CN116554329A - 一种Fc融合纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc及其制备方法与应用 - Google Patents

一种Fc融合纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新型Fc融合纳米抗体CTLA‑4 Nb16‑Fc的制备方法及应用，所述CTLA‑4 Nb16‑Fc的结构包含能够延长血浆半衰期及介导ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应的Fc段的第一功能域以及能够特异性结合并有效阻断T细胞表面CTLA‑4分子的第二功能域，所述第一功能域、第二功能域从N端到C端顺序连接。本发明还提供CTLA‑4 Nb16‑Fc融合蛋白纳米抗体制备方法及应用。本发明提供的新型融合纳米抗体能够在肿瘤免疫治疗中能消除免疫抑制功能的同时，同时还能发挥额外的Fc介导的ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应功能。

Description

一种Fc融合纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种新型Fc融合纳米抗体及其制备方法与应用。
背景技术
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（Cytotoxic T lymphocyte-associatedAntigen-4，CTLA-4）是一种免疫负调节因子，主要表达于活化T细胞表面，具有抑制T细胞的增殖与活化的功能。专利号ZL201610575258.3的发明专利，公开了一种利用噬菌体展示技术，成功筛选出针对CTLA-4的特异性纳米抗体16 （CTLA-4 Nb16），CTLA-4 Nb16 可增强树突细胞/肝癌融合细胞（DC/HepG2-FC）诱导的CD8+ T细胞介导的肿瘤杀伤作用，从而抑制肿瘤的生长。同时由于纳米抗体具有人源化、高效化及小型化的优点，能够更好地阻断 CTLA-4 抑制信号通路，促进细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）的高效特异性。构建以纳米抗体作为基础结构的T细胞激动剂能利用纳米抗体的诸多优势，可有望进一步提高药物的疗效。同时但由于纳米抗体体积小导致其半衰期短、组织滞留少、从血清中清除快的缺点，在一定程度上影响了其疗效。因此，如何克服因分子量小代谢迅速导致的疗效下降是纳米抗体在临床应用中的核心问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服CTLA-4 Nb16纳米抗体半衰期短及生物学功能单一的不足，提供一种新型Fc融合纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc及其制备方法与应用。
为了解决该技术问题，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc，其结构包含能够延长纳米抗体在体内的作用时间，介导ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应的Fc段的第一功能域；以及能够特异性结合并有效阻断T细胞表面免疫检查位点CTLA-4的第二功能域；所述第一功能域、所述第二功能域从N端到C端顺序连接。
优选地，所述第二功能域的抗CTLA-4 Nb16包含决定簇互补区CDR和框架区FR；所述第二功能域的决定簇互补区CDR由CDR1、CDR2和CDR3组成；其中CDR1为SEQ ID No.1中的第26-35位氨基酸，CDR2为SEQ ID No.1中的第51-59位氨基酸，CDR3为SEQ ID No.1中的第97-106位氨基酸；
优选地，所述第一功能域Fc的氨基酸序列为SEQ ID No.2，其GenBank的登录号为:AH007035.2；
优选地，所述第一功能域的Fc来源于人IgG1 Fc 片段，与所述抗CTLA-4纳米抗体16之间通过连接片段（Linker）连接；
优选地，所述连接片段为以G4S为单元的柔性连接片段；
所述G4S具体为GGGGS；
所述Linker含有二个G4S单位，所述连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO .1和SEQID NO .2所示；
优选地，所述新型Fc融合蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO .3所示。
本发明的新型Fc融合蛋白纳米抗体分子量小，穿透性强，抗原结合性能好且免疫原性弱，能够通过Fc段延长纳米抗体在体内的作用时间，保留了ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应，并能有效阻断T细胞表面CTLA-4分子，从而增强T细胞活化所需的信号；能够显著增强树突状细胞/肿瘤细胞融合疫苗诱导的特异性T淋巴细胞对靶细胞的杀伤能力，抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠的生存时间。
本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，其编码所述新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc；
优选地，编码所述CTLA-4 Nb16-Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示。
本发明的第三方面，提供一种表达载体，其含有所述多核苷酸。
本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，其被所述表达载体所转化。
本发明的第五方面，提供一种药物组合物，其包含所述新型Fc融合纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc和可药用载体。
本发明的第六方面，提供一种新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的制备方法，包括构建含有新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的基因序列的原核表达载体，然后将含有Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的基因序列的原核表达载体转化至宿主菌中诱导表达和纯化，从而获得所述新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc，所述原核表达载体采用pET-30a（+）。
所述宿主菌采用E.coli Rosstta (DE3)。
本发明的第七方面，提供一种新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc在制备用于治疗肿瘤药物中的应用，包括采用基因工程技术，将高亲和力hCTLA-4 Nb16基因、hIgG1Fc片段基因通过柔性接头序列Ger4Ser相连，并插入用于纯化和鉴定的含标签蛋白基因His-tag，进行基因重组克隆，得到CTLA-4 Nb16-Fc重组基因序列的原核表达载体；然后将重组基因序列的原核表达载体转化至宿主菌中诱导表达，收获、溶解包涵体，用His标签蛋白试剂盒纯化，并进行超滤浓缩从而获得所述新型Fc融合纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc；
采用BCA法测定超滤浓缩后的CTLA-4 Nb16-Fc（用ddH2O溶解）蛋白浓度，然后将CTLA-4 Nb16-Fc融合蛋白联合树突状细胞/肿瘤细胞融合疫苗共同孵育的CD8+ T细胞通过尾静脉注射，过继治疗荷瘤小鼠。观察小鼠皮下肿瘤的生长速度，计算荷瘤小鼠的生存时间，以此评判CTLA-4 Nb16-Fc融合蛋白的治疗效果。具体步骤和产生的效果如下：
（1）选取4-6周龄BALB/c裸鼠, 在右侧腋下皮下注射肿瘤细胞 HepG2或者MCF7或者C8161 100 μL，含有2 × 107个细胞/mL，分别构建肝癌、乳腺癌和黑色素瘤三个肿瘤模型；观察肿瘤的成瘤情况，包括出瘤率、肿瘤体积和成瘤时间；
（2）当小鼠瘤体积约为100 mm3时开始治疗，当天记为“Day 0”；选取出瘤情况一致，瘤体积大小相等的小鼠，将小鼠随机分为5组，每组5只；采取尾静脉注射给药，分别按照分组将药物用100 μL重悬进行治疗，每周给药2次，连续2周；观察小鼠肿瘤的治疗效果；
（3）在三种不同的荷瘤小鼠模型中，实验结果显示：CTLA-4 Nb16-Fc联合树突状细胞/肿瘤细胞融合疫苗共同诱导的CTLs过继治疗能够显著抑制肿瘤生长和延长荷瘤小鼠生存时间。
有益效果
1.本发明所述的新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc是以融合人 IgG1 Fc片段，并以纳米抗体作为结构基础的T细胞激动剂，该融合蛋白体积小，抗原结合性能好，容易基因工程改造和实现大量生产，免疫原性弱；以及引入的Fc片段可以与FcRn结合，从而克服纳米抗体在体内半衰期短、组织滞留少、血浆清除率快的缺点。此外，Fc段可介导额外的ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应，与CTLA-4 Nb16融合后，解决了原本纳米抗体生物功能单一的问题。采用原核细胞表达系统生产，其程序较传统单克隆抗体简单，且蛋白产量高，使用方便，可工业化生产，具有良好的发展前景且适于推广使用。
2.本发明所述的新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc可延长纳米抗体在体内的作用时间，保留了ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应。同时，所述新型Fc融合蛋白纳米抗体（CTLA-4 Nb16-Fc）包含的抗CTLA-4纳米抗体能有效阻断CTLA-4介导的免疫抑制信号通路，消除其免疫抑制功能，诱导T细胞激动剂具有更高疗效，在肿瘤免疫治疗领域具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1 CTLA-4 Nb16-Fc 的结构示意图。
图2 CTLA-4 Nb16-Fc的作用机制示意图。
图3A 为重组质粒pET-30a（+）- CTLA-4 Nb16-Fc示意图（A）和琼脂糖凝胶电泳图（B），其中，M表示Marker 泳道；2表示CTLA-4 Nb16-Fc双酶切产物泳道。
图4 为CTLA-4 Nb16-Fc蛋白SDS-PAGE分析图，其中M表示Marker泳道，1表示CTLA-4 Nb16-Fc蛋白泳道。
图5 为CTLA-4 Nb16-Fc蛋白Western blot分析图，其中M表示Marker泳道；1表示CTLA-4 Nb16-Fc蛋白泳道。
图6 显示 CTLA-4 Nb16-Fc的ELISA鉴定结果。
图7 显示CTLA-4 Nb16-Fc介导的T细胞对相应靶细胞的杀伤效应；A表示在不同效靶比作用下各实验分组介导的T细胞对靶细胞HepG2的杀伤效率；B表示在不同效靶比作用下各实验分组介导的T细胞对靶细胞MCF7的杀伤效率；C表示在不同效靶比作用下各实验分组介导的T细胞对靶细胞C8161的杀伤效率。
图8显示CTLA-4 Nb16-Fc介导的T细胞对相应皮下移植瘤生长的抑制作用；A表示在各实验分组介导的T细胞对HepG2皮下移植瘤生长的抑制作用；B表示在不同效靶比作用下各实验分组介导的T细胞对MCF7皮下移植瘤生长的抑制作用；C表示在不同效靶比作用下各实验分组介导的T细胞对C8161皮下移植瘤生长的抑制作用。
具体实施方式
本发明的新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的结构包含能够延长纳米抗体在体内的作用时间，介导额外的ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应的Fc段的第一功能域，以及能够特异性结合并有效阻断T细胞表面CTLA-4分子的第二功能域，结构如图1所示。本发明的新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的作用机制如图2所示。
在本发明的实施例中，CTLA-4 Nb16-Fc含有延长纳米抗体在体内的作用时间、介导ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应的第一功能域，以及一个能够特异性结合并有效阻断T细胞表面CTLA-4分子的第二功能域，所述第一功能域、第二功能域从N端到C端顺序连接；所述第一功能域为人 IgG1 Fc 片段，Fc的氨基酸序列为SEQ ID No.2，其GenBank的登录号为: AH007035.2。所述第二功能域为抗CTLA-4纳米抗体Nb16，其决定簇互补区CDR由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述CDR1为SEQ ID No.1中的第26-35位氨基酸；CDR2为SEQ ID No.1中的第51-59位氨基酸；CDR3为SEQ ID No.1中的第97-106位氨基酸。所述抗CTLA-4 Nb16与所述Fc之间通过连接片段连接，所述连接片段为以GGGGS为单元的柔性连接片段。本实施例所述的CTLA-4 Nb16-Fc新型融合蛋白不仅能延长纳米抗体在体内的作用时间，保留了ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应。同时， CTLA-4 Nb16-Fc包含的抗CTLA-4纳米抗体能有效阻断CTLA-4介导的免疫抑制信号通路，消除其免疫抑制功能，诱导T细胞更高效地分泌IL-2、TNF-α、IFN- γ等细胞因子发挥抗肿瘤作用，在肿瘤免疫治疗领域具有良好的临床应用前景。
编码新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的多核苷酸。
本发明的编码新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的多核苷酸可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。
本发明的实施例中，编码所述CTLA-4 Nb16-Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示。
新型Fc融合蛋白纳米抗体（CTLA-4 Nb16-Fc）的表达载体。
本发明的表达载体含有编码CTLA-4 Nb16-Fc的多核苷酸。用本领域的技术人员熟知的方法能够构建本发明的表达载体；这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。可将编码CTLA-4 Nb16-Fc蛋白的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mRNA合成进而表达蛋白。本发明的实施例中，所述表达载体采用pET-30a（+）；所述宿主菌采用E.coliRosstta (DE3)。
新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的制备方法。
本发明的制备前述CTLA-4 Nb16-Fc的方法，包括：构建含有CTLA-4 Nb16-Fc基因序列的表达载体，然后将含CTLA-4 Nb16-Fc基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的CTLA-4 Nb16-Fc。本发明的实施例中，所述表达载体采用pET-30a。所述宿主菌采用E.coli Rosstta (DE3)。
编码新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的应用。
本发明的新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc可用于制备肿瘤治疗药物。
实施例1: CTLA-4 Nb16-Fc的制备
1.CTLA-4 Nb16-Fc的构建
采用基因工程技术，将专利为L201610575258.3所筛选出的高亲和力CTLA-4 Nb16基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示；以及能够延长血浆半衰期及介导ADCC、ADCP和CDC细胞毒性效应的Fc段的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示；所述CTLA-4 Nb16纳米抗体与Fc段从N端到C端通过以GGGGS为单元的柔性连接片段（Linker）顺序连接。
2.CTLA-4 Nb16-Fc的多核苷酸的制备
为使 CTLA-4 Nb16在原核系统中进行表达，针对Fc、抗CTLA-4 Nb16序列均根据密码子优化原则进行了优化得到了CTLA-4 Nb16-Fc的核苷酸序列。具体地，CTLA-4 Nb16-Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示。
3.CTLA-4 Nb16-Fc的原核表达载体制备
通过PCR法将目的基因序列合成并扩增，并与酶切后的pET-30a（+）重组获得重组原核表达质粒pET-30a（+）-CTLA-4 Nb16-Fc，该质粒结构如图3A所示。具体地，采用酶切的方法对pET-30a（+）表达质粒进行酶切，酶切后琼脂凝胶电泳检测显示经酶切后片段大小约6213 bp，条带清晰。将酶切后的pET-30a（+）表达质粒与PCR法得到的目的序列重组，将重组后的原核表达质粒pET-30a（+）-CTLA-4 Nb16-Fc进行双酶切鉴定，结果显示CTLA-4 Nb16-Fc和载体的大小分别与重组之前一致，凝胶电泳结果如图3B所示。将获得的重组质粒pET-30a（+）-CTLA-4 Nb16-Fc转化至Rosetta（DE3）大肠杆菌中，将卡那霉素筛选出的阳性克隆菌株进行测序验证，经过比对基因序列正确。
4．CTLA-4 Nb16-Fc的表达
（1）活化菌种，从-80℃拿出冻存的甘油菌置于37℃水浴锅中，轻微摇动至完全溶解。无菌操作下打开盖子，用接种环从冻存管中沾取适量菌滴，划线接种于含KanR+ LB的平板上，于37℃培养箱中倒置培养12 h。
（2）小枪头挑取单克隆菌落至20 mL含KanR+ LB液体培养基，于37℃摇床中振荡培养12 h。
（3）按1:100比例转接于250 mL含KanR+ LB液体培养基。37℃振荡培养至菌液OD600=0.6。
（4）对照取样，取1 mL菌液至Ep管中离心取菌体沉淀，标明未诱导，冻存于-20 ℃。
（5）诱导：在剩余的菌液中加入IPTG，使其终浓度为0.5 mM，将试管置于37℃，200rpm进行低温诱导培养12 h。
（6）收集菌体沉淀之前取1mL菌液至Ep管中离心取菌体沉淀，冻存于-20 ℃。
（7）收集菌体沉淀，将诱导后的菌液于4℃，4000 g离心20min。弃上清液，收集菌体沉淀，秤湿重，冻存于-80 ℃。
（8）SDS-PAGE凝胶电泳分析：分别向对照样品、诱导后样品的菌体沉淀用100 μL无菌水重悬菌液，加入25μL 5× SDS 上样缓冲液，涡旋震荡混匀后置于金属浴中煮10 min，10000 g离心5 min，取5 μL上清液凝胶电泳检测诱导情况。
（9）解冻菌体沉淀，按每克菌体沉淀湿重加入4 mL非变性裂解液的比例加入非变性裂解液，充分重悬菌体。
（10）加入溶菌酶至终浓度为1 mg/mL、加入脱氧核糖核酸酶 I至终浓度为5 µg/mL，并加入适量的100×蛋白酶抑制剂，混匀后冰上放置30 min。
（11）冰上超声裂解细菌：首先用超声仪超声水，水洗超声仪探头。超声菌液的条件为：功率30%，工作5 s，间隔8 s，持续15 min。至菌液不再黏稠即可。结束后水洗超声仪探头。
（12）4℃，12000 g离心30 min，收集细菌裂解液上清置于冰上。取1 mL上清至Ep管，存于-20 ℃，后续待用。
（13）洗涤包涵体，将裂解后的菌体沉淀，用1× PBS洗涤一次。
（14）溶解包涵体，沉淀用8M Urea的溶菌平衡缓冲液溶解包涵体，室温震荡60min，4℃ 12000 g离心30 min弃沉淀。
5.CTLA-4 Nb16-Fc的纯化
（1）平衡凝胶：取1 mL混合均匀的50% 凝胶储存液4ºC，1000 g瞬时离心弃去储存液，向凝胶中加入0.5 mL 溶菌平衡缓冲液混匀以平衡凝胶，4ºC，1000 g瞬时离心弃去液体，重复2次，弃去液体。
（2）将约4 mL细菌裂解液的上清加入凝胶中，于4ºC条件下，摇床上缓慢摇动1 h，得到凝胶和细菌裂解液的混合物。
（3）将凝胶和细菌裂解液的混合物装入亲和层析柱管中。
（4）将柱管底部的盖子打开，重力作用下使纯化柱内液体流出，收集穿流液并重复上柱4次以充分结合目的蛋白，收集20 μL穿流液作后续分析用。
（5）咪唑的洗涤和收集：分别用20 mM IM、50 mM IM、100 mM IM、250 mM、500 mMIM含有8 M Urea的洗脱液洗脱，收集流出液到不同的离心管中。
（6）纯化检测，对粗蛋白液、洗涤液、洗脱液分别处理制样，跑SDS-PAGE验证蛋白是否纯化出。
（7）将纯化出的蛋白质溶于洗脱缓冲液中，将其放入处理后的透析袋，按照复性缓冲液1/洗脱缓冲液比例为1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:0进行梯度透析，最后于复性缓冲液2中处理12 h。
最终纯化后的CTLA-4 Nb16-Fc蛋白使用SDS-PAGE分析，通过考马斯亮蓝染色来显示蛋白条带，然后使用Image Lab软件检测条带所占的比例。凝胶电泳结果由图4可知，SDS-PAGE电泳显示在分子量约39 kDa位置处有明显可见的蛋白条带（箭头所示），而且具有95%的纯度。
采用Western blot进一步鉴定纯化后的CTLA-4 Nb16-Fc蛋白，通过Western blot步骤操作，显色试剂盒显色。WB结果由图5可知，Western blot结果显示在分子量约39 kDa位置处有明显可见的蛋白条带（箭头所示），表明该蛋白为CTLA-4 Nb16-Fc。
实施例2：ELISA检测CTLA-4 Nb16-Fc与人CTLA-4蛋白的结合能力
（1）包被：用0.05 M的Na2CO3/NaHCO3缓冲液（CBS，pH 9.6）将hCTLA-4稀释至2 μg/mL，每孔加100 μL，4℃包被过夜。甩去板孔中的液体，每孔加入300 μL的1× PBST，静置1min，甩去板孔中的液体，吸水纸上大力拍干，1× PBST重复洗涤3次。
（2）封闭：于37℃恒温箱用3% BSA封闭液封闭1 h。甩去板孔中的液体，每孔加入300 μL的1× PBST，静置1 min，甩去板孔中的液体，吸水纸上大力拍干，1× PBST重复洗涤3次。
（3）实验分组：分为PBS组，Irr Nb16-Fc组，CTLA-4 Nb16，CTLA-4 Nb16-Fc组和CTLA-4 mAb组，将CTLA-4 Nb16-Fc组按照系列倍比进行稀释。
（4）加一抗：加入系列倍比稀释的CTLA-4 Nb16-Fc，最高浓度为500 ng/mL，稀释后浓度依次为：250 ng/mL，125 ng/mL，62.5 ng/mL，31.3 ng/mL，15.6 ng/mL，8 ng/mL，4 ng/mL，每孔加100 μL，设3个复孔，37℃恒温箱孵育1 h。甩去板孔中的液体，每孔加入300 μL的1× PBST，静置1 min，甩去板孔中的液体，吸水纸上大力拍干，1× PBST重复洗涤5次。同样，向PBS组采用相同方法加一抗。
（5）加二抗：向PBS组，Irr Nb16-Fc组，CTLA-4 Nb16，CTLA-4 Nb16-Fc组加入稀释好的HRP标记的抗His tag二抗，另外向CTLA-4 mAb组加入稀释好的HRP标记的羊抗兔抗IgG二抗，每孔100 μL，37℃恒温箱孵育30 min。甩去板孔中的液体，每孔加入300 μL的1×PBST，静置1 min，甩去板孔中的液体，吸水纸上大力拍干。用1× PBST重复洗涤7次。
（6）显色：每孔加入新鲜配置的TMB显色液100 μL，37℃避光孵育15 min。
（7）测OD450值：每孔加入50 μL终止液，15 min内测定各孔的OD450值。
ELISA结果由图6可知，CTLA-4 Nb16-Fc可以与hCTLA-4蛋白结合。
实施例3：CTLA-4 Nb16-Fc介导的细胞杀伤实验
（1）收集靶细胞：当靶细胞长满达到90%的时候，收集靶细胞，然后对靶细胞进行染色并进行细胞计数，加入完全DMEM培养基调细胞浓度为1×106个细胞/mL。
（2）按照1:1，10:1，20:1的效靶比，在24孔板中加入不同组别相应数量的效应T淋巴细胞。
（3）按照实验设计与分组加入CTLA-4 Nb16-Fc及其他对照，然后加入完全RPMI1640培养基至体积为500 μL/孔，每组设置3个复孔。另设置最大释放孔和自然释放孔，将细胞置于37℃，5% CO2培养箱中培养18 h。
（4）将各组细胞1500 rpm/min，离心15 min收集细胞，弃掉上清液，加入100 μL 1× PBS重悬细胞，然后加入5 μL PI染液，充分混匀，于室温避光孵育30 min，使用1× PBS重复洗涤2次，加入500 μL 1× PBS 重悬细胞后上流式细胞仪检测。
（5）同时准备未染色空白管和未做任何处理的单染管，各1×106个细胞/管作为对照和流式补偿调节。
（6）根据杀伤公式计算T细胞对相应靶细胞的杀伤效率。杀伤效率（%）=（实验孔-自然释放孔）/（最大释放孔-空白孔）×100%。
结果如图7显示，CTLA-4 Nb16-Fc组对HepG2、MCF7和C8161靶细胞的杀伤作用最强，高于对照组的杀伤比率。而且随着效靶比增大而对靶细胞杀伤比率增高。
实施例4：CTLA-4 Nb16-Fc介导的皮下移植瘤抑制实验
（1）收集处于对数生长期的HepG2、MCF7和C8161细胞，PBS清洗两遍，然后用预冷的PBS调整细胞密度为2 × 107个细胞/mL。
（2）4周龄BALB/c裸鼠, 在右侧腋附近皮下注射HepG2、MCF7和C8161细胞100 μL。开始观察肿瘤的成瘤情况，包括出瘤率、肿瘤体积和成瘤时间。
（3）当小鼠瘤体积约为100 mm3时，选取出瘤情况一致，瘤体积大小相等的小鼠，将小鼠随机分为5组，每组5只，用于观察小鼠肿瘤的治疗效果。
（4）分别按照分组情况从尾静脉注射药物100 μL进行治疗。在治疗过程中，每周给予药物2次，治疗时间共2周。分组情况及给药情况：jPBS组: PBS 100 μL/只；k树突状细胞/肿瘤细胞(HepG2, MCF7, C8161)融合疫苗组：树突状细胞/肿瘤细胞(HepG2, MCF7,C8161)融合疫苗诱导的CD8+ T淋巴细胞2 × 107个细胞/只；l树突状细胞/肿瘤细胞(HepG2, MCF7, C8161)融合疫苗+Irr Nb-Fc组：树突状细胞/肿瘤细胞(HepG2, MCF7,C8161)融合疫苗+Irr Nb-Fc诱导的CD8+ T淋巴细胞2×107个细胞/只；m树突状细胞/肿瘤细胞(HepG2, MCF7, C8161)融合疫苗+CTLA-4 Nb16组：树突状细胞/肿瘤细胞(HepG2, MCF7,C8161)融合疫苗+CTLA-4 Nb16诱导的CD8+ T淋巴细胞2 × 107个细胞/只；⑤树突状细胞/肿瘤细胞(HepG2, MCF7, C8161)融合疫苗+CTLA-4 Nb16-Fc组：树突状细胞/肿瘤细胞(HepG2, MCF7, C8161)融合疫苗+CTLA-4 Nb16-Fc诱导的CD8+ T淋巴细胞2 × 107个细胞/只。各个组注射的细胞都用预冷的PBS在无菌条件下处理。
（5）从治疗时间起，每隔3天测量小鼠的体重，并用游标卡尺测量肿瘤的长度（L）与宽度(W)，按照公式 V（mm3）=W2×L/2（V：肿瘤体积，W：宽度，L：长度）计算肿瘤体积。
（6）从第一次治疗当天开始计算，30天后，进行小鼠眼球取血，并剥离瘤体，称量瘤体重量，并按公式计算抑瘤率（抑瘤率=（对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/对照组瘤），根据记录绘制小鼠肿瘤体积生长曲线。
（7）另一组小鼠采取同样的处理方法，观察小鼠的存活时间分析其生存率。
结果如图8显示，树突状细胞/肿瘤细胞(HepG2, MCF7, C8161)融合疫苗+CTLA-4Nb16-Fc诱导的CD8+T淋巴细胞过继治疗可抑制肿瘤生长，延长荷人肝癌(HepG2)，乳腺癌(MCF7)，黑色素瘤(C8161) BALB/c裸鼠的生存时间。

Claims (7)

1.一种Fc融合纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc，其特征在于：结构包含
能够延长血浆半衰期及介导ADCC、ADCP和CDC细胞毒性效应的Fc段的第一功能域，所述Fc的氨基酸序列为SEQ ID No.2，其GenBank的登录号为: AH007035.2；
以及能够特异性结合并有效阻断T细胞表面CTLA-4分子的第二功能域Nb16；所述第二功能域抗CTLA-4的纳米抗体Nb16（全名为CTLA-4 Nb16）的决定簇互补区CDR由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述CDR1为SEQ ID No.1中的第26-35位氨基酸；CDR2为SEQ ID No.1中的第51-59位氨基酸；CDR3为SEQ ID No.1中的第97-106位氨基酸；
所述第一功能域、第二功能域从N端到C端顺序连接；
所述抗CTLA-4 Nb16与所述Fc之间通过连接片段连接，所述连接片段为以GGGGS为单元的柔性连接片段。
2. 一种多核苷酸，其编码如权利要求1所述的Fc融合纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc。
3.一种表达载体pET-30a（+），其含有如权利要求2所述的多核苷酸。
4. 一种宿主细胞E.coli Rosstta (DE3)，其转化有如权利要求3所述的表达载体。
5. 一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的Fc融合纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc和可药用载体。
6. 一种如权利要求1所述的Fc融合纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的制备方法，其特征在于：
（1）采用基因工程技术，将高亲和力hCTLA-4 Nb16基因、hIgG1 Fc片段基因通过柔性接头序列Ger4Ser相连，并插入用于纯化和鉴定的含标签蛋白基因His-tag，进行基因重组克隆，得到CTLA-4 Nb16-Fc重组基因序列的原核表达载体；
（2）将重组基因序列的原核表达载体转化至宿主菌中诱导表达，收获、溶解包涵体，用His标签蛋白试剂盒纯化，并进行超滤浓缩从而获得所述新型Fc融合纳米抗体CTLA-4Nb16-Fc。
7. 一种如权利要求1所述的Fc融合纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc在制备用于治疗肿瘤药物中的应用：
（1）采用BCA法测定超滤浓缩后，用ddH2O溶解的CTLA-4 Nb16-Fc蛋白浓度；
（2）将CTLA-4 Nb16-Fc融合纳米抗体联合树突状细胞/肿瘤细胞融合疫苗共同孵育的CD8+T细胞通过尾静脉注射，过继治疗荷瘤小鼠，观察小鼠皮下肿瘤的生长情况，计算荷瘤小鼠的生存时间。
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