCR4受体的NIH3T3细胞中,SDF-1和414H5和515H7 Mab对福斯高林刺激的cAMP生成的抑制。
图8显示通过监测稳定地表达于CHO-K1细胞中的组成性活性突变体Asn119Ser CXCR4受体的[35S]GTPγS结合反应,抗CXCR4 Mab 414H5和515H7对G蛋白活化的调节。
图9图解了在体外Mab 414H5对SDF-1诱导的Hela细胞增殖的抑制。
图10A和10B显示在体外CXCR4 Mab 414H5(图10A)和Mab 515H7(图10B)对SDF-1诱导的U937细胞迁移的抑制。
图11显示在Nod/Scid小鼠中,抗CXCR4 Mab 414H5(A)和Mab 515H7(B)对MDA-MB-231异种移植物肿瘤生长的抑制。
图12显示在U937Nod/Scid小鼠存活模型中,抗CXCR4 Mab 414H5的活性。
图13A-13C显示在CHO-CXCR4细胞(图13A)和MDA-MB-231(图13B)、U937(图13C)癌细胞中,抗CXCR4 Mab 515H7对SDF-1诱导的钙释放的抑制。
图14显示在Nod/Scid小鼠中,414H5对T细胞KARPAS 299异种移植物肿瘤的抑制。
图15显示在U937Nod/Scid小鼠存活模型中,鼠的抗CXCR4 Mab m515H7的活性。
图16显示在Nod/Scid小鼠中,鼠的抗CXCR4 Mab m515H7在抑制T细胞KARPAS 299异种移植物肿瘤生长中的活性。
图17显示在稳定地表达野生型人类CXCR4的CHO-K1细胞的细胞膜上,鼠的m414H5和m515H7 Mab和嵌合的Mab c414H5和c515H7对特异性[125I]SDF1结合的竞争(T:全部结合;NS:非特异性结合)。
图18显示通过监测用SDF-1(10nM)刺激的NIH-3T3细胞中稳定地表达的野生型CXCR4受体的[35S]GTPγS结合反应,鼠的m414H5和m515H7 Mab和嵌合的Mab c414H5和c515H7对G蛋白活化的调节。
图19显示通过监测用SDF-1(10nM)刺激的HeLa人肿瘤细胞的[35S]GTPγS结合反应,抗CXCR4鼠的m414H5和m515H7 Mab和嵌合的Mab c414H5和c515H7对G蛋白活化的调节。
图20A-20C显示在HEK293细胞中,通过生物发光共振能量转移(BRET)方法,由SDF-1和由m414H5、c414H5、m515H7和c515H7 Mab调节CXCR4受体与不同相互作用配偶体的结合。(图20A:CXCR4:CXCR4同二聚化;图20B:CXCR2:CXCR4异二聚化,图20C:CXCR4介导的β-抑制蛋白的募集。
图21A和21B显示在CHO-CXCR4细胞(图21A)和U937细胞(图21B)中,SDF-1诱导的钙释放的抑制。
图22A和22B显示在体外CXCR4 Mab m414H5和c414H5(图22A)和Mab m515H7和c515H7(图22B)对SDF-1诱导的U937细胞迁移的抑制。
图23显示在U937 Nod/Scid小鼠存活模型中,抗CXCR4嵌合的Mab c414H5和c515H7的活性。
具体实施方式
实施例
实施例1:癌细胞中CXCR4和CXCR2的表达
-Q-PCR分析:
为了定量不同癌细胞系中CXCR4和CXCR2的相对表达,使用实时RT-PCR。
使用RNeasy Mini或Midi Protocols(Qiagen Corporation,France)从不同的细胞系提取RNA样品。然后,使用Experion自动电泳系统(BIO-RAD Corporation,France)控制RNA样品,其显示出良好的质量/完整性。使用iScript cDNA合成试剂盒(BIO-RAD Corporation,France)将1μg的每种RNA样品转化为cDNA模板。对于CXCR2,用TaqMan探针,对于CXCR4,用SYBERGreen,使用qPCR定量cDNA水平。比较样品需要标准化,因此引入内参照RPL0。TaqMan探针(用于CXCR2)带有5’FAM受体标记和3’TAMRA猝灭剂基团。通过在50℃下加热2分钟和在95℃下加热10分钟活化PCR酶。使用两个步骤的方法,在包含5μl的cDNA模板(1/20稀释)、1×qPCR Mastermix(TaqMan Universal PCR Master Mix,Applied Biosystems corporation,Branchburg New Jersey,USA)、50至900nM的每种引物和50至100nM探针的PCR混合物(总体积50μl)中,95℃下15秒,和62℃下1分钟,进行40或45个循环。使用iCycler仪器(BIO-RAD Corporation)进行所有的反应。使用Q-PCR测定循环阈值(Ct)。Ct值越小,待试验的基因表达的越多。用于大的人核糖体蛋白P0的引物和探针为:
正向引物,5’-GAAACTCTGCATTCTCGCTTCCTG-3’(SEQ ID No.32);
反向引物,5’-AGGACTCGTTTGTACCCGTTGA-3’(SEQ ID No.33);
探针,5-(FAM)-TGCAGATTGGCTACCCAACTGTTGCA-(TAMRA)-3’(SEQ ID No.34)。
用于人CXCR4(趋化因子受体4)的引物为:
正向引物,5’-CTCCTTCATCCTCCTGGAAATC-3’(SEQ ID No.35);
反向引物,5’-CCAAGGAAAGCATAGAGGATGG-3’(SEQ ID No.36)。
用于人CXCR2(趋化因子受体2)的引物和探针为:
正向引物,5’-GTGGTCATTATCTATGCCCTGG-3’(SEQ ID No.37);
反向引物,5’-CGACCCTGCTGTATAAGATGAC-3’(SEQ ID No.38);
探针,5-(FAM)-TATTCCTGCTGAGCCTGCTGGGAAA-(TAMRA)-3’(SEQ ID No.39)。
在我们的比较研究中,在两个不同的样品:待试验的细胞系和参照细胞系中定量两个基因[试验的基因(CXCR4或CXCR2)和RPL0])的表达。所述参照细胞系对应于包含最低表达定量基因的细胞系。使用下式进行比较性基因表达的计算:
相对基因表达=(1+E基因)-ΔCt(1)/(1+ERPL0)--ΔCt(2)
E基因=使用定量基因的引物/探针的PCR效率
ERPL0=使用RPL0引物/探针的PCR效率
Ct=阈值循环数
ΔCt(1)=Ct基因(试验细胞系)-Ct基因(参照细胞系)
ΔCt(2)=CtRPL0(试验细胞系)-CtRPLO(参照细胞系)
对于每种PCR系列,计算相对基因定量值,考虑从最高到阴性的表达水平,将癌细胞系分组。将所有数据都列在图1A和1B中。除了DU145和U-87MG只表达CXCR2(图1B),待试验的其它所有癌细胞系都表达CXCR4(图1A)和CXCR2。
-FACS分析:
透化MDA-MB-231、PC3和U937癌细胞系,然后,用10μg/mL的抗CXCR4单克隆抗体[44717(R & DSystems)对比其同种型对照IgG2b(SIGMA]或10μg/mL的抗-CXCR2单克隆抗体(抗h-CXCR2、克隆48311,R & D Systems,Mab 331对比其同种型对照IgG2a)进行孵育。接着,用1%的BSA/PBS/0.01%NaN3洗涤细胞。接着,将Alexa标记的第二抗体加入细胞中,并使其在4℃下孵育20分钟。然后,再次洗涤细胞两次。在第二次洗涤之后,进行FACS分析。这些结合研究的结果提供在图2中。因此,肿瘤细胞比如MDA-MB-231、PC3和U937同时表达CXCR4和CXCR2蛋白。
实施例2:抗人CXCR4的单克隆抗体(Mab)的产生
为了产生CXCR4的单克隆抗体,用重组NIH3T3-CXCR4细胞和/或对应于CXCR4细胞外N末端和环的肽免疫接种Balb/c小鼠。在第一次免疫接种时,用完全Freund氏佐剂中的抗原皮下(s.c.)免疫接种6-16周龄的小鼠一次,接着用不完全Freund氏佐剂中的抗原皮下免疫接种2至6次。通过眶后放血监测免疫应答。通过ELISA(如下描述的)筛选血清,并且使用具有较高滴度的抗CXCR4抗体的小鼠进行融合。在处死并切除脾脏前两天,用抗原静脉内免疫加强(boost)小鼠。
-ELISA
为了选择产生抗CXCR4抗体的小鼠,通过ELISA试验来自免疫接种的小鼠的血清。简而言之,用以5μg当量肽/mL结合BSA的纯化的[1-41]N末端肽包被微量滴定板,在4℃下以100μl/孔孵育过夜,然后用250μl/孔的PBS中的0.5%明胶封闭。将来自CXCR4免疫的小鼠的血浆稀释液加入至每孔中,并在37℃下孵育2小时。用PBS洗涤平板,然后,在37℃下,用结合HRP(Jackson Laboratories)的山羊抗小鼠IgG抗体孵育1小时。在洗涤之后,用TMB底物使平板显影,在5分钟之后,通过加入100μl/孔的1M H2SO4终止该反应。使用出现最高滴度的抗CXCR4抗体的小鼠进行抗体产生。
-产生CXCR4的Mab的杂交瘤的产生
用PEG将从出现最高滴度的抗CXCR4抗体的Balb/c小鼠中分离的小鼠脾细胞融合至小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/O。将细胞以约1×105/孔植板于微量滴定板,接着在包含超培养基+2mM L-谷氨酰胺+1mM丙酮酸钠+1x HAT的选择培养基中孵育2周。然后,通过ELISA筛选各孔的抗CXCR4单克隆IgG抗体。然后,通过有限稀释,将抗体分泌杂交瘤亚克隆至少两次,体外培养以产生抗体,用于进一步的分析。
实施例3:通过FACS分析的抗CXCR4 Mab 414H5和515H7结合特异性和癌细胞系识别的鉴定
在该实验中,通过FACS分析检查了抗CXCR4 Mab 414H5和515H7的对人CXCR4的特异性结合。
用10μg/ml的单克隆抗体414H5和515H7孵育NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4转染的细胞、MDA-MB-231、Hela和U937癌细胞系。然后,用1%的BSA/PBS/0.01%NaN3洗涤该细胞。接着,将Alexa标记的第二抗体加入至所述细胞中,并在4℃下孵育20min。然后,再次洗涤该细胞两次。在第二次洗涤之后,进行FACS分析。将这些结合研究的结果提供在下表4中,其显示[通过FACS获得的平均荧光强度(MFI)]抗CXCR4 Mab 414H5和515H7特异性结合人CXCR4-NIH3T3转染的细胞系,而在亲代NIH3T3细胞上无识别。这些Mab也能够识别人癌细胞系,例如MDA-MB-231乳腺癌细胞、U937早幼粒细胞性癌细胞和Hela宫颈癌细胞。
抗CXCR4 Mab 414H5和515H7识别NIH3T3-hCXCR4转染子,而不能识别亲代NIH3T3野生型细胞。Mab 414H5和515H7也能够识别癌细胞系。
表4
实施例4:在稳定地表达人CXCR4受体的CHO-K1膜上,抗CXCR4 Mab 414H5和515H7对[125I]SDF-1的竞争结合
该测定允许评价414H5和515H7 Mab在正构(orthosteric)结合位点或变构(allosteric)结合位点,竞争放射标记的[125I]SDF-1与人CXCR4受体结合的能力。
稳定地和组成性表达人CXCR4受体的CHO-K1细胞是当用带有人CXCR4受体的全部编码序列(RefSeq NM_003467)的哺乳动物表达载体转染原态CHO-K1细胞(ATCC CCL-61)时获得的。将细胞在完全培养基[补充有5%胎牛血清(FCS)和500μg/ml遗传霉素的DMEM-Ham’s F12]中繁殖。放射性配体结合实验在将CHO/CXCR4细胞机械性粉碎(mechanical scrapping)于裂解缓冲剂[Hepes 20mM,pH 7.4,NaCl 150mM]中,接着离心(10000g,15min)时获得的细胞膜上进行。使用SPA技术(闪烁亲近测定法-GE Healthcare)进行[125I]SDF-1结合(比活度:1500Ci/mmol)。简而言之,将细胞膜(30μg/孔)与评价的化合物(SDF-1或mAb)、放射性配体(1nM)和最后与SPA-WGA-PVT珠子(7.3mg/孔)一起在结合缓冲液[Hepes20mM,pH 7.4,CaCl2 1mM,MgCl2 5mM,NaCl 150mM,BSA 1%]中孵育。在25℃下1小时之后,达到结合平衡。当离心[1000g,10分钟]时,在闪烁计数器(TopCount,Perkin Elmer)中测量放射性计数。在10μM未标记的SDF-1的存在下,评价非特异性结合。
未标记的SDF-1剂量依赖性抑制了[125I]SDF-1结合,pKi值(IC50=产生特异性[125I]SDF-1结合50%抑制的配体浓度)为7.75±0.27nM(n=4)(图3A)。在相同的实验条件下,我们的抗CXCR4 Mab(100nM)有效地竞争[125I]SDF-1结合,具有下述等级次序的竞争功效([125I]SDF-1的抑制%):515H7(64±3%)、414H5(43±4%)(图3B)。
实施例5:抗CXCR4 Mab 414H5和515H7对表达野生型CXCR4受体的细胞膜上[35S]GTPγS结合的调节
该功能性测定能够通过野生型人CXCR4受体监测G蛋白活化及CXCR4配体和414H5和515H7 mAb对其的调节。
如上述实施例中对于CHO-K1细胞所描述的,获得稳定地和组成性表达野生型CXCR4受体的NIH-3T3细胞。将HeLa(人宫颈癌)细胞繁殖在完全培养基[补充有10%FCS、1%L-谷氨酰胺、2μ碳酸氢钠的EMEM]中。在机械性粉碎在裂解缓冲液[Hepes 20mM,pH 7.4,NaCl 150mM]中,并进一步离心(10000g,15min)时获得的细胞膜上进行[35S]GTPγS结合。使用SPA技术(闪烁亲近测定法-GE Healthcare)进行[35S]GTPγS(比活度:1000Ci/mmol)的掺入和检测。简而言之,将细胞膜(10μg/孔)与评价的化合物(SDF-1或目的mAb)、[35S]GTPγS(0.2-0.4nM)和最后与SPA-WGA-PVT珠子(7.3mg/孔)一起在结合缓冲液[Hepes 20mM,GDP 3μM,MgCl210mM,NaCl 100mM,EDTA 1mM,pH=7.4]中孵育。在25℃下,在1小时期间进行结合反应。当离心[1000g,10min.]时,在闪烁计数器(TopCount,Perkin Elmer)中测量放射性计数。通过应用Cheng Prussof方程式计算拮抗剂效价:
KB=[拮抗浓度]/{(EC50’/EC50)-1}其中EC50和EC50’分别为在不存在或存在mAb下,SDF-1的效价。
作为CXCR4受体活化G蛋白的结果,SDF-1诱导[35S]GTPγS结合的剂量依赖性增加。[35S]GTPγS结合的最大刺激分别表示高于对HeLa和NIH3T3/CXCR4细胞膜的基础[35S]GTPγS结合的167%和320%。对于这两种细胞系,SDF-1的效价类似,对应于41.3±9.7nM(图4A-4B)。在这些实验条件下,如在NIH3T3/CXCR4细胞中测定的414H5和515H7 Mab的拮抗剂效价分别为51nM和15nM。对于HeLa细胞,观察到类似的拮抗剂功效(图5)。
实施例6:CXCR4与不同相互作用配偶体的结合:同二聚化和异二聚化,通过生物发光共振能量转移(BRET)方法的β-抑制蛋白的募集,及414H5和515H7Mab对这些二聚体的作用
该功能性测定能够评价当SDF-1和/或414H5和515H7 Mab以CXCR4同二聚体和CXCR2/CXCR4异二聚体形成的水平结合CXCR4受体以及募集β抑制蛋白-2信号传导蛋白时诱导的构象变化。
通过采用常规分子生物学技术将每个研究的相互作用配偶体的表达载体构建成具有相应染料(海肾(Renilla reniformis)荧光素酶,Rluc和黄色荧光蛋白,YFP)的融合蛋白。在进行BRET实验前两天,用编码如下相应BRET配偶体的表达载体瞬时转染HEK293细胞:研究CXCR4同二聚化的[CXCR4/Rluc+CXCR4/YFP]、研究CXCR4和CXCR2异二聚化的[CXCR4/Rluc+CXCR2:YFP]和研究CXCR4介导的β抑制蛋白-2募集的[CXCR4/Rluc+β-arr2:YFP]。第二天,将细胞分配至聚赖氨酸预包被的白色96MW平板中的完全培养基[补充有10%FBS的DMEM]中。在37℃下,用5%CO2首先培养细胞,以使细胞粘附该平板。然后,用200μl的DMEM/孔使细胞饥饿过夜。在BRET试验之前,立即除去DMEM,并用PBS快速洗涤细胞。然后,在存在或不存在抗体下,在37℃下,将细胞在PBS中孵育10分钟,之后加入有或无SDF-1 300nM的腔肠素(coelenterazine)H 5μM,最终体积50μl。在37℃下进一步孵育10分钟,使用Mithras LB940多标记读数器(Berthold)(1s/波长/孔,在室温下重复15次)开始在485nm和530nm的光发射采集。
如前所述(Angers等人,2000)进行BRET比例的计算:[(发射波长530nm)-(发射波长485nm)×Cf]/(发射波长485nm),其中对于在相同实验条件下单独表达Rluc融合蛋白的细胞,Cf=(发射波长530nm)/((发射波长485nm)。简单化该方程式显示出BRET比例对应于两种BRET配偶体存在时获得的比例530/485nm,通过该测定中仅仅存在融合Rluc的配偶体时,在相同实验条件下获得的比例530/485nm进行校正。为了易读起见,将结果以milliBRET单位(mBU)表示;mBU对应于BRET比例乘以1000。
由融合CXCR4受体的衔接蛋白和受体蛋白的空间接近性引起的BRET信号的SDF1(300nM)增加20%,很可能表明CXCR4/CXCR4同二聚体形成或先前存在的二聚体的构象变化(图6A和6B)。令人感兴趣的是,由融合CXCR2和CXCR4的衔接蛋白和受体蛋白的空间接近性引起的BRET信号的SDF1(300nM)降低24%,或许也表明CXCR4/CXCR4异二聚体形成或先前存在的二聚体的构象变化(图6C和6D)。在后者情况下,SDF-1活化的CXCR4/CXCR2的构象似乎对于BRET能量转移较不利。在两种情况下,414H5和515H7 Mab能够调节SDF-1诱导的CXCR4同二聚体(对于414H5,SDF-1诱导的BRET增加63%抑制,对于515H7,SDF-1诱导的BRET增加69%抑制,分别为图6A和6B)以及CXCR2/CXCR4异二聚体的形成(对于414H5,SDF-1诱导的BRET减少50%抑制,对于515H7,SDF-1诱导的BRET减少90%抑制,分别为图6C和6D)的构象改变。414H5和515H7 Mab也能够分别独立地调节CXCR4/CXCR4和CXCR2/CXCR4的空间接近性,表明414H5和515H7 Mab对于CXCR4/CXCR4同二聚体和CXCR2/CXCR4异二聚体的构象都有影响(图6A、6B、6C和6D)。
SDF-1(300nM)对CXCR4的活化引起强的细胞内信号传导分子β抑制蛋白的募集,如BRET信号增强233%所示(图6E和6F)。该募集部分地被414H5和515H7 Mab抑制(对于414H5,约20%抑制,对于515H7,95%抑制,分别为图6E和6F),显示出Mab 414H5和515H7对信号传导的作用。
实施例7:CXCR4介导的cAMP产生的抑制
该功能性测定设计用于监测通过抑制性Gi/o蛋白的腺苷酸环化酶水平的CXCR4受体信号。
按照供应商提供的详细描述应用cAMP LANCE方法(Perkin Elmer)。简而言之,获得稳定地和组成性表达野生型CXCR4受体的NIH3T3细胞,并如上所述繁殖。使用不含胰蛋白酶的试剂Versene收集细胞,并将其以106细胞/ml的浓度重悬于包含结合AlexaFluor的抗cAMP Mab(1/100稀释)和化合物(福斯高林,SDF-1和/或414H5和515H7 Mab)的溶液中。当在室温下培养30分钟时,加入包含铕-抗生蛋白链菌素(1/125稀释)和生物素-cAMP(1/125稀释)复合物的检测混合物。当在室温下孵育1小时时,在Mithras LB940(Berthold)多标记读数器中测量得到的FRET信号。将数据表示为任意的荧光值或相对于减去FK作用时的SDF-1反应的相对刺激。
福斯高林(FK)剂量依赖性刺激NIH3T3/CXCR4细胞中的cAMP产生,效价为约0.3μM(图7A)。在SDF-1共同存在下,由于CXCR4受体对抑制性Gi/o蛋白的活化,细胞内cAMP水平降低。SDF-1的效价为5.0±3.1nM(图7A)。414H5和515H7 Mab有效地抑制了福斯高林刺激的SDF-1(100nM)作用,对于414H5,该抑制在60%以上,对于515H7该抑制在80%以上(图7B)。
实施例8:Mab 414H5和515H7对表达组成性活性突变体Asn119Ser CXCR4受体的细胞膜上[35S]GTPγS结合的调节
该功能性测定能够监测通过组成性活性突变体(CAM)Asn119Ser CXCR4受体的G蛋白活化(参见Zhang等人,2002)。该灵敏的测定能够基于CXCR4配体的内在活性(部分激动剂,沉默拮抗剂或反向激动剂)区别CXCR4配体。如Zhang及其同事之前描述的,CXCR4配体比如AMD3100或T140分别表现为CAM CXCR4受体的部分激动剂和反向激动剂。沉默拮抗剂的鉴定可能很困难,因为这类分子必须对于活性和无活性状态的CXCR4都显示出类似的亲和力(Wurch等人,1999)。
通过应用常规分子生物学技术(QuickChange位点定向诱变试剂盒,Stratagene US)进行CXCR4受体编码序列中Asn119Ser突变的引入。如上述实施例中所述,获得了稳定地和组成性表达CAM CXCR4受体的CHO-K1细胞。在裂解缓冲液[Hepes 20mM,pH 7.4,NaCl 150mM]的机械粉碎和进一步离心(10000g,15min)时获得的细胞膜上进行[35S]GTPγS结合。使用SPA技术(闪烁亲近测定法-GE Healthcare)进行[35S]GTPγS的掺入(比活度:1000Ci/mmol)。简而言之,将细胞膜(10μg/孔)与评价的化合物(SDF-1或mAb)、[35S]GTPγS(0.2-0.4nM)和最后与SPA-WGA-PVT珠子(7.3mg/孔)一起在结合缓冲液[Hepes 20mM,GDP 3μM,MgCl2 10mM,NaCl 100mM,EDTA 1mM,pH=7.4]中孵育。在25℃下,在1小时期间进行结合反应。当离心[1000g,10min.]时,在闪烁计数器(TopCount,Perkin Elmer)中测量放射性计数。
SDF-1(100nM)以130%刺激[35S]GTPγS结合。反向激动剂T140抑制基础的(-17%)和SDF-1刺激的(-159%)[35S]GTPγS结合。相反,414H5和515H7 Mab表现为CAM CXCR4的沉默拮抗剂,而没有改变基础的[35S]GTPγS结合(图8),但是抑制了SDF-1诱导的[35S]GTPγS结合(图8)。
实施例9:在体外CXCR4 Mab 414H5对SDF-1诱导的Hela细胞增殖的抑制
将来自ATCC的HeLa细胞常规培养在EMEM培养基(Lonza Corporation.Verviers.Belgium)、10%FCS(SIGMA Corporation.St Louis.USA)、1%的L-谷氨酰胺(Invitrogen Corporation.Scotland.UK)、2%的碳酸氢钠7.5%溶液(Invitrogen Corporation.Scotland.UK)中。在增殖测定之前,细胞分裂3天,以便其能够融合。
-SDF-1诱导的Hela细胞增殖
将HeLa细胞以200μl不含血清的培养基(EMEM培养基加1%的L-谷氨酰胺、2%的碳酸氢钠7.5%溶液)中1×104细胞/孔的密度植板于96孔组织培养板中。在植板二十四小时之后,将适当稀释的SDF-1加入HeLa细胞中。在总共培养76小时之后,将细胞用0.25μCi的[3H]胸苷(Amersham Biosciences AB.Uppsala.Sweden)脉冲16小时。通过液体闪烁计数定量掺入DNA中的[3H]胸苷的量。
将结果表示为增殖指数=[细胞+SDF-1的平均cpm/细胞-SDF-1的平均cpm]。
用SDF-1(0至1000ng/ml)孵育HeLa细胞。SDF-1刺激体外HeLa细胞增殖1.5至2倍。获得最高和可再现增殖指数的SDF-1的浓度为200ng/ml(25nM)。
-在体外CXCR4 414H5 Mab对SDF-1诱导的Hela细胞增殖的抑制
将HeLa细胞以200μl不含血清的培养基(EMEM培养基加1%的L-谷氨酰胺、2%的碳酸氢钠7.5%溶液)中1×104细胞/孔的密度植板于96孔组织培养板中。在植板二十四小时之后,在存在或不存在SDF-1(最终浓度200ng/ml(25nM))下,将适当稀释的抗CXCR4 Mab 414H5、稀释介质加入HeLa细胞中,一式三份。在总共培养76小时之后,将细胞用0.25μCi的[3H]胸苷(Amersham Biosciences AB.Uppsala.Sweden)脉冲16小时。通过液体闪烁计数定量掺入DNA中的[3H]胸苷的量。
将结果表示为使用下式计算的影响分数(Fa):
Fa=[1-[用Mab+SDF-1孵育的细胞的平均cpm/用稀释介质+SDF-1孵育的细胞的平均cpm)]×100
鉴定抗CXCR4 Mab 414H5对SDF-1诱导的HeLa细胞增殖的体外作用。在有或者没有SDF-1(200ng/ml)下,用414H5 Mab或对照孵育HeLa细胞。SDF-1刺激HeLa细胞的体外生长(1.5至2倍)。在细胞植板24小时之后,通过用0至1500nM范围的连续两倍稀释的Mab处理细胞24小时,获得414H5 Mab的剂量反应曲线。在植板之后评价细胞增殖76小时,每个试验条件都对应于Mab或对照的48小时曝露时间。将结果表示为使用上述Fa式的影响分数。结果(表示在图9中)显示出CXCR4 Mab 414H5在体外抑制SDF-1诱导的Hela细胞增殖。
实施例10:抗CXCR4 Mab 414H5和515H7对SDF-1诱导的U937细胞迁移的作用
为了评价抗CXCR4单克隆抗体414H5和515H7对迁移过程的抑制作用,在孔的底部存在或不存在SDF-1下,且在上室中有或没有Mab 414H5和515H7下,将补充有2%FCS的RPMI 1640培养基中的100000个U-937细胞植板于迁移室的上室中(具有8-μm孔径的24孔平板)。在该试验中,将鼠的IgG2a和IgG2B引入作为同种型对照。在植板两小时之后,计数迁移细胞。呈现在图10A(对于414H5)和10B(对于515H7)中的结果证实,如预期的,SDF-1能够诱导U-937细胞迁移的显著增加。当用IgG2同种型对照孵育细胞时,没有观察到任何作用。相反,对于用414H5和515H7 Mab孵育的细胞,观察到SDF-1诱导的U937细胞迁移的显著和可再现的减少:414H5 Mab减少50%,515H7 Mab减少超过80%。
实施例11:在Nod/Scid小鼠中,抗CXCR4 Mab 414H5对MDA-MB-231异种移植物肿瘤生长的抑制
这些实验的目的是评价抗CXCR4 Mab 414H5和515H7抑制Nod/Scid小鼠中MDB-MB-231异种移植物生长的能力。
将来自ECACC的MDA-MB-231细胞常规培养在DMEM培养基(Invitrogen Corporation,Scotland,UK)、10%的FCS(Sigma,St Louis MD,USA)中。在移植物移入之前,将细胞分裂48小时,以便使其处于指数生长期。将在PBS中的一千万个MDA-MB-231细胞移入7周龄的Nod/Scid小鼠(Charles River,France)中。在植入五天之后,肿瘤是可测量的(34mm3<V3<40mm3),将动物分成具有可比较的肿瘤尺寸的6只小鼠的组。分别腹腔内注射2mg/小鼠加载剂量的Mab 414H5和Mab 515H7处理小鼠。
然后,给小鼠注射1mg/剂量/小鼠的Mab 414H5,每周两次,或者注射0.5mg/剂量/小鼠的Mab 515H7,每周三次。在该实验中,引入PBS组作为对照组。每周测量肿瘤体积两次,并通过下式计算:π/6×长度×宽度×高度。使用Mann-Whitney检验进行每个测量的统计分析。
在该实验中,处理期间没有观察到死亡。与PBS组相比,对于415H5 Mab 1mg/剂量或515H7 0.5mg/剂量,D7和D39(p≤0.002)之间存在显著的肿瘤生长抑制,在处理5周之后,与PBS相比,对于Mab 415H5和515H7,平均肿瘤体积分别减小了82%和50%(图11A和11B)。
实施例12:U937小鼠存活模型中抗CXCR4 Mab 414H5的活性
将来自ATCC的U937细胞培养在RPMI 1640培养基、10%FCS、1%L-谷氨酰胺中。在移植物移入之前,将细胞分裂两天,以便使其处于指数生长期。将一千万个U937细胞腹腔内注射到雌性NOD/SCID小鼠中。在植入两天之后,用加载剂量2mg的414H5 mAb/小鼠处理小鼠,接着用1mg的抗体/小鼠处理小鼠,每周两次。对照小鼠接受已经在前述研究中显示的PBS注射剂,在注射PBS的小鼠和给予小鼠IgG同种型对照的小鼠之间没有观察到存活率的任何差异。每天监测小鼠存活率。
描述在图12中的结果显示出用414H5 Mab处理的小鼠具有引人注意的且显著的寿命增加,T/C%为约343。
实施例13:CXCR4受体介导的细胞内钙贮存的动员
该功能性测定设计用于监测通过刺激磷脂酶C途径、诱导来自内质网的细胞内贮存的钙释放的CXCR4受体信号传导。
如上述实施例中描述的获得稳定地和组成性表达野生型CXCR4受体的CHO-K1细胞。将MDA-MB-231(人乳腺癌)和U937(人淋巴瘤)细胞分别在完全培养基[补充有10%FCS的DMEM]和[补充有10%FCS、20mM HEPES、1%非必需氨基酸溶液、1%丙酮酸钠、1%L-谷氨酰胺、4.5g/l葡萄糖的RPMI 1640]中繁殖。将所有的细胞类型都植板于黑色96MW平板中的合适的培养基中,密度为100,000个细胞/孔。在进行实验之前,使细胞饥饿过夜。在37℃下30min.,接着在25℃下30min.,使细胞负载加样缓冲液[HBSS 1x,HEPES 20mM,丙磺舒酸(Probenicid acid)25mM]中的荧光钙染料(Fluo-4 No Wash,Invitrogen US)。通过直接注射到每个孔中进行SDF-1的刺激。对于拮抗实验,在加入SDF-1之前至少10min.,将10μl的Mab溶液直接加入加样缓冲液中。使用下述设置,在多模式荧光微量板读数器Mithras LB940(Berthold)上进行动力学荧光测量:激发波长485nm,发射波长535nm,激发能为10000个任意单位。在每一秒的0,1秒期间记录每孔中的荧光,在SDF-1注射之前,记录20秒的时期(基础信号)。然后,注射20μl的SDF-1,数据记录持续2min的时期。每个实验条件进行一式双份。首先通过减去基础荧光和没有细胞的对照孔发射的荧光校正每孔的值。相对数据可以表示为SDF-1(100nM)获得的最大刺激的百分数。
SDF1(100nM)诱导重组CHO/CXCR4中细胞内钙的快速和强的释放,而在原态CHO-K1细胞中没有检测到荧光信号。最大强度达到超过基础荧光的>160%,并且当SDF-1刺激时观察到约30秒;用MDA-MB-231和U-937观察到类似的动力学曲线(图13A、13B、13C),虽然SDF-1(100nM)的最大荧光强度较低(基础的130-140%)。在所有三个研究的细胞系中,515H7抗体(133nM)产生SDF-1(100nM)诱导的钙信号的强的和几乎完全的抑制。
实施例14:在Nod/Scid小鼠中,抗CXCR4 Mab 414H5对T细胞KARPAS 299异种移植物肿瘤生长的抑制
该实验的目的是评价抗CXCR4 Mab 414H5抑制Nod/Scid小鼠中KARPAS 299异种移植物生长的能力。
将来自ECACC的KARPAS 299细胞常规培养在RPMI培养基、1%L-Glu和10%FCS(Sigma,St Louis MD,USA)中。在移植物移入之前,将细胞分裂48小时,以便使其处于指数生长期。将PBS中的五百万个KARPAS 299细胞移入7周龄Nod/Scid小鼠(Charles River,France)中。在植入5天之后,肿瘤是可测量的(32mm3<v3<49mm3),并将动物分成具有可比较的肿瘤尺寸的6只小鼠的组。腹腔内注射2mg/小鼠加载剂量的Mab 414H5处理小鼠。
然后,给小鼠注射1mg/剂量/小鼠的Mab 414H5,每周两次。在该实验中,将PBS组引入作为对照组。每周测量肿瘤体积两次,并通过下式计算:π/6×长度×宽度×高度。使用Mann-Whitney检验进行每次测量的统计分析。
在该实验中,处理期间没有观察到死亡。与PBS组相比,对于414H5 Mab 1mg/剂量,D7和D33(p≤0.002)之间存在显著的肿瘤生长抑制,在处理5周之后,与PBS相比,对于Mab 414H5,平均肿瘤体积减小了73%(图14)。
实施例15:U937小鼠存活模型中抗CXCR4 Mab 515H7的活性
将来自ATCC的U937细胞培养在RPMI 1640培养基、10%FCS、1%L-谷氨酰胺中。在移植物移入之前,将细胞分裂两天,以便使其处于指数生长期。将千万个U937细胞腹腔内注射到雌性NOD/SCID小鼠中。在植入两天之后,用加载剂量2mg的515H7 Mab/小鼠处理小鼠,接着用1mg的抗体/小鼠处理小鼠,每周两次。对照小鼠接受已经在前述研究中显示的PBS注射剂,在注射PBS的小鼠和给予小鼠IgG同种型对照的小鼠之间没有观察到存活率的差异。每天监测小鼠存活率。
描述在图15中的结果显示出用515H7 Mab处理的小鼠具有引人注意的和显著的寿命增加,对于515H7 Mab,T/C%为约280(图15)。
实施例16:在Nod/Scid小鼠中,抗CXCR4 Mab 515H7对T细胞KARPAS 299异种移植物肿瘤生长的抑制
该实验的目的是评价抗CXCR4 Mab 515H7抑制Nod/Scid小鼠中KARPAS 299异种移植物生长的能力。
将来自ECACC的KARPAS 299细胞常规培养在RPMI培养基、1%L-Glu和10%FCS(Sigma,St Louis MD,USA)中。在移植物移入之前,将细胞分裂48小时,以便使其处于指数生长期。将PBS中的五百万个KARPAS 299细胞移入7周龄Nod/Scid小鼠(Charles River,France)中。在植入5天之后,肿瘤是可测量的(32mm3<v3<49mm3),并将动物分成具有可比较的肿瘤尺寸的6只小鼠的组。腹腔内注射2mg/小鼠加载剂量的Mab 515H7处理小鼠。
然后,给小鼠注射1mg/剂量/小鼠的Mab 515H7,每周两次。在该实验中,将PBS组引入作为对照组。每周测量肿瘤体积两次,并通过下式计算:π/6×长度×宽度×高度。使用Mann-Whitney检验进行每次测量的统计分析。
在这些实验中,处理期间没有观察到死亡。与PBS组相比,对于515H7 Mab 1mg/剂量,D7和D33(p≤0.002)之间存在显著的肿瘤生长抑制,在处理5周之后,与PBS相比,对于Mab 515H7,平均肿瘤体积减小了63%(图16)。
实施例17:抗CXCR4嵌合Mab c414H5和c515H7的产生
设计了鼠的414H5和515H7 Mab的嵌合形式:其对应于目的鼠抗体的轻链和重链可变结构域,遗传性地融合人Ckappa和IgG1恒定结构域。所有的重组Mab都是在使用具有pCEP4表达载体的HEK293/EBNA系统(InVitrogen,US)瞬时转染时产生的。
对应于414H5和515H7 Mab轻链和重链可变结构域的全部核苷酸序列都是通过全基因合成(Genecust,Luxembourg)来合成的。将它们亚克隆到pCEP4载体(InVitrogen US)中,该载体带有人IgG1免疫球蛋白的轻链[Ckappa]或重链[CH1-铰链-CH2-CH3]恒定结构域的全部编码序列。根据实验手册(Sambrook和Russel,2001)描述的常规分子生物学技术或根据供应商的说明书进行所有的克隆步骤。每个遗传构建体都是通过使用Big Dye终止子循环测序试剂盒(Applied Biosystems,US)的核苷酸测序充分证实的,并使用3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems,US)分析。
将适应悬浮液的HEK293 EBNA细胞(InVitrogen,US)按常规培养在定轨振荡器(110rpm转速)上250ml烧瓶中的50ml不合血清的培养基Excell 293(SAFC Biosciences)中,该不含血清的培养基Excell 293补充有6mM的谷氨酰胺。使用在水中以混合最终浓度1mg/mL制备的直链25kDa聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences)和质粒DNA(最终浓度1.25μg/ml,重链与轻链质粒的比例为1∶1),以2.106个细胞/ml进行瞬时转染。在转染后4小时,将该培养物用一倍体积的新鲜培养基稀释,以获得最终106个细胞/ml的细胞密度。基于细胞生存力和Mab生产监测培养过程。通常,将培养物保持4至5天。在蛋白A树脂(GE Healthcare,US)上,使用常规色谱方法纯化Mab。所有的不同Mab都是以适于功能评价的水平产生的。生产率水平通常在6至15mg/L的纯化Mab的范围。
实施例18:通过FACS分析的抗CXCR4嵌合Mab c414H5和c515H7结合特异性和癌细胞系识别的鉴定
在该实验中,通过FACS分析检查了抗CXCR4嵌合Mab c414H5和c515H7对人CXCR4的特异性结合。
用10μg/mL的单克隆抗体c414H5和c515H7孵育NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4转染的细胞和MDA-MB-231癌细胞系。然后,用1%的BSA/PBS/0.01%NaN3洗涤该细胞。接着,将Alexa标记的第二抗体加入所述细胞中,并使其在4℃下孵育20分钟。然后,再次洗涤所述细胞两次。在第二次洗涤之后,进行FACS分析。将这些结合研究的结果提供在下表5中,其显示[通过FACS获得的平均荧光强度(MFI)]抗CXCR4嵌合Mab c414H5和c515H7特异性结合人CXCR4-NIH3T3转染的细胞系,且还识别人癌细胞系,例如MDA-MB-231乳腺癌细胞。
表5
克隆 | 细胞系上的MFI |
(10μg/ml) | NIH3T3-CXCR4 | MDA-MB-231 |
c414H5 | 1039 | 未测试 |
c515H7 | 2294 | 118 |
实施例19:抗CXCR4鼠的Mab m414H5和m515H7和嵌合的Mab c414H5和c515H7对稳定地表达人CXCR4受体的CHO-K1膜上的[125I]SDF-1的竞争性结合
该测定能够评价鼠Mab m414H5、m515H7和嵌合的Mab c414H5、c515H7在正构或变构结合位点上,竞争放射标记的[125I]SDF-1对人CXCR4受体结合的能力。
稳定地和组成性表达人CXCR4受体的CHO-K1细胞是用带有人CXCR4受体的全部编码序列(RefSeq NM_003467)的哺乳动物表达载体转染原态CHO-K1细胞(ATCC CCL-61)时获得的。将细胞在完全培养基[补充有5%胎牛血清(FCS)和500μg/ml的遗传霉素的DMEM-Ham’s F12]中繁殖。放射性配体结合实验是将CHO/CXCR4细胞机械性粉碎在裂解缓冲剂[Hepes 20mM,pH 7.4,NaCl 150mM]中,接着离心(10000g,15min)时获得的细胞膜上进行的。使用SPA技术(闪烁亲近测定法-GE Healthcare)进行[125I]SDF-1结合(比活度:1500Ci/mmol)。简而言之,将细胞膜(30μg/孔)与评价的化合物(SDF-1或mAb)、放射性配体(1nM)和最后与SPA-WGA-PVT珠子(7.3mg/孔)一起在结合缓冲液[Hepes 20mM,pH 7.4,CaCl2 1mM,MgCl2 5mM,NaCl 150mM,BSA 1%]中孵育。在25℃下1小时之后,达到结合平衡。当离心[1000g,10分钟]时,在闪烁计数器(TopCount,Perkin Elmer)中测量放射性计数。在10μM未标记的SDF-1的存在下,评价非特异性(NS)结合。
抗CXCR4 Mab(100nM)有效地竞争[125I]SDF-1结合,具有下述等级次序的竞争功效([125I]SDF-1的抑制%):m515H7(62±10%)、c515H7(55±4%)、m414H5(30±5%)和c414H5(21±10%)(图17)。
实施例20:抗CXCR4鼠的Mab m414H5和m515H7和嵌合的Mab c414H5和c515H7对表达野生型CXCR4受体的细胞膜上[35S]GTPγS结合的调节
该功能性测定能够监测通过野生型人CXCR4受体的G蛋白活化及抗CXCR4鼠的Mab m414H5、m515H7和嵌合的Mab c414H5、c515H7对其的调节。
如上述实施例中对于CHO-K1细胞所描述的,获得了稳定地和组成性表达野生型CXCR4受体的NIH-3T3细胞。将HeLa(人宫颈癌)细胞繁殖在完全培养基[补充有10%FCS、1%L-谷氨酰胺、2μM碳酸氢钠的EMEM]中。在机械性粉碎在裂解缓冲液[Hepes 20mM,pH 7.4,NaCl 150mM]中,并进一步离心(10000g,15min)时获得的细胞膜上进行[35S]GTPγS结合。使用SPA技术(闪烁亲近测定法-GEHealthcare)进行[35S]GTPγS(比活度:1000Ci/mmol)的掺入和检测。简而言之,将细胞膜(10μg/孔)与评价的化合物(SDF-1和目的Mab)、[35S]GTPγS(0.2-0.4nM)和最后与SPA-WGA-PVT珠子(7.3mg/孔)一起在结合缓冲液[Hepes 20mM,GDP 3μM,MgCl2 10mM,NaCl 100mM,EDTA 1mM,pH=7.4]中孵育。在25℃下,在1小时期间进行结合反应。当离心[1000g,10min.]时,在闪烁计数器(TopCount,Perkin Elmer)中测量放射性计数。对于每种Mab计算IC50。
在这些实验条件下,NIH3T3/CXCR4细胞中测定的m414H5、c414H5、m515H7和c515H7 Mab的IC50分别为1.6nM、1.1nM、1.9nM和1.5nM (图18)。在相同的实验条件下,使用Hela细胞测定的m414H5、c414H5、m515H7和c515H7 Mab的IC50分别为0.5nM、0.3nM、0.2nM和0.6nM(图19)。
实施例21:CXCR4与不同相互作用配偶体的结合:同二聚化和异二聚化,通过生物发光共振能量转移(BRET)方法的β抑制蛋白的募集,及鼠的Mab m414H5、m515H7和嵌合的Mab c414H5和c515H7对这些二聚体的作用
该功能性测定能够评价当SDF-1和/或m414H5、m515H7鼠的Mab和c414H5,及c515H7嵌合的Mab以CXCR4同二聚体和CXCR2/CXCR4异二聚体形成的水平结合CXCR4受体以及β抑制蛋白-2信号传导蛋白募集时诱导的构象变化。
通过应用常规分子生物学技术,将每个研究的相互作用配偶体的表达载体构建成具有相应染料(海肾荧光素酶,Rluc和黄色荧光蛋白,YFP)的融合蛋白。在进行BRET实验前两天,用编码如下相应BRET配偶体的表达载体瞬时转染HEK293细胞:研究CXCR4同二聚化的[CXCR4/Rluc+CXCR4/YFP]、研究CXCR4和CXCR2异二聚化的[CXCR4/Rluc+CXCR2-YFP]和研究CXCR4介导的β抑制蛋白-2募集的[CXCR4-Rluc+β-arr2-YFP]。第二天,将细胞分配在聚赖氨酸预包被的白色96MW平板中的完全培养基[补充有10%FBS的DMEM]中。在37℃下,用5%CO2首先培养细胞,以使细胞粘附该平板。然后,以200μl的DMEM/孔使细胞饥饿过夜。在BRET实验之前,立即除去DMEM,并用PBS快速洗涤细胞。然后,在存在或不存在抗体下,在37℃下,将细胞在PBS中孵育15分钟,之后加入有或无SDF-1100nM的腔肠素H 5μM,最终体积50μl。在37℃下孵育5分钟和在室温下仅仅对同二聚体和异二聚体进一步孵育20分钟之后,使用Mithras LB940多标记读数器(Berthold)(1s/波长/孔,在室温下重复15次)开始在485nm和530nm的光发射采集。
如前所述(Angers等人,2000)进行BRET比例的计算:[(发射波长530nm)-(发射波长485nm)×Cf]/(发射波长485nm),其中对于相同的实验条件下单独表达Rluc融合蛋白的细胞,Cf=(发射波长530nm)/(发射波长485nm)。简单化该方程式显示出BRET比例对应于两种BRET配偶体存在时获得的比例530/485nm,以该测定中仅仅存在融合Rluc的配偶体时,相同实验条件下获得的比例530/485nm进行校正。为了易读起见,将结果以milliBRET单位(mBU)表示;mBU对应于BRET比例乘以1000。
由融合CXCR4受体的供体和受体蛋白的空间接近性引起的BRET信号的SDF1(100nM)增加约10%,这可能表明CXCR4/CXCR4同二聚体形成或先前存在的二聚体的构象变化(图20A)。令人感兴趣的是,由融合CXCR4和CXCR2的供体蛋白和受体蛋白的空间接近性引起的BRET信号的SDF1(100nM)降低17%,或许也表明CXCR2/CXCR4异二聚体形成或先前存在的二聚体的构象变化(图20B)。在后者情况下,SDF-1活化的CXCR4/CXCR2的构象似乎对于BRET能量转移较不利。在两种情况下,m414H5、c414H5和m515H7、c515H7 Mab能够调节SDF-1诱导的CXCR4同二聚体(对于c414H5,SDF-1诱导的BRET增加75%抑制,对于c515H7,SDF-1诱导的BRET增加96%抑制,图20A)以及CXCR2/CXCR4异二聚体形成(对于c414H5,SDF-1诱导的BRET减少77%抑制,对于c515H7,SDF-1诱导的BRET减少98%抑制,图20B)的构象变化。m414H5、c414H5、m515H7和c515H7 Mab也能够分别独立地调节CXCR4/CXCR4和CXCR2/CXCR4的空间接近性,表明这些Mab对于CXCR4/CXCR4同二聚体和CXCR2/CXCR4异二聚体构象都存在影响(图20A和20B)。
SDF-1(100nM)对CXCR4的活化引起强的细胞内信号传导分子β抑制蛋白的募集,如BRET信号增强400%所示(图20C)。该募集部分地被c414H5和c515H7 Mab抑制(对于c414H5,约63%抑制,对于c515H7,93%抑制,图20C),显示出这些Mab对信号传导的作用。
实施例22:CXCR4受体介导的细胞内钙贮存的动员
该功能性测定设计用于监测通过刺激磷脂酶C途径、诱导来自内质网的细胞内贮存的钙释放的CXCR4受体信号传导。
如上述实施例中描述的获得稳定地和组成性表达野生型CXCR4受体的CHO-K1细胞。将U937(人淋巴瘤)细胞繁殖在完全培养基中,分别为[补充有10%FCS的DMEM]和[补充有10%FCS、20mM HEPES、1%非必需氨基酸溶液、1%丙酮酸钠、1%L-谷氨酰胺、4.5g/l葡萄糖的RPMI 1640]。将所有的细胞类型都植板于黑色96MW平板中的合适培养基中,密度为100,000个细胞/孔。在进行实验之前,使细胞饥饿过夜。在37℃下30min.,接着在25℃下30min.,使细胞负载加样缓冲液[HBSS 1x,HEPES 20mM,丙磺舒酸25mM]中的荧光钙染料(Fluo-4 No Wash,Invitrogen US)。通过直接注射到每个孔中进行SDF-1的刺激。对于拮抗试验,在加入SDF-1之前至少10min.,将10μl的Mab溶液直接加入加样缓冲液中。使用下述设置,在多模式荧光微量板读数器Mithras LB940(Berthold)上进行动力学荧光测量:激发波长485nm,发射波长535nm,激发能为10000个任意单位。在每一秒的0.1秒期间记录每孔中的荧光,在SDF-1注射之前,记录20秒的时期(基础信号)。然后,注射20μl的SDF-1,数据记录持续2min的时期。每个实验条件进行一式双份。首先通过减去基础荧光和没有细胞的对照孔发射的荧光校正每孔的值。相对数据可以表示为SDF-1(100nM)获得的最大刺激的百分数。
SDF1(100nM)诱导重组CHO/CXCR4中细胞内钙的快速和强的释放,而在原态CHO-K1细胞中没有检测到荧光信号。最大强度达到超过基础荧光的>140%,并且当SDF-1刺激时观察到约40秒;用U-937细胞观察到类似的动力学曲线(图21A、21B)。在两个研究的细胞系中,嵌合抗体c515H7(133nM)产生SDF-1(100nM)诱导的钙信号的强的和几乎完全的抑制。
实施例23:抗CXCR4鼠的Mab m414H5、m515H7和嵌合的Mab c414H5、c515H7对SDF-1诱导的U937细胞迁移的作用
为了评价抗CXCR4 Mab m414H5、m515H7、c414H5和c515H7对迁移过程的抑制作用,在孔的底部存在或不存在SDF-1下,且上室中有或没有Mab c414H5、m414H5、c515H7和m515H7下,将补充有2%FCS的RPMI 1640培养基中的100000个U-937细胞植板于迁移室的上室中(具有8μm孔径的24孔板)。在该试验中,将鼠的IgG2a和IgG2b引入作为同种型对照。在植板两小时之后,计数迁移细胞。显示于图22A(c414H5对比m414H5)和22B(c515H7对比m515H7)中的结果证实,如预期的,SDF-1能够诱导U-937细胞迁移的显著增加。当用IgG2同种型对照孵育细胞时,没有观察到任何作用。相反,对于用c414H5、m414H5、c515H7和m515H7 Mab孵育的细胞,观察到SDF-1诱导的U937细胞迁移的显著和可再现的减少:c414H5和m414H5 Mab减少50%,c515H7和m515H7 Mab减少80%以上。
实施例24:U937小鼠存活模型中抗CXCR4嵌合的Mab c414H5和c515H7的活性
将来自ATCC的U937细胞培养在RPMI 1640培养基、10%FCS、1%L-谷氨酰胺中。在移植物移入之前,将细胞分裂两天,以便使其处于指数生长期。将一千万个U937细胞腹腔内注射到雌性NOD/SCID小鼠中。在植入两天之后,用加载剂量2mg的c414H5或c515H7 Mab/小鼠皮下注射处理小鼠,接着用1mg的抗体/小鼠处理小鼠,每周两次。对照小鼠接受已经在前述研究中显示的PBS注射剂,在注射PBS的小鼠和给予小鼠IgG同种型对照的小鼠之间没有观察到存活率的差异。每天监测小鼠存活率。
描述在图23中的结果显示出用c414H5和c515H7 Mab处理的小鼠具有引人注意的和显著的寿命增加,c414H5和c515H7的T/C%分别为约210和180。
Claims (39)
1.一种用于选择能够抑制CXCR4活化的抗CXCR4抗体或其功能片段或衍生物之一的方法,特征在于其包括下述步骤:
i)筛选产生的抗体,并且选择能够特异性结合CXCR4和还能够调节CXCR4活化的抗体;
ii)测试步骤i)中选择的抗体,并且选择能够诱导CXCR4同二聚体构象变化的抗体,然后
iii)测试步骤ii)中选择的抗体,并且选择能够诱导CXCR4/CXCR2异二聚体构象变化的抗体。
2.根据权利要求1的方法,其中步骤ii)包括通过BRET分析,在表达CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP的细胞上评价抗体,并选择能够抑制BRET信号至少40%的抗体。
3.根据权利要求1的方法,其中步骤iii)包括通过BRET分析,在表达CXCR4-RLuc/CXCR2-YFP的细胞上评价抗体,并选择能够抑制BRET信号至少40%的抗体。
4.一种能够通过权利要求1所述方法获得的分离的抗体、或其衍生化合物或功能片段。
5.根据权利要求4的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其由单克隆抗体组成。
6.根据权利要求4的分离的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括至少一个选自下述的CDR:包含至少SEQ ID No.1、2、3、4、5或6的序列的CDR。
7.根据权利要求6的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括轻链,该轻链包含序列SEQ ID No.1的CDR-L1、序列SEQ ID No.2的CDR-L2和序列SEQ ID No.3的CDR-L3。
8.根据权利要求6的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括轻链,该轻链包含序列SEQ ID No.9的CDR-L1、序列SEQ ID No.10的CDR-L2和序列SEQ ID No.3的CDR-L3。
9.根据权利要求6的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括重链,该重链包含序列SEQ ID No.7的CDR-H1、序列SEQ ID No.5的CDR-H2和序列SEQ ID No.8的CDR-H3。
10.根据权利要求6的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括重链,该重链包含序列SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQ ID No.12的CDR-H2和序列SEQ ID No.6的CDR-H3。
11.根据权利要求6的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括:
-轻链,其包含序列SEQ ID No.1的CDR-L1、序列SEQ ID No.2的CDR-L2和序列SEQ ID No.3的CDR-L3;和
-重链,其包含序列SEQ ID No.7的CDR-H1、序列SEQ ID No.5的CDR-H2序列SEQ ID No.8的CDR-H3。
12.根据权利要求6的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括:
-轻链,其包含序列SEQ IDNo.9的CDR-L1、序列SEQ IDNo.10的CDR-L2和序列SEQ ID No.3的CDR-L3;和
-重链,其包含序列SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQ ID No.12的CDR-H2序列SEQ ID No.6的CDR-H3。
13.根据权利要求6的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.13的轻链序列,并且在于其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.14的重链序列。
14.根据权利要求4的分离的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括至少一个选自下述的CDR.包含至少SEQ ID No.40、2、41、42、5或43的序列的CDR。
15.根据权利要求14的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括轻链,该轻链包含序列SEQ ID No.40的CDR-L1、序列SEQ ID No.2的CDR-L2和序列SEQ ID No.41的CDR-L3。
16.根据权利要求14的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括轻链,该轻链包含序列SEQ ID No.46的CDR-L1、序列SEQ ID No.47的CDR-L2和序列SEQ ID No.41的CDR-L3。
17.根据权利要求14的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括重链,该重链包含序列SEQ ID No.44的CDR-H1、序列SEQ ID No.5的CDR-H2和序列SEQ ID No.45的CDR-H3。
18.根据权利要求14的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括重链,该重链包含序列SEQ ID No.48的CDR-H1、序列SEQ ID No.49的CDR-H2和序列SEQ ID No.43的CDR-H3。
19.根据权利要求14的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括:
-轻链,其包含序列SEQ ID No.40的CDR-L1、序列SEQ ID No.2的CDR-L2和序列SEQ ID No.41的CDR-L3;和
-重链,其包含序列SEQ ID No.44的CDR-H1、序列SEQ ID No.5的CDR-H2和序列SEQ ID No.45的CDR-H3。
20.根据权利要求14的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括:
-轻链,其包含序列SEQ ID No.46的CDR-L1、序列SEQ ID No.47的CDR-L2和序列SEQ ID No.41的CDR-L3;和
-重链,其包含序列SEQ ID No.48的CDR-H1、序列SEQ ID No.49的CDR-H2和序列SEQ ID No.43的CDR-H3。
21.根据权利要求14的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.50的轻链序列,并且在于其包括包含氨基酸序列SEQID No.51的重链序列。
22.一种鼠杂交瘤,其选自2007年10月22日以保藏号I-3860提交至巴黎巴斯德研究所CNCM的杂交瘤或2008年6月25日以保藏号I-4019提交至巴黎巴斯德研究所CNCM的杂交瘤。
23.一种根据权利要求22的杂交瘤分泌的抗体。
24.根据权利要求6或14的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包含嵌合抗体。
25.根据权利要求6和24的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.64的轻链序列,并且在于其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.65的重链序列。
26.根据权利要求14和24的抗体、或其衍生化合物或功能片段,特征在于其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.66的轻链序列,并且在于其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.67的重链序列。
27.一种分离的核酸,特征在于其选自下述核酸:
-核酸、DNA或RNA,用于编码根据权利要求4至21和23至26之一的抗体或其衍生化合物或功能片段;
-与a)中定义的核酸互补的核酸;
-能够在高度严谨条件下与核酸序列SEQ ID No.15至26或SEQ ID No.52至61的至少一个CDR杂交的至少18个核苷酸的核酸;或
-能够在高度严谨条件下与核酸序列SEQ ID No.27或SEQ ID No.62或SEQ ID No.68或70的至少轻链和/或核酸序列SEQ ID No.28或SEQ ID No.63或SEQ ID No.69或71的重链杂交的至少18个核苷酸的核酸。
28.一种由根据权利要求27的核酸组成的载体。
29.一种包含根据权利要求28的载体的宿主细胞。
30.一种包含由根据权利要求29的载体转化的细胞的除了人类之外的转基因动物。
31.一种用于制备根据权利要求4至21和23至26之一的抗体、或其衍生化合物或功能片段的方法,特征在于所述方法包含下述步骤:
-在培养基和合适的培养条件下培养根据权利要求29的宿主细胞;和
-从培养基中或从所述培养细胞中回收如此产生的所述抗体或其功能片段之一。
32.根据权利要求4至21和23至26之一的抗体、或其衍生化合物或功能片段,用作药物。
33.一种组合物,其包含作为活性成分的由根据权利要求4至21、23至26和32之一的抗体或其衍生化合物或功能片段组成的复合物。
34.根据权利要求33的组合物,特征在于其另外包括作为用于同时、分开或延长方式使用的联合产品的不同于针对CXCR4抗体的抗肿瘤抗体。
35.根据权利要求33或34的组合物,特征在于其另外包括作为用于同时、分开或延长方式使用的联合或结合产品的细胞毒剂/细胞增殖抑制剂、细胞毒素和/或放射性同位素。
36.根据权利要求33至35之一的组合物,用作药物。
37.根据权利要求4至21、23至26和32之一的抗体或其衍生化合物或功能片段,和/或根据权利要求33至36中任一项的组合物,作为用于调节细胞中CXCR4活性的药物。
38.根据权利要求4至21、23至26和32之一的抗体或其衍生化合物或功能片段,和/或根据权利要求33至36中任一项的组合物,用于预防或治疗癌症。
39.根据权利要求38的抗体、或其衍生化合物或功能片段和/或组合物,特征在于所述癌症为选自下述的癌症:前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌和结肠癌。
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