CN110903397A - 具有降低低密度脂蛋白的pcsk9特异性全人源抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术技术领域，公开了能降低低密度脂蛋白(LDL)的PCSK9特异性全人源抗体及其应用，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。通过体外细胞学试验和模型小鼠体内试验，初步证实了本发明提供的全人源抗体能够调节细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLR)的数量、调节细胞对LDL的摄取，调节模型小鼠血液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL‑C)的浓度水平，由此可见，本发明为制备靶向PCSK9的降胆固醇制剂奠定了核心原料基础。

Description

具有降低低密度脂蛋白的PCSK9特异性全人源抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，具体涉及人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin kexin type 9，PCSK9)特异性的全人源抗体，编码该抗体的基因、插入有该基因的载体、转染有该基因的宿主细胞，以及它们在制备用于预防和/或治疗低密度脂蛋白升高相关病症的制剂中的应用，和一种制剂。
技术背景
心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是当今世界上危害人类健康最为严重的疾病之一，业内普遍认为，血液中的低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)水平升高会导致动脉粥样硬化，是心血管疾病主要的罪魁祸首。
降低血液中LDL是防治CVD的基本策略。他汀类药物是3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)的抑制剂，抑制内源性胆固醇的合成，是治疗CVD的首选降脂药物。然而部分患者，尤其是家族性高胆固醇(FH)患者的血清LDL水平(临床上常用LDL中的胆固醇LDL-C的浓度表示)，尽管注射他汀类药物，仍旧难以恢复到正常水平，甚至一些患者还出现了他汀类药物耐受反应。因此，迫切需要开发降低胆固醇的新型替代药物。
前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin kexin type9，PCSK9)是一种分泌性丝氨酸蛋白酶，被认为是LDL代谢的重要调节因子，是FH和CVD的潜在治疗靶点。PCSK9是前蛋白转化酶家族的一员，主要表达于肝、肠、肾和中枢神经系统。PCSK9由前体结构域、催化结构域和C端结构域组成，其中后者富含半胱氨酸和组氨酸。转录后，PCSK9 mRNA进入内质网并翻译表达一个分子量为74kD的前蛋白。前蛋白在高尔基体中裂解为分子量为20kD原结构域和63kD成熟结构域。前体结构域与催化结构域非共价连接，抑制PCSK9的自催化作用。
PCSK9通过下调肝细胞表面的低密度脂蛋白受体(LDL receptor，LDL-R)，对LDL-C的降解和脂质代谢的调节起着重要作用。PCSK9的催化结构域与LDL-R的表皮生长因子A结构域结合形成配体-受体复合物。复合物被包裹进入细胞质并转移到溶酶体中，在溶酶体中LDL-R被降解。结果，血液中的LDL清除率降低，血液LDL-C水平升高。
目前已经研发出多种形式的PCSK9抑制剂，如siRNA、抑制性短肽或小分子化合物。这些抑制剂都不同程度地存在靶向性低的缺点。部分机构研制了PCSK9抗体抑制剂，这些抗体具有特异性高、副作用小等优点。随着杂交瘤技术的建立与完善，小鼠单克隆抗体已广泛应用于疾病的诊断。然而，如果长期应用于人体，小鼠单克隆抗体将被人体免疫系统识别，产生人抗-小鼠抗体(HAMA)，降低治疗效果。因此，制备人源化抗体在抗体药物研发中至关重要。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的不足，提供一种具有降低低密度脂蛋白的PCSK9特异性全人源抗体及其应用。
本发明的发明人通过将抗体库技术和噬菌体展示技术相结合，建立了噬菌体抗体库，抗体可变区的编码序列与噬菌体外壳蛋白基因相连，表达的抗体融合蛋白展示在噬菌体表面，这些噬菌体，可以用于体外抗体的淘选，获得对特定抗原靶标具有特异性结合能力的目标噬菌体。对目标噬菌体基因测序后，获得了抗体可变区编码序列。该技术可以避开免疫过程和杂交瘤技术，获得全人源的抗体。通过实验证实该抗体能抑制HepG2细胞中LDL-R水平降低并下调PCSK9诱导的LDL摄取，还能下调PCSK9诱导小鼠模型中的LDL-C浓度水平，因此，该抗体可用于人降低LDL-C制剂的研发。
为了实现上述目的，基于如上的研究成果，本发明第一方面提供了一种全人源抗体，该抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明第二方面提供了编码如上所述的全人源抗体的基因。
本发明第三方面提供了一种表达载体，该表达载体插入有如上所述的基因。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有如上所述的表达载体。
本发明第五方面提供了如上所述的抗体、或者如上所述的基因、或者如上所述的表达载体、或者如上所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗低密度脂蛋白升高相关病症的制剂中的应用。
本发明第六方面提供了一种制剂，该制剂含如上所述的全人源抗体。
本发明通过建立噬菌体展示全人源抗体库，体外真核重组表达人PCSK9蛋白，通过抗体淘选，获得PCSK特异性全人源单链抗体，将此抗体轻链可变区编码基因和重链可变区编码基因插入相应的真核表达载体，共转染哺乳细胞，表达和纯化完整抗体。通过体外细胞学试验和模型小鼠体内试验，初步证实了该抗体能够调节细胞表面LDLR的数量、调节细胞对LDL的摄取，调节模型小鼠血液中LDL-C的浓度水平，由此可见，本发明为制备靶向PCSK9的降胆固醇制剂奠定了核心原料基础。
附图说明
图1为重组人PCSK9蛋白的鉴定(真核重组表达纯化后人PCSK9的SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色)图；
图2为全人源抗体3D2在抑制HepG2细胞表面由PCSK9诱导LDL-R的下调(细胞处理后提取蛋白应用LDLR特异性抗体进行免疫印迹分析)中的影响；
其中，泳道1：50μg BSA；泳道2：30μg全人源抗体3D2；泳道3：50μg PCSK9+30μg对照抗体；泳道4：50μg PCSK9+3μg全人源抗体3D2；泳道5：50μg PCSK9+10μg全人源抗体3D2；泳道6：50μg PCSK9+30μg全人源抗体3D2；
图3为全人源抗体3D2对HepG2细胞中LDL的摄取量的影响；
图4为全人源抗体3D2在下调PCSK9诱导的高LDL小鼠模型血清中LDL-C中的影响。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供一种全人源抗体，该抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。
SEQ ID NO：1：
EIVLTQSPVTLSVSPGERATLSCRASQSVIGNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASARAAGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLKSEDFAVYYCQQYGSSPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：2：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCQASGGTFSGYDIHWVRQATGQGLEWMGWMNPHSGNAGYAQKFQGRVTMTRDTSTATAYMELTSLTSDDTAVYYCARYAQLSLEWGQGTLVTVSS
本领域技术人员公知，抗体分子含有四条多肽链，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain，L)。同一抗体分子中的两条H链和两条L链的氨基酸组成完全相同。通过分析不同Ig重链和轻链的氨基酸序列发现，重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将Ig轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variableregion，V)，分别占重链和轻链的1/4和1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)，分别占重链和轻链的3/4和1/2。
由以上可知，在本发明限定了要保护的抗体为全人源抗体，同时限定了所述人源抗体的重链可变区和轻链可变区的情况下，根据本领域的公知常识，本领域技术人员能够得到符合本发明的全人源抗体。
本发明提供的全人源抗体来源于人体，可以长期应用于人体，并且对前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin kexin type 9，PCSK9)具有高特异性，能够有效的抑制PCSK9的活性，从而提高血液中的LDL清除率。
第二方面，本发明提供了编码如上所述的全人源抗体的基因。
本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。
根据本发明的一种优选实施方式，所述全人源抗体的轻链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
SEQ ID NO：3：
gaaattgtgttgacacagtctccagtcaccctgtctgtgtctccaggggagagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttatcggcaacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccgccagggccgccggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctgaagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtatggtagctcaccgtacacttttggccaggggaccaagctggagatcaaa
根据本发明的一种优选实施方式，所述全人源抗体的重链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
SEQ ID NO：4：
caggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtgtcctgtcaggcttctggaggcaccttcagtggttatgatatccactgggtgcgacaggccactggacaaggccttgagtggatgggatggatgaaccctcactctggtaacgcaggctatgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacaagggacacatcgacagccacagcctacatggaactgaccagcctgacgtctgacgacacggccgtatattactgtgcccgctacgcccagctgagcctggagtggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
根据本发明，所述的“编码全人源抗体的基因”并非指一条基因序列，而是根据本发明的全人源抗体可以分为几条基因序列，例如，编码重链的基因，编码轻链的基因。根据本发明一种优选的实施方式，所述基因包括两条基因序列，也即，编码轻链的基因序列，其具有SEQ ID NO：3所示的编码轻链可变区的核苷酸序列，和编码重链的基因序列，其具有SEQ ID NO：4所示的编码重链可变区的核苷酸序列。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，该表达载体插入有如上所述的基因。
根据本发明，所述表达载体可以按照本领域的常规技术手段进行构建，例如，可以将编码具有本发明重链可变区的重链的基因和编码具有本发明轻链可变区的轻链的基因构建在同一载体中，也可以构建在不同的载体中。根据本发明一种优选的实施方式，将编码具有本发明重链可变区的重链的基因和编码具有本发明轻链可变区的轻链的基因构建在不同的载体中，优选为哺乳动物表达载体。其中，所述哺乳动物表达载体可以为本领域常规使用的哺乳动物表达载体，优选的，将具有抗体轻链可变区编码基因的轻链编码序列插入pFUSE2-CLIg-hk，获得抗体轻链表达载体；将具有抗体重链可变区编码基因的重链编码序列插入pFUSE-CHIg-hG1，获得抗体重链表达载体。
根据本发明，可以采用本领域常规技术手段来构建本发明的表达载体，例如，可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的目的基因片段连接，获得本发明的表达载体。
第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有如上所述的表达载体。
根据本发明，可以通过本领域常规的方法将所述表达载体转化、转导或者转染到宿主细胞中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化。所述宿主细胞优选为细胞株。根据本发明一种优选的实施方式，所述宿主细胞为含有本发明的表达载体的HEK293细胞，其可以通过将本发明的表达载体转染HEK293细胞而获得。
根据本发明，本发明提供的全人源抗体可以通过培养本发明的宿主细胞，并从细胞培养上清中通过Protein A亲和层析纯化完整抗体。
第五方面，本发明提供了如上所述的抗体、或者如上所述的基因、或者如上所述的表达载体、或者如上所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗低密度脂蛋白升高相关病症的制剂中的应用。
根据本发明，本发明所述的病症可以为任意的由低密度脂蛋白升高所引起的病症，例如，心血管疾病及其并发症、动脉粥样硬化及其并发症或高胆固醇症及其并发症。
第六方面，本发明提供了一种制剂，该制剂含有如上所述的全人源抗体。
根据本发明，所述制剂还可以含有各种药学上可接受的辅剂，所述辅剂的种类可以根据所述制剂的剂型而进行具体的选择，这些均是本领域技术人员所公知的。
根据本发明，所述制剂可以为各种剂型，例如，口服剂型，静脉注射剂型、肌肉注射剂型等等。
实施例
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，室温指“25℃”。
实施例1
本实施例用来说明人PCSK9蛋白制备
首先应用Trizol试剂(碧云天生物技术有限公司)从人肝癌细胞系HepG2(ATCC)中提取总RNA，逆转录获得cDNA。以cDNA为模板，采用聚合酶链反应(PCR)扩增PCSK9的cDNA序列。将PCR产物连接到一个修饰的哺乳动物表达载体pcDNA3.1-hIgG1Fc(BioVector产品)中。对阳性克隆进行DNA测序(上海英骏生物技术有限公司)，以确定正确构建PCSK9真核表达载体pcDNA3.1-hIgG1 Fc-PCSK9。大量提取质粒后应用ExpiFectamineTM293Transfection Kit转染试剂盒(Gibco产品)将该表达载体转染到HEK293细胞(ATCC)中并培养。转染后8天收集细胞培养基上清液。应用Protein A琼脂糖层析柱(GE Healthcare)从细胞培养上清纯化重组蛋白。收集洗脱液，用酶TEV(上海生工)消化。消化产物用ProteinA琼脂糖层析柱(GE Healthcare)再次纯化。收集洗脱液，通过用SDS-PAGE和考马斯蓝染色验证重组蛋白的其分子量和纯度，结果如图1所示。应用小鼠抗人PCSK9单克隆抗体(R&DSystem)对重组蛋白进行免疫印迹检测以验证其免疫原性。经验证，本实施例成功制备了人PCSK9蛋白。
实施例2
本实施例用来说明人PCSK9特异性全人源抗体的制备
通过收集人外周血单个核细胞，分离总RNA，应用噬菌体展示技术，常规建立全人源scFv抗体库。将重组表达的人PCSK9蛋白包被在免疫棒(GE Healthcare)上，常规进行抗体的淘选。经5轮筛选后，随机选择部分菌落，应用辅助噬菌体M13KO7(NEB)诱导组装噬菌体。应用重组表达的PCSK9蛋白包被酶标板微孔，HRP-anti-M13抗体(北京义翘神州科技有限公司)作为检测抗体，建立间接噬菌体ELISA，验证重组噬菌体对PCSK9的识别和结合。选择阳性噬菌体，应用重组表达的PCSK9蛋白包被酶标板微孔，加入阳性噬菌体，以Bio-LDLR蛋白为竞争剂，HRP-链霉亲和素(Solarbio Life Sciences)为指示剂，建立竞争性噬菌体ELISA，验证重组噬菌体与PCSK9的特异性结合。
选择目标噬菌体，通过DNA测序(上海英骏生物技术有限公司)分别获得抗体重链可变区(VH，SEQ ID NO：2)和轻链可变区(VL，SEQ ID NO：1)的编码DNA序列，通过DNA化学合成技术分别合成编码抗体重链可变区(VH，SEQ ID NO：2)和轻链可变区(VL，SEQ ID NO：1)的DNA序列(上海英骏生物技术有限公司)，并将其分别插入哺乳动物表达载体pFUSE2-CLIg-hk和pFUSE-CHIg-hG1(InvivoGen)中。验证正确后，应用ExpiFectamineTM293转染试剂盒(Gibco)将质粒转染HEK293细胞(ATCC)。培养8天后，收集细胞培养上清。应用Protein A琼脂糖层析柱(GE Healthcare)从细胞培养上清纯化重组抗体(本发明的人PCSK9特异性全人源抗体，命名为3D2)。通过SDS-PAGE检测重组抗体的分子量和纯度。应用重组表达的PCSK9蛋白作为抗原，应用纯化的重组蛋白为抗体，HRP标记山羊抗人多克隆抗体为第二抗体，通过免疫印迹验证重组抗体与PCSK蛋白的特异性结合。
实施例3
本实施例用来说明PCSK9特异性全人源抗体的活性鉴定
1.重组抗体下调HepG2细胞表面的LDLR
将5×105个HepG2细胞(ATCC)接种到6孔板中，用含有10体积％的FBS的DMEM培养基中(Gibco)培养过夜。第二天，将培养基换成含有10体积％的LDPS(Gibco)的DMEM培养基，再培养24小时。第三天，将不同剂量的实施例2制备的PCSK9特异性全人源抗体3D2(3、10、30μg)分别与重组PCSK9蛋白(50μg)混合，孵育1小时，加入HepG2细胞培养中。继续培养4小时后，收集细胞，用RIPA缓冲液(碧云天生物技术有限公司)提取细胞总蛋白。应用LDLR特异性抗体(Signalway Antibody LLC)通过Western blot检测LDLR水平，同时应用GAPDH作为内参。比较分析重组PCSK9特异性抗体对HepG2细胞表面LDLR水平的影响，结果如图2所示。
如图2所示，各泳道所示细胞的处理方式分别为：泳道1为50μg BSA；泳道2为30μg全人源抗体3D2；泳道3为50μg PCSK9+30μg对照抗体(人IgG1同型对照抗体，；泳道4为50μgPCSK9+3μg全人源抗体3D2；泳道5为50μg PCSK9+10μg全人源抗体3D2；泳道6为50μgPCSK9+30μg全人源抗体3D2。结果表明，PCSK9蛋白能显著下调靶细胞表面的LDLR(泳道3)，本发明所制备的全人源抗体3D2能以剂量依赖的方式上调靶细胞表面的LDLR(泳道4、5和6)。
2.重组蛋白调节HepG2细胞对LDL的摄取
将HepG2细胞在密度为2×104个细胞/孔的96孔细胞培养板中用含有10体积％FBS的DMEM培养过夜。然后将培养基更换为含有10体积％的LDPS(Gibco)的DMEM培养基继续培养。24小时后，将系列浓度的实施例2制备的PCSK9特异性全人源抗体3D2(0、8、16、32、64和128mg/mL)与PCSK9(1mg/ml，实验前确定该浓度能显著抑制细胞对LDL的摄取)混合，孵育1小时，然后将混合物加入HepG2细胞培养孔(每孔加入2μL)，继续培养细胞4小时后，每孔加入浓度为0.25mg/mL的Dil标记的LDL(Dil-LDL，上海前尘生物科技有限公司)，每孔4μL。继续培养5小时，先后用2mg/mL BSA-PBS、PBS洗涤细胞各2次，每孔用80μL Ripa缓冲液(碧云天生物技术有限公司)裂解细胞，在荧光分光光度计上，用540nm波长为激发，检测580nm波长的发射光(荧光)。使用Graphpad软件计算EC50值，绘制3D2调节细胞摄取LDL的性能及其工作浓度曲线，结果如图3所示。
如图3所示，阴性对照为人IgG1同行对照抗体(应用最高抗体浓度128mg/mL，北京义翘神州科技有限公司)，阳性对照为不加PCSK9蛋白和抗体的细胞。结果表明，PCSK蛋白能显著抑制靶细胞对LDL的摄取，而抗体3D2能以剂量依赖的方式逆转PCSK的效应，恢复细胞对LDL的摄取。
3.重组抗体在实验小鼠模型中的降LDL效应
雄性C57BL/6小鼠(8周龄，购自吉林医药学院实验动物中心)，随机分为对照组(ctl)、模型组(PCSK9)和3D2治疗组(3d2)。模型组小鼠注射PCSK9蛋白4mg/kg，重组抗体3D2治疗组注射抗体PCSK9蛋白4mg/kg加上重组抗体10mg/kg(注射前将二者混合孵育1小时)，对照组注射等量生理盐水。每组随机抽取等量小鼠，分别于注射后不同时间点(24小时、48小时、72小时)处死。采集小鼠血清，用LDL-C检测试剂盒(成都迈克生物科技股份有限公司)检测血清中LDL-C浓度，了解重组抗体对实验小鼠的LDL水平的影响，结果如图4所示。
如图4所示，在注射PCSK9蛋白和抗体3D2后不同时间点(24小时、48小时和72小时)，小鼠血清中LDL-C的浓度因注射PCSK9蛋白而升高，使用抗体3D2可以逆转此过程，将升高的LDL-C下调回去。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林医药学院
重庆探生科技有限公司
<120> 具有降低低密度脂蛋白的PCSK9特异性全人源抗体及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 轻链可变区的氨基酸序列(Amino acid sequence of light chain variableregion)
<400> 1
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Gly Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ala Arg Ala Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Lys Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 重链可变区的氨基酸序列(Amino acid sequence of heavy chain variableregion)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro His Ser Gly Asn Ala Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ala Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ala Gln Leu Ser Leu Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 321
<212> DNA
<213> 轻链可变区的编码序列(Coding sequence of light chain variableregion)
<400> 3
gaaattgtgt tgacacagtc tccagtcacc ctgtctgtgt ctccagggga gagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttatc ggcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccgcca gggccgccgg catcccagac 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctgaagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tatggtagct caccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 4
<211> 348
<212> DNA
<213> 重链可变区的编码序列(Coding sequence of heavy chain variableregion)
<400> 4
caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtg 60
tcctgtcagg cttctggagg caccttcagt ggttatgata tccactgggt gcgacaggcc 120
actggacaag gccttgagtg gatgggatgg atgaaccctc actctggtaa cgcaggctat 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg acaagggaca catcgacagc cacagcctac 240
atggaactga ccagcctgac gtctgacgac acggccgtat attactgtgc ccgctacgcc 300
cagctgagcc tggagtgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348

Claims (9)

1.一种全人源抗体，该抗体包括轻链可变区和重链可变区，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.编码权利要求1所述的全人源抗体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其中，编码所述轻链可变区的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求2或3所述的基因，其中，编码所述重链可变区的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
5.一种表达载体，其特征在于，该表达载体插入有权利要求2-4中任意一项所述的基因。
6.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有权利要求5所述的表达载体。
7.权利要求1所述的抗体、或者权利要求2-4中任意一项所述的基因、或者权利要求5所述的表达载体、或者权利要求6所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗低密度脂蛋白升高相关病症的制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述低密度脂蛋白升高相关病症为心血管疾病及其并发症、动脉粥样硬化及其并发症或高胆固醇症及其并发症。
9.一种制剂，其特征在于，该制剂含有权利要求1所述的全人源抗体。
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