CN117003876A - 一种Anti-CXCR4膜蛋白抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫细胞治疗领域，具体涉及一种Anti‑CXCR4膜蛋白抗体及其制备方法和应用；本发明通过CXCR4/VLP小鼠免疫筛选获得了两株Anti‑CXCR4高亲和力抗体：8H5D5和1B5B10；8H5D5重组抗体能够竞争阻断生物素标记的SDF‑1a配体与Hela细胞上过表达CXCR4膜蛋白的结合。CXCR4/VLP（lipoparticle)将全长膜蛋白展示在VLP包膜上，对膜蛋白有富集的效果；VLP具有免疫佐剂的作用，促进CXCR4膜蛋白的免疫效果。CXCR4/VLP可以直接用于包被Elisa板，测试膜蛋白与抗体的结合。膜蛋白CXCR4在VLP颗粒的包膜上多价多分子展示，也可以采用抗体夹心Elisa表征抗体与CXCR4/VLP的结合，以抗体包板捕获CXCR4/VLP，说明抗体与膜蛋白有结合，CXCR4/VLP被捕获后，VLP颗粒上还有CXCR4膜蛋白分子能够与生物素标记的相同抗体（检测抗体）结合表征亲和力。

Description

一种Anti-CXCR4膜蛋白抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于免疫细胞治疗领域，具体涉及一种Anti-CXCR4 膜蛋白抗体及其制备方法和应用。
背景技术
G蛋白偶联受体（GPCR）是人类最大的膜蛋白超家族，已知GPCR有800多种，其中约100多种是孤儿受体，即与其结合的配体、信号通路都未得到清楚解析。GPCR是治疗各种疾病的关键药物靶点，其靶向药物占美国FDA 批准的所有药物的 30% 以上。GPCR含有7段跨膜区，N端和三个loop位于胞外，参与受体与其配体的相互作用，C端和3个loop位于胞内，参与与G蛋白的相互作用，在介导胞内的信号传导中发挥重要的作用。与GPCR相关的G蛋白是由三个亚基（α，β和γ亚基）组成的异源三聚体，能够结合三磷酸鸟苷GTP和二磷酸鸟苷GDP，是细胞膜上的鸟苷酸交换因子（GEF）。配体与GPCR的结合会引起受体构象的改变，使Gα亚基本来结合的GDP发生解离，随后细胞质中（GTP）与Gα亚基结合，G蛋白三聚体解离为Gα亚基和Gβγ亚基。这一过程使得G蛋白变成激活状态,介导下游信号通路，GPCR也可以介导不依赖G蛋白的信号传导，如通过与β-arrestin等分子相互作用调节下游通路。
人趋化因子受体CXCR4由352个氨基酸组成，是一种高度保守的具有代表性的GPCR，趋化因子CXCL12（SDF-1）是CXCR4的唯一配体，其最普遍的异构体SDF-1α由68个氨基酸组成，CXCL12的N端是其与受体相互作用的主要结构基础。CXCL12与CXCR4结合可激活多个G 蛋白偶联信号途径及效应分子，包括MAPK，PI3K-AKT，JAK-STAT和NF-kB等信号通路，以及可抑制cAMP-PKA等信号通路，促进肿瘤增殖、侵袭转移，抑制癌细胞凋亡，CXCR4的过表达与与肿瘤的恶性程度及预后不良有关。此外，CXCR4还参与HIV病毒感染。靶向CXCR4-CXCL12轴及其级联信号通路的药物在临床治疗中表现出巨大的潜力。
研究表明，GPCRs除了单体，还可能形成同源二聚，异源二聚以及多聚体(oligomer及 nanoclusters） 形态，能够调节其功能性质以及对药物的反应。CXCR4与配体CXCL12结合后诱导CXCR4二聚化并活化胞质酪氨酸蛋白激酶JAK2和JAK3，进而激活JAK-STAT信号通路，此信号通路的异常持续活化与肿瘤发生发展相关。CXCR4与CXCR7两个GPCR受体能够形成同源和异源受体二聚体，均与配体CXCL12结合。在65%的直肠癌中都能够检测到CXCR4/CXCR7异源二聚体的存在，CXCL12-CXCR4/CXCR7 生物轴成为重要的GPCR药物靶点。 CXCR4除了与CXCR7形成异源二聚体，还与其它GPCR受体，包括CCR7，CB2，CCR5，CCR2，CX3CR1等形成异源二聚体具有重要的与疾病相关的生物功能。
因此亟待开发CXCR4抗原制备，膜蛋白免疫筛选方法以及膜蛋白特异性抗体。这些抗体能够成为研究GPCR的工具，也具有药物开发的潜力。
由于GPCR膜蛋白表达量低，难以富集获得免疫用的 CXCR4抗原蛋白。此外对抗体的筛选表征也具有很多挑战性，低表达的抗原在免疫反应中产生的信号弱，容易受到背景噪音的干扰，难以筛选获得针对GPCR膜蛋白的高亲和力高特异性抗体。
发明内容
本专利采用CXCR4/VLP (lipoparticle)进行免疫，探索了免疫流程及抗体筛选方法，获得两株抗CXCR4的高亲和力鼠单抗8H5D5和1B5B10，其中鼠单抗8H5D5能够阻断配体CXCL12的结合。
本发明第一个方面公开了一种Anti-CXCR4 膜蛋白抗体，包括8H5D5和1B5B10；
所述8H5D5包括SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的抗体轻链和SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的抗体重链；
上述8H5D5的抗体轻链氨基酸序列如下所示：
MDSQAQVLILLLLWVSGTCGDIVMAQSPSSLAVSAGEKVTMRCKSSQSLFNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC（SEQ ID NO：1）；
优选地，其中8H5D5的抗体轻链可变区的氨基酸序列为：
DIVMAQSPSSLAVSAGEKVTMRCKSSQSLFNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIK
上述8H5D5的抗体重链氨基酸序列如下所示：
MKLWLNWIFLVTLLNGMQCEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRHKANGYTTDYSASVKGRFTISRDNSRSILYLQMNTLRAEDSATYYCARDVPAMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGGTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPALLQSGLYTLSSSVTVTSNTWPSQTITCNVAHPASSTKVDKKIEPRDPIEPRVPITQNPCPPHQRVPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALPSPIEKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMITGFLPAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTATVLDSDGSYFMYSKLRVQKSTWERGSLFACSVVHEVLHNHLTTKTISRSLGK（SEQ ID NO：2）；
优选地，其中8H5D5的抗体重链可变区的氨基酸序列为：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRHKANGYTTDYSASVKGRFTISRDNSRSILYLQMNTLRAEDSATYYCARDVPAMDYWGQGTSVTVSS
根据IMGT编号系统，所述8H5D5的抗体轻链包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的CDR1、SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的CDR2和SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的CDR3；
CDR-1 QSLFNSRTRKNY（SEQ ID NO: 5）
CDR-2 WAS（SEQ ID NO: 6）
CDR-3 KQSYNLRT（SEQ ID NO: 7）；
所述8H5D5的抗体重链包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的CDR1、SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的CDR2和SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的CDR3。
CDR-1 GFTFTDYY（SEQ ID NO: 8）
CDR-2 IRHKANGYTT（SEQ ID NO: 9）
CDR-3 ARDVPAMDY（SEQ ID NO: 10）。
8H5D5 轻链恒定区 mouse Igkappa
8H5D5 重链恒定区 mouse IgG2a
所述1B5B10包括SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的抗体轻链和SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的抗体重链；
所述1B5B10抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示：
MSVPTQVLGLLLLWLTGARCDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRPSENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYSAKTLAEGVPLRFSGSYSGTHFSLRINSLQPEDFGSYYCQHHYGSPLTFGSGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC（SEQ ID NO：3）
优选地，所述1B5B10抗体轻链中的可变区序列如下所示：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRPSENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYSAKTLAEGVPLRFSGSYSGTHFSLRINSLQPEDFGSYYCQHHYGSPLTFGSGTKLELK
所述1B5B10抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示：
MRVLILLWLFTAFPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYIDNSGSTNYNPSLRSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCALNDYHYVMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK（SEQ ID NO：4）
优选地，所述1B5B10抗体重链中的可变区序列如下所示：
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYIDNSGSTNYNPSLRSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCALNDYHYVMDYWGQGTSVTVSSA
根据IMGT编号系统，所述1B5B10的抗体轻链包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的CDR1、SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的CDR2和SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的CDR3；
CDR-1 ENIYSY（SEQ ID NO: 11）
CDR-2 SAK（SEQ ID NO: 12）
CDR-3 QHHYGSPLT（SEQ ID NO: 13）
所述1B5B10的抗体重链包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的CDR1、SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的CDR2和SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的CDR3；
CDR-1 GYSITSDYA（SEQ ID NO: 14）
CDR-2 IDNSGST（SEQ ID NO: 15）
CDR-3 ALNDYHYVMDY（SEQ ID NO: 16）
1B5B10 轻链恒定区 mouse Igkappa
1B5B10 重链恒定区 mouse IgG2b
所述8H5D5或1B5B10靶向CXCR4，且与CXCR4 膜蛋白高亲和力结合。
所述8H5D5阻断CXCR4与配体CXCL12结合。
术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母标识，与其相对应的氨基酸名称三英文字母简写分别是：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、I1e(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。
所述的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体，其靶向CXCR4，且与CXCR4 膜蛋白高亲和力结合。
所述的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体，其阻断CXCR4与配体CXCL12结合。
所述的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体，其还靶向CXCR4的二聚体或多聚体；所述二聚体或多聚体的结合对象包括CXCR7、CCR、CB2、CCR5和CCR2中的一种或多种的组合。
本发明第二个方面公开了制备上述Anti-CXCR4 膜蛋白抗体的方法，具体步骤如下：
S1：将CXCR4膜蛋白展示在VLP包膜上，制备得到CXCR4/VLP；
S2：利用S1制备的CXCR4/VLP作为抗原进行免疫筛选；
S3：CXCR4/VLP可以直接包被Elisa板，筛选S2中免疫抗血清与CXCR4的结合。筛选之后制备单克隆抗体，采用抗体夹心Elisa方法，以S2筛选获得的单克隆抗体包被Elisa板捕获CXCR4/VLP，以生物素标记的相同单克隆抗体检测，验证单克隆抗体，获得高亲和力结合的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体。
S1所述的CXCR4/VLP利用已知药物抗体ulocuplumab做抗体夹心Elisa，估算CXCR4膜蛋白的量。
本发明第三个方面公开了一种核酸分子，包含编码上述的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体的核苷酸序列。
编码8H5D5的抗体轻链基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示：
ATGGATTCTCAGGCCCAAGTCTTGATTCTTCTTCTCCTGTGGGTGTCTGGGACATGCGGGGACATAGTGATGGCTCAGAGCCCCTCTAGCCTTGCCGTCTCAGCTGGAGAGAAAGTGACTATGAGATGTAAATCTTCACAGTCCCTCTTCAACAGCCGCACACGCAAGAACTACCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGGCAATCCCCAAAACTGCTGATATATTGGGCCTCTACCAGGGAGAGCGGTGTGCCTGACCGGTTTACCGGTTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACATTGACCATCTCATCCGTGCAGGCAGAAGACCTTGCCGTGTACTATTGCAAACAGAGTTATAACCTGAGAACCTTTGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATTAAAAGGGCCGATGCCGCTCCTACAGTGAGCATCTTTCCTCCTTCCTCCGAGCAGCTGACAAGCGGCGGCGCCAGCGTGGTGTGTTTCCTGAACAACTTCTATCCTAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAGATCGACGGCAGCGAGAGACAGAACGGCGTGCTGAACTCCTGGACCGACCAGGATTCCAAGGACTCCACCTACTCCATGTCCTCCACACTGACCCTGACCAAGGATGAGTACGAGAGGCACAACAGCTACACATGCGAGGCCACACACAAGACCTCCACCAGCCCTATCGTGAAGAGCTTCAATAGAAACGAGTGC（SEQ ID NO：17）；
编码8H5D5的抗体重链基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示：
ATGAAGCTGTGGTTGAATTGGATATTCTTGGTGACCCTGTTGAATGGGATGCAGTGTGAGGTGAAACTCGTGGAGAGTGGAGGCGGCCTGGTCCAGCCGGGGGGTAGCTTGAGACTGTCTTGCGCTACGAGCGGTTTCACATTCACCGACTACTACATGTCATGGGTCAGGCAGCCTCCTGGAAAAGCCCTCGAGTGGCTCGGATTTATTCGCCATAAGGCCAATGGCTACACCACCGATTACTCAGCCTCTGTGAAGGGTCGGTTTACAATTAGCCGCGACAACAGCAGGTCCATTCTCTACCTCCAGATGAATACTTTGCGGGCTGAGGACTCTGCTACGTATTATTGCGCAAGAGATGTGCCAGCAATGGACTATTGGGGCCAGGGCACATCAGTGACTGTGTCCAGTGCTAAGACTACCGCCCCCTCAGTTTATCCTCTGGCTCCTGTGTGCGGTGGCACAACCGGAAGTAGCGTCACGCTCGGATGCCTGGTGAAGGGATACTTCCCTGAGCCTGTGACACTCACCTGGAACTCTGGCTCTCTGTCCTCCGGAGTGCATACTTTCCCAGCCCTTCTTCAGTCCGGGCTGTACACTCTGTCCAGTTCTGTTACCGTGACAAGTAATACTTGGCCTAGTCAGACTATCACTTGCAATGTCGCCCACCCTGCCTCAAGCACGAAAGTGGACAAGAAGATCGAACCCCGCGACCCCATCGAGCCCCGCGTGCCAATCACACAGAACCCTTGCCCACCTCACCAGAGAGTGCCTCCTTGCGCCGCTCCCGACCTGCTCGGCGGGCCTTCTGTGTTCATCTTCCCTCCAAAGATTAAGGACGTGCTGATGATTAGCCTGAGCCCTATGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCCGAGGACGACCCCGACGTGCAGATTTCTTGGTTCGTGAACAACGTGGAGGTGCACACCGCTCAGACCCAGACCCACAGGGAGGACTACAACTCTACACTGCGGGTGGTGTCCGCCCTGCCTATTCAGCACCAGGACTGGATGTCCGGAAAGGAGTTCAAGTGCAAGGTGAACAACCGCGCTCTCCCATCCCCTATTGAGAAAACCATTTCTAAGCCACGCGGGCCAGTGAGAGCCCCTCAGGTGTACGTGCTGCCTCCACCCGCCGAGGAGATGACAAAGAAGGAGTTCAGCCTCACATGCATGATTACCGGCTTCCTGCCCGCCGAGATCGCCGTGGACTGGACCAGCAACGGGCGCACCGAGCAGAACTACAAGAACACCGCTACAGTGCTCGACAGCGACGGATCTTACTTCATGTACTCTAAGCTGAGAGTGCAGAAGTCTACATGGGAGCGCGGATCTCTGTTCGCTTGCTCTGTGGTGCACGAGGTGCTCCACAACCACCTGACAACCAAGACAATTTCTAGGTCGCTGGGAAAG（SEQ ID NO：18）。
编码1B5B10的抗体轻链基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示：
ATGTCTGTCCCCACCCAGGTACTGGGATTGTTGCTCCTTTGGCTTACGGGGGCAAGATGCGACATACAGATGACCCAGAGCCCCGCCTCACTGAGTGCCAGTGTGGGAGAGACAGTTACCATTACATGTCGGCCCTCCGAAAATATCTATTCCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACAGGGGAAGTCCCCTCAGCTGCTGGTGTATAGCGCTAAAACGTTGGCTGAGGGCGTGCCACTGCGCTTTTCAGGCTCCTACTCTGGCACACACTTTTCTCTCCGGATTAACAGCTTGCAACCCGAGGACTTCGGGAGCTACTACTGTCAGCACCACTATGGCTCTCCCCTGACCTTTGGGAGCGGAACCAAGCTCGAGCTGAAACGCGCCGATGCCGCTCCTACAGTGAGCATCTTTCCTCCTTCCTCCGAGCAGCTGACAAGCGGCGGCGCCAGCGTGGTGTGTTTCCTGAACAACTTCTATCCTAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAGATCGACGGCAGCGAGAGACAGAACGGCGTGCTGAACTCCTGGACCGACCAGGATTCCAAGGACTCCACCTACTCCATGTCCTCCACACTGACCCTGACCAAGGATGAGTACGAGAGGCACAACAGCTACACATGCGAGGCCACACACAAGACCTCCACCAGCCCTATCGTGAAGAGCTTCAATAGAAACGAGTGC（SEQ ID NO：19）；
编码1B5B10的抗体重链基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示：
ATGAGAGTGCTGATTTTGCTCTGGCTGTTTACTGCTTTCCCCGGCATTCTGTCCGACGTGCAGCTGCAGGAATCTGGACCCGGCCTGGTGAAGCCAAGTCAGAGCTTGAGCCTCACATGCACCGTGACTGGCTATTCCATTACCAGCGACTACGCCTGGAACTGGATTAGACAATTCCCAGGTAACAAGCTGGAGTGGATGGGATACATCGACAATAGCGGTAGCACCAACTATAATCCTAGCCTGAGGTCTAGAATCTCCATTACGAGAGATACCTCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAACTCAACTCTGTAACTACCGAGGATACTGCCACTTACTACTGTGCCCTCAACGACTACCACTATGTGATGGATTACTGGGGTCAGGGAACGTCCGTTACCGTCTCCTCCGCCAAAACAACCCCTCCCAGTGTCTACCCCCTCGCTCCCGGTTGTGGGGACACTACAGGTTCATCTGTCACCCTGGGCTGTCTGGTCAAGGGCTACTTCCCAGAGTCTGTGACCGTGACTTGGAACAGCGGCTCTCTGAGCTCTTCCGTGCACACCTTTCCTGCACTTTTGCAGTCCGGATTGTATACTATGTCTTCCAGTGTAACTGTGCCTAGCTCTACATGGCCTAGTCAGACCGTGACTTGCAGTGTAGCTCATCCGGCTTCCAGCACGACTGTGGACAAGAAACTGGAACCTAGTGGCCCTATCTCCACGATTAATCCCTGTCCTCCTTGCAAAGAGTGCCATAAATGCCCAGCTCCTAACTTGGAGGGGGGACCAAGTGTGTTTATCTTCCCCCCAAATATCAAGGACGTGCTCATGATCAGCCTCACCCCAAAAGTTACGTGCGTCGTGGTGGACGTTAGCGAAGACGACCCCGACGTGCAGATCTCCTGGTTCGTGAATAACGTAGAAGTGCATACAGCTCAGACCCAGACACACAGGGAAGATTACAACAGTACGATCAGGGTTGTGAGCACACTTCCCATACAGCACCAGGATTGGATGAGCGGTAAAGAGTTTAAGTGCAAGGTGAACAATAAAGATCTCCCCAGCCCAATTGAAAGAACAATCTCCAAGATCAAGGGGCTGGTGCGAGCGCCTCAGGTGTACATTCTGCCACCGCCTGCTGAGCAGCTGTCACGAAAGGACGTCTCTCTGACCTGCCTTGTCGTAGGTTTCAACCCTGGAGATATATCCGTGGAATGGACCAGTAACGGCCATACCGAGGAGAACTACAAGGATACCGCCCCGGTCCTCGACTCCGACGGGTCTTATTTTATTTACTCTAAGTTGAATATGAAAACATCCAAGTGGGAGAAAACTGACTCCTTTTCCTGCAATGTTAGACATGAGGGGCTGAAAAACTATTACTTGAAAAAAACAATTTCCAGGTCTCCCGGGAAG（SEQ ID NO：20）。
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明第四个方面公开了一种重组载体，包含如上述的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体或上述的核酸分子；
所述载体选自DNA 载体、RNA 载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体或病毒载体。
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory，New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。
本发明第五个方面公开了一种工程化免疫细胞，包含上述的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体、上述的核酸分子或上述的重组载体。
将基因引入细胞和将基因表达的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory，New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为聚乙烯亚胺 (PEI)转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
本发明第六个方面公开了上述的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体经过抗体人源化后，可应用于制备肿瘤治疗的药物，所述药物还包括药学上可接受的载体、辅剂或赋形剂。
所述药物用于阻碍癌细胞的增殖、侵袭和转移，促进癌细胞的凋亡。
所述药物为选自适合口服、直肠、局部、皮下或胃肠外给药如注射的制剂形式，包括片剂、粉剂、胶囊剂、锭剂、乳剂、霜剂、糖浆剂、舌下片、小药袋、扁囊剂、酏剂、凝胶剂、混悬液、注射溶液、气雾剂、软膏、栓剂以及综合以上多种形式的复合制剂形式。
药物
本发明的分离的核酸分子、载体、宿主细胞、本发明的经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、绝剂、锭剂、栓剂、注射剂（包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。
本发明的分离的核酸分子、载体、宿主细胞、本发明的经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部（如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药（例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。本领域技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，分离的核酸分子、核酸构建体、载体、宿主细胞、本发明的经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物通过静脉注射或推注给予。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的分离的核酸分子、核酸构建体、载体、宿主细胞、本发明的经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物。“预防有效量”是指足以预防、阻止或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。分离的核酸分子、核酸构建体、载体、宿主细胞、本发明的经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物的治疗有效量可根据如下因素发生变化:待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
在本发明中，可调整给药方案以获得最佳目的反应（例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
本发明取得如下有益技术效果：
本发明通过CXCR4/VLP小鼠免疫筛选获得了Anti-CXCR4 高亲和力抗体 。
CXCR4/VLP （lipoparticle) 将全长膜蛋白展示在VLP包膜上，对膜蛋白有富集的效果，估算100ng CXCR4膜蛋白/ 1mg VLP总蛋白。VLP具有免疫佐剂的作用，促进CXCR4膜蛋白的免疫效果，小鼠免疫后抗血清能够结合过表达CXCR4膜蛋白的Hela细胞。
抗体夹心Elisa方法适用于表征抗体与CXCR4/VLP结合。膜蛋白CXCR4 在VLP颗粒的包膜上多价多分子展示，以抗体包板捕获CXCR4/VLP，说明抗体与膜蛋白有结合，CXCR4/VLP被捕获后，利用VLP颗粒上的CXCR4膜蛋白分子，能够与生物素标记的相同抗体（检测抗体）结合表征亲和力。
全长膜蛋白抗原制备，不需要额外添加磷脂分子或表面活性剂，膜蛋白制备成本低。
附图说明
图1为实施例1以Ulocuplumab抗体通过夹心Elisa估算CXCR4/VLP膜蛋白量。
图2为实施例2 Hela细胞结合小鼠抗血清FACS图。
图3为实施例3 CXCR4/VLP 与 1B5B10 , 8H5D5单克隆杂交瘤上清ELISA结合。
图4为实施例4 Hela细胞结合1B5B10，8H5D5重组抗体FACS图。
图5为实施例4 1B5B10 , 8H5D5重组抗体，Ulocuplumab药物抗体与CXCR4/VLP结合夹心Elisa。
图6 为实施例4 1B5B10，8H5D5重组抗体对配体的阻断, Hela细胞FACS图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所用原料和设备均为本领域技术人员熟知，且均为市场上能够购买到或容易获得或制得。
实施例1：以Ulocuplumab抗体通过夹心Elisa估算CXCR4/VLP膜蛋白的量
包膜VLP（Enveloped VLP)在哺乳细胞HEK293里表达，当蛋白亚基组装成颗粒之后，颗粒从细胞里出芽，将细胞表面重组表达的全长膜蛋白带出来，展示在颗粒表面，形成膜蛋白/VLP (lipoparticles)。采用此方法制备的CXCR4/VLP将多分子，构象完整的CXCR4膜蛋白直接展示在VLP表面，无需额外添加表面活性剂，是获取膜蛋白的一种途径，且VLP具有免疫佐剂的作用，CXCR4/VLP适合作为膜蛋白抗原免疫。
本实施例通过夹心ELISA方法估算VLP上CXCR4的量（图1），用于评价后续免疫剂量。将抗CXCR4抗体ulocuplumab以2ug/ml包板，捕获CXCR4/VLP （0.5mg/ml 估算的VLP总蛋白量)，CXCR4/VLP 三倍梯度稀释加入第一孔至第11孔，每孔加入100ul。第12孔为阴性对照，以生物素标记的ulocuplumab抗体作为检测抗体2ug/ml，每孔加入100ul，再用SA-HRP结合显色，假设ulocuplumab 的检测限为pg/ml级别, 根据上述Elisa产生信号值的抗体稀释倍数估算出CXCR4膜蛋白的浓度为100pg 膜蛋白/ 1mg VLP 总蛋白。ulocuplumab药物抗体与CXCR4/VLP 高亲和力结合，也验证了CXCR4/VLP全长膜蛋白具有好的功能性质。
实施例2：以CXCR4-VLP为抗原免疫小鼠及抗血清检测
CXCR4/VLP总蛋白浓度为0.5mg/ml （100ng CXCR4膜蛋白/ 1mg VLP总蛋白），初次免疫使用120ul CXCR4/VLP与等体积的氢氧化铝佐剂混合均匀，肌肉多点注射6周雌性Balb/C小鼠。加强免疫使用60ul CXCR4/VLP抗原与等体积的氢氧化铝佐剂，每次免疫间隔两周，再以加强免疫相同剂量和方式加强免疫，免疫五次以后进行ELISA血清效价检测（图2）。Hela 细胞株表达CXCR4， 图2 A以Hela细胞结合抗血清，图2 B以Hela细胞结合Ulocuplumab，阳性对照 图2 C以Hela细胞结合mouse IgG1 阴性对照抗体。FACS检测显示抗血清含有抗CXCR4抗体。
实施例3：杂交瘤细胞株的筛选：
小鼠细胞融合前，将30ug CXCR4/VLP以1xPBS稀释至300ul腹腔注射进行加强免疫。取小鼠脾脏与PEG1500进行细胞融合，融合细胞培养10天后，用间接法ELISA检测CXCR4/VLP 与杂交瘤细胞上清的结合，筛选杂交瘤细胞株。将CXCR4/VLP 20ul/孔包被在聚氯乙烯Elisa板上为正筛选，将VLP 20ul/孔包被在聚氯乙烯板上为负筛选，结合杂交瘤细胞上清，筛选出CXCR4/VLP抗原阳性，VLP抗原阴性的细胞株，即获得了分泌抗CXCR4抗体的杂交瘤细胞株，经有限稀释至单克隆状态后进行扩大培养和冻存。单克隆杂交瘤细胞上清用间接法ELISA重复验证，图3显示1B5B10 , 8H5D5单克隆杂交瘤细胞株的细胞上清能够高亲和力，特异性结合CXCR4/VLP。
实施例4：重组单克隆抗体与CXCR4/VLP Elisa 结合及SDF-1a 配体阻断测试
将筛选到的杂交瘤细胞株1B5B10 , 8H5D5进行扩大培养至密度1E+07个/ml，送杂交瘤单抗测序（百英生物科技有限公司）。将抗体重链及轻链序列，做哺乳密码子优化基因合成，分别构建进哺乳细胞表达载体pTT5, 表达载体也可选用pCMV， pCDNA3.1等商业化载体。转染HEK293哺乳细胞分泌表达，经protein A 树脂亲和纯化得到重组抗体。图4 FACS验证，1B5B10 , 8H5D5重组抗体能够与Hela细胞结合。图5显示1B5B10 , 8H5D5重组抗体，Ulocuplumab药物抗体与CXCR4/VLP结合夹心Elisa。
Hela细胞过表达CXCR4 膜蛋白，将Hela细胞制备成单细胞悬液(3% FBS，PBS)，细胞密度2E+06个/ml，抗CXCR4抗体1B5B10 , 8H5D5，Ulocuplumab，生物素标记SDF-1a配体（SKU# RBP48061, Reprokine）分别稀释至0.1uM与Hela细胞结合，4度静置30分钟，分别加入山羊抗小鼠FITC（结合鼠抗1B5B10 , 8H5D5）,山羊抗人FITC（结合Ulocuplumab），SA-FITC（结合生物素标记SDF-1a配体）做为二抗4度静置孵育30分钟，Hela细胞使用1xPBS洗涤三次后轻柔吹打均匀成单细胞，FACS上机分析作为对照组,另外一组实验组分别为1B5B10，8H5D5，Ulocuplumab重组抗体分别与生物素标记SDF-1a配体混合后结合Hela细胞，4度静置30分钟。再分别使用山羊抗小鼠FITC,山羊抗人FITC，SA-FITC做为二抗4度静置结合30分钟。Hela细胞以PBS洗涤三次后轻柔吹打均匀成单细胞，图6 FACS结果显示，曲线1为生物素标记SDF-1a配体与Hela细胞有结合（阳性对照），曲线4为山羊抗小鼠FITC，山羊抗人FITC与Hela细胞的结合（阴性对照）。曲线2显示8H5D5重组抗体和曲线3显示 Ulocuplumab能够竞争阻断生物素标记SDF-1a配体与Hela细胞膜蛋白CXCR4的结合。曲线5显示1B5B10重组抗体不能阻断配体结合CXCR4。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种Anti-CXCR4 膜蛋白抗体，其特征在于，包括8H5D5和1B5B10；
所述8H5D5的抗体轻链包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的CDR1、SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的CDR2和SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的CDR3；
所述8H5D5的抗体重链包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的CDR1、SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的CDR2和SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的CDR3。
2.如权利要求1所述的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体，其特征在于，所述1B5B10的抗体轻链包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的CDR1、SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的CDR2和SEQ IDNO: 13的氨基酸序列的CDR3；
所述1B5B10的抗体重链包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的CDR1、SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的CDR2和SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的CDR3。
3.如权利要求1所述的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体，其特征在于，所述8H5D5包括SEQ IDNO：1所示氨基酸序列的抗体轻链和SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的抗体重链；
所述1B5B10包括SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的抗体轻链和SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的抗体重链。
4.如权利要求1-3任一项所述的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体，所述8H5D5或1B5B10靶向CXCR4，且与CXCR4 膜蛋白高亲和力结合。
5.如权利要求4所述的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体，所述8H5D5阻断CXCR4与配体CXCL12结合。
6.如权利要求5所述的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体，其还靶向CXCR4的二聚体或多聚体；所述二聚体或多聚体的结合对象包括CXCR7、CX3CR1、CB2、CCR5和CCR2中的一种或多种的组合。
7.制备如权利要求1-3任一项所述Anti-CXCR4 膜蛋白抗体的方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1：将CXCR4膜蛋白展示在VLP包膜上，制备得到CXCR4/VLP；
S2：利用S1制备的CXCR4/VLP作为抗原进行免疫筛选；
S3：CXCR4/VLP可以直接包被Elisa板，筛选S2中免疫抗血清与CXCR4的结合；筛选之后制备单克隆抗体，采用抗体夹心Elisa方法，以S2筛选获得的单克隆抗体包被Elisa板捕获CXCR4/VLP，以生物素标记的相同单克隆抗体检测，验证单克隆抗体，获得高亲和力结合的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，S1所述的CXCR4/VLP采用已知抗体ulocuplumab做抗体夹心Elisa，估算CXCR4 膜蛋白的量。
9.分离的核酸分子，其编码根据权利要求1-3任一项所述的抗体轻链或抗体重链。
10.一种重组载体，包含如权利要求1-3任一项所述的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体或权利要求9所述的核酸分子；
所述载体选自DNA 载体、RNA 载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体或病毒载体。
11.一种工程化免疫细胞，包含权利要求1-3任一项所述的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体、权利要求9所述的核酸分子或权利要求10所述的重组载体。
12.根据权利要求1-3任一项所述的Anti-CXCR4 膜蛋白抗体，其特征在于，所述抗体在经过抗体人源化后，可应用于制备肿瘤治疗的药物。
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CN117567635A (zh) * 2024-01-16 2024-02-20 恺佧生物科技(上海)有限公司 抗Cas9酶的抗体及其应用

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